CN105821073B - 一种通过基因瞬时表达对整株植物定点改造的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通过基因瞬时表达对整株植物定点改造的方法。本发明提供的对整株植物中目的基因靶标片段进行定点改造的方法，包括如下步骤：以目的植物的整个植株为瞬时表达对象，在所述目的植物中瞬时表达特异于所述靶标片段的核酸酶，在所述核酸酶的作用下，所述靶标片段被剪切，再通过所述植物的自身DNA修复，最终实现对所述靶标片段的定点改造。本发明通过瞬时表达特异性核酸酶不仅省去了组织培养，在整株植物水平上获得突变；而且不依赖植物的基因型和受体范围，可广泛的应用于不同物种的不同品种之间；同时可以直接获得T1突变体并能将产生的突变稳定的遗传到后代，更为重要是产生的突变体植物里没有外源基因的整合，具有较高的生物安全性。

Description

一种通过基因瞬时表达对整株植物定点改造的方法
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，涉及一种通过基因瞬时表达对整株植物定点改造的方法。
背景技术
转基因是指利用分子生物学手段将外源基因转移到某种特定生物体中，使其生物性状或机能发生部分改变。1983年，世界上第一例转基因植物抗病毒烟草在美国培育成功后，转基因研究开始迅速发展；1986年，抗病毒棉花成功研制并在美国进入田间试验；1987年，抗虫基因、耐除草剂基因转入作物；1992年，中国商业化种植转基因烟草；1995年，加拿大开始商业化种植转基因抗除草剂油菜；1996年，转基因抗虫棉和耐除草剂大豆在美国大规模种植。目前全球已拥有120多种转基因植物，其中大豆、棉花、玉米等51种转基因作物已开始商品化生产。
进入21世纪，转基因问题受到越来越多的关注，主要是转基因食品安全性受到极大争议，各国政府对转基因生物安全管理愈加保守，对转基因作物市场化前的监控愈加严格：如果一项技术或产品被认为是转基因，将花费大量的时间与金钱对该技术或产品进行监管。国际CropLife调查发现，一项转基因事件的监督管理大约需要5.5年，花费约3500万美金才能投放市场。此外，已经市场化的转基因作物并不能被大众认可，如全球第一种允许上市的转基因番茄最终由于销量不佳而下架。因此，通过非转基因方法对作物进行改良具有重要意义。
当前对作物的遗传改良或基因修饰都有很多缺陷，例如，传统杂交育种方法需要多个世代，耗时费力，且受物种间生殖隔离限制和不良基因连锁的影响；物理或化学诱变方法，如辐射诱变，EMS诱变等，可以在基因组上随机产生大量突变位点，但是鉴定突变位点十分困难。
基因组定点修饰工具是近年来兴起的新技术，主要包括三大类型序列特异性核酸酶：锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)和成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR associated,CRISPR/Cas9system)。它们的共同特征是能够作为核酸内切酶切割特定的DNA序列，创造DNA双链断裂(Double-strand break,DSB)。DSB能够激活细胞内固有的修复机制非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)和同源重组(Homologous recombination,HR)对细胞中的DNA损伤进行修复，在修复过程中，对该特定的DNA序列进行定点编辑。
利用转基因技术将上述工具转入作物中，可以克服传统育种的效率低、耗时长、特异性差的缺点，但由于此过程涉及转基因，因此需要通过后代分离筛选出不含修饰工具的定点突变体，这是目前被认可的获得无转基因痕迹定点突变体的重要方法。由于此方法涉及到外源基因先要整合到植物基因组中，然后通过后代分离去除外源基因，因此，这种获得突变体的方法仍存在一定的争议，需要寻求更安全有效的方法避开转基因，同时对作物进行定点改造。
常规的转基因手段如农杆菌、基因枪、原生质体等方法需要组织培养，植物组织培养指从植物体分离出符合需要的组织、细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株。组织培养过程容易产生体细胞突变，同时受基因型和受体范围的限制，需要较长时间的培养才能得到植物体，耗费大量的人力、物力。原位转化则是指不需要组织或细胞培养手段而达到植物在活体而非离体状态下的转化。原位转化通常以整株植物为作用对象进行转化，如花粉管通道、花序浸染、茎尖再生、子房注射及农杆菌注射叶片等。原位转化可以避免组织培养过程，操作简单且不需要精良的实验室设备；同时此种方法不依赖植物基因型，可广泛的应用于不同物种的不同品种之间，并且可以直接获得转基因后代。所以，通过瞬时表达体系可以实现对植物基因组的改造，有利于基因编辑技术在植物上的有效利用。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过基因瞬时表达对整株植物基因组进行定点改造的方法。
本发明所提供的对植物目的基因中靶标片段进行定点改造的方法，具体可包括如下步骤：以目的植物的整个植株为瞬时表达对象，在所述目的植物中瞬时表达特异于所述靶标片段的核酸酶，所述核酸酶靶向并剪切所述靶标片段，再通过所述植物的自身DNA修复，完成对所述靶标片段的定点改造。同时此过程不涉及组织培养的过程。
在所述方法中，在所述目的植物中瞬时表达特异于所述靶标片段的核酸酶的方法包括如下步骤：直接向所述目的植物中导入特异于所述靶标片段的核酸酶或向所述目的植物中导入用于表达特异于所述靶标片段的核酸酶的遗传物质，将导入所述核酸酶或所述遗传物质后的植物在无选择压力的情况下种植生长，所述核酸酶或未整合在所述目的植物的染色体上的所述遗传物质被细胞降解；
所述遗传物质为重组载体(如DNA质粒)或DNA线性片段或体外转录的RNA。
在无选择压力情况下，植物自身的防御机制会抑制外源基因的进入并将已进入的外源基因降解。因而，将所述瞬时表达的整株植物体进行种植生长，外源基因(包括用于表达特异于所述靶标片段的核酸酶的遗传物质的任何片段)不会整合入植物基因组中，最终获得的植物体为非转基因的定点改造植物体。
在所述方法中，向所述目的植物中导入所述核酸酶或所述遗传物质时，在所述目的植物上的导入部位可为任何能够导入所述核酸酶或所述遗传物质的部位，具体如花粉管、花序、茎尖、子房或叶片等。
在一个实施方式中，当所述导入部位为花粉管时，按照包括如下步骤的方法进行导入：在授粉后向柱头注射所述重组载体或所述DNA线性片段或所述RNA的溶液或所述核酸酶的溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源的所述遗传物质或所述核酸酶导入受精卵细胞(即花粉管通道法)。
在一个实施方式中，当所述导入部位为花序时，按照包括如下步骤的方法进行导入：用含有所述重组载体或所述DNA线性片段的农杆菌浸染花序(即花序浸染法)。
在一个实施方式中，当所述导入部位为茎尖时，按照包括如下步骤的方法进行导入：用含有所述重组载体或所述DNA线性片段的农杆菌浸染茎尖(即茎尖再生法)。
在一个实施方式中，当所述导入部位为子房时，按照包括如下步骤的方法进行导入：在授粉后向子房注射所述重组载体或所述DNA线性片段或所述RNA的溶液或所述核酸酶的溶液，将外源的所述遗传物质或所述核酸酶导入受精卵细胞(即子房注射法)。
在一个实施方式中，当所述导入部位为子房时，按照包括如下步骤的方法进行导入：在授粉后向子房注射含有所述重组载体或所述DNA线性片段的农杆菌(即农杆菌子房注射法)。
在一个实施方式中，当所述导入部位为叶片时，可按照包括如下步骤的方法进行导入：用含有所述重组载体或所述DNA线性片段的农杆菌注射叶片(即叶盘法)。
在所述方法中，特异于所述靶标片段的所述核酸酶可为锌指核酸酶(ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9核酸酶等所有能实现基因组编辑的核酸酶。
在本发明的一个实施方式中，所述核酸酶具体为CRISPR/Cas9核酸酶。相应的，所述遗传物质为能转录向导RNA和表达Cas9蛋白的重组载体或DNA线性片段；或所述遗传物质由能转录向导RNA的重组载体或DNA线性片段(或分别转录crRNA和tracrRNA的两个重组载体或DNA线性片段)，以及能表达Cas9蛋白的重组载体或DNA线性片段或RNA组成；或所述遗传物质由向导RNA(或crRNA和tracrRNA)以及能表达Cas9蛋白的重组载体或DNA线性片段或RNA组成；所述向导RNA为由crRNA和tracrRNA通过部分碱基配对结合而成的具有回文结构的RNA；所述crRNA含有能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段。
在进一步的实施方式中，在所述重组载体或DNA线性片段中，启动所述向导RNA的编码核苷酸序列转录的启动子为U3启动子或者U6启动子。
更加具体的，所述能转录向导RNA和表达Cas9蛋白的重组载体为在pHSN401质粒的两个酶切位点BsaI之间正向插入所述“能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段”的编码核苷酸序列后得到的重组质粒，或在pBUE411质粒的两个酶切位点BsaI之间正向插入所述“能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段”的编码核苷酸序列后得到的重组质粒。所述转录向导RNA的重组载体为在pZmU3-gRNA质粒的两个酶切位点BbsI之间正向插入所述“能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段”的编码核苷酸序列后得到的重组质粒；所述表达Cas9蛋白的重组载体为pJIT163-Ubi-Cas9载体。
在本发明一个实施方式中，当特异于所述靶标片段的所述核酸酶为TALEN核酸酶时，所述用于表达特异于所述靶标片段的核酸酶的遗传物质可为同时表达成对TALEN蛋白的重组载体(DNA质粒)，或同时表达成对TALEN蛋白的DNA线性片段；或同时表达成对TALEN蛋白的RNA；所述TALEN蛋白由能够识别所述靶标片段并与其结合的DNA结合域和Fok I结构域组成；
在本发明一个实施方式中，当特异于所述靶标片段的所述核酸酶为锌指核酸酶时，所述用于表达特异于所述靶标片段的核酸酶的遗传物质可为同时表达成对ZFN蛋白的重组载体(DNA质粒)，或同时表达成对ZFN蛋白的DNA线性片段；或同时表达成对ZFN蛋白的RNA；所述ZFN蛋白由能够识别所述靶标片段并与其结合的DNA结合域和Fok I结构域组成。
在所述方法中，所述定点改造具体为：对植物基因组中的靶标片段的核苷酸进行插入突变、缺失突变和/或替换突变。在一个实施方式中，所述靶标片段在目的基因的编码区内。在一个实施方式中，所述靶标片段在目的基因的转录调控区如启动子内。在一个实施方式中，所述目的基因可以是结构基因或非结构基因。在一个实施方式中，所述改造导致所述目的基因丧失功能。在一个实施方式中，所述改造导致所述目的基因获得或改变功能。
在一些实施方式中，所述植物可为任何基因型的植物，不受基因型限制。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，例如，玉米、小麦、大豆、棉花、烟草、拟南芥、黑麦、刺梨、枇杷、番木瓜、狗蔷薇、金钗石斛、甘蓝、苦荞麦、橡胶树等。
当所述植物为单子叶植物或双子叶植物(如玉米、小麦、大豆、棉花、烟草等等)时，所述方法中采用的遗传物质或所述核酸酶导入方法可为花粉管通道法；当所述植物为单子叶植物或双子叶植物(如拟南芥、小麦、黑麦等等)时，所述方法中采用的遗传物质导入方法可为花序浸染法；当所述植物为单子叶植物或双子叶植物(如玉米、刺梨、枇杷、番木瓜、狗蔷薇等等)时，所述方法中采用的遗传物质导入方法可为茎尖再生法；当所述植物为单子叶植物或双子叶植物(如小麦、大豆、棉花、金钗石斛等等)时，所述方法中采用的遗传物质或所述核酸酶导入方法可为子房注射法；当所述植物为单子叶植物或双子叶植物(如烟草、甘蓝、苦荞麦、橡胶树等等)时，所述方法中采用的遗传物质导入方法可为叶盘法。
在本发明的一个实施方式(实施例1)中，所述植物为单子叶植物玉米(具体如玉米杂交种HiII及自交系B73、郑58等)；所述核酸酶为CRISPR/Cas9；所述目的基因为玉米内源基因ZmIPK；所述靶标片段为5’-AGCTCGACCACGCCGCCGAC-3’；所述转录向导RNA的重组载体具体为在pZmU3-gRNA质粒的两个酶切位点BbsI之间正向插入5’-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3’所示DNA片段后得到的重组质粒；所述表达Cas9蛋白的重组载体具体为pJIT163-Ubi-Cas9载体；所述转录向导RNA和表达Cas9蛋白的重组载体具体为在pBUE411质粒的两个酶切位点BsaI之间正向插入5’-GGCGGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3’所示DNA片段后得到的重组质粒。
在本发明的另一个实施方式(实施例2)中，所述植物为双子叶植物拟南芥；所述核酸酶为CRISPR/Cas9；所述目的基因为拟南芥内源基因AtPTPA；所述靶标片段为5’-ACGATATCCGCCGATTTCAC-3’；所述转录向导RNA和表达Cas9蛋白的重组载体具体为在pHSN401质粒的两个酶切位点BsaI之间正向插入5’-ATTGGTGAAATCGGCGGATATCGT-3’所示DNA片段后得到的重组质粒。
采用所述方法对待改造植物的目的基因中的靶标片段进行定点改造，从而使所述目的基因丧失功能后获得的突变植株或其后代(非转基因突变植株)也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了一种培育非转基因突变植物的方法。
该方法具体可包括如下步骤：采用如上所述方法对目的植物的目的基因中的靶标片段进行定点改造，进而获得所述目的基因丧失功能、且基因组中未整合外源基因的植物，即为所述非转基因突变植物。
在本发明中，所述转基因植物指外源基因整合入基因组中的植物；所述非转基因植物指外源基因未整合入基因组中的植物。
本发明将以整株植物为作用对象的瞬时表达体系与基因组编辑技术相结合，即利用花粉管通道、花序浸染、茎尖再生、子房注射及叶片侵染等方法将序列特异性核酸酶导入整株植物的细胞或组织中，通过序列特异性核酸酶的瞬时表达过程实现对植物基因组的改造，可以直接获得具有较高的生物安全性的突变体后代。以花粉管通道为例：利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道(花粉管引导组织)，将编码序列特异性核酸酶的DNA溶液或RNA溶液或序列特异性核酸酶的蛋白缓冲液导入受精卵细胞或生殖细胞(精子或卵子)，由于这些细胞仍处于未形成细胞壁的类似“原生质体”状态，并且正进行活跃的DNA复制、分离和重组，因此序列特异性核酸酶会对其进行高效地编辑，被改造的受精卵细胞或生殖细胞逐渐发育为新的突变体。由于编码序列特异性核酸酶的RNA或序列特异性核酸酶会被植物细胞降解，同时整个过程在无选择压力的情况下进行，使得编码序列特异性核酸酶的DNA也会被植物细胞降解，因此不涉及外源基因的整合，产生的突变体具有较高的生物安全性。
本发明的优势在于：不仅省去了组织培养，在整株植物水平上获得突变；而且不依赖植物的基因型和受体范围，可广泛的应用于不同物种的不同品种之间；同时可以直接获得T1突变体并能将产生的突变稳定的遗传到后代，更为重要的是产生的突变体植物里没有外源基因的整合，具有较高的生物安全性。
附图说明
图1为原生质体中瞬时表达gRNA：Cas9系统对玉米内源基因ZmIPK定点突变结果。其中，a为电泳图谱。Marker从下往上依次为(250、500、750、1000bp)；第1泳道为Marker，泳道2和3为导入了gRNA：Cas9系统的原生质体DNA的PCR产物经内切酶SacI酶切结果，泳道4为野生的原生质体DNA的PCR产物经内切酶SacI酶切结果，泳道5为野生型的原生质体PCR产物。b为部分突变体测序结果。
图2为在玉米品种HiII中利用花粉管通道方法瞬时表达gRNA：Cas9系统对玉米内源基因ZmIPK的定点突变及测序结果。其中，a为电泳图谱。Marker从下往上依次为(100、250、500、750、1000bp)；第1泳道为Marker，第2-12泳道为检测突变体PCR产物SacI酶切结果，第13泳道为野生型对照PCR产物经SacI酶切结果。b为部分突变体测序结果。
图3为在玉米品种B73中利用花粉管通道方法瞬时表达gRNA：Cas9系统对玉米内源基因ZmIPK的定点突变及测序结果。其中，a为电泳图谱。Marker从下往上依次为(100、250、500、750、1000bp)；第1泳道为Marker，第2-6泳道为检测突变体PCR产物SacI酶切结果，第7泳道为野生型对照PCR产物经SacI酶切结果。b为部分突变体测序结果。
图4为在玉米品种郑58中利用花粉管通道方法瞬时表达gRNA：Cas9系统对玉米内源基因ZmIPK的定点突变及测序结果。其中，a为电泳图谱。Marker从下往上依次为(100、250、500、750、1000bp)；第1泳道为Marker，第2-9泳道为检测突变体PCR产物SacI酶切结果，第10泳道为野生型对照PCR产物经SacI酶切结果。b为部分突变体测序结果。
图5为分别利用pZmU3-gRNA-C1及pJIT163-Ubi-Cas9载体上的2对引物扩增利用花粉管通道得到的不同玉米品种ZmIPK基因突变体凝胶电泳图。a为采用引物对ZmU3-F/C1R的扩增结果；b为采用引物对Cas9-1F/Cas9-1R的扩增结果。其中，Marker从下往上依次为(100、250、500、750、1000bp)；第1泳道为Marker，第2-10泳道为检测突变体，第11泳道为阳性对照(质粒pZmU3-gRNA-C1或pJIT163-Ubi-Cas9)。
图6为原生质体中瞬时表达gRNA：Cas9系统对拟南芥的内源基因AtPTPA定点突变结果。a为电泳图谱。Marker从下往上依次为(100、250、500、750、1000、2000、3000、5000bp)；第1泳道为Marker，泳道2和3为导入了含有gRNA：Cas9系统的原生质体DNA，PCR产物经内切酶EcoRV酶切结果，泳道4为野生的原生质体DNA的PCR产物经内切酶EcoRV酶切结果；泳道5为野生型的原生质体PCR产物。b为部分未切开条带测序结果。
图7为花序浸染法瞬时表达gRNA：Cas9系统对拟南芥的内源基因AtPTPA的定点突变结果。其中，a为电泳图谱。Marker从下往上依次为(100、250、500、750、1000、2000、3000、5000bp)；第1泳道为Marker，第2-9泳道为检测突变体PCR产物EcoRV酶切结果，第10泳道为野生型对照PCR产物经EcoRV酶切结果。b为部分突变体测序结果。
图8为利用pHSN401-C2载体上的引物扩增拟南芥AtPTPA基因突变体凝胶电泳图。a为采用引物对pHSN401-1F/C2R的扩增结果；b为采用引物对CAS9-2F/CAS9-2R的扩增结果。其中，Marker从下往上依次为(100、250、500、750、1000、2000、3000、5000bp)；第1泳道为Marker，第2-9泳道为检测突变体，第10泳道为阳性对照(质粒pHSN401)。
图9为拟南芥AtPTPA基因突变体后代突变结果。Marker从下往上依次为(100、250、500、750、1000、2000、3000、5000bp)；第1泳道为Marker，第2，3，4，5泳道为纯合突变体后代，第6，7泳道为分离到的野生型后代，第8、9、10泳道为杂合突变体后代。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
表达载体pZmU3-gRNA在文献“Liang,Z.et al.Targeted mutagenesis in Zeamays using TALENs and the CRISPR/Cas System.Journal of Genetics andGenomics.41:63-68,(2014)”中公开过。
表达载体pJIT163-Ubi-Cas9在文献“Wang,Y.et al.Simultaneous editing ofthree homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance topowdery mildew.Nature Biotechnology.32,947-951(2014).”中公开过。
表达载体pHSN401及pBUE411在文献“Xing,H.et al.ACRISPR/Cas9 toolkit formultiplex genome editing in plants.BMC Plant Biology.14:327,(2014)”中公开过。
玉米品种HiII在文献“Armstrong,C.L.,Green,C.E.& Phillips,R.L.Development and availability of germplasm with high type II cultureformation response.Maize Genet.Coop.News Lett.65,92–93(1991)”中公开过。
玉米品种B73在文献“Russell,W.A.Registration of B70 and B73 parentallines of maize.Crop Sci.12,721(1972)”中公开过。
玉米品种郑58在文献“张发林，玉米优良自交系郑58的育成和应用.作物杂志,2001(4):31-31”中公开过。
拟南芥品种Columbia在文献“Koorneef,M.et al.Linkage map of Arabidopsisthaliana.Jornal of Heredity.74,265-272(1983)”中公开过。
MS培养基配制：MS盐(Sigma，M5524)4.43g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3g/L，pH值为5.7，121℃灭菌20分钟。
LB培养基：Trypton 10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，溶解后调pH7.0，固体LB培养基，每升液体培养基中加入15g琼脂粉，121℃灭菌20分钟。
原生质体制备和转化所用溶液如表1-表6所示。
表1拟南芥50ml酶解液
Figure BDA0000915812660000071
Figure BDA0000915812660000081
表2玉米50ml酶解液
Figure BDA0000915812660000082
表3 500ml W5
Figure BDA0000915812660000083
表4 250ml WI溶液
Figure BDA0000915812660000084
表5 10ml MMG溶液
Figure BDA0000915812660000085
Figure BDA0000915812660000091
表6 4ml PEG溶液
Figure BDA0000915812660000092
上述表1-表6中的％表示质量体积百分含量，g/100ml。
农杆菌转化方法：
1)将-80℃保存的感受态细胞置于冰中融化后，加入约2μg质粒DNA，轻弹混匀，于冰上放置30min。
2)将EP管放入液氮中1min。
3)迅速取出，将EP管转入37℃水浴(2min)融化后，加入1ml LB液体培养基，于28℃低速振荡(150rpm)4～5h。
4)10000rpm离心30s收集菌体，去上清，留100μl悬浮菌体后均匀涂布于含相应抗生素的筛选平板上。
5)倒置于28℃培养至白色转化子长出。
实施例1、利用花粉管通道和茎尖再生定点编辑玉米内源基因ZmIPK
一、靶标片段target-C1的设计
Target-C1：5’-CCGAGCTCGACCACGCCGCCGAC-3’；(Genbank No.AY172635的ZmIPK基因中，第393-415位)。
二、含有C1核苷酸片段的pZmU3-gRNA质粒及pBUE411质粒的制备
C1是能与靶标Target-C1互补结合的RNA的编码DNA。
合成下述带有粘性末端(下划线部分)的单链引物：
C1-1F：5’-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3’；
C1-2F：5’-GGCGGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3’；
C1R：5’-AAACAGCTCGACCACGCCGCCGAC-3’。
C1-1F/C1R经过引物退火程序形成有粘性末端的双链DNA，插入到pZmU3-gRNA质粒的两个BbsI酶切位点之间，即得含有C1的pZmU3-gRNA质粒，质粒经测序验证阳性质粒，即在pZmU3-gRNA质粒的两个酶切位点BbsI之间正向插入5’-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3’所示DNA片段后得到的重组质粒为阳性，命名为pZmU3-gRNA-C1。
C1-2F/C1R经过引物退火程序形成有粘性末端的双链DNA，插入到pBUE411质粒的两个BsaI酶切位点之间，即得含有C1的pBUE411质粒，质粒经测序验证阳性质粒，即在pBUE411质粒的两个酶切位点BsaI之间正向插入5’-GGCGGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3’所示DNA片段后得到的重组质粒为阳性，命名为pBUE411-C1。
三、转化gRNA：Cas9系统至玉米原生质体
将含有C1的pZmU3-gRNA-C1质粒及pJIT163-Ubi-Cas9质粒转化玉米原生质体，原生质体制备和转化具体过程为：
1、玉米苗的培养
将玉米杂交种HiII及自交系B73、郑58的种子分别在水中浸泡过夜，将浸泡后的种子转移到放有吸水纸的培养皿中加水，光照处理3天，使其发芽(大约1cm)。土壤种植发芽的玉米种子，24℃，培养10-11天，得到玉米苗。
2、原生质体分离
1)取玉米苗幼嫩的叶片，用刀片将其中间部分切成宽度0.5-1mm的丝，将其放入50ml酶解液中消化5小时(先抽真空酶解0.5h，再10rpm缓慢摇晃4.5h)，得到酶解产物。
注：酶解温度要保持在20-25℃，且要避光，酶解完轻轻摇晃酶解液，使原生质体释放出来。
2)加30ml W5稀释酶解产物，用75um尼龙滤膜过滤酶解液于圆底离心管中(50ml)。
注：尼龙滤膜要浸泡在体积百分含量为75％(体积分数)的酒精水溶液里，用时要用水冲洗，用W5浸泡2min再用于过滤。
3)将圆底管中的溶液23℃，150g离心3min，弃上清，得原生质体。
4)加10ml W5重悬原生质体，150g离心3分钟，弃上清。
5)加适量MMG溶液悬浮，至于冰上，待转化。
注：此时需要确定原生质体的浓度，镜检(×100)，原生质体数为2×105个/ml至1×106个/ml。
3、玉米原生质体转化
1)加10μg pZmU3-gRNA-C1质粒及10μg pJIT163-Ubi-Cas9质粒于2ml离心管，用枪头吸取200μl原生质体轻弹混匀，静置3-5min，再加220μl PEG4000溶液，轻弹混匀，避光诱导15min。
2)加880μl W5(室温)颠倒混匀，100g离心3min，弃上清，得沉淀。
3)向沉淀中加1ml WI溶液，颠倒混匀，轻轻转至6孔板中(每个孔中已预先加入1mlWI溶液)，23℃培养过夜。
四、PCR/RE实验分析在玉米原生质体中gRNA：Cas9系统对内源基因ZmIPK的突变结果
在玉米原生质体转化后48小时提取基因组DNA，以其为模板，进行PCR/RE(Polymerase Chain Reaction/Restriction digestion)实验分析。同时设置野生型玉米品种Hi II的原生质体作为对照。PCR/RE分析方法参考文献“Shan,Q.et al.Rapid andefficient gene modification in rice and Brachypodium using TALENs.MolecularPlant,6(4):1365-1368,(2013)”，由于玉米内源基因ZmIPK(Genbank No.AY172635)的靶标片段(Genbank No.AY172635的第393-415位)上存在限制性内切酶SacI的识别序列(5’-GAGCTC-3’)，因而实验中采用限制性内切酶SacI进行PCR/RE检测实验。PCR扩增引物如下：
ZmIPK-1F：5’-TCGCAGCCCCTGGCAGAGCAA-3’；
ZmIPK-1R：5’-GAGACCTGGGAGAAGGAGACGGATCC-3’
PCR/RE实验分析结果见图1，结果表明玉米在ZmIPK基因靶位点发生了突变，回收测序未切开条带，测序结果表明ZmIPK基因发生了碱基插入/删除(insertion/deletion，indel)类型的突变。
五、利用花粉管通道法定点编辑玉米内源基因ZmIPK
细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides简称CPPs)是一类能够携带超出自身100倍的大分子物质包括蛋白质及核酸进入细胞的短肽，近年来研究表明细胞穿膜肽与DNA结合后具有保护DNA完整性防止DNA酶降解的功能。因此，在农业科研及生产中通常将细胞穿膜肽与花粉管通道转化法相结合，以提高花粉管通道的效率。
1)含穿膜肽的DNA溶液的制备：将固态粉末状穿膜肽(氨基酸序列为RKKRRQRRRRKKRRQRRR，由上海生物工程公司合成)用无菌水配置成30mg/ml母液，在pZmU3-gRNA-C1质粒及pJIT163-Ubi-Cas9质粒混合溶液(混合溶液中pZmU3-gRNA-C1质粒与pJIT163-Ubi-Cas9质粒的质量比为1:1)中按质量比1：1加入穿膜肽，使所得的DNA和穿膜肽的终浓度为25-30μg/ml(两个质粒终浓度之和为25-30μg/ml，穿膜肽的终浓度为25-30μg/ml)。
2)选择大田中长势旺盛的玉米(HiII、B73及郑58)作为受体材料，在开花期从受体群体中选择发育较好的植株进行套袋授粉杂交或自交。授粉18～21h后，先将雌穗上的纸袋摘下，用剪刀剪去距离穗轴顶端2-3厘米的花丝和苞叶，保持花丝切面平齐，加以修剪并使苞叶内的花丝略低于苞叶形成一个小凹槽；然后快速用移液枪在切口处滴注300-400μl步骤1)准备好的含穿膜肽的DNA溶液，将花丝浸泡在DNA溶液中，之后立即重新套上纸袋，每种处理做40-50个果穗。待玉米果穗成熟时，将其分别晒干脱粒。
3)将晒干的玉米种子种植，待萌发后用PCR/RE方法检测玉米ZmIPK基因突变体(具体检测方法及采用引物序列参见步骤四)。
不同基因型的玉米均通过花粉管通道的方法获得了突变体，部分突变体的检测结果如图2-图4所示,结果表明不同的玉米品种均在ZmIPK基因靶位点发生了突变，回收测序未切开条带，测序结果表明ZmIPK基因发生了碱基插入/删除(insertion/deletion，indel)类型的突变。可见，本发明所提供的花粉管通道法在整株植物水平上获得突变不依赖植物的基因型和受体范围。
六、利用茎尖再生法定点编辑玉米内源基因ZmIPK
1、玉米材料准备：
1)将玉米自交系HiII种子放入三角瓶中，70％(体积分数)酒精消毒5min，5％(体积分数)次氯酸钠消毒30min，无菌水洗5次。然后加入1.5倍种子体积的水，封口放入28℃，浸4-6h。
2)第二次灭菌，5％(体积分数)次氯酸钠消毒30min，无菌水洗5次。
3)将灭菌种子放入带有滤纸的无菌培养皿中萌发，28℃暗培养约3天。将生长状态一致的萌发种子转入MS培养基中，28℃暗培养3-4天，待植株长到4-5cm时使用。
2、玉米茎尖再生
1)拨芽尖：在骨节上1.5mm-2mm处横切露出芽尖，然后纵切，在芽尖的中间一刀切到骨节的下方约0.2mm处(一般刚刚过骨节即可)，根保留0.8cm左右。
2)将含有C1的pBUE411-C1质粒转入农杆菌感受态AGL1中，质粒PCR及酶切鉴定后，阳性菌株用于侵染植物。
3)将阳性菌株涂在LB固体培养基上，28℃暗培养，2天后，刮取少量菌液溶入20mlMS液体培养基中，28℃至悬浊液OD600＝0.8左右，加入200μM乙酰丁香酮。
4)将切好的植株放入培养皿中，切口朝下，将培养皿倾斜30-45℃放入真空皿中，加入少量没过切口的农杆菌菌液，浸染20min。期间抽真空10min，压力0.05MP。
5)侵染后，将植株从菌液中取出，用滤纸将多余菌液吸去，而后插入MS培养基中。23℃暗培养3天。
6)共培养结束后，取出材料，洗去培养基，将苗子栽入花盆中(普通土壤占据4/5，表层放蛭石，约占1/5)，移栽后先28℃暗培养2天，而后光照7-10天，可于正常条件下生长至自然结实。将结实后的玉米种子种植，待萌发后用PCR/RE方法检测玉米ZmIPK基因突变体。
结果表明玉米在ZmIPK基因靶位点发生了突变，回收测序未切开条带，测序结果表明ZmIPK基因发生了碱基插入/删除(insertion/deletion，indel)类型的突变。
七、检测经过花粉管通道得到的玉米突变体中是否存在pZmU3-gRNA-C1质粒及pJIT163-Ubi-Cas9质粒
根据pZmU3-gRNA-C1质粒及pJIT163-Ubi-Cas9质粒序列，设计2对引物进行PCR扩增，分别扩增pZmU3-gRNA-C1质粒与pJIT163-Ubi-Cas9质粒。
ZmU3-F/C1R位于ZmU3与靶标片段之间：
ZmU3-F：5’-CTGCCAAGATCAACAGCAACCA-3’；
C1R：5’-AAACAGCTCGACCACGCCGCCGAC-3’。
理论扩增片段大小约为322bp，序列为序列表中序列1的第467-788位，序列1为pZmU3-gRNA-C1的序列。
Cas9-1F/Cas9-1R位于pJIT163-Ubi-Cas9载体上：
Cas9-1F：5’-CTTCCCAAGCATTCCCTCCTGT-3’；
Cas9-1R：5’-CTTATGCCGTCCCATGACCTTC-3’。
理论扩增片段大小约为744bp，序列为序列表中序列2的第1573-2316位，序列2为pJIT163-Ubi-Cas9载体的Cas9序列。
结果显示，所有植物都未能扩增出目的条带(图5)，说明本发明在定点改造植物的同时避免了外源基因的插入或携带，获得的突变体具有较高的生物安全性。
八、检测经过茎尖再生得到的玉米突变体中是否存在pBUE411-C1质粒
根据pBUE411-C1质粒序列，设计2对引物进行PCR扩增，分别扩增OsU3p与Cas9部分。
pBUE411-1F/C1R位于OsU3p与靶标片段之间：
pBUE411-1F：5’-GACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTAC-3’；
C1R：5’-AAACAGCTCGACCACGCCGCCGAC-3’。
理论扩增片段大小约为289bp，序列为序列表中序列3的第174-462位，序列3为pBUE411-C1质粒的gRNA序列。
CAS9-2F/CAS9-2R位于pBUE411-C1载体的Cas9载体上：
CAS9-2F：5’-CTCCCTAAGCACTCGCTCCTGT-3’；
CAS9-2R：5’-TTCTGCGTGGTCTGATTCTCCC-3’。
理论扩增片段大小约为794bp，序列为序列表中序列4的第1639-2432位，序列4为pHSN411-C1载体的CAS9序列。
结果显示，所有植物都未能扩增出目的条带。说明本发明在定点改造植物的同时避免了外源基因的插入或携带，获得的突变体具有较高的生物安全性。
实施例2、利用花序浸染法定点编辑拟南芥内源基因AtPTPA
一、靶标片段target-C2的设计
Target-C2：5’-CCGACGATATCCGCCGATTTCAC-3’；(Genbank No.AF360133所示的AtPTPA基因中，第351-373位)。
二、含有C2核苷酸片段pHSN401质粒的制备
C2是能与靶标Target-C2互补结合的RNA的编码DNA。
合成下述带有粘性末端(下划线部分)的单链引物：
C2F：5’-ATTGGTGAAATCGGCGGATATCGT-3’；
C2R：5’-AAACACGATATCCGCCGATTTCAC-3’。
经过引物退火程序形成有粘性末端的双链DNA，插入到pHSN401质粒的两个BsaI酶切位点之间，即得含有C2的pHSN401质粒，质粒经测序验证阳性质粒，即在pHSN401质粒的酶切位点BsaI处正向插入5’-ATTGGTGAAATCGGCGGATATCGT-3’所示DNA片段后得到的重组质粒为阳性，命名为pHSN401-C2。
三、转化gRNA：Cas9系统至拟南芥原生质体
将步骤二获得的含有C2的pHSN401-C2质粒转化至拟南芥品种Columbia的原生质体，原生质体制备和转化具体过程为：
1、拟南芥的种植：
1)种子处理：将拟南芥品种Columbia的种子置于1.5mL离心管中，75％(体积分数)乙醇浸泡1min，弃去乙醇，加10％(体积分数)NaClO浸泡15min，倒掉NaClO，然后用无菌蒸馏水洗涤5-6遍。
2)将消毒处理后的种子用微量进样器点到MS培养基上，每次仅点一粒种子，点样完毕后，将培养基密封，置于4℃春化3-4天。
3)春化完毕后，将培养基转入培养箱中，培养条件为：温度21℃，光照强度5500±300Lx，光照时间12h。当植株生长3周时间时进行移植。
4)利用镊子将幼苗小心的插入土壤(泥炭土：蛭石：珍珠岩＝1:1:1，体积比)中，将幼苗根部掩埋，掩埋过程中土质要保持疏松，种下拟南芥后需要浇水并盖膜3-4天。然后置于21℃、6300±300Lx的光照强度下培养。
2、原生质体分离：
1)取拟南芥品种Columbia幼嫩的叶片(培养约一个月的幼苗)，用刀片将其切成0.5mm的丝，放入50ml酶解液中消化5小时(先抽真空酶解0.5h，再10rmp缓慢摇晃4.5h)。
注：酶解温度要保持在20-25℃，且要避光，酶解完轻轻摇晃酶解液，使原生质体释放出来。
2)加30ml W5稀释酶解产物，用75μm尼龙滤膜过滤酶解液于50ml圆底离心管中。
注：尼龙滤膜要浸泡在75％(体积分数)酒精里，用时要用水冲洗，再用W5浸泡2min再过滤。
3)23℃，60g离心5min，弃上清。
4)用10ml W5轻轻悬起原生质体，摇晃均匀，60g离心5min，弃上清。
5)加适量MMG溶液悬浮，至于冰上，待转化。
注：此时需要确定原生质体的浓度，镜检(×100)，原生质体数为2×105个/ml至1×106个/ml。
3、拟南芥原生质体转化
1)加20μg含有C2的pHSN401-C2质粒于2ml离心管，用枪头吸取200μl原生质体轻弹混匀，再加220μl PEG4000，轻弹混匀，避光诱导15-30min；
2)加880μl W5(室温)颠倒混匀，60g离心5min，弃上清；
3)加1ml W5，颠倒混匀，轻轻转至6孔板中，已预先加入1ml W5，23℃培养过夜。
四、PCR/RE实验分析gRNA：Cas9系统对拟南芥内源基因AtPTPA定点突变结果
拟南芥原生质体转化后48小时提取基因组DNA，以该DNA为模板，进行PCR/RE(Polymerase Chain Reaction/Restriction digestion)实验分析。PCR/RE分析方法参考了文献Shan,Q.et al.Rapid and efficient gene modification in rice andBrachypodium using TALENs.Molecular Plant(2013)，由于拟南芥内源基因AtPTPA(Genbank No.AF360133)的靶标片段(Genbank No.AF360133的第351-373位)上存在限制性内切酶EcoRV的识别序列(5’-GATATC-3’)，因而实验中采用限制性内切酶EcoRV进行PCR/RE检测实验。其中，PCR扩增所用引物为：
PTPA-F：5’-GATGCTCCAGCCACCATATC-3’；
PTPA-R：5’-CAGTTCGGTACACCACTTATATCA-3’。
PCR/RE实验分析结果见图6，结果表明拟南芥在AtPTPA基因靶位点发生了突变，回收测序图6中的条带，测序结果表明在AtPTPA基因的靶位点发生了碱基插入/删除(insertion/deletion，indel)类型的突变。
五、利用花序浸染法定点编辑拟南芥内源基因AtPTPA
1)拟南芥材料的准备
在拟南芥初次开花时将花蕾剪掉，促进侧枝产生更多的花枝。在用花序浸染法浸染拟南芥之前，先用剪刀剪去已经长成的角果。
2)将含有C2的pHSN401-C2质粒转入农杆菌感受态GV3101中，质粒PCR及酶切鉴定后，阳性菌株用于浸染植物。
3)阳性农杆菌菌株先用2ml离心管少量摇菌，约8-10小时后转移到200ml LB培养基中(按1：100的比例接菌)过夜培养到OD600值约0.8～1.0为止，5000g离心15min集菌，用浸染缓冲液(配方：2.16g/LMgCl2·6H2O，5％(5g/100ml)蔗糖，0.02％(0.02g/100ml)silwetL-77)重悬细胞用于浸染植物。
4)把100ml浸染缓冲液倒入大皿内，然后把拟南芥的花序浸入侵染2分钟，侵染过程中要不断转动拟南芥，侵染后用滤纸擦干菌液，用黑色塑料袋或者薄膜覆盖拟南芥，暗培养24小时。由于拟南芥的盛花期较长，所以一般要侵染2-3次。
5)正常培养条件下生长、收获T1代拟南芥种子并种植，待种子萌芽后对AtPTPA基因进行PCR/RE检测(具体检测方法及采用引物序列参见步骤四)，得到的500株植物中有20株AtPTPA基因突变体。同时设置野生型拟南芥品种Columbia作为对照。
检测结果如图7所示，结果表明在AtPTPA基因靶位点发生了突变，回收测序图中的条带，测序结果表明在AtPTPA基因的靶位点都发生了碱基插入/删除(insertion/deletion,indel)类型的突变。
6)经过步骤5)产生的20株突变体进行PCR扩增，检测突变体中是否存在pHSN401-C2质粒，设计2对引物进行PCR扩增(分别位于U6-26p与Cas9部分上)。
pHSN401-1F/C2R位于U6-26p与靶标片段之间：
pHSN401-1F：5’-TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC-3’；
C2R：5’-AAACACGATATCCGCCGATTTCAC-3’。
理论扩增片段大小约286bp，序列为序列表中序列5的第170-455位，序列5为pHSN401-C2载体的gRNA部分序列。
CAS9-2F/CAS9-2R位于pHSN401-C2载体的CAS9载体上：
CAS9-2F：5’-CTCCCTAAGCACTCGCTCCTGT-3’；
CAS9-2R：5’-TTCTGCGTGGTCTGATTCTCCC-3’。
理论扩增片段大小约为794bp，序列为序列表中序列4的第1639-2432位，序列4为pHSN401-C2载体的CAS9序列。利用pHSN401-C2载体上的引物pHSN401-1F/C2R扩增拟南芥AtPTPA基因突变体凝胶电泳图如图8中a所示。利用pHSN401-C2载体上的引物CAS9-2F/CAS9-2R扩增拟南芥AtPTPA基因突变体凝胶电泳图如图8中b所示。从图的结果可以看出，步骤5)获得的拟南芥AtPTPA基因突变体均未扩增到目的片段，证明突变体中已经不存在gRNA：Cas9系统质粒上的片段。
7)经过步骤5)产生的20株突变体的后代中，随机挑选9株进行PCR/RE检测，电泳结果如图9所示。可以看出，步骤5)获得的拟南芥AtPTPA基因突变体可以稳定遗传到后代。可见，本发明在定点改造植物的同时避免转基因的插入或携带，免除后续的转基因的安全问题及大众担忧；同时避免了组织培养过程，减少了人力、物力的消耗。
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Claims (12)

1.对整株植物中目的基因的靶标片段进行定点改造的方法，包括如下步骤：以目的植物的整个植株为瞬时表达对象，在所述目的植物中瞬时表达特异于所述靶标片段的CRISPR/Cas9系统的序列特异性核酸酶，所述核酸酶靶向并剪切所述靶标片段，由此通过所述目的植物的自身DNA修复，完成对所述靶标片段的定点改造；
其中在所述目的植物中瞬时表达所述序列特异性核酸酶的方法包括如下步骤：
a)直接向所述目的植物中导入序列特异性核酸酶或向所述目的植物中导入用于表达序列特异性核酸酶的遗传物质，
b)将导入所述核酸酶或所述遗传物质后的植物在无选择压力的情况下种植生长，所述核酸酶或未整合在所述目的植物的染色体上的所述遗传物质被细胞降解；
其中所述遗传物质为能转录向导RNA和表达Cas9核酸酶的重组载体或DNA线性片段；或所述遗传物质由能转录向导RNA的重组载体或DNA线性片段，以及能表达Cas9核酸酶的重组载体或DNA线性片段或RNA组成；或所述遗传物质由向导RNA，以及能表达Cas9核酸酶的重组载体或DNA线性片段或RNA组成；所述向导RNA为由crRNA和tracrRNA通过部分碱基配对结合而成的具有回文结构的RNA；所述crRNA含有能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段；
其中在向所述目的植物中导入所述序列特异性核酸酶或所述遗传物质的过程中，在所述目的植物上的导入部位为花粉管、花序、茎尖、或子房。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述导入部位为花粉管，则按照包括如下步骤的方法进行导入：在授粉后向柱头注射所述重组载体或所述DNA线性片段或体外转录的RNA的溶液或所述序列特异性核酸酶的溶液；或
所述导入部位为花序，则按照包括如下步骤的方法进行导入：用含有所述重组载体或所述DNA线性片段的农杆菌浸染花序；或
所述导入部位为茎尖，则按照包括如下步骤的方法进行导入：用含有所述重组载体或所述DNA线性片段的农杆菌浸染茎尖；或
所述导入部位为子房，则按照包括如下步骤的方法进行导入：在授粉后向子房注射所述重组载体或所述DNA线性片段或体外转录的RNA的溶液或所述序列特异性核酸酶的溶液；或
所述导入部位为子房，则按照包括如下步骤的方法进行导入：在授粉后向子房注射含有所述重组载体或所述DNA线性片段的农杆菌。
3.根据权利要求1-2中任一所述的方法，其特征在于：所述序列特异性核酸酶为CRISPR/Cas9核酸酶；
其中所述遗传物质为能转录向导RNA和表达Cas9蛋白的重组载体或DNA线性片段；或所述遗传物质由能转录向导RNA的重组载体或DNA线性片段，以及能表达Cas9蛋白的重组载体或DNA线性片段或RNA组成；或所述遗传物质由向导RNA，以及能表达Cas9蛋白的重组载体或DNA线性片段或RNA组成；所述向导RNA为由crRNA和tracrRNA通过部分碱基配对结合而成的具有回文结构的RNA；所述crRNA含有能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述定点改造为：对所述靶标片段的核苷酸进行插入突变、缺失突变和/或替换突变。
5.一种培育非转基因突变植物的方法，包括如下步骤：采用权利要求1-4中任一所述方法对目的植物的目的基因中的靶标片段进行定点改造，进而获得所述目的基因丧失功能、且基因组中未整合外源基因的植物，即为所述非转基因突变植物。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述植物为任何基因型的植物。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物选自玉米、小麦、大豆、棉花、烟草、拟南芥、黑麦、刺梨、枇杷、番木瓜、狗蔷薇、金钗石斛、甘蓝、苦荞麦和橡胶树。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物是玉米；所述序列特异性核酸酶是CRISPR/Cas9核酸酶；所述靶基因是ZmIPK。
9.根据权利要求8的方法，其中所述靶标片段是5’-AGCTCGACCACGCCGCCGAC-3’；所述转录向导RNA的重组载体为在pZmU3-gRNA质粒的两个酶切位点BbsI之间正向插入5’-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3’所示DNA片段后得到的重组质粒；所述表达Cas9蛋白的重组载体为pJIT163-Ubi-Cas9载体。
10.根据权利要求8的方法，其中所述靶标片段是5’-AGCTCGACCACGCCGCCGAC-3’；所述转录向导RNA和表达Cas9蛋白的重组载体为在pBUE411质粒的两个酶切位点BsaI之间正向插入5’-GGCGGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3’所示DNA片段后得到的重组质粒。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物是拟南芥；所述序列特异性核酸酶是CRISPR/Cas9核酸酶；所述靶基因是AtPTPA。
12.根据权利要求11的方法，其中所述靶标片段为5’-ACGATATCCGCCGATTTCAC-3’；所述转录向导RNA和表达Cas9蛋白的重组载体为在pHSN401质粒的两个酶切位点BsaI之间正向插入5’-ATTGGTGAAATCGGCGGATATCGT-3’所示DNA片段后得到的重组质粒。
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Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system;Qiwei Shan等;《Nature Protocols》;20140918;第9卷(第10期);第2395-2410页 *
Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9;Jian-Feng Li等;《Nature Biotechnology》;20130808;第31卷(第8期);第688-691页 *
Precision Genome Engineering and Agriculture:Opportunities and Regulatory Challenges;Daniel F. Voytas等;《PLOS Biology》;20140630;第12卷(第6期);第1-6页 *
Targeted Mutagenesis in Zea mays Using TALENs and the CRISPR/Cas System;Zhen Liang等;《Journal of Genetics and Genomics》;20131214;第41卷;第63-68页 *

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Assignee: Suzhou Qihe Biotechnology Co.,Ltd.

Assignor: Shanghai Blue Cross Medical Science Research Institute

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Denomination of invention: A method of site-specific modification of whole plant through gene transient expression

Granted publication date: 20210810

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