EA039511B1 - Способ сайт-направленной модификации целого растения посредством транзиентной экспрессии гена - Google Patents

Способ сайт-направленной модификации целого растения посредством транзиентной экспрессии гена Download PDF

Info

Publication number
EA039511B1
EA039511B1 EA201791681A EA201791681A EA039511B1 EA 039511 B1 EA039511 B1 EA 039511B1 EA 201791681 A EA201791681 A EA 201791681A EA 201791681 A EA201791681 A EA 201791681A EA 039511 B1 EA039511 B1 EA 039511B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
plant
sequence
fragment
cas9
recombinant vector
Prior art date
Application number
EA201791681A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201791681A1 (ru
Inventor
Каиксиа Гао
Йи Жанг
Жонгуи Ву
Кэнг Жанг
Original Assignee
Инститьют Оф Дженетикс Энд Девелопментал Байолоджи, Чайниз Акэдеми Оф Сайенсиз
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Инститьют Оф Дженетикс Энд Девелопментал Байолоджи, Чайниз Акэдеми Оф Сайенсиз filed Critical Инститьют Оф Дженетикс Энд Девелопментал Байолоджи, Чайниз Акэдеми Оф Сайенсиз
Publication of EA201791681A1 publication Critical patent/EA201791681A1/ru
Publication of EA039511B1 publication Critical patent/EA039511B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
    • C12N15/8207—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated by mechanical means, e.g. microinjection, particle bombardment, silicon whiskers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/89—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microinjection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03048—Protein-tyrosine-phosphatase (3.1.3.48)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/10—Vectors comprising a non-peptidic targeting moiety

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение обеспечивает способ сайт-направленной модификации целого растения посредством транзиентной экспрессии гена. Данный метод сайт-направленной модификации целевого фрагмента гена-мишени в целом растении состоит из следующих этапов: транзиентной экспрессии последовательность-специфической нуклеазы в растении, характеризующейся тем, что в качестве объекта для транзиентной экспрессии используется целое растение, таргетирования и расщепления целевого фрагмента, при этом сайт-направленная модификация достигается посредством саморепарации ДНК растения. В соответствии с настоящим изобретением исключается процесс культуры тканей за счет транзиентной экспрессии последовательность-специфической нуклеазы; получаемая мутация происходит на уровне целого растения; метод не зависит от генотипа растения или растения-реципиента и может применяться в отношении растений различных сортов и различных видов; мутанты Т1 получают напрямую, и мутация стабильно наследуется; более того, получаемое мутантное растение свободно от экзогенных генов и, таким образом, обладает более высокой биобезопасностью.

Description

Изобретение относится к области генетической инженерии растений и касается способа сайтнаправленной модификации целого растения посредством транзиентной экспрессии гена.
Предпосылки создания изобретения
Трансгенез - это процесс переноса экзогенного гена(ов) в конкретный организм с помощью механизмов молекулярной биологии с целью частичного изменения биологической характеристики или функций организма. В 1983 г. впервые в мире в США было получено трансгенное растение - трансгенное растение табака с антивирусной устойчивостью. В 1986 г. в США был создан трансгенный хлопчатник, устойчивый к вирусам, и проведены полевые испытания с трансгенным хлопчатником. В 1987 г. в культурные растения были введены гены устойчивости к насекомым-вредителям и гербицидам. В 1992 г. трансгенное растение табака было получено в Китае. В 1995 г. Канада начала коммерческую реализацию трансгенных гербицидоустойчивых растений Brassica. В 1996 г. в США началось массовой выращивание хлопчатника, устойчивого к насекомым-вредителям, и сои, устойчивой к гербицидам. В настоящее время в мире существует более 120 трансгенных растений, из которых 51 - соя, хлопчатник и кукуруза - предназначены для коммерческого использования.
Сегодня распространение трансгенных продуктов вызывает все большее беспокойство. Особое беспокойство вызывает генетически модифицированные продукты питания. В большинстве стран регулирование использования трансгенных организмов является весьма жестким. Контроль за трансгенными технологиями и продуктами требует много времени и больших денежных средств. Исследования международной ассоциации CropLife International показали, что на коммерциализацию трансгенного события требуется 5,5 лет и 35 миллионов долларов США. Кроме того, уже доступные коммерческие трансгенные культуры не пользуются большой популярностью на рынке. Например, первые трансгенные томаты были сняты с рынка из-за крайне низких продаж. Поэтому важно разработать нетрансгенные способы улучшения культурных растений.
Существующие способы генетического улучшения культурных растений или модификации генов обладают многочисленными недостатками. Например, традиционное перекрестное скрещивание необходимо проводить на протяжении нескольких поколений, что требует больших затрат труда и времени. Оно может также ограничиваться межвидовой репродуктивной изоляцией и нарушаться нежелательными генными взаимодействиями. Способы физического или химического мутагенеза, такие как радиационный мутагенез, EMS мутагенез и т.д., могут приводить к случайному введению большого количества мутантных сайтов в геном, и идентификация таких мутантных сайтов чрезвычайно затруднена.
Появившиеся в последние годы новейшие технологии, которые используются в качестве инструментов для сайт-направленной модификации геномов, включают, в основном, три категории последовательность-специфических нуклеаз (SSN): нуклеазы цинковые пальцы (ZFN), эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN) и короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные груnпами/CRISPR-ассоциированные системы (CRISPR/Cas9). Их общим признаком является то, что они могут действовать в качестве эндонуклеазы для расщепления ДНК в специфических участках последовательностей с образованием в ДНК двухцепочечных разрывов (DSB). DSB способны активировать внутренние механизмы репарации клеток -негомологичное соединение концов (NHEJ) и гомологичную рекомбинацию (HR) - для репарации повреждений ДНК. В ходе процесса репарации ДНК может достигаться сайт-направленная модификация в отношении последовательности ДНК.
Использование технологий переноса генов для доставки вышеуказанных инструментов в культурные растения может способствовать преодолению таких недостатков традиционного скрещивания, как низкая эффективность, временные затраты и плохая специфичность. Этот процесс происходит, однако, с участием трансгенов и чтобы получить сайт-направленный модифицированный мутант, свободный от трансгенов, необходимо осуществить сегрегацию в поколении потомков. Поскольку экзогенные гены интегрируются в геном растения (хотя затем и удаляются путем сегрегации), обеспокоенности, касающиеся безопасности, продолжают существовать. Таким образом, все еще есть необходимость в способе сайт-направленной модификации культурных растений без участия трансгенов.
Осуществление традиционных способов переноса генов, таких как трансформация бомбардировкой частицами, Agrobacterium-опосредованная трансформация или трансформация протопластов, требует культуры тканей. Культура тканей растений означает, что желаемые ткани, клетки или протопласты изолируют из растений и культивируют в искусственных условиях для регенерации целого растения. При культивировании тканей могут происходить соматические мутации. Культура тканей также ограничивается генотипом растения и конкретным растением-реципиентом. Получение регенерированного растения требует больших затрат времени и значительных денежных средств. Трансформация in situ - это трансформация живого растения (не ex vivo) без необходимости культуры тканей или клеток. При трансформации in situ в качестве объекта для трансформации обычно используется целое растение. Такая трансформация включает, например, трансформацию с использованием прорастающих пыльцевых трубок, трансформацию методом погружения соцветий, регенерации стеблевых апексов, инъекции в оплодотворенную завязь, трансформацию листовых дисков и т.п. Способы трансформации in situ исключают процесс культуры тканей, и поэтому они просты в осуществлении и не требуют специального оборудования.
- 1 039511
Эти способы не зависят от генотипа растения и растения-реципиента и, следовательно, могут применяться в отношении растений различных сортов и различных видов. Более того, трансгенное потомство можно получать напрямую. Таким образом, сайт-направленная модификация растительного генома может достигаться с помощью системы транзиентной экспрессии посредством трансформации in situ, что способствует применению технологий редактирования генов в растениях.
Краткое изложение сущности изобретения
Целью изобретения является обеспечение способа сайт-направленной модификации целого растения посредством транзиентной экспрессии гена.
Настоящее изобретение обеспечивает способ проведения сайт-направленной модификации целевого фрагмента гена-мишени в растении, который может состоять из следующих этапов: транзиентной экспрессии последовательность-специфической нуклеазы в растении интереса, характеризующейся тем, что в качестве объекта для транзиентной экспрессии используется целое растение, таргетирования и расщепления целевого фрагмента последовательность-специфической нуклеазой, при этом достигается сайтнаправленная модификация посредством саморепарации ДНК растения. Данный способ исключает процесс культуры ткани.
Согласно варианту осуществления данного способа подход для транзиентной экспрессии сайтнаправленной нуклеазы в растении состоит из следующих этапов:
a) введения последовательность-специфической нуклеазы или генетического материала в растение для экспрессии последовательность-специфической нуклеазы и
b) выращивания растения, получаемого на этапе a), в условиях отсутствия селективного давления, при этом последовательность-специфическая нуклеаза или генетический материал, не интегрировавшийся в растительный геном, деградируется.
Согласно варианту осуществления способа по изобретению указанный генетический материал представляет собой рекомбинантный вектор (например, плазмиду ДНК) или линейный фрагмент ДНК, либо РНК, транскрибированную in vitro.
В отсутствие селективного давления защитная система растения ингибирует доступ экзогенного гена и деградирует экзогенный ген, который уже был введен в растение. Таким образом, при выращивании целого растения, обеспечивавшего транзиентную экспрессию, экзогенный ген (включая любой фрагмент генетического материала для экспрессии нуклеазы, специфичной в отношении целевого фрагмента) не интегрируется в геном растения, и получаемое в результате растение представляет собой нетрангенное растение с сайт-направленной модификацией.
Согласно варианту осуществления способа по изобретению последовательность-специфическая нуклеаза или генетический материал вводится через любую часть растения, пригодную для введения последовательность-специфической нуклеазы или генетического материала, такую как пыльцевая трубка, соцветие, стеблевой апекс, завязь или лист и т.п.
Согласно варианту осуществления настоящего изобретения, если данная часть растения представляет собой пыльцевую трубку, введение осуществляется путем инъекции раствора, содержащего рекомбинантный вектор (такой как плазмида ДНК) или линейный фрагмент ДНК, либо РНК, транскрибированную in vitro, или раствора, содержащего последовательность-специфическую нуклеазу, в рыльца после опыления, при этом экзогенный генетический материал или последовательность-специфическая нуклеаза вводится в оплодотворенную завязь через пыльцевую трубку, которая развивается во время цветения и оплодотворения (подход с использованием прорастающих пыльцевых трубок).
Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения, если данная часть растения представляет собой соцветие, введение осуществляется путем погружения соцветия в раствор Agrobacterium tumefaciens, несущий рекомбинантный вектор (такой как плазмида ДНК) или линейный фрагмент ДНК (подход методом погружения соцветий или цветочных почек).
Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения, если данная часть растения представляет собой стеблевой апекс, введение осуществляется путем погружения стеблевого апекса в раствор Agrobacterium tumefaciens, несущий рекомбинантный вектор (такой как плазмида ДНК) или линейный фрагмент ДНК (подход методом регенерации стеблевых апексов).
Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения, если данная часть растения представляет собой завязь, введение осуществляется путем инъекции раствора, содержащего рекомбинантный вектор (такой как плазмида ДНК) или линейный фрагмент ДНК, либо РНК, транскрибированную in vitro, или раствора, содержащего последовательность-специфическую нуклеазу, в завязь после опыления (подход способом инъекции в оплодотворенную завязь).
Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения, если данная часть растения представляет собой завязь, введение осуществляется путем инъекции раствора Agrobacterium tumefaciens, несущего рекомбинантный вектор (такой как плазмида ДНК) или линейный фрагмент ДНК, в завязь после опыления (подход способом инъекции Agrobacterium в оплодотворенную завязь).
Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения, если данная часть растения представляет собой лист, введение осуществляется путем инъекции раствора Agrobacterium tumefaciens, несущего рекомбинантный вектор (такой как плазмида ДНК) или линейный фрагмент ДНК, в лист
- 2 039511 (подход методом листовых дисков).
В указанном способе последовательность-специфическая нуклеаза, специфичная в отношении целевого фрагмента, может быть любой нуклеазой, с помощью которой возможно осуществление редактирования генома, например, нуклеаза цинковые пальцы (ZFN), эффекторная нуклеаза, подобная активаторам транскрипции (TALENs), нуклеаза CRISPR/Cas9 и т.п.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения последовательность-специфическая нуклеаза предпочтительно является нуклеазой CRISPR/Cas9. В некоторых вариантах осуществления изобретения генетический материал для экспрессии нуклеаз CRISPR/Cas9, специфичных в отношении целевого фрагмента, предпочтительно включает рекомбинантный вектор или фрагмент ДНК для транскрипции направляющей РНК (или два рекомбинантных вектора или фрагмента ДНК для транскрипции crPHK и tracrPHK, соответственно) и для экспрессии белка Cas9; либо предпочтительно включает рекомбинантный вектор или фрагмент ДНК для транскрипции направляющей РНК (или два рекомбинантных вектора или фрагмента ДНК для транскрипции crPHK и tracrPHK, соответственно) и рекомбинантный вектор или фрагмент ДНК, либо РНК, для экспрессии белка Cas9; либо предпочтительно включает направляющую РНК (или crPHK и tracrPHK) и рекомбинантный вектор или фрагмент ДНК, либо РНК, для экспрессии белка Cas9. Направляющая РНК представляет собой РНК палиндромной структуры, образующуюся путем частичного спаривания оснований между crPHK и tracrPHK, при этом crPHK содержит фрагмент РНК, способный комплементарно связываться с целевым фрагментом.
Кроме того, в рекомбинантном векторе или фрагменте ДНК для транскрипции направляющей РНК промотором для инициации транскрипции кодирующей нуклеотидной последовательности направляющей РНК является промотор U6 или промотор U3.
Наиболее предпочтительно, рекомбинантный вектор для транскрипции направляющей РНК и экспрессии Cas9 представляет собой рекомбинантную плазмиду, получаемую путем инсерции кодирующей последовательности фрагмента РНК, способного комплементарно связываться с целевым фрагментом в направлении вверх по течению между BsaI сайтами рестрикции плазмиды pHSN40 или pHSN401.
Рекомбинантный вектор для транскрипции направляющей РНК представляет собой рекомбинантную плазмиду, получаемую путем инсерции кодирующей последовательности фрагмента РНК, способного комплементарно связываться с целевым фрагментом в направлении вверх по течению между BbsI сайтами рестрикции плазмиды pZmU3-gRNA; рекомбинантный вектор для экспрессии нуклеазы Cas9 предпочтительно представляет собой вектор pJIT163-Ubi-Cas9.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения последовательность-специфической нуклеазой являются нуклеазы TALENs. Генетический материал для экспрессии последовательность-специфической нуклеазы, специфичной в отношении целевого участка, может представлять собой рекомбинантный вектор (плазмиду ДНК) или фрагмент ДНК, либо РНК, экспрессирующую спаренные белки TALEN, при этом белок TALEN включает ДНК-связывающий домен, способный узнавать и связываться с целевым фрагментом, и домен Fok I.
Если последовательность-специфической нуклеазой являются нуклеазы цинковые пальцы (ZFN), генетическим материалом для экспрессии последовательность-специфической нуклеазы, специфичной в отношении целевого участка, может быть рекомбинантный вектор (плазмида ДНК) или фрагмент ДНК, либо РНК, экспрессирующая спаренные белки ZFN, при этом белок ZFN включает ДНК-связывающий домен, способный узнавать и связываться с целевым фрагментом, и домен Fok I.
В способе согласно настоящему изобретению сайт-направленная модификация предпочтительно представляет собой инсерцию, делецию и/или замену в целевом фрагменте растительного генома. Согласно варианту осуществления настоящего изобретения целевой фрагмент располагается внутри кодирующей области гена-мишени.
Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения целевой участок располагается в области регуляции транскрипции гена-мишени, такой как промотор. Согласно еще одному варианту осуществления изобретения ген-мишень может быть структурным или неструктурным геном. Согласно варианту осуществления настоящего изобретения модификация приводит к утрате функции генамишени. Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения модификация приводит к приобретению (или изменению) функции гена-мишени.
Согласно варианту осуществления изобретения растение может быть растением любого генотипа. Растение может быть однодольным или двудольным растением, таким как кукуруза сахарная (Zea mays), пшеница, соя, хлопок, табак, Arabidopsis, рожь, Rosa roxbunghii, Eriobotrya japonica, Carica papaya, Rosa canina, Dendrobium nobile Lindl., Brassica oleracea, Fagopyrum tataricum или Hevea brasiliensis.
Если растение представляет собой кукурузу, пшеницу, сою, хлопок, табак и т.п., последовательность-специфическая нуклеаза или генетический материал может доставляться с помощью подхода с использованием прорастающих пыльцевых трубок. Если растение представляет собой Arabidopsis, пшеницу, рожь и т.п., последовательность-специфическая нуклеаза или генетический материал может доставляться с помощью подхода методом погружения соцветий. Если растение представляет собой кукурузу, Rosa roxbunghii, Eriobotrya japonica, Carica papaya, Rosa canina и т.п., генетический материал может доставляться с помощью подхода методом регенерации стеблевых апексов. Если растение представляет
- 3 039511 собой пшеницу, сою, хлопок, Dendrobium nobile Lindl. и т.п., последовательность-специфическая нуклеаза или генетический материал может доставляться с помощью подхода методом инъекции в оплодотворенную завязь. Если растение представляет собой табак, Brassica oleracea, Fagopyrum tataricum, Hevea brasiliensis и т.п., генетический материал может доставляться с помощью подхода методом листовых дисков.
Согласно варианту осуществления настоящего изобретения (пример 1) растение представляет собой растение кукурузы (в частности, гибрид HiII и инбредную линию В73, Zheng58 и т.п.); нуклеаза представляет собой CRISPR/Cas9; ген-мишень представляет собой эндогенный ген ZmIPK кукурузы; целевой фрагмент представляет собой 5'-AGCTCGACCACGCCGCCGAC-3'; рекомбинантный вектор для транскрипции направляющей РНК представляет собой рекомбинантную плазмиду, получаемую путем инсерции фрагмента ДНК, как показано в 5'-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3', в направлении вверх по течению между двумя BbsI сайтами рестрикции плазмиды pZmU3-gRNA; рекомбинантный вектор для экспрессии нуклеазы Cas9 предпочтительно представляет собой вектор pJIT163-Ubi-Cas9; рекомбинантный вектор для транскрипции направляющей РНК и экспрессии белка Cas9 представляет собой рекомбинантную плазмиду, получаемую путем инсерции фрагмента ДНК, как показано в 5'GGCGGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3', в направлении вверх по течению между двумя BsaI сайтами рестрикции плазмиды pBUE411.
Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения (пример 2) растение представляет собой Arabidopsis; нуклеаза представляет собой CRISPR/Cas9; ген-мишень представляет собой эндогенный ген AtPTPA Arabidopsis; целевой фрагмент представляет собой 5'-ACGATATCCGCCGAT TTCAC-3'; рекомбинантный вектор для транскрипции направляющей РНК и экспрессии белка Cas9 представляет собой рекомбинантную плазмиду, получаемую путем инсерции фрагмента ДНК, как показано в S'-ATTGGTGAAATCGGCGGATATCGT-S', в направлении вверх по течению между двумя BsaI сайтами рестрикции плазмиды pHSN401.
Объектом настоящего изобретения также является мутантное нетрансгенное растение и/или его потомство, получаемое путем использования способа по изобретению для проведения сайт-направленной модификации целевого фрагмента гена-мишени в растении интереса с целью утраты геном-мишенью своих функций.
Согласно настоящему изобретению также предлагается способ создания мутантного нетрансгенного растения, состоящий из следующих этапов: осуществления сайт-направленной модификации целевого фрагмента гена-мишени в растении интереса путем использования способа по данному изобретению, получения растения, в котором функции гена-мишени утеряны и геном которого свободен от интегрированного экзогенного гена.
В данном случае трансгенное растение касается растения, в геном которого интегрирован экзогенный ген. Нетрансгенное растение касается растения, геном которого не содержит интеграции экзогенного гена.
Настоящее изобретение объединяет технологию редактирования генома и систему транзиентной экспрессии, при которой в качестве объекта для экспрессии используется целое растение. Это означает, что в соответствии с настоящим изобретением в клетки или ткани целого растения вводится последовательность-специфическая нуклеаза посредством подходов с использованием прорастающих пыльцевых трубок, погружения соцветий, регенерации стеблевых апексов, инъекций в оплодотворенную завязь, листовых дисков и т.п.; затем достигается модификация растительного генома путем транзиентной экспрессии последовательность-специфической нуклеазы. Мутантное потомство, обладающее высокой степенью безопасности, можно получать напрямую. Например, при применении подхода с использованием прорастающих пыльцевых трубок раствор, содержащий последовательность-специфическую нуклеазу или ДНК/РНК для экспрессии последовательность-специфической нуклеазы, доставляется в оплодотворенные яйцеклетки или зародышевые клетки (сперматозоид или яйцеклетка) посредством пыльцевой трубки, формирующейся во время цветения или оплодотворения растения. Эти клетки подобны протопластам (лишены клеточной стенки), ДНК в этих клетках подвергается активной репликации и рекомбинации и, таким образом, эффективно редактируется с помощью последовательность-специфической нуклеазы. Модифицированные оплодотворенные яйцеклетки или зародышевые клетки могут развиваться в интактные мутантные растения. Интродуцированная последовательность-специфическая нуклеаза или РНК, кодирующая последовательность-специфическую нуклеазу, разрушается растительными клетками. ДНК, кодирующая последовательность-специфическую нуклеазу, также разрушается растительными клетками, так как способ осуществляется в отсутствие селективного давления. Таким образом, экзогенный ген не интегрируется в геном, и получаемые в результате мутанты обладают более высокой биобезопасностью.
Преимущества настоящего изобретения заключаются в следующем: отсутствует этап культуры тканей; получаемая мутация происходит на уровне целого растения и, следовательно, может применяться в отношении растений различных сортов и различных видов; мутанты T1 можно получать напрямую, при этом мутации стабильно наследуются; и самое важное - получаемые мутантные растения свободны от экзогенных генов и поэтому обладают более высокой биобезопасностью.
- 4 039511
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показан сайт-направленный мутагенез эндогенного гена ZmIPK кукурузы посредством системы транзиентной экспрессии gRNA:Cas9. a) Представляет собой гельэлектрофореграмму. Дорожка 1 - маркер, снизу вверх: 250, 500, 750, 1000 п.о., соответственно; дорожка 2 и дорожка 3 - результаты расщепления нуклеазами рестрикции SacI ПЦР-продуктов ДНК протопластов, где протопласты были трансформированы с использованием системы gRNA:Cas9; дорожка 4 - результат расщепления нуклеазой рестрикции SacI ПЦР-продукта ДНК протопласта дикого типа; дорожка 5 - ПЦР-продукт ДНК протопласта дикого типа. b) Результаты секвенирования некоторых мутантов.
На фиг. 2 показан сайт-направленный мутагенез эндогенного гена ZmIPK кукурузы сорта HiII посредством системы транзиентной экспрессии gRNA:Cas9 через подход с использованием прорастающих пыльцевых трубок, а также результаты секвенирования. a) Представляет собой гельэлектрофореграмму. Дорожка 1 - маркер, снизу вверх: 100, 250, 500, 750, 1000 п.о., соответственно; дорожки 2-12 - результаты расщепления нуклеазами рестрикции SacI ПЦР-продуктов мутантов; дорожка 13 - результат расщепления нуклеазой рестрикции SacI ПЦР-продукта контроля дикого типа. b) Результаты секвенирования некоторых мутантов.
На фиг. 3 показан сайт-направленный мутагенез эндогенного гена ZmIPK кукурузы сорта В73 посредством системы транзиентной экспрессии gRNA:Cas9 через подход с использованием прорастающих пыльцевых трубок, а также результаты секвенирования. a) Представляет собой гельэлектрофореграмму. Дорожка 1 - маркер, снизу вверх: 100, 250, 500, 750, 1000 п.о., соответственно; дорожки 2-6 - результаты расщепления нуклеазами рестрикции SacI ПЦР-продуктов мутантов; дорожка 7 - результат расщепления нуклеазой рестрикции SacI ПЦР-продукта контроля дикого типа. b) Результаты секвенирования некоторых мутантов.
На фиг. 4 показан сайт-направленный мутагенез эндогенного гена ZmIPK кукурузы сорта Zheng58 посредством системы транзиентной экспрессии gRNA:Cas9 через подход с использованием прорастающих пыльцевых трубок, а также результаты секвенирования. a) Представляет собой гельэлектрофореграмму. Дорожка 1 - маркер, снизу вверх: 100, 250, 500, 750, 1000 п.о., соответственно; дорожки 2-9 результаты расщепления нуклеазами рестрикции SacI ПЦР-продуктов мутантов; дорожка 10 - результат расщепления нуклеазой рестрикции SacI ПЦР-продукта контроля дикого типа. b) Результаты секвенирования некоторых мутантов.
Фиг. 5 представляет собой гельэлектрофореграмму амплификации генов-мутантов ZmIPK различных сортов кукурузы через подход с использованием прорастающих пыльцевых трубок и с участием наборов из 2 праймеров на векторах pZmU3-gRNA-C1 и pJIT163-Ubi-Cas9. a) Результат амплификации с участием пары праймеров ZmU3-F/C1R. b) Результат амплификации с участием пары праймеров Cas91F/Cas9-1R. Дорожка 1 - маркер, снизу вверх: 100, 250, 500, 750, 1000 п.о., соответственно; дорожки 2-10 - тестируемые мутанты; дорожка 11 - положительный контроль (плазмида pZmU3-gRNA-C1 или pJIT163Ubi-Cas9).
На фиг. 6 показан сайт-направленный мутагенез эндогенного гена AtPTPA Arabidopsis посредством системы транзиентной экспрессии gRNA:Cas9 в протопластах. a) Представляет собой гельэлектрофореграмму. Дорожка 1 - маркер, снизу вверх: 100, 250, 500, 750, 1000, 2000, 3000, 5000 п.о., соответственно; дорожка 2 и дорожка 3 - результаты расщепления нуклеазами рестрикции EcoRV ПЦР-продуктов ДНК протопластов, где протопласты были трансформированы с использованием системы gRNA:Cas9; дорожка 4 -результат расщепления EcoRV ПЦР-продукта ДНК протопласта дикого типа; дорожка 5 - ПЦРпродукт протопласта дикого типа. b) Результаты секвенирования неразрезанных полосок.
На фиг. 7 показан сайт-направленный мутагенез эндогенного гена AtPTPA Arabidopsis посредством системы транзиентной экспрессии gRNA:Cas9 через подход погружения соцветий. a) Представляет собой гельэлектрофореграмму. Дорожка 1 - маркер, снизу вверх: 100, 250, 500, 750, 1000, 2000, 3000, 5000 п.о., соответственно; дорожка 2-9 -результаты расщепления нуклеазами рестрикции EcoRV ПЦР-продуктов мутантов; дорожка 10 - результат расщепления EcoRV ПЦР-продукта контроля дикого типа. b) Результаты секвенирования некоторых мутантов.
Фиг. 8 представляет собой гельэлектрофореграмму амплификации генов-мутантов AtPTPA с участием праймеров на векторе pHSN401-C2. a) Результат амплификации с участием пары праймеров pHSN401-1F/C2R; b) Результат амплификации с участием пары праймеров CAS9-2F/CAS9-2R. Дорожка 1 - маркер, снизу вверх: 100, 250, 500, 750, 1000, 2000, 3000, 5000 п.о., соответственно; дорожки 2-9 - тестируемые мутанты; дорожка 10 -положительный контроль (плазмида pHSN401).
На фиг. 9 представлены мутации в потомках генов-мутантов AtPTPA. Дорожка 1 -маркер, снизу вверх: 100, 250, 500, 750, 1000, 2000, 3000, 5000 п.о., соответственно; дорожки 2, 3, 4, 5 - потомки гомозиготных мутантов; дорожки 6, 7 - потомки дикого типа, полученные путем сегрегации; дорожки 8, 9, 10 - потомки гетерозиготных мутантов.
Подробное описание вариантов осуществления изобретения
Все экспериментальные методы, использованные в следующих примерах, представляют собой традиционные методы, если не указано иное.
Все материалы и реагенты, использованные в следующих примерах, можно получить из коммерче- 5 039511 ских источников, если не указано иное.
Экспрессионный вектор pZmU3-gRNA был раскрыт в Liang., Y. и соавт. Таргетированный мутагенез в Zea mays с использованием TALENs и системы CRISPR/Cas. Journal of Genetics and Genomics.
41:63-68,(2014).
Экспрессионный вектор pJIT163-Ubi-Cas9 был раскрыт в Wang, Y. и соавт. Совместное редактирование трех гомеоаллелей в гексаплоидной мягкой пшенице придает наследуемую устойчивость к мучнистой росе. Nature Biotechnology. 32, 947-951 (2014).
Экспрессионные векторы pHSN401 и pBUE411 были раскрыты в Xing, Н. и соавт. Набор CRISPR/Cas9 для мультиплексного редактирования геномов в растениях. ВМС Plant Biology. 14:327, (2014).
Кукуруза сорта Hill была раскрыта в Armstrong, C.L., Green, С.Е. & Phillips, R.L. Создание и доступность идиоплазмы с высоким уровнем формирования культур класса II. Maize Genet. Coop. News Lett. 65,92-93 (1991).
Кукуруза сорта B73 была раскрыта в Russell, W.A. Регистрация родительских линий В70 и В73 кукурузы. Crop Sci. 12, 721 (1972).
Кукуруза сорта Zheng58 была раскрыта в Zhang Falin, Селекция и использование инбредной линии Zheng58 кукурузы. Crop Journal, 2001 (4):31-31.
Arabidopsis thaliana экотипа Columbia был раскрыт в Koomeef, М. и соавт. Генетическая карта Агаbidopsis thaliana. Journal of Heredity. 74,265-272 (1983).
Среда MS: 4,43 г/л MS солей (Sigma, M5524), 30 л сахарозы, 3 г/л фитогеля, pH 5,7, автоклавировали при 121 °C в течение 20 мин.
Среда LB: 10 г/л триптона, 5 г/л экстракта дрожжей, 10 г/л NaCl, pH 7,0 (для уплотнения среды LB на литр жидкой среды добавляли 15 г агара), автоклавировали при 121 °C в течение 20 мин.
Растворы, использованные для приготовления и трансформации протопластов, представлены в табл. 1-6.
Таблица 1. 50 мл раствор для энзимолиза Arabidopsis
Добавляемое количество Окончательная концентрация
Целлюлоза R10 0,75 г 1,5%
Мацерозим R10 0,15 г 0,3%
Маннитол 3,6434 г 0,4 М
2-(N- морфолино)этансульфоновая кислота 0,2132 г 20 мМ
КС1 07074 г 20мМ
доводили раствор водой двойной дистилляции до 50 мл, pH регулировали до 5,7 с помощью КОН; инкубировали на водяной бане при 55°С в течение 10 мин и охлаждали при комнатной температуре перед добавлением
СаС12 0,0735 г 10 мМ
BSA 0,05 г 0,1%
фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм
Таблица 2. 50 мл раствор для энзимолиза кукурузы
Добавляемое количество Окончательная концентрация
Целлюлоза R10 0,75 г 1,5%
Мацерозим R10 0,15 г 0,3%
Маннитол 5,4651 г 0,6 М
2-(N- морфолино)этансульфоновая кислота 0,1066 г 10 мМ
доводили раствор водой двойной дистилляции до 50 мл, pH регулировали до 5,7 с помощью КОН; инкубировали на водяной бане при 55°С в течение 10 мин и охлаждали при комнатной температуре перед добавлением
СаС12 0,00735 г 1 мМ
BSA 0,05 г 0,1%
фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм
Таблица 3. 500 мл W5
Добавляемое количество Окончательная концентрация
NaCl 4,5 г 154 мМ
СаС12 9,189 г 125 мМ
КС1 0,1864 г 5 мМ
2-(N- морфолино)этансульфоновая кислота 0,4264 г 4 мМ
доводили раствор водой двойной дистилляции до 500 мл, pH регулировали до 5,7 с помощью NaOH
-6039511
Таблица 4. 250 мл раствор WI
Добавляемое количество Окончательная концентрация
Маннитол 27,34 г 0,6 М
КС1 0,0745 г 4 мМ
2-(N- морфолино)этансульфоновая кислота (200 мМ) 0,2135 г 4 мМ
доводили раствор водой двойной дистилляции до 250 мл, pH регулировали до 5,7 с помощью КОН
Таблица 5. 10 мл раствор MMG
Добавляемое количество Окончательная концентрация
Маннитол (0,8 М) 5 мл 0,4 М
MgCl2 (1 М) 0,15 мл 15 мМ
2-(N- морфолино)этансульфоновая кислота (200 мМ) 0,2 мл 4 мМ
Вода двойной дистилляции до 10 мл
Таблица 6. 4 мл раствор PEG
Добавляемое количество Окончательная концентрация
PEG4000 1,6 г 40%
Маннитол (0,8 М) 1 мл 0,2 М
СаС12 (1 М) 0,4 мл 0,1 м
Вода двойной дистилляции до 4 мл
В табл. 1-6, выше, % раствора означает количество единиц массы в единице объема, г/100 мл.
Трансформация Agrobacterium tumefaciens:
1) компетентные клетки (хранили при -80°C) оттаивали на льду, затем добавляли 2 мкг плазмидной ДНК и перемешивали, смесь помещали на 30 мин на лед;
2) пробирку типа Эппендорф погружали в жидкий азот на 1 мин и быстро переносили в водяную баню при 37°C для оттаивания (2 мин);
3) затем добавляли 1 мл жидкой среды LB и инкубировали при 28°C в течение 4-5 ч при низкой скорости перемешивания (150 об/мин);
4) бактериальные клетки собирали путем центрифугирования 30 с при частоте 10000 об/мин, супернатант сливали и 100 мкл ресуспендированных бактериальных клеток помещали в планшеты с селективной средой, содержащей соответствующие антибиотики;
5) планшеты инкубировали перевернутыми при 28°C до появления белых колоний (трансформантов).
Пример 1. Сайт-направленное редактирование эндогенного гена ZmIPK кукурузы при помощи подхода с использованием прорастающих пыльцевых трубок и подхода на основе регенерации стеблевых апексов
I. Дизайн целевого фрагмента: мишень-С1.
Мишень-d: 5'47CGAGCTCGACCACGCCGCCGAC-3'; (положение 393-415 гена ZmIPK, как показано в GenBank, код доступа AY172635).
II. Приготовление плазмиды pZmU3-gRNA и плазмиды pBUE411, содержащих сайт C1.
C1 представляет собой последовательность ДНК для синтеза РНК, которая может комплементарно связываться с мишенью-d.
Были синтезированы следующие одноцепочечные олигонуклеотиды с липкими концами (подчеркнуты):
C1-1F: 5'-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3';
С1-2F: 5'-GGCGGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3';
C1R: 5'-AAACAGCTCGACCACGCCGCCGAC-3'.
Путем отжига C1-1F и C1R формировали двухцепочечную ДНК с липкими концами и инсерцировали между двумя сайтами рестрикции BbsI в плазмиду pZmU3-gRNA, в результате чего получали плазмиду pZmU3-gRNA, содержащую сайт C1. Положительную плазмиду выявляли путем секвенирования. Рекомбинантная плазмида, которая была получена в результате инсерции фрагмента ДНК, как показано в 5'-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3', в направлении вверх по течению в сайте рестрикции BbsI плазмиды pZmU3-gRNA, была положительной и была обозначена как pZmU3-gRNA-C1.
Путем отжига C1-2F и C1R формировали двухцепочечную ДНК с липкими концами и инсерцировали между двумя сайтами рестрикции BbsI в плазмиду pBUE411, в результате чего получали плазмиду pBUE411, содержащую сайт C1. Положительную плазмиду выявляли путем секвенирования. Рекомби- 7 039511 нантная плазмида, которая была получена в результате инсерции фрагмента ДНК, как показано в 5'GGCGGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3', в направлении вверх по течению в сайте рестрикции BbsI плазмиды pBUE411, была положительной и была обозначена как pBUE411-C1.
III. Введение системы gRNA:Cas9 в протопласты кукурузы.
Вектор pJIT163-Ubi-Cas9 и плазмиду pZmU3-gRNA-C1, полученную на этапе II, вводили в протопласты кукурузы. Этот специфический процесс включает:
1. Выращивание сеянцев кукурузы.
Семена кукурузы гибридного сорта HiII и инбредных линий B73 и Zheng58 на ночь замачивали в воде и переносили в планшет с абсорбирующей бумагой (с добавлением воды), выдерживали в условиях освещенности в течение 3 дней для прорастания. Проросшие семена растили в почве при 24°C в течение 10-11 дней, в результате получали сеянцы кукурузы.
2. Выделение протопластов.
1) Брали нежные листья кукурузы, из средней части листьев нарезали 0,5-1 мм нити с помощью лезвия, которые помещали в 50 мл раствор для энзимолиза на 5 ч для расщепления (0,5 ч энзимолиз проводили в вакууме, затем 4,5 ч при медленном встряхивании при 10 об/мин).
Примечание: температура в течение энзимолиза должна поддерживаться в пределах 20-25°C, реакция должна осуществляться в темноте; после реакции раствор следует аккуратно встряхивать для высвобождения протопластов.
2) Продукт энзимолиза растворяли путем добавления 30 мл W5 и фильтровали в 50 мл круглодонной центрифужной пробирке с использованием нейлоновой фильтровальной мембраны с размером пор 75 мкм.
Примечание: перед использованием нейлоновую фильтровальную мембрану следует погрузить в 75% (объемный процент) этанола, промыть водой и затем намочить в W5 в течение 2 мин.
3) Проводили центрифугирование (150 г, 3 мин, 23°C) и сливали супернатант.
4) Пеллету суспендировали в 10 мл W5, центрифугировали (150 г, 3 мин), супернатант сливали.
5) Протопласты суспендировали путем добавления необходимого количества раствора MMG и помещали на лед до трансформации.
Примечание: концентрацию протопластов необходимо определять путем микроскопии (х100). Количество протопластов составило от 2х105/мл до 1x10 6/мл.
3. Трансформация протопластов кукурузы.
1) 10 мкг вектора pJIT163-2NLSCas9 и 10 мкг плазмиды pZmU3-gRNA-C1 вносили в 2 мл цетрофужную пробирку. С помощью пипетки прибавляли 200 мкл протопластов, содержимое смешивали, слегка постукивая по пробирке пальцем, и отстаивали в течение 3-5 мин. Затем прибавляли 220 мкл раствора PEG4000 и перемешивали, слегка постукивая по пробирке пальцем. Трансформацию проводили в темноте в течение 15 мин;
2) Прибавляли 880 мкл W5 (комнатной температуры) и перемешивали путем реверсивного вращения, проводили центрифугирование (100 г, 3 мин), супернатант сливали;
3) Прибавляли 1 мл раствора WI и перемешивали путем реверсивного вращения, затем содержимое аккуратно переносили в 6-луночный культуральный планшет (с заранее добавленным в луночки 1 мл раствора WI) и культивировали при 23°C на протяжении ночи.
IV. Проведение ПЦР/RE-экспериментов для анализа мутагенеза эндогенного гена ZmIPK кукурузы с использованием системы gRNA:Cas9.
Через 48 ч после трансформации протопластов кукурузы экстрагировали геномную ДНК, которую использовали в качестве матрицы для проведения ПЦР/RE (полимеразная цепная реакция/рестриктное расщепление). Одновременно протопласты кукурузы сорта HiII дикого типа использовали в качестве контроля. Анализ методом ПЦР/RE основывается на работе Shan, Q. и соавт. Быстрая и эффективная модификация генов риса и Brachypodium с использованием TALENs. Molecular Plant (2013). Поскольку целевой фрагмент (код доступа, GenBank: AY172635, положения 393-415) эндогенного гена ZmIPK кукурузы (код доступа, GenBank: AY172635) содержит последовательность узнавания (5'-GAGCTC-3') эндонуклеазы рестрикции SacI, то эндонуклеазу рестрикции SacI использовали в эксперименте по проведению ПЦР/RE-теста. Для проведения ПЦР-амплификации использовались следующие праймеры:
ZmIPK-1F: 5 '-TCGCAGCCCCTGGCAGAGCАА-3';
ZmIPK- 1R: 5'-GAGACCTGGGAGAAGGAGACGGATCC-3'.
Результаты ПЦР/RE экспериментов можно видеть на фиг. 1. Эти результаты показали, что в целевом участке гена ZmIPK происходили мутации, неразрезанные полоски были выделены и секвенированы, результаты секвенирования показали, что в целевом участке гена ZmIPK имела место инсерция/делеция (индел).
V. Сайт-специфическое редактирование эндогенного гена ZmIPK кукурузы посредством подхода с использованием прорастающих пыльцевых трубок.
Проникающие в клетки пептиды (CPPs) представляют собой класс коротких пептидов, способных доставлять в клетки макромолекулы (включая белки и нуклеиновые кислоты). Последние исследования
- 8 039511 показали, что проникающие в клетки пептиды, при связывании с ДНК, способны защитить ДНК от энзиматической деградации. Поэтому проникающие в клетки пептиды обычно применяют в подходе с использованием прорастающих пыльцевых трубок для улучшения эффективности подхода.
1) Приготовление раствора ДНК, содержащего CCPs: из плотного порошка CPPs (аминокислотная последовательность - RKKRRQRRRRKKRRQRRR, синтезированная Shanghai Bio-engineering Co., Ltd.) в стерилизованной воде приготовляли 30 мг/мл маточного раствора. CPPs добавляли в смесь из плазмид pZmU3-gRNA-C1 и pJIT163-Ubi-Cas9 (весовое соотношение pZmU3-gRNA-C1 к pJIT163-Ubi-Cas9 в смеси - 1:1) в весовом соотношении 1:1 пока окончательная концентрация ДНК и CPPs не составила 25-30 мкг/мл (суммарная окончательная концентрация обеих плазмид - 25-30 мкг/мл, окончательная концентрация CPPs - 25-30 мкг/мл).
2) В качестве растений-реципиентов в поле отобрали сильные растения кукурузы (HiII, B73 и Zheng58). После цветения на рыльца растений надевали защитные мешочки, чтобы избежать перекрестного опыления или самоопыления. В строго определенный срок проводили ручное опыление. Через 1821 ч после опыления защитные мешочки снимали, пестичные нити и кроющие литья обрезали до длины 2-3 см с верхней части оставленных початков. Поскольку площадь поперечного сечения среза у пестичных нитей несколько меньше, чем у кроющих листьев, то в результате между пестичными нитями и кроющими листьями образовывалось небольшое углубление, в которое пипеткой быстро закапывали 300-400 мкл раствора ДНК, получаемого на этапе 1). Пестичные нити оказывались погруженными в раствор ДНК, и на рыльца снова надевали защитные мешочки. В каждом эксперименте участвовало 40-50 початков кукурузы. После созревания зерен початки кукурузы собирали и сушили по отдельности.
3) Высушенные семена проращивали и после прорастания семян проводили детекцию мутантов гена ZmIPK методом ПЦР-RE (что касается конкретных шагов и используемых праймеров, см. IV).
Мутанты получали посредством подхода с использованием прорастающих пыльцевых трубок для растений кукурузы различных генотипов. Результаты детекции некоторых мутантов представлены на фиг. 2-4 и показывают, что мутации происходили внутри целевого участка гена гена ZmIPK у разных сортов кукурузы. Неразрезанные полоски были выделены и секвенированы, результаты секвенирования показали, что в целевом участке гена ZmIPK имела место инсерция/делеция (индел). Таким образом, показано, что мутанты можно получать на уровне целого растения посредством подхода с использованием прорастающих пыльцевых трубок по данному изобретению, независимо от генотипа растения или растения-реципиента.
VI. Сайт-направленное редактирование эндогенного гена ZmIPK кукурузы при помощи подхода на основе регенерации стеблевых апексов
1. Приготовление материалов кукурузы.
1) Семена кукурузы инбредной линии HiII помещали в треугольную колбу, стерилизовали 70% (объемных процентов) спиртом в течение 5 мин и 5% (объемных процентов) раствором гипохлорита натрия в течение 30 мин, затем промывали в пяти порциях стерильной воды. Добавляли 1,5 объема воды, колбу герметично закрывали и инкубировали в течение 4-6 ч при 28°C.
2) Вторая стерилизация. Семена стерилизовали 5% (объемных процентов) раствором гипохлорита натрия в течение 30 мин, после чего промывали в пяти порциях стерильной воды.
3) Стерилизованные семена помещали в стерилизованный планшет с фильтровальной бумагой, инкубировали при температуре 28°C в течение 3-4 дней в условиях темноты для прорастания. Проросшие семена однородного роста переносили на среду MS и культивировали в темноте при 28°C в течение 3-4 дней до достижения проростками высоты 4-5 см.
2. Регенерация стеблевых апексов кукурузы.
1) Разрезание почек: на стеблях выполняли поперечные надрезы на расстоянии 1,5-2 мм выше узлов кущения, раскрывая почки внутри стебля. Затем почки разрезали по центру в продольном направлении на расстоянии 0,2 мм ниже узлов кущения (либо по узлам кущения). Сохраняли около 0,8 мм корней.
2) Плазмиду pBUE411-C1, содержащую C1, трансформировали в Agrobacterium-компетентную клетку AGL1. После верификации методом ПЦР и рестриктного расщепления растения инфицировали путем использования положительного штамма.
3) Положительный штамм помещали в планшет, содержащий твердую среду LB, и культивировали в темноте при 28°C в течение 2 дней. Некоторое количество бактерий соскребали в 20 мл жидкую MSсреду, культивировали при 28°C до OD600=0,8. Затем добавляли 200 мкМ ацетосирингона.
4) Надрезанные растения помещали в планшет надрезами вниз. Планшет помещали наклонно (3045°C) в вакуумное устройство; добавляли раствор Agrobacterium для покрытия надрезов и выдерживали 20 мин, чтобы вызвать инфицирование. Во время инфицирования проводили вакуумирование в течение 10 мин, давление 0,05 МР.
5) После инфицирования растения извлекали из раствора Agrobacterium (избыточный раствор Agrobacterium на растениях удаляли с помощью фильтровальной бумаги) и помещали в MS-среду, культивировали в темноте при 23°C в течение 3 дней.
6) После культивирования материалы извлекали и промывали, чтобы удалить среду, и после этого растили в горшке (4/5 обычной почвы и сверху 1/5 вермикулита). После пересадки сеянцы культивиро-
- 9 039511 вали при 28°C в темноте в течение 2 дней, затем 7-10 дней на свету и после этого при нормальных условиях до плодоношения. Полученные семена кукурузы растили и тестировали по гену ZmIPK посредством метода ПЦР-RE после прорастания.
Результаты показали, что в целевом участке гена ZmIPK происходили мутации. Неразрезанные полоски выделяли для секвенирования. Результаты секвенирования показали, что в гене ZmIPK имела место инсерция/делеция (индел).
VII. Определение присутствия pZmU3-gRNA-C1 и pJIT163-Ubi-Cas9 в мутантах кукурузы, полученных посредством подхода с использованием прорастающих пыльцевых трубок.
Проводили дизайн двух наборов праймеров согласно последовательностям плазмиды pZmU3gRNA-C1 и плазмиды pJIT163-Ubi-Cas9 для амплификации обеих плазмид, соответственно.
ZmU3-F/CIR располагался между ZmU3 и целевым фрагментом:
ZmU3 -F: 5 '-CTGCCAAGATCAACAGCААССА-3';
CIR: 5'-AAACAGCTCGACCACGCCGCCGAC-3'.
Теоретически, амплифицированный фрагмент доложен быть длиной около 322 п.о., а последовательность должна быть в положении 467-788 SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 1 представляет собой последовательность pZmU3-gRNA-C1.
Cas9-1F/Cas9-1R располагался на векторе pJIT163-Ubi-Cas9:
Cas9-1F: 5'-CTTCCCAAGCATTCCCTCCTGT-3';
Cas9-1R: 5'-CTTATGCCGTCCCATGACCTTC-3'.
Теоретически, амплифицированный фрагмент доложен быть длиной около 744 п.о., а последовательность должна быть в положении 1573-2316 SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 2 представляет собой последовательность pJIT163-Ubi-Cas9.
Целевые полоски не были амплифицированы для всех растений (фиг. 5), что свидетельствует о том, что способ по настоящему изобретению препятствует инсерции или переносу трансгена при осуществлении сайт-направленной модификации растения, и что получаемый мутант обладает относительно более высокой биобезопасностью.
VIII. Определение присутствия pBUE411-C1 в мутантах кукурузы, получаемых при помощи подхода на основе регенерации стеблевых апексов
Проводили дизайн двух наборов праймеров согласно последовательности плазмиды pBUE411-C1 для амплификации OsU3p и Cas9, соответственно.
pBUE411-1F/C1R располагался между OsU3p и целевым фрагментом:
pBUE411 -IF: 5'-GACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTAC-3';
CIR: 5'-AAACAGCTCGACCACGCCGCCGAC-3'.
Теоретически, амплифицированный фрагмент доложен быть длиной около 289 п.о., а последовательность должна быть в положении 174-462 SEQ ID NO: 3. SEQ ID NO: 3 представляет собой последовательность gRNA pBUE411-C1.
CAS9-2F/CAS9-2R располагался в области Cas9 на векторе pBUE411-C1:
CAS9-2F: 5'-CTCCCTAAGCACTCGCTCCTGT-3';
CAS9-2R: 5'-TTCTGCGTGGTCTGATTCTCCC-3'.
Теоретически, амплифицированный фрагмент доложен быть длиной около 794 п.о., а последовательность должна быть в положении 1639-2432 SEQ ID NO: 4. SEQ ID NO: 4 представляет собой последовательность Cas9 pHSN411-C1.
Целевые полоски не были амплифицированы для всех растений, что свидетельствует о том, что способ по настоящему изобретению препятствует инсерции или переносу трансгена при осуществлении сайт-направленной модификации растения, и что получаемый мутант обладает относительно более высокой биобезопасностью.
При мер 2. Сайт-направленное редактирование эндогенного гена AtPTPA Arabidopsis посредством подхода на основе погружения соцветий.
I. Дизайн целевого фрагмента: мишень-C2.
Мишень-C2:5ACGACGATATCCGCCGATTTCAC-3'. (положение 351-373 гена, AtPTPA, код доступа, GenBank: AF360133).
II. Приготовление плазмиды pHSN401, содержащей фрагмент C2.
C2 представляет собой последовательность ДНК для синтеза РНК, которая может комплементарно связываться с мишенью-C2.
Были синтезированы следующие одноцепочечные олигонуклеотиды с липкими концами (подчеркнуты):
C2F: 5'-ATTGGTGAAATCGGCGGATATCGT-3';
C2R: 5'-AAACACGATATCCGCCGATTTCAC-3'.
- 10 039511
Путем отжига олигонуклеотидов формировали двухцепочечную ДНК с липкими концами и инсерцировали между двумя сайтами рестрикции BsaI в плазмиду pHSN401, в результате чего получали плазмиду pHSN401, содержащую сайт C2. Положительную плазмиду выявляли путем секвенирования. Рекомбинантная плазмида, которая была получена в результате инсерции фрагмента ДНК, как показано в 5'-ATTGGTGAAATCGGCGGATATCGT-3', в направлении вверх по течению в сайте рестрикции BsaI плазмиды pHSN401, была положительной и была обозначена как pHSN401-C2.
III. Введение системы gRNA:Cas9 в протопласты Arabidopsis.
Плазмиду pHSN401-C2, получаемую на этапе II, вводили в протопласты Arabidopsis экотипа Columbia. Этот специфический процесс включает:
1. Выращивание сеянцев Arabidopsis.
1) Обработка семян: Семена Arabidopsis экотипа Columbia помещали в 1,5 мл колбу и замачивали в 75% (объемных процентов) спирте в течение 1 мин и 10% (объемных процентов) растворе гипохлорита натрия в течение 15 мин, затем промывали в 5-6 порциях стерильной воды.
2) Стерилизованные семена, каждое в отдельности, с помощью микропипетки переносили в планшет, содержащий среду MS. Планшеты герметично закрывали и держали 3-4 дня при 4°C для яровизации.
3) После яровизации планшеты переносили в инкубатор, культивировали при следующих условиях: 25±2°C, освещенность 5500±300 люкс, световой режим 12 ч день/ночь. Через 3 недели сеянцы пересаживали.
4) Сеянцы аккуратно пересаживали в грунт (торф: вермикулит: перлит = 1:1:1), накрывали пленкой на 3-4 дня, после этого культивировали при 21°C, освещенность 6300±300 люкс.
2. Выделение протопластов.
1) Брали нежные листья Arabidopsis экотипа Columbia (выращиваемого около 1 месяца) и нарезали 0,5 мм нити с помощью лезвия, которые помещали в 50 мл раствор для энзимолиза на 5 ч для расщепления (0,5 ч энзимолиз проводили в вакууме, затем 4,5 ч при медленном встряхивании при 10 об/мин).
Примечание: температура в течение энзимолиза должна поддерживаться в пределах 20-25°C, реакция должна осуществляться в темноте; после реакции раствор следует аккуратно встряхивать для высвобождения протопластов.
2) Продукт энзимолиза растворяли путем добавления 30 мл W5 и фильтровали в 50 мл круглодонной центрифужной пробирке с использованием нейлоновой фильтровальной мембраны с размером пор 75 мкм.
Примечание: перед использованием нейлоновую фильтровальную мембрану следует погрузить в 75% (объемный процент) этанола, промыть водой и затем замочить в W5 в течение 2 мин.
3) Проводили центрифугирование (60 г, 5 мин, 23°C) и сливали супернатант.
4) Пеллету ресуспендировали в 10 мл W5 аккуратным встряхиванием; центрифугировали (60 г, 5 мин) и супернатант сливали.
5) Протопласты суспендировали путем добавления необходимого количества раствора MMG и помещали на лед до трансформации.
Примечание: концентрацию протопластов необходимо определять путем микроскопии (х100). Количество протопластов составило от 2х105/мл до 1х106/мл.
3. Трансформация протопластов Arabidopsis.
1) 20 мкг плазмиды pHSN401-C2 вносили в 2 мл цетрифужную пробирку. С помощью пипетки прибавляли 200 мкл протопластов, полученных на этапе 2, содержимое смешивали, слегка постукивая по пробирке пальцем. Затем прибавляли 250 мкл PEG4000 и перемешивали, слегка постукивая по пробирке пальцем. Трансформацию проводили в темноте в течение 15-30 мин.
2) Прибавляли 880 мкл W5 (комнатной температуры) и перемешивали путем реверсивного вращения, проводили центрифугирование (60 г, 5 мин), супернатант сливали.
3) Прибавляли 1 мл W5 и перемешивали путем реверсивного вращения, затем содержимое аккуратно переносили в 6-луночный культуральный планшет (с заранее добавленным в луночки 1 мл W5) и после этого культивировали при 23°C на протяжении ночи.
IV. Проведение ПЦР/RE-экспериментов для анализа сайт-направленного мутагенеза эндогенного гена AtPTPA Arabidopsis с использованием системы gRNA:Cas9.
Через 48 ч после трансформации протопластов Arabidopsis экстрагировали геномную ДНК, которую использовали в качестве матрицы для проведения ПЦР/RE (полимеразная цепная реакция/рестриктное расщепление) экспериментального анализа. Анализ методом ПЦР/RE основывается на работе Shan, Q. и соавт. Быстрая и эффективная модификация генов риса и Brachypodium с использованием TALENs. Molecular Plant (2013). Поскольку целевой фрагмент (код доступа, GenBank: AF360133, положения 351-4373) эндогенного гена AtPTPA Arabidopsis (код доступа, GenBank: AF360133) содержит последовательность узнавания (5'-GATATC-3') эндонуклеазы рестрикции EcoRV, то эндонуклеазу рестрикции EcoRV использовали в эксперименте по проведению ПЦР/КБ-теста. Для проведения ПЦРамплификации использовались следующие праймеры:
- 11 039511
PTPA-F: 5'-GATGCTCCAGCCACCATATC-3';
PTPA-R: 5'-CAGTTCGGTACACCACTTATATCA-3'.
Результаты ПЦР/RE экспериментов можно видеть на фиг. 6. Эти результаты показали, что в целевом участке гена AtPTPA происходили мутации, неразрезанные полоски, показанные на фиг. 6, были выделены и секвенированы, результаты секвенирования показали, что в целевом участке гена AtPTPA имела место инсерция/делеция (индел).
V. Сайт-специфическое редактирование эндогенного гена AtPTPA Arabidopsis посредством подхода на основе погружения соцветий:
1) Приготовление материалов Arabidopsis.
Почки Arabidopsis удаляли при первом цветении, чтобы стимулировать ветвление.
2) Плазмиду pHSN401-C2, содержащую С2, трансформировали в Agrobacterium-компетентную клетку GV3101. После верификации методом ПЦР и рестриктного расщепления растения инфицировали путем использования положительного штамма.
3) Положительный штамм Agrobacterium помещали в 2 мл колбу на 8-10 ч, планшет затем переносили в 200 мл твердой среды LB (инокулированной в соотношении 1:100) и культивировали в течение ночи до OD600 около 0,8~1,0. Клетки Agrobacterium собирали путем центрифугирования в течение 15 мин и ресуспендировали в инфекционный буфер (2,16 г/л MgCl2-6H2O, 5% сахароза, 0,02% silwet L-77) для заражения растений.
4) Соцветия Arabidopsis погружали в 100 мл инфекционный буфер, содержащийся в большой плашке, на 2 мин при постоянном вращении растений. После инфицирования избыточный раствор Agrobacterium на растениях удаляли с помощью фильтровальной бумаги. Растения накрывали черным пластиковым мешком или пленкой на 24 ч в условиях темноты. Поскольку период цветения Arabidopsis относительно продолжительный, обычно требуются 2-3 заражения.
5) Растения растили в нормальных условиях. Семена Т1 собирали и проращивали. После прорастания ген AtPTPA тестировали методом ПЦР-RE (что касается конкретных шагов и используемых праймеров, см. IV). Из 500 полученных растений 20 были мутантами по гену AtPTPA. В качестве контроля использовали Arabidopsis экотипа Columbia дикого типа.
Результаты, представленные на фиг. 7, показывают, что в целевом участке гена AtPTPA происходили мутации. Неразрезанные полоски на фиг. 7 выделяли и секвенировали. Результаты секвенирования показали, что в целевом участке гена гена AtPTPA имела место инсерция/делеция (индел).
6) В отношении 20 мутантов, полученных на этапе 5), проводили ПЦР, чтобы определить в них присутствие pHSN401-C2. Для амплификации проводили дизайн 2 наборов праймеров (мишень в отношении U6-26p и Cas9, соответственно).
pHSN401-1F/C2R располагался между U6-26p и целевым фрагментом:
pHSN401-lF: 5'-TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC-3';
C2R: 5'-AAACACGATATCCGCCGATTTCAC-3'.
Теоретически, амплифицированный фрагмент доложен быть длиной около 286 п.о., а последовательность должна быть в положении 170-455 SEQ ID NO: 5. SEQ ID NO: 5 представляет собой часть последовательности gDNA в pHSN401-C2.
CAS9-2F/CAS9-2R располагался в области Cas9 вектора pHSN401-C2:
CAS9-2F: 5'-CTCCCTAAGCACTCGCTCCTGT-3';
CAS(-2R: 5'-TTCTGCGTGGTCTGATTCTCCC-3'.
Теоретически, амплифицированный фрагмент доложен быть длиной около 794 п.о., а последовательность должна быть в положении 1639-2432 SEQ ID NO: 4. SEQ ID NO: 4 представляет собой последовательность Cas9 в pHSN401-C2.
Гельэлектрофореграмма амплификации гена-мутанта AtPTPA Arabidopsis с использованием праймеров pHSN401-1F/C2R на pHSN401-C2 показана на фиг. 8a. Гельэлектрофореграмма амплификации гена-мутанта AtPTPA Arabidopsis с использованием праймеров CAS9-2F/CAS9-2R на pHSN401-C2 показана на фиг. 8b. Как можно видеть, целевые полоски не были амплифицированы у генов-мутантов AtPTPA Arabidopsis, полученных на этапе 5), что свидетельствует о том, что в мутантах отсутствовали фрагменты gDNA:Cas9.
7) Из потомства 20 мутантов, полученных на этапе 5), случайно отбирали 9 растений для анализа методом ГГЦР-RE. Результаты представлены на фиг. 9. Как можно видеть, приобретаемая мутация гена AtPTPA Arabidopsis может стабильно передаваться потомкам. Таким образом, способ по данному изобретению препятствует инсерции или переносу трансгена при осуществлении сайт-направленной модификации растения, что исключает общественные обеспокоенности относительно безопасности трансгенных продуктов. При этом также исключается процесс культуры тканей.
- 12 039511
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (12)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ создания мутантного нетрансгенного растения, состоящий из следующих этапов:
    транзиентной экспрессии последовательность-специфической нуклеазы в растении, характеризующейся тем, что в качестве объекта используется целое растение, и включающий:
    a) введения последовательность-специфической нуклеазы CRISPR-ассоциированной системы, которая расщепляет целевой фрагмент с достижением сайт-направленной модификации посредством саморепарации ДНК растения или генетического материала для экспрессии указанной последовательностьспецифической нуклеазы в растение через пыльцевую трубку, соцветие, стеблевой апекс или завязь, и
    b) выращивания растения, получаемого на этапе a), в отсутствие селективного давления, при этом последовательность-специфическая нуклеаза или генетический материал, не интегрировавшийся в хромосому растения, деградируется, таким образом, напрямую получая нетрансгенное T1 мутантное растение, содержащее сайт-направленную модификацию на уровне непосредственно целого растения, при этом отсутствует этап культивирования тканей;
    при этом генетический материал представляет собой рекомбинантный вектор или линейный фрагмент ДНК, либо РНК, транскрибированную in vitro.
  2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что последовательность-специфическая нуклеаза или генетический материал вводится через
    a) пыльцевую трубку, введение осуществляют путем инъекции раствора, содержащего рекомбинантный вектор или линейный фрагмент ДНК, либо РНК, транскрибированную in vitro, или раствора, содержащего последовательность-специфическую нуклеазу, в рыльце после опыления;
    b) соцветие, введение осуществляют путем погружения соцветия в раствор Agrobacterium tumefaciens, несущий рекомбинантный вектор или линейный фрагмент ДНК.
    c) стеблевой апекс, введение осуществляют путем погружения стеблевого апекса в раствор Agrobacterium tumefaciens, несущий рекомбинантный вектор или линейный фрагмент ДНК.
    d) завязь, введение осуществляют путем инъекции раствора, содержащего рекомбинантный вектор или линейный фрагмент ДНК, либо РНК, транскрибированную in vitro, или раствор, содержащий последовательность-специфическую нуклеазу, в завязь после опыления, либо путем инъекции раствора Agrobacterium tumefaciens, несущего рекомбинантный вектор или линейный фрагмент ДНК, в завязь после опыления.
  3. 3. Способ по любому из пп.1-2, отличающийся тем, что последовательность-специфическая нуклеаза CRISPR-ассоциированных систем представляет собой нуклеазу CRISPR/Cas9, генетический материал включает рекомбинантный вектор или фрагмент ДНК, способный транскрибировать направляющую РНК и экспрессировать белок Cas9; либо генетический материал включает рекомбинантный вектор или фрагмент ДНК, способный транскрибировать направляющую РНК, и рекомбинантный вектор или фрагмент ДНК, либо РНК, способные экспрессировать белок Cas9; либо генетический материал включает направляющую РНК, и рекомбинантный вектор или фрагмент ДНК, либо РНК, способные экспрессировать белок Cas9; при этом направляющая РНК представляет собой РНК палиндромной структуры, образующуюся путем частичного спаривания оснований между crPHK и tracrPHK, и crPHK содержит фрагмент РНК, способный комплементарно связываться с целевым фрагментом.
  4. 4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что сайт-направленная модификация представляет собой инсерцию, делецию и/или мутационную замену в целевом фрагменте.
  5. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в растении, получаемом на этапе b) функции гена-мишени утеряны и его геном свободен от интегрированного экзогенного гена.
  6. 6. Способ по любому из пп.1-5, отличающиеся тем, что растение представляет собой растение любого генотипа.
  7. 7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что растение выбирают из группы, включающей кукурузу, пшеницу, сою, хлопок, табак, Arabidopsis, рожь, Rosa roxbunghii, Eriobotrya japonica, Carica papaya, Rosa canina, Dendrobium nobile Lindl., Brassica oleracea, Fagopyrum tataricum и Hevea brasiliensis.
  8. 8. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что растение представляет собой кукурузу, последовательность-специфическая нуклеаза представляет собой нуклеазу CRISPR/Cas9, ген-мишень представляет собой ZmIPK.
  9. 9. Способ по п.8, отличающийся тем, что целевой фрагмент представляет собой 5'AGCTCGACCACGCCGCCGAC-3'; рекомбинантный вектор для транскрипции направляющей РНК получают путем инсерции фрагмента ДНК, представляющего собой 5'-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT3', между двумя сайтами рестрикции BbsI плазмиды pZmU3-gRNA; и рекомбинантный вектор для экспрессии нуклеазы CRISPR/Cas9 представляет собой pJIT163-Ubi-Cas9.
  10. 10. Способ по п.8, отличающийся тем, что целевой фрагмент представляет собой 5'AGCTCGACCACGCCGCCGAC-3'; рекомбинантный вектор для транскрипции направляющей РНК и экспрессии нуклеазы CRISPR/Cas9 получают путем инсерции фрагмента ДНК, представляющего собой 5'-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3', между двумя сайтами рестрикции BbsI плазмиды pBUE411.
    - 13 039511
  11. 11. Способ по любому из пп. 1 -6, отличающийся тем, что растение представляет собой Arabidopsis, последовательность-специфическая нуклеаза представляет собой нуклеазу CRISPR/Cas9, ген-мишень представляет собой AtPTPA.
  12. 12. Способ по п.11, отличающийся тем, что целевой фрагмент представляет собой 5'AGCTCGACCACGCCGCCGAC-3'; рекомбинантный вектор для транскрипции направляющей РНК и экспрессии нуклеазы CRISPR/Cas9 получают путем инсерции фрагмента ДНК, представляющего собой 5'-ATTGGTGAAATCGGCGGATATCGT-3', между двумя сайтами рестрикции BsaI плазмиды pHSN401.
EA201791681A 2015-01-27 2016-01-27 Способ сайт-направленной модификации целого растения посредством транзиентной экспрессии гена EA039511B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510040078 2015-01-27
PCT/CN2016/072352 WO2016119703A1 (zh) 2015-01-27 2016-01-27 一种通过基因瞬时表达对整株植物定点改造的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201791681A1 EA201791681A1 (ru) 2018-03-30
EA039511B1 true EA039511B1 (ru) 2022-02-04

Family

ID=56542435

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201791681A EA039511B1 (ru) 2015-01-27 2016-01-27 Способ сайт-направленной модификации целого растения посредством транзиентной экспрессии гена

Country Status (13)

Country Link
US (2) US11421241B2 (ru)
EP (2) EP3252162B1 (ru)
JP (1) JP2018503392A (ru)
KR (1) KR102046450B1 (ru)
CN (1) CN105821073B (ru)
AR (1) AR103539A1 (ru)
AU (1) AU2016212529B2 (ru)
BR (1) BR112017015988B1 (ru)
CA (1) CA2973903C (ru)
DK (1) DK3252162T3 (ru)
EA (1) EA039511B1 (ru)
ES (1) ES2945315T3 (ru)
WO (1) WO2016119703A1 (ru)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11859219B1 (en) 2016-12-30 2024-01-02 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of altering a target nucleotide sequence with an RNA-guided nuclease and a single guide RNA
CN106834341B (zh) * 2016-12-30 2020-06-16 中国农业大学 一种基因定点突变载体及其构建方法和应用
JP2020072645A (ja) * 2017-01-31 2020-05-14 日本たばこ産業株式会社 植物に物質を導入する方法
CN107164402B (zh) * 2017-05-31 2020-10-16 未名兴旺系统作物设计前沿实验室（北京）有限公司 一种基于CRISPR-Cas9系统的基因编辑载体及其应用
CN107287230B (zh) * 2017-08-03 2020-10-13 沈阳农业大学 一种质粒载体及其构建方法
WO2019103034A1 (ja) * 2017-11-27 2019-05-31 国立研究開発法人理化学研究所 ゲノム編集植物の生産方法
CN109929872A (zh) * 2017-12-18 2019-06-25 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种通过基因编辑技术创制番茄白果材料的方法
CN108374020A (zh) * 2017-12-28 2018-08-07 南京农业大学 一种改良的农杆菌介导大豆整体转化方法
MA51787A (fr) * 2018-02-05 2020-12-16 Vertex Pharma Substances et méthodes de traitement d'hémoglobinopathies
WO2019205919A1 (zh) * 2018-04-28 2019-10-31 青岛清原化合物有限公司 一种生物突变体库的构建方法
CN108642078A (zh) * 2018-05-18 2018-10-12 江苏省农业科学院 基于CRISPR/Cas9基因编辑技术选育绿豆开花传粉突变体的方法及专用gRNA
CN108866096B (zh) * 2018-07-26 2021-11-16 山东农业大学 大田蔷薇属植株上建立病毒诱导基因沉默体系的方法
CN111254159B (zh) * 2018-11-30 2023-03-31 东北农业大学 一种大豆GmST1基因突变体植株及其制备方法
US20230081632A1 (en) * 2020-02-28 2023-03-16 KWS SAAT SE & Co. KGaA Immature inflorescence meristem editing
CN111647620A (zh) * 2020-06-10 2020-09-11 北京市农林科学院 一种菜薹非转基因突变株的创制方法
CN112385539A (zh) * 2020-11-05 2021-02-23 贵州师范大学 一种果壳不破裂早熟优质黑米荞的选育方法
CN112501179B (zh) * 2020-11-12 2022-05-24 福建农林大学 GmPIN1基因突变调控大豆结瘤和密植的方法及其应用
CN113717982B (zh) * 2021-08-30 2023-09-01 山东大学 一种利用基因编辑敲除籽粒发育相关蛋白TaGSR1增加小麦籽粒长度的方法
CN113846075A (zh) * 2021-11-29 2021-12-28 科稷达隆(北京)生物技术有限公司 Mad7-nls融合蛋白、用于植物基因组定点编辑的核酸构建物及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103555711A (zh) * 2013-07-22 2014-02-05 安徽省农业科学院水稻研究所 一种主要农作物非转基因的基因组定向分子改良方法和应用
WO2014194190A1 (en) * 2013-05-30 2014-12-04 The Penn State Research Foundation Gene targeting and genetic modification of plants via rna-guided genome editing

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1288073C (en) 1985-03-07 1991-08-27 Paul G. Ahlquist Rna transformation vector
US5736369A (en) 1994-07-29 1998-04-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for producing transgenic cereal plants
US6051409A (en) 1995-09-25 2000-04-18 Novartis Finance Corporation Method for achieving integration of exogenous DNA delivered by non-biological means to plant cells
CA2306184C (en) 1997-11-18 2007-05-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods for genetic modification of plants
WO2000066746A1 (en) 1999-04-29 2000-11-09 Syngenta Limited Herbicide resistant plants
US6603061B1 (en) 1999-07-29 2003-08-05 Monsanto Company Agrobacterium-mediated plant transformation method
AU8786201A (en) 2000-09-29 2002-04-08 Syngenta Ltd Herbicide resistant plants
US20030135891A1 (en) 2001-12-04 2003-07-17 The Texas A&M University System Method of transforming intact plants
CN1681923B (zh) 2002-07-18 2010-06-02 孟山都技术有限公司 利用人工的多核苷酸及其组合物来减少转基因沉默的方法
AU2008305568B2 (en) 2007-09-27 2013-11-21 Corteva Agriscience Llc Engineered zinc finger proteins targeting 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase genes
JP2011120478A (ja) 2008-03-31 2011-06-23 Japan Tobacco Inc アグロバクテリウム菌による形質転換植物の作成方法
EA201391373A1 (ru) 2011-03-23 2014-07-30 Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. Способы получения сложного локуса трансгенных признаков
WO2013096567A2 (en) 2011-12-21 2013-06-27 Duke University The hsf-like transcription factor, tbf1, is a major molecular switch for growth-to-defense transition in plants
CN102558309B (zh) 2012-02-10 2014-09-17 浙江大学 一对转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
NZ701060A (en) * 2012-05-02 2016-10-28 Sangamo Biosciences Inc Targeted modification of malate dehydrogenase
EP2847338B1 (en) 2012-05-07 2018-09-19 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration of transgenes
GEP20217251B (en) 2012-05-25 2021-04-26 Charpentier Emmanuelle De Emanuel Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
CN105209624A (zh) 2013-03-15 2015-12-30 明尼苏达大学董事会 采用CRISPR/Cas系统的植物基因组的工程改造
WO2014199358A1 (en) 2013-06-14 2014-12-18 Cellectis Methods for non-transgenic genome editing in plants
CN103343120B (zh) 2013-07-04 2015-03-04 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种小麦基因组定点改造方法
CN103382468B (zh) 2013-07-04 2015-04-29 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种水稻基因组定点改造方法
US20160201072A1 (en) 2013-08-22 2016-07-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genome modification using guide polynucleotide/cas endonuclease systems and methods of use
WO2015066637A1 (en) 2013-11-04 2015-05-07 Dow Agrosciences Llc A universal donor system for gene targeting
US10787684B2 (en) 2013-11-19 2020-09-29 President And Fellows Of Harvard College Large gene excision and insertion
CN103667338B (zh) 2013-11-28 2016-01-27 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种玉米基因组定点改造方法
JP6715419B2 (ja) 2014-08-06 2020-07-01 トゥールジェン インコーポレイテッド カンピロバクター・ジェジュニｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓシステムに由来するｒｇｅｎを使用したゲノム編集
US10883111B2 (en) 2014-11-27 2021-01-05 Danziger Innovations Ltd. Nucleic acid constructs for genome editing
DE102015004187A1 (de) 2015-04-02 2016-10-06 Kws Saat Se Männlich sterile Pflanze der Gattung Triticum
CN106811479B (zh) 2015-11-30 2019-10-25 中国农业科学院作物科学研究所 利用CRISPR/Cas9系统定点修饰ALS基因获得抗除草剂水稻的系统及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014194190A1 (en) * 2013-05-30 2014-12-04 The Penn State Research Foundation Gene targeting and genetic modification of plants via rna-guided genome editing
CN103555711A (zh) * 2013-07-22 2014-02-05 安徽省农业科学院水稻研究所 一种主要农作物非转基因的基因组定向分子改良方法和应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIANG, Wenzhi; "Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing in ArabiDopsis thaliana and Inheritance of Modified Genes in the T2 and T3 Generations" PLOS ONE, vol. 9, no. 6, 11 June 2014 (11.06.2014), DOI: 10.1371/journal, pone.0099225, pages 1-10, see abstract, and page 1, column right, paragraph 2 for details *
LIANG, Zhen et al. "Targeted Mutagenesis in zea mays Using TALENs and the CRISPR/Cas System" Journal of Genetics and Genomics, vol. 41, no. 2, 20 February 2014 (20.02.2014), ISSN: 1673-8527, pages 63-68, see page 67, column left, paragraph 3, and SUPPLEMENTARY DATA Table S1 and Table S2 for details *
SHAN, Qiwei et al. "Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system" nature protocols, vol. 9, no. 10, 18 September 2014 (18.09.2014), DOI:10.1038/nprot. 2014.157, pages 2395-2410, see page 2397, column left, paragraph 1 for details *
VOYTAS, D.F. et al. "Precision Genome Engineering and Agriculture: Opportunities and Regulatory Challenges", PLOS biology, vol. 12, no. 6, 10 June 2014 (10.06.2014), DOI: 10.1371/jounal.pbio.1001877, pages 1-6, see page 4, Box 2 and page 2, column left, paragraph 2 for details *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20170098953A (ko) 2017-08-30
AU2016212529A1 (en) 2017-08-03
CN105821073B (zh) 2021-08-10
EP3252162B1 (en) 2023-03-01
JP2018503392A (ja) 2018-02-08
EA201791681A1 (ru) 2018-03-30
AR103539A1 (es) 2017-05-17
CA2973903A1 (en) 2016-08-04
US20180016589A1 (en) 2018-01-18
WO2016119703A1 (zh) 2016-08-04
EP4219730A1 (en) 2023-08-02
CA2973903C (en) 2024-03-12
EP3252162A1 (en) 2017-12-06
US11421241B2 (en) 2022-08-23
AU2016212529B2 (en) 2018-11-01
ES2945315T3 (es) 2023-06-30
US20220411810A1 (en) 2022-12-29
BR112017015988A2 (pt) 2018-03-20
BR112017015988B1 (pt) 2024-02-27
DK3252162T3 (da) 2023-06-06
CN105821073A (zh) 2016-08-03
EP3252162A4 (en) 2018-02-21
KR102046450B1 (ko) 2019-11-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220411810A1 (en) Method for conducting site-specific modification on entire plant via gene transient expression
JP2018502590A (ja) 一過性遺伝子発現により植物を正確に改変するための方法
JP2018508221A (ja) 植物ゲノムの部位特異的改変の実施に非遺伝物質を適用する方法
WO2022026403A2 (en) Removable plant transgenic loci with cognate guide rna recognition sites
US20230083144A1 (en) Inht30 transgenic soybean
US20220364105A1 (en) Inir12 transgenic maize
Namuddu et al. Agrobacterium mediated transformation of banana (Musa sp.) cv. Sukali Ndiizi (ABB) with a modified Carica papaya cystatin (CpCYS) gene
US11326177B2 (en) INIR12 transgenic maize
US11359210B2 (en) INIR12 transgenic maize
CA3188276A1 (en) Inir11 transgenic maize
US20230265445A1 (en) Removable plant transgenic loci with cognate guide rna recognition sites
US20210222190A1 (en) Cysdv resistance in members of the cucurbitaceae family
WO2024065009A1 (en) Methods of plant manipulation
Poddar Advancing enabling technology and genome editing in monocot crops for disease resistance and sustainability
EP4172342A2 (en) Removable plant transgenic loci with cognate guide rna recognition sites
CN118308418A (zh) 玉米基因dwf4和功能位点及其用途
AU2020295995A1 (en) Compositions and methods for improving pod shatter tolerance in canola