JP2023510457A - ヘテロデラ属の病原体に対する耐性遺伝子 - Google Patents

Abstract

ビートシストセンチュウの寄生に対するより効率的な育種、または新規耐性系統の開発は、本発明によるヘテロデラ耐性媒介核酸分子の提供を介して可能となり、特に、標的植物における優勢な耐性効果は、同定された核酸分子の特性により引き起こされる。ヘテロデラ耐性媒介核酸分子、および前述の本発明の実施態様は、新規耐性品種を開発する目的で、シス遺伝的アプローチまたはトランス遺伝的アプローチにおける耐性遺伝子対立遺伝子の付加的適用、例えば使用を提供する。

Description

本発明は、植物中に、特にBeta vulgaris種の植物中に存在する場合、ヘテロデラ属の病原体、特にビートシストセンチュウのHeterodera schachtiiに対する耐性を付与することができる核酸分子、ならびに本発明による核酸分子によりコードされるポリペプチドに関する。特に、本発明による核酸分子は、核酸分子の存在により付与されるヘテロデラ属の病原体に対する耐性効果が優勢であるということを特徴とする。さらに、本発明は、内因性遺伝子として、編集遺伝子として、または導入遺伝子として核酸分子またはその部分を含むヘテロデラ耐性植物、植物細胞、植物器官、植物組織、植物部分、または植物の種子もしくは子孫に関する。さらに、本発明はまた、植物中で、特にBeta vulgaris種の植物中で、ヘテロデラ属の病原体に対する耐性を高める方法、ならびにヘテロデラ耐性植物を生産または同定および場合により選択する方法を包含する。本発明はまた、Heterodera schachtii病原体による寄生を監視する方法、ならびに本発明による核酸分子とハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーを包含する。

背景技術
商業的に栽培されるテンサイにおいて、２ダースを超える多様な線虫種が経済的損失を引き起こすことが報告されている（Hafez, Sugar Beet nematodes in Idaho and Eastern Oregon (1997), University of Idaho, College of Agriculture）。ビートの最も深刻な線虫害虫は、ほとんどドイツおよびヨーロッパのビート栽培地域において最も経済的に重要性を有するビートシストセンチュウHeterodera schachtiiである（Cooke, Agricultural Zoology Reviews 2 (1987), 132-183）。この線虫は、１８５９年にドイツで最初に検出され、目下の推定に基づくと、テンサイ生産地域の１０～２５％は世界的にこの害虫が寄生し、最大８０％の収穫量損失を引き起こしている可能性があり（Hafez 1997）、この収穫量損失は、土壌中の線虫の量、テンサイの播種および寄生時期、ならびに気象条件に依存する。

このビートシストセンチュウは、植物病原性線虫であり、テンサイにおいてだけでなく、レッドビート、飼料用ビートおよびフダンソウのような他のビートにおいても、ならびにホウレンソウのようなヒユ科、ナタネ、キャベツ、ハクサイ、カリフラワー、メキャベツ、ブロッコリー、カブ、ダイコンおよびスウェーデンカブのようなアブラナ科のような他の植物においても、特に夏期の間の根系の深刻な損傷により、かなりの収穫量損失を引き起こすことがある。この線虫はまた、野生のカブ、ナズナ、アカザおよびスベリヒユのような多くの一般的な雑草にも感染する。

テンサイ畑では、ビートシストセンチュウの寄生は、最初は発育不全植物の円形から楕円形の領域として現れる。線虫は、植物の根を食べ、栄養分や水を吸収する植物の能力を低下させる。したがって、地上の症状は、栄養不足や干ばつ、植分低下、成長不良、すくみ、黄変およびしおれのように見え、この症状は、感染時期の成長状態に基づき変化する。実生が感染すると、この症状は、すくみや葉の成長低下を含み、日中の暑い時期の間には古い外葉は黄変し、しおれる。寄生された作物は、価値および品質の低下した小さな植物が含まれ、雑草との競争力が低下する。

この病気の拡がりは続き、害虫は、栽培者にとって管理することがますます困難になる。しかしながら、土壌線虫の個体数が多いとテンサイの生産が不経済となることがあるため、この害虫を防除することが重要である。この病気に戦うために多様な方法が存在するが、現在適用されている実践は満足できるものではない。殺線虫剤によるビートシストセンチュウの化学的防除は、農業経営者にコストを負わせ、環境を汚染するだけでなく、多くの国ではもはや許可されておらず、土壌除染は、比較的広い畑には適用できない。さらに、線虫の個体数を減らすためにテンサイを４年毎にだけ栽培するかまたはより少ない頻度で栽培する輪作は、常に実行できるものではなく、十分に効果的でもない。さらに一般的な管理実践は、採油用ダイコンまたはマスタードのような線虫耐性間作作物の栽培を含む。これらの植物は、害虫を誘引するが、その発育および繁殖を阻害し、害虫の個体数を減らす。耐性または許容性テンサイ品種を栽培することも可能である。これまでの線虫の土壌固体数を減らすための最も効果的な方法は、耐性テンサイ品種の栽培であった。

一方、線虫耐性および許容性のテンサイ栽培品種は、例えばBeta procumbens由来のビートシストセンチュウに対する主要耐性遺伝子を標識して内在的に持つことで提供される（Heijbroek et al., Euphytica 38 (1988), 121-131; Lange et al., Proceedings of the 53rd IIRB Congress, Brussels (1990), 89-102）。転座されたBeta procumbensセグメント、すなわちB. vulgarisの第９染色体の末端に組み込まれたB. procumbens第一染色体セグメント内で、Ｈｓ１ｐｒｏ－１遺伝子は、原因因子としてポジショナルクローニングにより同定された（Cai et al., Science 275 (1997), 832-834）。しかしながら、Beta vulgarisのゲノム内へBeta procumbens第１染色体セグメントを組み込む場合、植物内にビートシストセンチュウに対する所望の耐性だけが導入されるのではなく、ヘテロデラ耐性の肯定的な形質と関連する付加的遺伝子の継承のためしばしば例えば収穫量低下のような不所望な形質も導入されてしまう。この現象は、「リンケージドラッグ」の用語により知られている。したがって、育種におけるこの遺伝子の使用は、リンケージドラッグによる有意な収穫量ペナルティのため、さらに転座の不安定性のために制限される。

線虫耐性の別の要素は、フランスで採取された材料中の野生のシービート（sea beet）B. vulgaris subsp. maritima内に発見された（Hijner, Meded. Inst. rat. Suikerprod. 21 (1951), 1-13）。しかしながら、ヘテロデラ耐性の遺伝的および機能的バックグラウンドならびに耐性遺伝子の同定は、これまで全く不明であった。

しかしながら、上述のように、記載された耐性を有する栽培品種の欠点は、複雑な遺伝のために品種開発において極めて骨が折れかつ面倒であることにあり、かつこのような栽培品種では、寄生の不存在では、通常の栽培品種と比べて収穫量性能が著しく劣ることにある。とりわけ、これは、いくつかの耐性遺伝子が糖生産を担う遺伝子とのエピジェネティックな相互作用に関連し、これが病原体の不存在では植物の適応度の低下を引き起こすことがある。

例えばＴＡＬＥヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ系による遺伝子編集に基づく新たな育種技術の使用、およびトランスジェニックアプローチの使用は、耐性の開発において必要とされる遺伝子が同定および特性決定されていないため実際には不可能である。

耐性を克服するヘテロデラ変異体の危険性を打ち消すビートシストセンチュウに対する持続的育種のために、新しい耐性遺伝子を継続的に同定し、これらの耐性遺伝子をテンサイのような栽培植物の遺伝子プールに組み込む必要がある。特にこの課題は、植物中に存在する場合、それ自体で既に、Heterodera schachtiiに対して極めて大きな優勢な耐性効果を生じる適切な耐性遺伝子を提供することにある。本発明によると、この課題は、特許請求の範囲内および明細書内に特徴付けられる実施形態を介して達成される。

発明の説明
本発明は、植物、特にBeta vulgaris subsp. vulgarisにおいて、ヘテロデラ属の病原体、特にHeterodera schachtiiに対する耐性を付与することができる核酸分子に関する。この核酸分子は、植物中に存在する場合、Heterodera schachtiiに対して優勢な耐性効果を示す。

さらに、本発明は、この核酸分子またはその部分を内因的にまたは遺伝子導入により含むヘテロデラ耐性植物、植物細胞、植物器官、植物組織、植物部分、種子、種子ストック、または植物の子孫に関する。特別な任意付加的な実施形態によると、本質的にもっぱら生物的プロセスによるだけで得られたこれらの植物およびその構成要素は、免除される。

植物内で、特にBeta vulgaris種の植物内でヘテロデラに対する耐性を高める方法、ならびにヘテロデラ耐性植物を生産または同定および場合により選択する方法も同様に、本発明に包含される。本発明はまた、病原体Heterodera schachtiiの寄生を監視する方法、ならびに本発明による核酸分子とハイブリダイゼーションするプローブおよびプライマーとしてのオリゴヌクレオチドを包含する。

したがって、本発明は、以下の点で列挙され、かつ実施例および図面で示される実施形態に関する。
［１］ 核酸分子を発現する植物内でヘテロデラ属の病原体に対する耐性を高める核酸分子において、この核酸分子は、以下の：
（ａ） 配列番号１、４および７からなる群から選択される配列を含むヌクレオチド配列またはその機能的フラグメント；
（ｂ） 配列番号２、５および８からなる群から選択されるコード配列を含むヌクレオチド配列またはその機能的フラグメント；
（ｃ） ストリンジェントな条件下で（ａ）、（ｂ）、（ｆ）または（ｇ）によるヌクレオチド配列の相補的配列とハイブリダイズし、好ましくは植物中に存在する場合にヘテロデラ属の病原体に対する耐性を付与することができるヌクレオチド配列；
（ｄ） （ａ）、（ｂ）、（ｆ）または（ｇ）のいずれか１つのヌクレオチド配列のＤＮＡ配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるＤＮＡ配列を含み、好ましくは植物中に存在する場合にヘテロデラ属の病原体に対する耐性を付与することができるヌクレオチド配列；
（ｅ） （ａ）、（ｂ）、（ｆ）または（ｇ）の対立遺伝子または１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換、挿入、転移、および／または付加による誘導体であるＤＮＡ配列を含み、好ましくは植物中に存在する場合にヘテロデラ属の病原体に対する耐性を付与することができるヌクレオチド配列；
（ｆ） 配列番号３、６および９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメント；
（ｇ） 配列番号３、６および９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｈ） 遺伝コードの縮重による（ａ）～（ｇ）のいずれかのＤＮＡ配列の変異体であり、好ましくは植物中に存在する場合にヘテロデラ属の病原体に対する耐性を付与することができるヌクレオチド配列
からなる群から選択されることを特徴とする。

［２］ 核酸分子が、植物内で優勢なヘテロデラ属の病原体に対する耐性を付与することを特徴とする、［１］による核酸分子。

［３］ 核酸分子が、Beta vulgaris subsp. maritima由来であることを特徴とする、［１］または［２］による核酸分子。

［４］ ［１］から［３］までのいずれか１つによる核酸分子によりコードされるポリペプチド。

［５］ 核酸分子は、好ましくはベクターまたは発現カセットに対して異種であるか、または核酸分子は、好ましくは異種調節エレメント、好ましくはプロモーターまたはターミネーターに連結されている、［１］から［３］までのいずれか１つによる核酸分子を含むベクターまたは発現カセット。

［６］ ［１］から［３］までのいずれか１つによる核酸分子、［５］によるベクターまたは発現カセット、または［４］によるポリペプチドを含み、この核酸分子または発現カセットは、好ましくは内因遺伝子または導入遺伝子として存在する細胞。

［７］ 植物またはその部分は、［１］から［３］までのいずれか１つによる核酸分子を内因的または遺伝子導入により含むか、または［５］によるベクターまたは発現カセットを含み、好ましくは核酸分子を内因的に含む植物は、ベタ種、特にBeta vulgaris種の植物であるが、Beta vulgaris subsp. maritimaではないことを特徴とする、植物またはその部分。好ましくは、前記植物は、ヘテロデラ属の病原体に対する耐性を有する植物である。

［８］ 植物は、ハイブリッド植物であることを特徴とする、［７］による植物。

［９］ 核酸配列分子は、植物のゲノム中でヘテロ接合またはホモ接合して存在することを特徴とする、［７］または［８］による植物。

［１０］ 種子または子孫は、遺伝子導入によりまたは内因的に［１］から［３］までのいずれか１つによる核酸分子、または［５］によるベクターまたは発現カセットを含む、［７］から［９］までのいずれか１つによる植物の種子または子孫。

［１１］ 技術的処理された［１０］による種子において、この技術的処理は、以下のものからなる群から選択される：
（ａ） ポリシング
（ｂ） ドレッシング、好ましくはペレッティング
（ｃ） インクラステーション
（ｄ） カラーリング。

［１２］ 以下の：
（ｉ） ［１］から［３］までのいずれか１つによる核酸分子、または［５］によるベクターまたは発現カセットを、好ましくは部位特異的ヌクレアーゼにより促進される、相同指向修復または相同組換えにより、植物、好ましくはBeta vulgaris種の植物の少なくとも１つの細胞のゲノム内へ組み込み、場合により植物細胞から植物を再生するステップ；または
（ｉｉ） 植物の少なくとも１つの細胞内での［１］から［３］までのいずれか１つの核酸分子の発現を、好ましくはネイティブプロモーターを修飾することによるかまたは［１］から［３］までのいずれか１つの核酸分子を、ネイティブプロモーターと比べてより高いレベルの活性を有する異種プロモーターと融合する、好ましくは作動的に連結することにより、特にヘテロデラ感染の間または後に高め、場合により少なくとも１つの植物細胞から植物を再生するステップ；または
（ｉｉｉ） ［４］によるポリペプチドの活性および／または安定性を、植物の少なくとも１つの細胞内で、［１］から［３］までのいずれか１つによる核酸分子のヌクレオチド配列の修飾により高め、場合により少なくとも１つの植物細胞から植物を再生するステップ；または
（ｉｖ） ［１］から［３］までのいずれか１つによる核酸分子、または［５］によるベクターまたは発現カセットを用いて植物細胞を形質転換し、場合により形質転換された植物細胞から植物を再生するステップ
を含み、
ヘテロデラに対する耐性は、好ましくは、Heterodera schachtiiに対する耐性であるか、または植物は、好ましくはBeta vulgaris種の植物、好ましくはBeta vulgaris subsp. vulgaris、特にテンサイである、
植物中で、好ましくはBeta vulgaris種の植物中で、ヘテロデラ属の病原体に対する耐性を高める方法。

［１３］ 以下の：
（ａ） ［１］から［３］までのいずれか１つによる核酸分子、または［５］によるベクターまたは発現カセットで植物細胞を形質転換するステップ；および
（ｂ） 形質転換された植物細胞からトランスジェニック植物を再生するステップ；または
（ｉ） 植物、好ましくはベタ属の植物、より好ましくはBeta vulgaris種の植物の細胞内へ、部位特異的ヌクレアーゼおよび修復マトリックスを導入するステップであって、部位特異的ヌクレアーゼは、細胞のゲノム内のＤＮＡの少なくとも１つの一本鎖切断または少なくとも１つの二本鎖切断を、好ましくは［１］から［３］のいずれか１つによる核酸分子に対して相同である標的領域の上流、下流または標的領域内で生成することができ、修復マトリックスは、［１］から［３］までのいずれか１つによる核酸分子を含む、部位特異的ヌクレアーゼおよび修復マトリックスを導入するステップ；
（ｉｉ） 相同指向修復または相同組換えを可能にする条件下で（ｉ）からの細胞を培養するステップであって、核酸分子は、修復マトリックスから植物のゲノム内に組み込まれる、細胞を培養するステップ；および
（ｉｉｉ） （ｉｉ）において修飾された細胞から植物を再生するステップ；または
（Ｉ） 植物、好ましくはベタ属の植物、より好ましくはBeta vulgaris種の植物の細胞内へ、部位特異的ヌクレアーゼまたは塩基エディターを導入するステップであって、部位特異的ヌクレアーゼは、細胞のゲノム内のＤＮＡの少なくとも１つの一本鎖切断または少なくとも１つの二本鎖切断を、好ましくは［１］から［３］までのいずれか１つによる核酸分子に対して相同である標的領域の上流、下流または標的領域内で生成する、部位特異的ヌクレアーゼまたは塩基エディターを導入するステップ；
（ＩＩ） 標的領域の修飾を可能にする条件下で、以下のものから選択される（Ｉ）からの細胞を培養するステップ；
（１） 少なくとも１つのヌクレオチドの置換；
（２） 少なくとも１つのヌクレオチドの欠失；
（３） 少なくとも１つのヌクレオチドの挿入；または
（４） （１）～（３）の任意の組合せ、好ましくは、この修飾は、［４］によるポリペプチドの活性および／または安定性を高める；および
（ＩＩＩ） （ＩＩ）において修飾された細胞から植物を再生するステップ
を含む、［７］から［９］までのいずれか１つによるヘテロデラ属の病原体に対する耐性を有する植物を生産する方法。

［１４］ 標的領域は、
ａ） マーカーｓ５ｅ３００１ｓ０２とマーカーｓ５ｅ４６６８ｘｘｘとの間に位置するか、または
ｂ） マーカーｓ５ｅ３００１ｓ０２とマーカーｓ５ｅ４６６８ｘｘｘとに隣接するか、または
ｃ） マーカーｓ５ｅ３００１ｓ０２とマーカーｓ５ｅ４６６８ｘｘｘとの間に染色体間隔を含み、場合により、［１］から［３］までのいずれか１つによる核酸分子の対立遺伝子変異体を含み、対立遺伝子変異体は、植物中に存在する場合にヘテロデラ属の病原体に対する耐性を付与しないかまたはヘテロデラに対する僅かな耐性を付与するだけである、
ことを特徴とする、［１３］による方法。

［１５］ 少なくとも１つの一本鎖切断または少なくとも１つの二本鎖切断は、標的領域の上流および／または下流の最大１００００塩基対の位置で起こるか、または［１４］に定義された対立遺伝子変異体から最大１００００塩基対離れた位置で起こることを特徴とする、［１３］または［１４］による方法。

［１６］ ［１３］から［１５］までのいずれか１つによる方法により得られたかまたはこれにより得ることができる植物またはその部分。

［１７］ ヘテロデラ属の病原体に対して耐性である植物、好ましくはBeta vulgaris種の植物を同定、場合により提供または選択する方法において、この方法は、少なくとも以下の（ｉ）または（ｉｉ）：
（ｉ） 植物またはその植物の部分中で、［１］から［３］までのいずれか１つによる核酸分子の存在および／または発現、または［４］によるポリペプチドの存在を検出するステップ；および／または
（ｉｉ） ［１］から［３］までのいずれか１つによる核酸分子のヌクレオチド配列で同時分離する少なくとも１つの領域を検出するステップ；および
（ｉｉｉ） 場合により、ヘテロデラ属の病原体に対する、好ましくはHeterodera schachtiiに対する耐性を有する植物を選択するステップ
を含むことを特徴とする、植物を同定、場合により提供または選択する方法。

［１８］ 植物中に存在する場合に、植物中に、好ましくはBeta vulgaris種の植物中にヘテロデラ属の病原体に対する耐性を付与することができる核酸分子を同定する方法において、この方法は、以下の：
（ｉ） ［４］によるポリペプチドのアミノ酸配列と、配列データベースからのアミノ酸配列と比較するか、植物の遺伝子型における［４］によるポリペプチドをコードする対立遺伝子変異体を同定するステップ；
（ｉｉ） アミノ酸配列が、［４］によるポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列、またはアミノ酸配列をコードする対立遺伝子変異体を同定するステップ；
（ｉｉｉ） 同定されたアミノ酸配列をコードする核酸分子、または対立遺伝子変異体を、植物内に、好ましくはBeta vulgaris種の植物中に導入し、植物内で核酸分子を発現させるステップ；および
（ｉｖ） ヘテロデラ属の病原体に対する耐性を検出するステップ
を含むことを特徴とする、核酸分子を同定する方法。

［１９］以下の
（ｉ） ［７］から［９］までのいずれか１つによる植物を提供するか、［１３］から［１６］までのいずれか１つによる方法により植物を生産するか、または［１７］による方法により植物を同定および選択するステップ、および
（ｉｉ） （ｉ）からの植物またはその子孫を栽培するステップ
を含み、
この方法は、栽培植物にヘテロデラ属の病原体が寄生することを妨げる、
植物、好ましくはBeta vulgaris種の植物を栽培する方法。

［２０］ ［１］から［３］までのいずれか１つに定義されたヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０、好ましくは少なくとも２１、２２、２３、２４、または２５、特に好ましくは少なくとも３０、３５、４０、４５、または５０、特に好ましくは少なくとも１００、２００、３００、または５００のヌクレオチド長さのオリゴヌクレオチド。

［２１］ オリゴヌクレオチド、好ましくは［２０］によるオリゴヌクレオチドのペアまたはこれらのオリゴヌクレオチドを含むキットにおいて、これらのオリゴヌクレオチドは、Beta vulgarisゲノム内の、［１］から［３］のいずれか１つによる核酸分子により付与されるヘテロデラ属の病原体に対する耐性を有するBeta vulgaris内で同時分離する領域に対してフォワードプライマーおよびリバースプライマーとしてのハイブリダイゼーションのために適しており、好ましくはBeta vulgarisゲノム内のこの領域は、マーカーｓ５ｅ３００１ｓ０２とマーカーｓ５ｅ４６６８ｘｘｘとの間に位置するか、マーカーｓ５ｅ３００１ｓ０２とマーカーｓ５ｅ４６６８ｘｘｘとに隣接するか、またはマーカーｓ５ｅ３００１ｓ０２とマーカーｓ５ｅ４６６８ｘｘｘとの間に染色体間隔を含む、オリゴヌクレオチドのペアまたはこれらのオリゴヌクレオチドを含むキット。

［２２］ Beta vulgaris subsp. vulgaris亜種のヘテロデラ耐性植物の生産における［１］から［３］までのいずれか１つによる核酸分子の使用。

［２３］ ｓ５ｅ３００１ｓ０２は、一塩基多型（ＳＮＰ）であり、好ましくはBeta vulgaris遺伝子型ＥＬ１０を参照する第５染色体の５６９４００７２ｂｐの位置にあり、前記ヌクレオチドは、ＧまたはＴであり、好ましくは配列番号１０または１１に記載された一塩基多型（ＳＮＰ）であり、より好ましくは前記ヌクレオチドは、Ｔであり；および／または
ｓ５ｅ４６６８ｘｘｘは、一塩基多型（ＳＮＰ）であり、好ましくはBeta vulgaris遺伝子型ＥＬ１０を参照する第５染色体の５７８０９８０７ｂｐの位置にあり、前記ヌクレオチドは、ＧまたはＴであり、好ましくは配列番号１２または１３に記載された一塩基多型（ＳＮＰ）であり、より好ましくは前記ヌクレオチドはＴである、
前述の項目のいずれかによる方法、植物、または植物部分またはオリゴヌクレオチドのペア。

［２４］ 植物またはこのような植物のペレット種子は、２００ｇ、２５０ｇ、３００ｇ、３５０ｇ、４００ｇ、４５０ｇまたは５００ｇの最小新鮮質量および１０００ｇ、１１００ｇ、１２００ｇ、１３００ｇ、１４００ｇ、１５００ｇ、１６００ｇ、１７００ｇ、１８００ｇ、１９００ｇまたは２０００ｇの最大質量を有するビート体の発育を可能にするゲノムを有する、［７］による植物。

［２５］ テンサイ植物のゲノムが、ビート体の新鮮質量において少なくとも１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％またはさらに２０％（質量パーセント）のサッカロース濃度を有するビート体の発育を可能にするテンサイ植物またはこのような植物のペレット種子である、［７］または［２４］による植物。

［２６］ 表４に示された配列番号の１つまたは配列番号１０～１３からなる群から選択される１つの配列番号を有する分子マーカー、オリゴヌクレオチドまたはプライマー。

［２７］ ［２６］による分子マーカー、オリゴヌクレオチドまたはプライマーから誘導される分子マーカー、オリゴヌクレオチドまたはプライマーにおいて、この分子マーカー、オリゴヌクレオチドまたはプライマーは、［１］による核酸分子を含む植物を選択するために適している、分子マーカー、オリゴヌクレオチドまたはプライマー。

［２８］ 以下の：アベイシックヌクレオチド；８’ｏｘｏ ｄＡおよび／または８’ｏｘｏ ｄＧヌクレオチド；その３’末端での逆塩基；２’Ｏ－メチルヌクレオチド；５’末端キャップ；ホスホチオアート修飾、メチルホスホナート修飾、ロック核酸（ＬＮＡ）修飾、Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）修飾、di PS修飾、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）修飾からなる群から選択される主鎖修飾；鎖内架橋；それと接合した蛍光染料；ＧＲＯＮの５’または３’末端でそれと接合した蛍光染料；ハイブリダイゼーションエネルギを高める１つ以上の塩基；その５’末端での２’Ｏ－メチルヌクレオチド；その３’末端での２’Ｏ－メチルヌクレオチド、その５’末端で接合した蛍光染料、その３’末端で接合した蛍光染料、その５’末端でのホスホチオアート残基、その３’末端でのホスホチオアート残基、３’ブロッキング置換基、５’ブロッキング置換基、３’と５’の両方のブロッキング置換基からなる群から選択される１つ以上の化学修飾または付加を含む、［２６］または［２７］による分子マーカー、オリゴヌクレオチドまたはプライマー。

まず、本出願において使用される用語のいくつかを、以下に詳細に説明する：
ヘテロデラ属は、様々な種、例えばHeterodera amygdali、Heterodera arenaria、Heterodera aucklandica、Heterodera avenae、Heterodera bergeniae、Heterodera bifenestra、Heterodera cacti、Heterodera cajani、Heterodera canadensis、Heterodera cardiolata、Heterodera carotae、Heterodera cicero、Heterodera cruciferae、Heterodera delvii、Heterodera elachista、Heterodera filipjevi、Heterodera gambiensis、Heterodera glycines、Heterodera goettingiana、Heterodera hordecalis、Heterodera humuli、Heterodera latipons、Heterodera longicaudata、Heterodera medicaginis、Heterodera oryzae、Heterodera oryzicola、Heterodera rosii、Heterodera rostochiensis、Heterodera sacchari、Heterodera schachtii、Heterodera tabacum、Heterodera trifolii、Heterodera ustinoviおよびHeterodera zeae種を含む。

ヌクレオチド配列の長さの詳述との関連で、「約」の用語は、＋／－２００塩基対、好ましくは＋／－１００塩基対、特に好ましくは＋／－５０塩基対の偏差を意味する。

「ベタ属の植物」とは、アマランス科（ヒユ科）に属する。これらの植物の中での番号付けは、Beta macrocarpa、Beta vulgaris、Beta lomatogona、Beta macrorhiza、Beta corolliflora、Beta trigyna、およびBeta nana種の植物である。Beta vulgaris種の植物は、特にBeta vulgaris subsp. vulgaris亜種の植物である。例えば、これらの中の番号付けは、Beta vulgaris subsp. vulgaris var. altissima（狭義のテンサイ）、Beta vulgaris ssp. vulgaris var. vulgaris（フダンソウ）、Beta vulgaris ssp. vulgaris var. conditiva （ビートルート／レッドビート）、Beta vulgaris ssp. vulgaris var. crassa/alba（飼料用ビート）である。本発明による核酸は、テンサイ、フダンソウ、ビートルート、または飼料用ビートにおいて天然では生じないが、人の行為を介してこれらの中に導入することができることに留意されたい。

ヌクレオチド配列の「機能的フラグメント」とは、機能的フラグメントが由来する完全なヌクレオチド配列の機能と同一または同等の機能を有するヌクレオチド配列のセグメントを意味する。このように、機能的フラグメントは、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、または９９％の長さにわたって、全体のヌクレオチド配列と同一または相同であるヌクレオチド配列を有してよい。これはまた、９０～１００％の範囲を明示的に含む。さらに、ヌクレオチド配列の「機能的フラグメント」は、例えば転写後または転写遺伝子サイレンシングの過程で、全体のヌクレオチド配列の機能性を修飾するヌクレオチド配列のセグメントを意味しうる。このように、ヌクレオチド配列の機能的フラグメントは、全体のヌクレオチド配列の少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５、好ましくは少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、または１４０、特に好ましくは少なくとも１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００の連続するヌクレオチドを含んでいてよい。これはまた、２１～５０のヌクレオチドの範囲を明示的に含む。

タンパク質の「機能的部分」とは、タンパク質のセグメント、またはタンパク質をコードするアミノ酸配列のセクションを意味し、このセグメントは、植物細胞内の全体のタンパク質と同一または同等の機能性を発揮してよい。少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、または９９％の長さにわたり、タンパク質の機能的部分は、機能的部分が由来するタンパク質に対して同一であるか、または保存的および半保存的アミノ酸交換を考慮して類似するアミノ酸配列を有する。

「異種」の用語は、導入されたポリヌクレオチドが、同じ種または異なる種の異なる遺伝的背景を有する細胞または生物に由来するか、または原核生物または真核生物の宿主細胞に対して相同であるが、異なる遺伝子環境に位置し、したがって天然に存在するかもしれない対応するポリヌクレオチドとは異なることを意味する。異種ポリヌクレオチドは、対応する内因性遺伝子に対して付加的に存在してよい。

本発明の意味において、「ホモログ」とは、同じ系統学的起源のタンパク質であると理解され、「アナログ」とは、同じ機能を発揮するが、異なる系統学的起源を有するタンパク質であると理解され、「オルソログ」とは、同じ機能を発揮する異なる種からのタンパク質であると理解され、「パラログ」とは、重複により種内に出現したタンパク質であり、このコピーは、同じタンパク質機能を保持するか、その発現テンプレートが変わるが機能は変わっていないか、そのタンパク質機能が変更されるか、または両方のコピー間で元の遺伝子機能が分割されているかのいずれかであると理解される。

「ハイブリダイジング」または「ハイブリダイゼーション」とは、一本鎖核酸分子が、最大限可能な範囲に対して相補的である核酸鎖に結合するプロセス、すなわちこれと塩基対形成するプロセスであると理解される。ハイブリダイゼーションのための標準的方法は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001に記載されている。好ましくは、これにより、核酸分子の塩基の少なくとも６０％、より好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、または８５％、特に好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が、最大限可能な範囲に対して相補的である核酸鎖と塩基対を形成することが理解される。このようなアニーリングの可能性は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。「ストリンジェンシー」の用語は、ハイブリダイゼーション条件に関連している。高いストリンジェンシーは、塩基対形成がより困難になる場合に存在し、低いストリンジェンシーは、塩基対形成がより簡単に行われる場合に存在する。例えば、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、塩濃度またはイオン強度および温度に依存する。一般に、ストリンジェンシーは、温度を上げることによっておよび／または塩濃度を下げることによって高めてよい。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、ハイブリダイゼーションが主に相同の核酸分子間でのみ起こる条件であると理解される。したがって、「ハイブリダイゼーション条件」の用語は、核酸の目下の添加において一般的な条件に関するだけでなく、引き続く洗浄ステップにおいても一般的な条件にも関する。例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、主に、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸分子だけがハイブリダイズする条件である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、例えば：６５℃で４×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーションに引き続き６５℃で０．１×ＳＳＣ中で全体で約１時間洗浄を繰り返すことである。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェントな条件下で起こる。

二本鎖ＤＮＡの形の核酸に関連して、「相補的」ヌクレオチド配列は、第１のＤＮＡ鎖に相補的な第２のＤＮＡ鎖が、塩基対形成の規則に従って、第１の鎖の塩基に対応するヌクレオチドを有することを意味する。相補的配列は、好ましくは、逆配列に対して完全に相補的であり、したがって好ましくは同じ長さを有する。

「単離された核酸分子」とは、その天然の環境または元の環境から抽出された核酸分子である。この用語はまた、合成により製造された核酸分子も包含する。「単離されたポリペプチド」とは、その天然の環境または元の環境から抽出されたポリペプチドであると理解される。この用語はまた、合成により製造されたポリペプチドも包含する。

「分子マーカー」は、植物個体群において多形であり、参照点または配向点として使用される核酸である。組換えイベントを検出するためのマーカーは、植物個体群中の差異または多形を監視するために適しているべきである。よって、このようなマーカーは、様々な対立形質状態（対立遺伝子）を検知しかつそれらを区別することを可能にする。「分子マーカー」の用語はまた、ゲノム配列、例えばプローブまたはプライマーとして使用される核酸に対して、相補的であるか、または少なくとも十分に相補的であるかまたは相同であるヌクレオチド配列にも関する。ＤＮＡレベルでのこれらの差異は、マーカーとして見ることができ、例えばポリヌクレオチド配列の差異、例えばＳＳＲ（単純配列反復）、ＲＦＬＰ（制限フラグメント長多形）、ＦＬＰ（フラグメント長多形）またはＳＮＰ（一塩基多型）である。マーカーは、ゲノム核酸または発現核酸、例えばスプライシングＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＥＳＴから誘導されてよく、プローブまたはプライマーペアとして使用され、かつＰＣＲに基づく方法を用いて配列フラグメントを増幅するために適している核酸にも関していてよい。（個体群の部分間の）遺伝子多形を説明するマーカーは、先行技術から十分に確立された方法を用いて検出されてよい（An Introduction to Genetic Analysis, 7th edition, Griffiths, Miller, Suzuki, et al., 2000）。例えば、これらの中で、ＤＮＡ配列決定、ＰＣＲに基づく配列特異的増幅、ＲＦＬＰの検証、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＡＳＨ）によるポリヌクレオチド多形の検証、植物ゲノムの増幅された可変配列の検出、３ＳＲ（自立配列複製）の検出、ＳＳＲ、ＳＮＰ、ＲＦＬＰ、またはＡＦＬＰ（増幅フラグメント長多形）の検出である。さらに、ＥＳＴ（発現配列タグ）およびＥＳＴ配列から誘導されるＳＳＲマーカーおよびＲＡＰＤ（ランダム増幅多形ＤＮＡ）の検出方法も公知である。この文脈に応じて、この記述内の「マーカー」の用語は、特定のマーカー（例えば、ＳＮＰ）が見出されてよい種のゲノム内の特定の染色体位置を意味しうる。

マーカーはまた、１つ以上の検出分子と接続されていてよい合成オリゴヌクレオチドを含み、検出分子は、検出反応のためまたは検証方法の範囲内で信号の生成のために使用されてよい。合成オリゴヌクレオチドはまた、標識されたプライマーも含む。標識されたプライマーは、人工化合物であり、天然では生じることはなく、天然から単離することもできない。このような化合物の製造を、以下にさらに説明する。

「プロモーター」は、典型的にコード領域の上流にある翻訳されない調節ＤＮＡ配列であり、ＲＮＡポリメラーゼについての結合点を含み、ＤＮＡの転写を開始する。プロモーターはさらに、遺伝子発現のためのレギュレータ遺伝子として作用する他のエレメント（例えば、シス調節エレメント）を含む。「コアまたはミニマルプロモーター」は、転写開始のために必要な基本エレメントを有するプロモーター（例えば、ＴＡＴＡボックスおよび／またはイニシエーター）である。

「病原体」は、植物との相互作用において、植物内の１つ以上の器官内で病気の症状を引き起こす生物を意味する。本明細書で使用される場合、病原体は、線虫、特にヘテロデラ属の線虫を意味する。

「病原性感染」とは、病原体が植物宿主組織と相互作用する最も早い時点であると理解される。この意味で、「寄生」は、病原体と宿主との間での接触の発生を意味する。Heterodera schachtiiの場合、シストが土壌中で活性化され、第二ステージの幼虫への発育が完了すると幼虫が孵化し、宿主植物の根に寄生する。線虫は、根端の背後の成長区域に侵入し、根細胞の融合細胞への変換を開始する（特別な摂食構造）。融合細胞は、線虫が成虫に発育すると同時に増加し、根の機能の障害を引き起こすことがあり、これが、作物の性能を制限し、収穫量損失が生じる。宿主植物なしでは、Heterodera schachtiiは、土壌中のシスト内で数年生き続けることができる。

植物「器官」とは、例えば、葉、新芽、茎、根、胚軸、枝芽、分裂組織、胚、葯、胚珠、種子、または果実を意味する。「植物部分」は、新芽または柄、葉、花、花序、根、果実、および種子、ならびに花粉を含むが、これらに限定されるものではない。「植物部分」の用語はまた、複数の器官の連合体、例えば花または種子、または器官の一部、例えば植物の新芽の断面を意味する。植物「組織」は、例えば、カルス組織、貯蔵組織、分裂組織、葉組織、新芽組織、根組織、植物腫瘍組織、または再生組織、ならびに形成層、実質組織、維管束組織、厚膜組織、および表皮である。しかしながら、組織は、この列挙に限定されるものではない。例えば、植物「細胞」とは、例えば、細胞壁またはその凝集体、またはプロトプラストを有する単離された細胞であると理解される。

本発明との関連で、「調節配列」の用語は、例えば、調節配列が定義された組織特異性を付与する特異性および／または発現強度に影響を与えるヌクレオチド配列に関する。このような調節配列は、ミニマルプロモーターの転写開始点の上流に位置していてよいが、その下流に、例えば、転写されているが翻訳されていないリーダー配列内にまたはイントロン内に位置していてよい。「調節配列」の用語はまた、プロモーター全体またはプロモーター内で使用するために適したシスエレメントを包含することができる。

「耐性」の用語は、広義に理解されるべきであり、病気の進行の遅延から完全な遮断までの防御の範囲をカバーする。重要な病原体の一例は、Heterodera schachtiiである。本発明の耐性植物細胞または本発明の耐性植物は、好ましくは、線虫の増殖を制限する植物の能力として定義されるHeterodera schachtiiに対する耐性を達成する。例えば、耐性の向上は、土壌試料を採取し、線虫の数を決定するかおよび／または植物の根に形成されたシストの量を決定することにより測定することができる。

「トランスジェニック植物」は、ゲノムが少なくとも１つのポリヌクレオチドに組み込まれている植物に関する。したがって、これは、異種ポリヌクレオチドまたは外因性ポリヌクレオチドであってよい。このポリヌクレオチドは、好ましくは安定して組み込まれ、これは、組み込まれたポリヌクレオチドが、植物中に安定して保存され、発現され、また安定して子孫に受け継がれてよいことを意味する。ポリヌクレオチドを、植物のゲノム内へ安定して導入することはまた、前の親世代の植物のゲノム内への組み込みも含み、このポリヌクレオチドは、さらに安定して受け継がれてよいことを含む。「異種」の用語は、導入されたポリヌクレオチドが、異なる遺伝的背景を有する細胞または生物に由来し、この細胞または生物は、同じ種または異なる種に属してよいかまたは原核生物または真核生物の宿主細胞に対して同種であるが、例えば異なる遺伝的環境に位置していて、よって、天然に存在することができる対応するポリヌクレオチドとは異なることを意味する。異種ポリヌクレオチドは、対応する内因性遺伝子に対して付加的に存在してよい。

本明細書で使用する場合、植物は、あらゆる双子葉植物または単子葉植物、特にヒユ科の植物、例えばBeta vulgarisおよびSpinacia oleracea、およびアブラナ科の植物、例えばBrassica napus、Brassica oleracea、Brassica rapa、Raphanus sativus、Brassica juncacea、Brassica nigra、Eruca vesicaria subsp. sativaを意味する。

本発明の構想および実施形態は、添付の配列および図面を参照して例として説明される。

第５染色体上の標的領域内の配列マッピングおよび配列アセンブリングの図（ｘ軸：数千塩基対の物理的距離（１ｋ＝１０００ｂｐ））を表す：上側部分は、９つの注釈付けられた遺伝子（＃１～＃９）のアセンブリング；矢印の方向は、それぞれの推定される遺伝子の５’－３’方向を示す。中央部分は、B. vulgaris subsp. maritima（ＢＭ）からの獲得物の多様な遺伝子移入の図、組換えイベントは、その局在化に従って示されている。下側部分は、配列番号１、４および７による候補遺伝子ＬＲＲ１、ＬＲＲ２およびＬＲＲ３の物理的マッピング。

発明の詳細な説明
本発明は、植物、特にBeta vulgaris種の植物、さらに好ましくはBeta vulgaris subsp. vulgaris中に存在する場合、ヘテロデラ属の病原体に対する耐性を付与することができる核酸分子に関する。特に、この核酸分子は、核酸分子によりコードされるポリペプチドを発現する植物中で、ヘテロデラ属の病原体に対する耐性を付与する。本発明の好ましい実施形態では、病原体は、テンサイの最も重大な病原性線虫であり、８０％までの収穫量損失を引き起こすことがあるHeterodera schachtiiである。Heterodera schachtiiは、テンサイだけでなく、レッドビートもしくはシルバービート、ルバーブおよびホウレンソウのような他のビートにおいても、ならびにキャベツ、ハクサイ、カリフラワー、芽キャベツ、ブロッコリー、カブ、ハツカダイコンおよびスウェーデンカブのようなアブラナ属の野菜作物においても、根系に深刻なダメージを与えることにより、かなりの収穫量損失を引き起こすことがある。

本発明は、植物、特にBeta vulgaris subsp. vulgaris中での存在が、ヘテロデラによる感染に対する植物の耐性に相関するかまたはその耐性を引き起こす、ドナーのBeta vulgaris subsp. maritimaに由来する遺伝子および遺伝子座のそれぞれの遺伝子ファインマッピング、同定、単離、および特性決定に基づく。最初の材料は、フランスで採取されたBeta vulgaris subsp. maritima個体群であった（Hijner 1951）。

集中的なファインマッピングおよびマップベースクローニングにより、耐性遺伝子座が同定されかつ配列決定され、耐性の遺伝子型と感受性の参照遺伝子型との間の配列比較が可能になった（図１）。耐性遺伝子座は、大きな配列重複を含み、特に感受性遺伝子型内でいくつかのレトロトランスポゾンが、標的領域内に埋め込まれているため、標的領域は、高度な複雑性を有することが示された。この耐性遺伝子座は、ヘテロデラに対する耐性を付与する候補遺伝子として同定された３つのタンデム反復ＬＲＲ遺伝子（ＬＲＲ１、ＬＲＲ２およびＬＲＲ３）を含む７つの注釈付けられた遺伝子を含み、この３つのＬＲＲ遺伝子は、配列類似性を示すことがわかった。

したがって、本発明は、好ましくはヘテロデラ属の病原体に対する、特にHeterodera schachtiiに対する耐性を付与する核酸分子および前記核酸分子によりコードされるポリペプチドのそれぞれに関する。本発明の核酸分子は、特に、ベタ属の植物中で、この病原体に対する耐性を付与する。本発明による核酸分子は、単離された核酸分子であってよい。これは、好ましくはＤＮＡであり、特に好ましくはｃＤＮＡ（コーディングＤＮＡ）である。植物は、好ましくは、Beta vulgaris種の植物であり、特に好ましくはBeta vulgaris subsp.vulgaris亜種の植物であり、これらの中には、栽培品種のテンサイ、ビートルート、飼料用ビート、フダンソウ、スイスチャードがある。

本発明の一実施形態では、本発明による核酸分子は、配列番号１、４および７のいずれか１つに記載のＤＮＡ配列および／または配列番号２、５および８のいずれか１つによるコード配列を含むヌクレオチド配列を含む。さらに、本発明は、配列番号３、６および９の１つによるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供する。

上述のように、本発明により同定された遺伝子は、特定の構造モチーフにより特徴付けられるタイプＮＢＳ－ＬＲＲの耐性遺伝子／タンパク質である。植物におけるこのような耐性タンパク質の一般的構造は、既に十分に調査されている（Martin et al., Annual Review Plant Biology 54 (2003), 23-61）。しかしながら、構造的実施形態の原理、特に、ＬＲＲドメインとして公知の、ほとんど未知の病原性エフェクターに対する潜在的検出ドメインとして適用される原理は予測できず、耐性遺伝子の機能的背景、すなわち遺伝子構造は、一般的にほとんど未知である。それ故、公知の構造モチーフに基づくだけのヘテロデラ耐性を付与する遺伝子またはタンパク質の同定は不可能である。さらに、耐性遺伝子座は大きな配列重複を含み、感受性遺伝子型内でいくつかのレトロトランスポゾンが標的領域内に埋め込まれているため、この配列領域は、高度な複雑性を有することが示され、このことが、診断マーカーの開発、ならびに配列データのアッセンブリを特に困難にしている。

さらに、置換、欠失、挿入、付加および／または他の任意の変化が、単独でまたは組み合わせて、本発明によるヌクレオチド配列のＤＮＡ配列内へ導入され、実際にヌクレオチド配列を変化させてよいが、この場合、修飾されたヌクレオチド配列は、当初の配列と同じ機能を実行してよい。本事例は、本発明の未修飾の核酸配列の対立遺伝子または誘導体であり、植物中に存在する場合、ヘテロデラ属の病原体に対して、特にHeterodera schachtiiに対する耐性を付与するＤＮＡ配列を含む核酸配列を包含する。さらに、本事例は、ヘテロデラ属の病原体に対する、特にHeterodera schachtiiに対する耐性を付与するアミノ酸配列のコーディングを扱う。したがって、他の実施形態では、本発明は、本発明によるヌクレオチド配列によりコードされるか、または本発明によるアミノ酸配列を含むポリペプチドの誘導体を表すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。１つ以上のアミノ酸の少なくとも１つの置換、欠失、挿入、または付加を有するが、コードされたポリペプチド／タンパク質の機能が保存されている誘導アミノ酸配列は、ポリペプチドの誘導体を表す。実際にヌクレオチド配列を変更するが、当初の配列と同じ機能を実行する、単独でのまたは組み合わせた置換、欠失、挿入、付加、および／または他の変更は、したがって、先行技術において公知の従来の方法、例えば部位特異的突然変異誘発、ＴＩＬＬＩＮＧ、ＰＣＲ媒介突然変異誘発、化学的に誘導された突然変異誘発、ゲノム編集などを用いてヌクレオチド配列内へ導入されてよい。

同じまたは同等または類似の化学的／物理的特性を有する異なるアミノ酸による１つのアミノ酸の置換は、「保存置換」または「半保存置換」と言われる。アミノ酸の物理的／化学的特性の例は、例えば疎水性または電荷である。どのアミノ酸置換が、保存置換または半保存置換を表すのかは、当業者に公知である。さらに、一般的専門技術により、当業者は、どのアミノ酸の欠失および付加が、耐性タンパク質の機能に無害であるか、およびどの位置で可能なのかを認識、識別、および検出することができる。当業者は、本件のＮＢＳ－ＬＲＲタンパク質の場合、アミノ酸配列の修飾（１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加）について、機能性、特に保存されたドメインの機能性は、保護されなければならず、したがって制限された上述の修飾だけが、このドメインにおいて可能であることを知っている。

したがって、本発明は、本発明によるヌクレオチド配列の機能的フラグメントを含む。したがって、「フラグメント」の用語は、上述のヌクレオチド配列に十分に類似したヌクレオチド配列を有する遺伝子を含む。「十分に類似」の用語は、第１のヌクレオチド配列または第１のアミノ酸配列が、第二のヌクレオチド配列または第二のヌクレオチド配列に対して、十分な数のまたは最小の数の同一もしくは同等のヌクレオチドまたはアミノ酸基を有することを意味する。

アミノ酸配列に関して、例えば後述される方法によって修飾した後に、これはまた、共通の構造ドメインを有しおよび／または共通の機能的活性を有する。本発明によるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の同一性を有するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、本明細書では十分に類似していると定義される。これはまた、９０％～１００％の範囲も明示的に包含する。機能的フラグメントについて、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、一般に、本発明の先に挙げたヌクレオチド配列またはアミノ酸と同じ特性を有する場合に十分な類似性が確立される。誘導体をコードするかまたは誘導されたアミノ酸配列をコードするこれらのヌクレオチド配列は、全長にわたってまたは少なくとも部分的に、本発明によるヌクレオチド配列に対応する当初のヌクレオチド配列から直接的にまたは間接的に（例えば増幅または複製ステップを介して）生成される。

したがって、本発明は、ストリンジェントな条件下で、本発明によるヌクレオチド配列または本発明によるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は、好ましくは植物中に存在しかつ／または発現する場合、ヘテロデラ属の病原体に対する耐性を付与することができる。

さらに、遺伝コードは冗長であり、これによりアミノ酸配列を明示する多数の三塩基対コドンの組合せを示すことは、一般的に公知である。したがって、本発明は、遺伝コードの縮重による変異体ＤＮＡ配列を含み、この変異体ＤＮＡ配列は、それでもなお好ましくは、植物中に存在しかつ／または発現する場合、ヘテロデラ属の病原体に対する耐性を付与することができる。

本発明の一実施形態では、本発明の核酸分子は、単独でまたは組み合わせて、好ましくは植物中に存在しかつ／または発現する場合、ヘテロデラ属の病原体に対する耐性を付与する、より好ましくはヘテロデラ属の病原体に対する耐性は、Heterodera schachtiiに対する耐性でありおよび／または植物は、Beta vulgaris subsp. vulgaris亜種の植物である。

本発明による核酸分子または本発明の耐性遺伝子座の記載された組合せは、好ましくは、植物中に存在する場合および／または植物中で発現する際に、これらはヘテロデラ属の病原体に対する、好ましくはHeterodera schachtiiに対する優勢な耐性効果を付与するか、またはこれらはヘテロデラ属の病原体に対する、好ましくはHeterodera schachtiiに対する優勢な耐性効果を付与することができるポリペプチドをコードすることを特徴とする。

したがって、本発明の一実施形態では、少なくとも２つまたは３つの核酸分子の組合せが、好ましくは植物中に、好ましくはBeta vulgaris subsp. vulgaris亜種の植物中に存在しかつ／または発現する場合、ヘテロデラ属の病原体に対する、特にHeterodera schachtiiに対する耐性を付与し、ここで、少なくとも２つまたは３つの核酸分子は、以下のものからなる群から選択される：
（ａ） 配列番号１に記載のＤＮＡ配列、配列番号２に記載のｃＤＮＡ配列を含み、配列番号１または２によるヌクレオチド配列の相補的配列とハイブリダイズし、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、および／または核酸配列およびアミノ酸配列の上述の対立遺伝子、誘導体または変異体の１つである、本発明のヌクレオチド配列を含む核酸分子；
（ｂ） 配列番号４に記載のＤＮＡ配列、配列番号５に記載のｃＤＮＡ配列を含み、配列番号４または５によるヌクレオチド配列の相補的配列とハイブリダイズし、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、および／または核酸配列およびアミノ酸配列の上述の対立遺伝子、誘導体または変異体の１つである、本発明のヌクレオチド配列を含む核酸分子；
（ｃ） 配列番号７に記載のＤＮＡ配列、配列番号８に記載のｃＤＮＡ配列を含み、配列番号７または８によるヌクレオチド配列の相補的配列とハイブリダイズし、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、および／または核酸配列およびアミノ酸配列の上述の対立遺伝子、誘導体または変異体の１つである、本発明のヌクレオチド配列を含む核酸分子。

本発明の特別な実施形態では、（ａ）および（ｂ）に記載される２つの核酸分子の組合せは、植物中に、好ましくはBeta vulgaris種の植物中に存在する場合、ヘテロデラに対する、特にHeterodera schachtiiに対する耐性を付与する。

本発明の別の特別な実施形態では、（ａ）および（ｃ）に記載される２つの核酸分子の組合せは、植物中に、好ましくはBeta vulgaris種の植物中に存在する場合、ヘテロデラに対する、特にHeterodera schachtiiに対する耐性を付与する。

本発明の別の特別な実施形態では、（ｂ）および（ｃ）に記載される２つの核酸分子の組合せは、植物中に、好ましくはBeta vulgaris種の植物中に存在する場合、ヘテロデラに対する、特にHeterodera schachtiiに対する耐性を付与する。

この組合せは、１つ以上の核酸分子であってよい。しかしながら、この組合せは、キット内に含まれていることもできる。この組合せがキット内に含まれる場合、上記の組合せの核酸（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）は、１つの核酸分子の全体の部分であることができるか、または個別の核酸分子の一部であることができる。

この文脈において、先に定義された組合せによってコードされるポリペプチド／タンパク質もまた本発明の一部である。タンパク質の組合せは、キット中に含まれていることができ、このキットも本発明の一部である。

さらに、上述の核酸分子の組合せを含む植物は、本発明の一部である。この組合せは、遺伝子導入または内因性によって植物の部分にすることができる。さらに、これらの配列の１つまたは２つは、遺伝子導入物質としての植物の部分であり、他の１つまたは２つの配列は、内因性物質として植物の部分であることができる。

別の実施形態では、本発明による核酸分子は、好ましくは植物中に存在する場合または植物中で発現する際に、既にそれ自体が、ヘテロデラ属の病原体に対する、好ましくはHeterodera schachtiiに対する優勢の耐性効果を付与するか、またはヘテロデラ属の病原体に対する優勢の耐性効果を付与することができるポリペプチドをコードすることを特徴とする。

したがって、一実施形態では、本発明の核酸分子の組合せの文脈で、（ｂ）に記載された核酸分子は、好ましくは植物中に、特にBeta vulgaris subsp. vulgaris亜種の植物中に存在しかつ／または発現する場合、ヘテロデラ属の病原体に対する、特にHeterodera schachtiiに対する耐性を付与する。

別の実施形態では、本発明の核酸分子の組合せの文脈で、（ｃ）に記載された核酸分子は、好ましくは植物中に、特にBeta vulgaris種の植物中に存在しかつ／または発現する場合、ヘテロデラ属の病原体に対する、特にHeterodera schachtiiに対する耐性を付与する。

好ましい実施形態では、本発明の核酸分子の組合せの文脈で、（ａ）に記載された核酸分子は、植物中に、特にBeta vulgaris subsp. vulgaris亜種の植物中に存在しかつ／または発現する場合、ヘテロデラ属の病原体に対する、特にHeterodera schachtiiに対する耐性を付与する。

既に上述のように、今までは、ヘテロデラ耐性Beta vulgaris subsp. vulgaris植物は、ヘテロデラ耐性の肯定的な形質と関連する付加的遺伝子の継承により、例えば収穫量の減少のような不所望な形質を導入することなく作り出すことはできなかった。したがって、記述された耐性を有する栽培品種の欠点は、複雑な遺伝のために栽培品種開発において極めて骨が折れかつ面倒であることにあり、このような栽培品種では、寄生の不存在では、通常の栽培品種と比べて収穫量性能が著しく劣ることにある。とりわけ、これは、いくつかの耐性遺伝子が糖生産を担う遺伝子とエピジェネティックな相互作用に関連することがあり、これが病原体の不存在では植物の適応度の低下を導く。

さらに、耐性を克服するHeterodera schachtii変異体の危険性を打ち消す、ビートシストセンチュウに対する持続的育種のために、新しい耐性遺伝子を継続的に同定し、これらをテンサイのような栽培植物の遺伝子プールに組み込む必要がある。

この文脈で、本発明者らは、著しく簡素化された育種のために使用されてよい新規ヘテロデラ耐性遺伝子を初めて単離しかつ同定した。この遺伝子の、優良種系統への標的化され促進された取り込みによって、高いヘテロデラ耐性を有する極めて高い収穫量の変異体を極めて迅速に開発し、従来の耐性を克服したヘテロデラ変異体に対する対策において使用することができる別の耐性遺伝子を提供することが可能となった。本発明による耐性付与配列の１つ以上の遺伝子移入のための可能な到達は、例えばB. vulgaris subsp. maritimaの個体群のスクリーニングにより得られた。このスクリーニングは、本発明による１つ以上の耐性付与配列を含む植物の同定に依存することができる。この同定は、本明細書の他の箇所に記載されているように実施することができる。好ましくは、スクリーニングまたは同定は、耐性遺伝子座を診断する分子マーカーの使用を含む。さらに、耐性付与配列を含む植物は、CPO Wageningen, Postbus 18, 6700 AA Wageningen/NLから、例えばaccession BMHから取得することができる。

したがって、本発明の枠組み内で、ヘテロデラ属の病原体に対する、特にHeterodera schachtiiに対する本発明による耐性を有し、したがって本発明に包含されるテンサイ植物、フダンソウ植物、レッドビートもしくはビートルート植物、飼料用ビート植物のようなBeta vulgaris subsp. vulgaris植物が初めて提供される。列挙された植物は全て栽培植物であるため、本発明による耐性を有する農業栽培に適した作物または植物は、本発明の一部である。特に、食品、原材料、または砂糖または他の化合物の工業的原料として使用可能な地下貯蔵器官を備え、かつ本発明による耐性を有するこのような作物は、本発明の一部であり、本発明の別の態様である。この貯蔵器官は、例えば、スクロースを含むテンサイのこのビート本体、レッドビートの消費可能なビート本体、または飼料用ビートの飼料として与えることが可能なビート本体であることができる。この地下貯蔵器官は、成熟した植物の全バイオマスの５０％超、テンサイの場合にはさらに７０％超であることができる。さらに、これらの植物の種子または種子材料も、本発明の一部である。種子または種子材料は、以下にさらに記載されるように、技術的に処理されることができる。

この文脈で、本発明はまた、配列番号３、６および９のいずれか１つによるタンパク質をコードする核酸を含み、特別な実施形態では、配列番号１、４および７のいずれか１つによる天然由来の核酸は除外される。

さらに、本発明は、本発明による核酸分子の配列を含む組換えおよび／または異種ＤＮＡ分子に関する。このＤＮＡ分子は、さらに、好ましくは調節配列を有する。これにより、このＤＮＡ分子は、調節配列と機能的に連結されていてよいか、またはこの調節配列の影響下にあってよい。この調節配列は、好ましくは、プロモーター配列および／または転写もしくは翻訳制御エレメント、例えばシスエレメントの他の配列である。本発明による核酸分子を含む遺伝子の発現を制御する調節配列は、好ましくは、病原性感染の結果として、発現を付与または調節することができる配列である。このプロモーターは、好ましくは、植物の根の中で特異的にＤＮＡ配列の発現を制御することができる。この調節配列は、発現配列と異種であってよい。このようなアプローチは、当業者が、発現させる配列の発現速度、発現を引き起こす組織、および発現を引き起こす時点をより良好に調節してよく、それぞれの使用状況に最適な調節配列を選択してよいという利点を有する。異種ＤＮＡ配列は、好ましくは、植物病原体防御の構成要素（例えば、耐性遺伝子（Ｒ遺伝子）または信号伝達に関与する酵素、例えばキナーゼもしくはホスファターゼをコードする遺伝子、およびＧタンパク質について、または病原性エフェクターをコードする遺伝子（いわゆる、非病原性遺伝子（ａｖｒ）））をコードするヌクレオチド配列を含む。異種ＤＮＡ配列は、本発明によるＤＮＡ配列の１つであってよい。異種ＤＮＡ配列はまた、付加的に植物病原体防御の別の構成要素をコードしてもよい。したがって、異種ＤＮＡ配列は、多シストロン性ｍＲＮＡがその転写後に作製されるように設計されていてよい。

本発明はさらにまた、本発明による核酸分子および機能的および／または免疫学的に活性のそのフラグメントをコードすることができるポリペプチド、ならびにそのポリペプチドまたはそのフラグメントと特異的に結合する抗体にも関する。このポリペプチドは、特に好ましくは、配列番号３、６または９のいずれか１つによるアミノ酸配列を有する。タンパク質、ポリペプチドおよびフラグメントの組換え生産は、当業者にとって周知である（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001、またはWingfield, P. T., 2008, Production of Recombinant Proteins, Current Protocols in Protein Science, 52:5.0:5.0.1-5.0.4）。本発明によるタンパク質に対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、当業者に公知の方法によって生産されてよい（E. Harlow et al., editor, Antibodies: A Laboratory Manual (1988)）。モノクローナル抗体の生産、ならびにタンパク質検出法でも有用であるＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２フラグメントの生成は、多様な従来の方法（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 98-118, New York: Academic Press (1983)）により実施されてよい。次いで、この抗体は、免疫学的スクリーニングによって同一遺伝子、相同遺伝子、または異種遺伝子を同定するための発現ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのために使用されてよく（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989,またはAusubel et al., 1994, “Current Protocols in Molecular Biology.” John Wiley & Sons）、またはウェスタンブロット分析のために使用されてよい。特に、本発明は、本発明によるヘテロデラ耐性付与対立遺伝子によりコードされるポリペプチドを選択的に検出し、本質的に対応する感受性対立遺伝子によりコードされるポリペプチドを選択的に検出しない抗体に関し、すなわち、本発明によるヘテロデラ耐性付与対立遺伝子によりコードされるポリペプチドよりも、対応する感受性対立遺伝子によりコードされるポリペプチドを２倍、好ましくは５倍、より好ましくは１０倍以上少なく検出する抗体に関する。

好ましい実施形態では、本発明による抗体は、天然には生じない合成ポリペプチドであることを特徴とする。

さらに、本発明による抗体は、免疫組織化学的方法で使用可能にするため、例えば抗体の着色を引き起こすために、蛍光染料と連結されていてよい。蛍光染料は、蛍光色素であってよい。本発明による抗体はまた、他のシグナリング分子と連結されて存在していてもよい。これには、例えばビオチン、放射性同位体、リポーター酵素、例えばアルカリホスファターゼ、またはオリゴヌクレオチドがある。

本発明の付加的主題は、場合により調節エレメントの制御下で、特に植物内の機能的調節エレメントの制御下で、ならびにネガティブおよび／またはポジティブな選択マーカーの制御下で、本発明による核酸分子または組換えＤＮＡ分子を含むベクターまたは発現カセットである。これにより、ベクター骨格は、本発明による核酸分子に対して異種であり、これは、このようなベクターが天然には存在せず、天然から単離することができないことを意味する。このベクターは、プラスミド、コスミド、ファージまたは発現ベクター、形質転換ベクター、シャトルベクターまたはクローニングベクターであり、これは、二本鎖または一本鎖、線状または環状であってよく、またはこれは、このゲノム内へのまたは染色体外による組み込みにより原核生物または真核生物を形質転換してもよい。発現ベクターまたは発現カセット内の本発明による核酸分子またはＤＮＡ分子は、好ましくは、原核細胞または真核細胞内での転写および場合により発現を可能にする１つ以上の調節配列と作動的に連結されている（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001）。これらの調節配列は、好ましくはプロモーターまたはターミネーター、特に転写開始点、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセッシングシグナル、転写終結部位、および／またはポリアデニル化シグナルである。例えば、核酸分子は、ここでは、適切なプロモーターおよび／またはターミネーターの制御下にある。適切なプロモーターは、構成性プロモーターであってよい（例：「カリフラワーモザイクウイルス」からの３５Ｓプロモーター（Odell et al., Nature 313 (1985), 810 - 812）、この病原誘導性であるプロモーターは、特に適切である（例：パセリからのＰＲ１プロモーター（Rushton et al., EMBO J. 15 (1996), 5,690-5,700））。特に適切な病原誘導性プロモーターは、天然には生じない合成プロモーターまたはキメラプロモーターであり、複数のエレメントから構成され、ミニマルプロモーターを含み、ミニマルプロモーターの下流に少なくとも１つのシス調節エレメントを有し、少なくとも１つのシス調節エレメントは、特別な転写因子のための結合部位として機能する。キメラプロモーターは、所望の要件に従って設計され、多様な因子を介して誘導または抑制される。このようなプロモーターの例は、国際公開第００／２９５９２号、国際公開第２００７／１４７３９５号、および国際公開第２０１３／０９１６１２号に見られる。例えば、適切なターミネーターは、ｎｏｓターミネーターである（Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 561-573）。適切なプロモーターおよびターミネーターはまた、天然のプロモーターおよび天然のターミネーターであってもよい。ベクターまたは発現カセットは、遺伝子の発現を介した直接的な検出がほとんどの場合困難であるため、所望のベクターまたはＤＮＡ分子／核酸分子の転移を検出するために、およびこれらを含む個体を選択するために、従来のインジケーター遺伝子／リポーター遺伝子または耐性遺伝子を付加的に含む。本発明による核酸分子自体は、ここではビートシストセンチュウに対する耐性を付与するポリペプチドをコードするため、付加的耐性遺伝子を提供することは植物内での発現にとって必須ではないが、迅速な選択を可能にするために推奨される。

インジケーター遺伝子／リポーター遺伝子の例は、例えばルシフェラーゼ遺伝子および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子である。さらに、これらはまた、遺伝子のプロモーターの活性および／または調節についての試験を可能にする。特に植物の形質転換のための耐性遺伝子の例は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、またはホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。付加的なポジティブな選択マーカーは、形質転換されていない植物に対する選択の利点、特に栄養素の利点を、形質転換された植物に提供する酵素、例えばマンノース－６－ホスファートイソメラーゼまたはキシロースイソメラーゼであってよい。しかしながら、当業者に公知の付加的なインジケーター遺伝子／リポーター遺伝子または耐性遺伝子を排除するものではない。好ましい実施形態では、ベクターは、植物ベクターである。さらに、発現カセットは、植物ゲノム内に組み込まれて存在してよい。

別の態様では、本発明は、本発明によるベクター、組換えＤＮＡ分子、および／または核酸分子を含む細胞に関する。本発明の意味で細胞は、原核生物（例えば、細菌）または真核生物細胞（例えば、植物細胞または酵母細胞）であってよい。この細胞は、好ましくは、Agrobacterium tumefaciensまたはAgrobacterium rhizogenesのようなアグロバクテリウム、Escherichia coli細胞、または植物細胞であり、植物細胞は、特に好ましくはベタ属の植物、Beta vulgaris種、またはBeta vulgaris subsp. vulgaris亜種の細胞である。細胞は、培養物として存在してもよい。したがって、本発明はまた、このような細胞を含む細胞培養物もカバーする。細胞培養物は、好ましくは、他のタイプの細胞を含まない純粋培養物または分離株である。

本発明による核酸分子、組換えＤＮＡ分子、および／または本発明のベクターもしくは発現カセットをアグロバクテリウム内に導入することができる接合またはエレクトロポレーションのような両方の多くの方法、および本発明による核酸分子、ＤＮＡ分子、および／または本発明のベクターを植物細胞内に導入することができる多様な形質転換法（生物学的形質転換、アグロバクテリウム媒介形質転換）の両方は、当業者に公知である（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001）。

さらに、本発明は、好ましくは、ヘテロデラ耐性植物、好ましくはヘテロデラ耐性を付与する本発明による核酸分子を含むBeta vulgaris subsp. vulgaris種の植物またはその部分に関する。ヘテロデラ耐性植物は、本発明による核酸分子を導入遺伝子としてまたは内因性遺伝子として含んでいてよい。本発明の範囲内で、本発明による核酸分子を含むBeta vulgaris subsp. vulgaris亜種の植物は、初めて製造された。本発明はここでまた、本発明による核酸分子を内因性遺伝子として含むBeta vulgaris subsp. vulgarisの植物も含む。

したがって、部分は、細胞、組織、器官、または複数の細胞、組織、または器官の組合せであってよい。複数の器官の組合せは、例えば花または種子である。本発明のヘテロデラ耐性植物は、好ましくは、本発明による核酸分子を含んでいない対応する植物（対照植物）よりも、ヘテロデラ、特にHeterodera schachtiiに対する高められた耐性を示す。この対照植物は、理想的には、本発明の植物と同一の遺伝子型を有し、同一の条件下で栽培されているが、耐性を付与する核酸分子だけを含まない。例えば、ヘテロデラ属の病原体、特にHeterodera schachtiiに対する耐性のレベルは、評価スコアを決定することによりベタ種の植物において定性的に確立されてよい（例えば例１参照）。より高い耐性は、少なくとも１の評価スコア、少なくとも２の評価スコア、および好ましくは最良の３以上の評価スコアによって、耐性における改善が明示される。

本発明による核酸分子を含む本発明の植物細胞または植物またはその部分、特にベタ種の植物は、好ましくは、ヘテロデラ属の病原体に対して、特にHeterodera schachtiiに対して、本発明による核酸分子を含まないか、または核酸分子の感受性対立遺伝子変異体を含んでよい対応する植物細胞または植物またはその部分と比べて高い耐性を示す。ヘテロデラ属の病原体に対する、例えばHeterodera schachtiiに対する耐性のレベルは、評価スコアの決定により、ベタ属の植物内で定性的に確立されてよい。より高い耐性は、少なくとも１の評価スコア、少なくとも２の評価スコア、および好ましくは最良の３以上の評価スコアによって、耐性における改善が明示される。

トランスジェニック植物細胞、または植物もしくはその一部の場合、これは、本発明による核酸分子またはＤＮＡ分子を、本発明の導入遺伝子またはベクターまたは発現カセットとして含む。このようなトランスジェニック植物細胞または植物もしくはその部分は、例えば、本発明による核酸分子、ＤＮＡ分子、または本発明のベクターもしくは発現カセットで、好ましくは安定に形質転換されているものである。好ましい実施形態では、この核酸分子は、転写、および場合により植物細胞内での発現を可能にする１つ以上の調節配列と作動的に連結されている。よって、本発明による核酸分子および調節配列により構成される全体構造は、導入遺伝子を表す。このような調節配列は、例えばプロモーターまたはターミネーターである。植物内に適用可能な多数の機能的プロモーターおよびターミネーターは、当業者に公知である。

本発明はまた、本発明による細胞の液胞、およびその中に貯蔵された含有物質（スクロースなど）を含む。

さらに、本発明はまた、細胞からの、好ましくは植物細胞からの、特に好ましくはBeta vulgarisの細胞からの、殊に好ましくは以下の：テンサイ、フダンソウ、またはビートルートの１つの作物の細胞からの細胞抽出物にも関する。植物は、細胞抽出物から再生することはできない。同様に、本発明による核酸を含む植物ゲノムは、本発明に含まれる。植物は、このような植物ゲノムから再生することはできない。

これにより、細胞抽出物からの糖濃度またはスクロース濃度は、本発明による細胞ではないが、同じ種または同じ作物に属する細胞に対して高められていてよい。これは、特に、ヘテロデラ属の病原体により寄生された場合の条件下で適用される。

糖（スクロース）の生産のためまたは（生）ジュースの生産のため、好ましくはビートルート（生）ジュースの生産のための細胞抽出物の使用もまた、本発明に含まれる。

同様に、本発明による細胞およびその液胞内に含まれる糖、特にスクロースも本発明に含まれる。

本発明の付加的態様は、本発明による核酸分子を含む種子を含む種子ストックである。本発明による核酸分子は、遺伝子組換えによりまたは内因的に存在してよい。種子ストックおよび種子は、技術的に処理されていてよい。よって、本発明はまた、技術的に処理された種子ストックおよび技術的に処理された種子も含む。技術的に処理された種子ストックの多様な実施形態を、以下に詳細に説明するが、この場合、種子ストックの用語は、種子も含む：技術的に処理された種子ストックは、ポリシングされた形で存在してよい。これにより、種子の最も外側の層は、除去され、これにより種子はより丸みを帯びた形になる。これは、播種において役立ち、最適な均一な形状は、種子ストック粒子の均一な分配を引き起こす。技術的に処理された種子ストックは、さらに丸剤化された種子ストックを包含する。したがって、種子ストックは、丸剤化材料上に置かれて、その中に含まれた種子ストックは保護され、より大きな塊にされるため、丸剤化種子ストックは、風ドリフトに関してより大きな抵抗能力を示し、風による吹き飛ばしを受けにくくなり、同時に、播種の際により正確な位置決めが可能となる。本発明の好ましい実施形態では、販売用に示されたバッチまたはユニットの全ての丸剤化シードストック穀物は、本質的に同じ形状および同じ質量を有する。直径および質量における５％の偏差は可能である。しかしながら、この偏差は１％を超えないことが好ましい。主成分の１つとして、丸剤化材料は、例えば、粘土および／または泥炭のような鉱物化合物を含んでよい。付加的に可能な成分は、米国特許第４０６７１４１号明細書に引用されている。さらに、丸剤化材料は、実際の栽培に肯定的な影響を与える付加的化学薬品を含んでいてよい。これらは、施肥剤に数えられる物質であってよい。さらにこれらは、殺菌剤、殺虫剤、および／または摂食阻害剤であってよい。殺菌剤は、チラムおよび／またはヒメキサゾールおよび／または他の殺菌剤であってよい。殺虫剤は、ネオニコチニドの群からなる物質であってよい。ネオニコチニドの群からなる物質は、好ましくはイミダクロプリド（ＡＴＣコード：ＱＰ５３ＡＸ１７）および／またはクロチアニジン（ＣＡＳ番号２１０８８０－９２－５）である。さらに、殺虫剤はまた、シフルトリン（ＣＡＳ番号６８３５９－３７－５）またはベタ－シフルトリンであってもよい。

丸剤化種子ストックは、ドレッシング種子ストックの特別な実施形態である。この文脈で、技術的に処理された種子ストックはまた、ドレッシング種子ストックも含む。しかしながら、本発明は、丸剤化種子ストックに限定されるものではなく、むしろ任意の形のドレッシング種子ストックに適用されてよい。よって、本発明はまた、丸剤化種子ストックを含むドレッシング種子ストックにも関するが、これに限定されるものではない。乾式ドレッシング、湿式ドレッシング、および懸濁物ドレッシングも包含される。したがって、ドレッシングは、少なくとも１つの染料を含んでいてよいため、ドレッシング種子ストックは、ドレッシングされていない種子ストックとは迅速に区別することができ、さらに、播種後に環境内での良好な視認性が保証される。このドレッシングはまた、丸剤化材料の文脈で記載されたような農薬を含んでいてよい。よって、本発明は、このようなドレッシング種子ストックを含み、この場合、ドレッシングは、少なくとも１つの摂食阻害剤、例えば殺虫剤および／または少なくとも１つの殺菌剤を含む。場合により、いわゆる電子的ドレッシング（電気エネルギの供給によるドレッシング）を適用してよい。しかしながら、電子的ドレッシングは、厳密な意味でのドレッシングではない。

技術的に処理された種子ストックの付加的形は、インクラステーション種子ストックである。コーティングとして公知であるものは、この文脈でも、コーティングで処理された種子ストックも同様に語られる。丸剤化種子ストックとの相違は、種子穀物が、当初の形状を保持していることであり、この方法は、特に経済的である。この方法は、例えば、欧州特許出願公開第０３３４２５８号明細書に記載されている。技術的に処理された種子ストックの付加的形状は、スプラウト種子ストックまたはプライミング種子ストックである。スプラウト種子ストックは、予備発芽によって前処理され、プライミング種子ストックは、プライミング（発芽）によって前処理されている。予備発芽種子ストックとプライミング種子ストックとは、短い出芽時間の利点を有する。播種後の出芽の時点は、同時に、より強く同期される。これにより、栽培の間に、特に収穫の間に、農業技術的処理が向上し、さらに、収穫量が増す。予備発芽において、種子ストックは、幼根が種子ストック殻から出るまで発芽し、引き続きこのプロセスは停止される。プライミングにおいて、このプロセスは、幼根が種子ストック殻から出る前に停止される。予備発芽種子ストックと比較して、プライミングに供された種子ストックは、再乾燥のストレスに対して不感受性であり、このような再乾燥の後で、通常再乾燥が勧められない予備発芽種子ストックと比較して長い貯蔵寿命を有する。この文脈で、技術的に前処理された種子ストックはまた、プライミング種子ストックおよび再乾燥種子ストックも含む。予備発芽のプロセスは、米国特許第４９０５４１１号明細書に説明されている。プライミングの多様な実施形態は、欧州特許出願公開第０６８６３４０号明細書に説明されている。これに加えて、１つのプロセスで丸剤化種子ストックとプライミング種子ストックを同時に作製することも可能である。この方法は、欧州特許第２００２７０２号明細書に記載されている。さらに丸剤化されたプライミング種子ストックは、本発明に包含される。

技術的に処理された種子ストックは、付加的に、先に説明された１つ以上の除草剤耐性を備えていてよい。これは、技術的に処理された種子ストックが、予め除草剤で処理された畑に展開されてよく、したがって完全除草であるため、さらに改善された農業技術的栽培を可能にする。

これに加えて、本発明はまた、本発明による種子ストックまたは本発明による種子と、先に定義されたドレッシング材料とを含む混合物も包含する。これにより、このドレッシング材料は、好ましくは、先に定義された丸剤化材料として具体化される。

本発明による種子ストックの貯蔵では、種子ストックの安定性または貯蔵寿命に不利な影響を与えない貯蔵条件を選択するのが好ましい。湿度の変動は、特にこの場合に不利な影響を有することがある。同時に撥水性でありかつ通気性でもある容器内で種子ストックを貯蔵する方法は、本発明の部分である。このような容器は、カートンとして設計されてよい。このようなカートンは、場合により内部蒸気バリアを有していてよい。カートンが二重カートンとして設計されている場合、その安定性は向上する。このような容器およびこのようなカートンを含む本発明による種子ストック、または本発明による技術的に処理された種子ストックも同様に本発明の部分である。このようなカートンの中に本発明による種子ストックまたは本発明による技術的に処理された種子ストックを入れることも同様に本発明の部分である。

一実施形態によると、本発明による植物は、ハイブリッド植物または倍加半数体植物である。ハイブリッド植物および倍加半数体植物は、天然には生じず、天然から単離することもできない。本発明による植物の別の実施形態では、本発明による核酸は、ヘテロ接合体またはホモ接合体の形で存在する。ハイブリッド植物の場合には、核酸分子は、ヘミ接合体の形で存在してもよい。本発明はまた、本発明による核酸または本発明によるポリペプチドを含むハイブリッド種子および倍加半数体種子も包含する。

本発明の別の実施形態は、植物内でヘテロデラ属の病原体に対する耐性がさらに高められていることを特徴とする植物、好ましくはBeta vulgaris種の植物を含む。例えば、これは、「遺伝子スタッキング」により実現されてよく、すなわち、この耐性は、この用量効果を用いて高められていてよい。このため、ヘテロデラ耐性付与対立遺伝子を含む本発明による植物は、植物内でこの遺伝子の転写の量を高めるために、この耐性対立遺伝子で過剰形質転換される。別のアプローチは、その発現速度を高めるための耐性付与対立遺伝子のネイティブプロモーターの遺伝子編集／部位特異的突然変異誘発またはＴＩＬＬＩＮＧ媒介修飾、またはその活性または安定性を高めるための耐性付与ＬＲＲ遺伝子対立遺伝子自体の修飾を含む。耐性遺伝子の修飾によって活性を高めるこのような方法は、例えば国際公開第２００６／１２８４４４号明細書に記載されており、当業者に公知の技術によって実施されてよい。付加的アプローチは、本発明による核酸分子と、特にヘテロデラ感染の際にネイティブプロモーターと比較してより高い活性を示す異種プロモーターの融合を含んでよい。

別の実施形態では、本発明の植物はさらに、遺伝子導入によるかまたは内因的に、ゲノム中の異なる部位で、ポリペプチドを発現する植物中でヘテロデラに対する耐性を付与することができるポリペプチドをコードする第二の核酸を含む。例えば、先行技術に記載されている耐性遺伝子または耐性遺伝子座の１つ以上は、それらが最初の遺伝子型中に存在しない限り、植物内での交配、形質転換、相同指向修復、または相同組換えにより本植物中へ導入されてよい。この中には、例えばB. procumbensのＨｓ１ｐｒｏ－１遺伝子がある（Cai et al., Science 275 (1997), 832-834）。

耐性の向上は、本発明による核酸分子を、Beta vulgaris種の植物の少なくとも１つの細胞の遺伝子内に組み込み、場合によりこの植物細胞から植物を再生することによって行ってよい。この組み込みは、両方の、例えば上述のBeta vulgaris subsp. maritimaの１つとの性的交配に引き続く選択によるか、または相同指向修復または相同組換えにより行ってよい。引用された後者の２つの方法は、好ましくは、以下の：Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、またはＣｐｆ１ヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、アルゴノートヌクレアーゼ、Ｆｏｋｌもしくはその変異体を含む制限エンドヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、または２つの部位特異的ニッキングエンドヌクレアーゼから選択されてよいがこれらに限定されない部位特異的ヌクレアーゼにより促進される。

別のアプローチは、植物中での本発明による核酸分子の発現の向上を含む。これは、ネイティブプロモーターの修飾によって行ってよく、この修飾は、好ましくは、遺伝子編集または部位特異的ヌクレアーゼにより媒介される部位特異的突然変異誘発、および場合により修復モデルによって行われる。このようなヌクレアーゼの例は、既に先に挙げられている。本発明による核酸分子の発現の向上は、同様に、特にヘテロデラ感染後に、核酸分子と、ネイティブプロモーターと比べてより高い活性を示す異種プロモーターとの融合によって行われてよい。この融合は、同様に、部位特異的ヌクレアーゼおよび修復モデルによって行われてよいが、二本鎖切断後の直接挿入によって行われてもよい。

既に先に言及されたように、ヘテロデラ耐性を高める方法は、本発明による核酸分子のヌクレオチド配列の修飾により、本発明によるポリペプチドの活性および／または安定性の向上を引き起こしてもよい。耐性遺伝子の修飾によって活性を高めるこのような方法は、例えば国際公開第２００６／１２８４４４号明細書に記載されており、当業者に公知の技術によって実施されてよい。このアプローチは、以下に詳細に説明する。

本明細書で使用される、「部位特異的ヌクレアーゼ」（ＳＤＮ）は、「認識部位」と言われる特定のヌクレオチド配列で二本鎖ＤＮＡ切断を導入することができる酵素である。このＳＤＮは、例えば、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＸまたはＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＹのようなＣＲＩＳＰＲ系からなる群から選択することができる。希少切断エンドヌクレアーゼは、好ましくは約１４～７０の連続するヌクレオチドの認識部位を有するＳＤＮであり、したがって、ほとんどの植物ゲノムのような長いゲノムにおいても極めて低い切断頻度を有する。メガヌクレアーゼとも言われるホーミングエンドヌクレアーゼは、このような希少切断エンドヌクレアーゼの族を構成する。これらは、イントロン、独立遺伝子または介在配列によりコードされてよく、より古典的な制限酵素、通常では細菌の制限修飾タイプＩＩ系とは区別される際立った構造および機能的特性を示す。この認識部位は、ほとんどの制限酵素認識部位の特徴的な二回転対称とは異なる一般的な非対称を有する。イントロンまたはインテインによってコードされるいくつかのホーミングエンドヌクレアーゼは、対立遺伝子のイントロン不在またはインテイン不在の部位内へのそれぞれの遺伝子エレメントのホーミングを促進することを示す。イントロン不在またはインテイン不在の対立遺伝子内での部位特異的二本鎖切断を行うことにより、これらのヌクレアーゼは、組換え誘導末端を作製し、コード配列を複製する遺伝子変換プロセスに関与し、ＤＮＡレベルでイントロンまたは介在配列の挿入を引き起こす。別の希少切断メガヌクレアーゼおよびそれらのそれぞれの認識部位のリストは、国際公開第０３／００４６５９号の表Ｉ（１７～２０頁）に提供されている（参照により本明細書に取り込まれる）。

さらに、基本的に選択の任意の標的ヌクレオチド配列を認識するカスタムメイドの希少切断エンドヌクレアーゼを設計する方法も利用可能である。簡単に言えば、キメラ制限酵素は、特定のヌクレオチド配列を認識するように設計されたジンクフィンガードメインとＦｏｋｌのような天然制限酵素からの非特異的ＤＮＡ切断ドメインとの間のハイブリッドを用いて調製することができる。このような方法は、例えば国際公開第０３／０８０８０９号、国際公開第９４／１８３１３号または国際公開第９５／０９２３３号、およびIsalan et al., 2001, Nature Biotechnology 19, 656- 660; Liu et al. 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5525-5530に記載されている。

カスタム設計エンドヌクレアーゼの別の例は、ヌクレアーゼの触媒ドメイン（例えばＦｏｋｌまたはその変異体）に融合するXanthomonas属の細菌からの転写アクチベータ様のエフェクター（ＴＡＬＥ）に基づくいわゆるＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含む。このＴＡＬＥのＤＮＡ結合特異性は、タンデム配列３４／３５アミノ酸リピート単位のリピート可変領域（ＲＶＤ）により定義され、１つのＲＶＤは、標的ＤＮＡ内の１つのヌクレオチドを特異的に認識する。このリピート単位は、基本的に任意の標的配列を認識するように組み立て、ヌクレアーゼの触媒ドメインと融合して、配列特異的エンドヌクレアーゼを作製することができる（例えば、Boch et al., 2009, Science 326:p1509-1512; Moscou and Bogdanove, 2009, Science 326:p1501、国際公開第２０１０／０７９４３０号、国際公開２０１１／０７２２４６号、国際公開２０１１／１５４３９３号、国際公開第２０１１／１４６１２１号、国際公開２０１２／００１５２７号、国際公開２０１２／０９３８３３号、国際公開２０１２／１０４７２９号、国際公開第２０１２／１３８９２７号、国際公開第２０１２／１３８９３９号参照）。国際公開第２０１２／１３８９２７号はさらに、モノマーの（コンパクト）ＴＡＬＥＮおよび多様な触媒ドメインおよびこれらの組合せを有するＴＡＬＥＮを記載する。

最近では、新規タイプのカスタマイズ可能なエンドヌクレアーゼ系が記載されている；いわゆるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系。天然環境内でのＣＲＩＳＰＲ系は、ＣａｓヌクレアーゼまたはＣｐｆ１ヌクレアーゼのような別のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと組み合わせた少なくとも１つの小さな個別の非コードＲＮＡを含む分子複合体を表し（Zetsche et al., “Cpf1 Is a Single RNA-Guides Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System”, Cell, 163, pp. 1-13, October 2015）、これは、特定のＤＮＡ二本鎖切断を作製することができる。現在、ＣＲＩＳＰＲ系は、５つのタイプのＣＲＩＳＰＲ系を含む２つのクラス、例えばＣａｓ９をエフェクターとして用いるタイプＩＩ系と、Ｃｐｆ１をエフェクター分子として用いるタイプＶ系とに分類される（Makarova et al., Nature Rev. Microbiol., 2015）。人工ＣＲＩＳＰＲ系において、合成非コードＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼおよび／または場合によりニッカーゼとして機能するために修飾されたかまたは任意のヌクレアーゼ機能が欠失する修飾ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、少なくとも１つの合成または人工ガイドＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよび／またはｔｒａｃｒＲＮＡの機能を組み合わせたｇＲＮＡと組み合わせて使用することができる（Makarova et al., 2015, supra）。天然系でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓにより媒介される免疫応答は、ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を必要とし、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの特異的活性化を制御するガイドＲＮＡの成熟は、これまでに特徴付けられた多様なＣＲＩＳＰＲ系の間でかなり変化する。まず、スペーサーとしても知られる侵入ＤＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の近位端での２つの隣接リピート領域の間に組み込まれる。タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ系は、干渉ステップのための鍵酵素としてＣａｓ９ヌクレアーゼをコードし、この系は、ガイドモチーフとしてｃｒＲＮＡおよびトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の両方を含む。これらはハイブリダイズして、ＲＮＡｓｅＩＩＩにより認識される二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ領域を形成し、成熟ｃｒＲＮＡを形成するために切断することができる。次いで、これらは、順番に標的核酸領域に特異的なヌクレアーゼに向けるためにＣａｓ分子と会合される。組換えｇＲＮＡ分子は、可変ＤＮＡ認識領域とＣＡＳ相互作用領域との両方を含むことができるため、特定の標的核酸および所望のＣａｓヌクレアーゼとは無関係に特異的に設計することができる。更なる安全メカニズムとして、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）は、標的核酸領域内に存在しなければならず；これらは、Ｃａｓ９／ＲＮＡ複合体認識ＤＮＡから直接続くＤＮＡ配列である。Streptococcus pyogenes由来のＣａｓ９についてのＰＡＭ配列は、「ＮＧＧ」または「ＮＡＧ」であると説明されている（標準ＩＵＰＡＣヌクレオチドコード）（Jinek et al, “A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity”, Science 2012, 337: 816-821）。Staphylococcus aureus由来のＣａｓ９についてのＰＡＭ配列は、「ＮＮＧＲＲＴ」または「ＮＮＧＲＲ（Ｎ）」である。さらに変異体ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は公知である。よって、Neisseria meningitidis Ｃａｓ９は、ＰＡＭ配列ＮＮＮＮＧＡＴＴで切断する。Streptococcus thermophilus Ｃａｓ９は、ＰＡＭ配列ＮＮＡＧＡＡＷで切断する。最近では、更なるＰＡＭモチーフＮＮＮＮＲＹＡＣは、カンピロバクターのＣＲＩＳＰＲ系について記載されている（国際公開第２０１６／０２１９７３号）。Ｃｐｆ１ヌクレアーゼについて、Ｃｐｆ１－ｃｒＲＮＡ複合体は、ｔｒａｃｒＲＮＡなしで効率よく認識され、Ｃａｓ９系により認識される一般的なＧリッチＰＡＭとは対照的に、短いＴリッチＰＡＭにより生じる標的ＤＮＡを切断することが説明されている（Zetsche et al., supra）。さらに、修飾ＣＲＩＳＰＲポリペプチドを使用することにより、特定の一本鎖切断を得ることができる。Ｃａｓニッカーゼと多様な組換えｇＲＮＡとを組み合わせる使用は、二重ＤＮＡニッキングにより高度に特異的なＤＮＡ二本鎖切断を誘導することもできる。２つのｇＲＮＡの使用により、さらに、ＤＮＡ結合の特異性およびそれによるＤＮＡ切断を最適化することができる。細菌について当初に記載されたＣａｓＸおよびＣａｓＹエフェクターのような別のＣＲＩＳＰＲエフェクターは、この間に利用可能であり、ゲノム工学の目的で使用することができる別のエフェクターを表す（Burstein et al., “New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes”, Nature, 2017, 542, 237-241）。

ＳＤＮの切断部位は、二本鎖ＤＮＡ切断が誘導されるＤＮＡの正確な位置に関する。切断部位は、ＳＤＮの認識部位に（重複して）含まれていてもいなくてもよく、よって、ＳＤＮの切断部位は、その認識部位に位置するかまたは認識部位の付近に位置すると言える。しばしば結合部位とも言われるＳＤＮ酵素の認識部位は、ＳＤＮ酵素により（特異的に）認識され、その結合特異性を決定するヌクレオチド配列である。例えば、ＴＡＬＥＮまたはＺＮＦモノマーは、それぞれＲＶＤリピートまたはＺＦリピートにより決定される認識部位を有し、その切断部位は、そのヌクレアーゼドメイン（例えばＦｏｋｌ）により決定され、通常は認識部位の外側に位置する。二量体ＴＡＬＥＮまたはＺＦＮの場合、切断部位は、それぞれのモノマーの２つの認識部位／結合部位の間に位置し、切断が行われるこの介在ＤＮＡ領域は、スペーサー領域とも言われる。本発明の一実施形態では、認識部位は、標的領域内に位置する。

当業者は、所定の認識部位を認識し、予め選択された部位でまたはその近傍の切断部位で鎖の切断を引き起こすＳＤＮを選択するか、またはそのようなＳＤＮを作り出すことができるであろう。あるいは、ＳＤＮ認識部位は、任意の従来の形質転換法を使用するかまたはそのゲノム内にＳＤＮ認識部位を有する生物と交配させることにより標的遺伝子内へ導入されてよく、任意の所望のＤＮＡは、その後で、このＳＤＮの切断部位にまたはその近傍に導入されてよい。

この実施形態の特に好ましい態様では、修復核酸分子は、付加的に植物細胞内へ導入される。

本明細書で使用される場合、「修復マトリックス」は、切断部位の近傍のまたは切断部位の予め選択された部位でゲノムＤＮＡの修飾のためのテンプレートとして使用される一本鎖または二本鎖のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である。本明細書で使用される場合、「ゲノムＤＮＡの修飾のためのテンプレートとして使用される」は、修復マトリックスが、予め選択された部位をフランキングする標的ゲノム内で、フランキング領域と対応する相同領域との間の相同組換えにより、場合により（例えば、フランキング領域が１つしかない場合に）修復マトリックスの２つの末端の一方での非相同的末端接合（ＮＨＥＪ）と組み合わせて、予め選択された部位で複製または統合されることを意味する。相同組換えによる統合は、ヌクレオチドレベルまで標的ゲノムへの修復マトリックスの正確な接合を可能にし、ＮＨＥＪは、修復マトリックスとゲノムＤＮＡとの間の接合で小さな挿入／欠失を引き起こしてよい。

「塩基エディター」は、本発明で使用される場合、標的塩基修飾、すなわち目的の点突然変異を引き起こす目的の塩基の変換を媒介する能力を有するタンパク質またはそのフラグメントに関する。好ましくは、本発明の文脈で、少なくとも１つの塩基エディターは、一時的にまたは恒久的に、少なくとも１つのＳＤＮと、好ましくは少なくとも１つの非機能的ＳＤＮと、または場合により少なくとも１つの（非機能的）ＳＤＮの成分と融合される。この融合は、共有結合および／または非共有結合であることができる。複数の刊行物は、シチジンデアミナーゼドメインに連結されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ニッカーゼまたは機能性ヌクレアーゼ、ＡＰＯリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集触媒ポリペプチド（ＡＰＯＢＥＣ１）、例えばラットから誘導されたＡＰＯＢＥＣを用いて、第１のシチジン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への標的塩基変換を示している。シトシン（Ｃ）の脱アミノは、シチジンデアミナーゼにより触媒され、チミン（Ｔ）の塩基対形成特性を有するウラシル（Ｕ）を生じる。最も公知のシチジンデアミナーゼは、ＲＮＡに作用し、ＤＮＡを受け入れることが公知のいくつかの例は、一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡを必要とする。ｄＣａｓ９標的ＤＮＡ複合体に関する研究は、Ｃａｓ９－ガイドＲＮＡ－ＤＮＡ「Ｒループ」複合体の形成時に、置換されたＤＮＡ鎖の少なくとも９つのヌクレオチド（ｎｔ）が対になっていないことを明らかにしている（Jore et al., Nat. Struct. Mol. Biol., 18, 529-536 (2011)）。実際に、Ｃａｓ９Ｒループ複合体の構造において、置換されたＤＮＡ鎖上のプロトスペーサーの最初の１１ｎｔが無秩序であり、これらの動きは、高度に制限されていないことを示唆している。非テンプレート鎖内のシトシンでのＣａｓ９ニッカーゼ誘導突然変異は、細胞性シトシンデアミナーゼ酵素によるそれらのアクセスビリティから生じるかもしれないことも推測される。Ｒループ内のｓｓＤＮＡのこの拡がりのサブセットは、ＤＮＡ内のＣのＵへの直接プログラム可能な変換をもたらすために、ｄＣａｓ９テザーシチジンデアミナーゼ用の効率的な基質として機能するかもしれないことが推測された（Komor et al., supra）。最近では、Goudelli et al（(2017). Programmable base editing of A・T to G・C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature, 551(7681), 464.）は、ゲノムＤＮＡ内でＡ・ＴのＧ・Ｃへの変換を媒介するアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）を記載している。

本明細書で使用される場合、ゲノムの修飾は、ゲノムが、少なくとも１つのヌクレオチドにより変化することを意味する。これは、修飾前に予め選択されたゲノム標的サイトのヌクレオチド配列と比べて、少なくとも１つのヌクレオチドの全体の変化をもたらす限り、少なくとも１つのヌクレオチドの置換および／または少なくとも１つのヌクレオチドの欠失および／または少なくとも１つのヌクレオチドの挿入により起こることができ、これにより、例えば当業者には周知である配列決定またはＰＣＲ分析などの技術により修飾の同定が可能になる。

本明細書で使用される場合、「予め選択された部位」または「予め定義された部位」は、１つ以上のヌクレオチドが挿入、置換および／または欠失することが望まれる位置でゲノム（例えば核ゲノム）内での特別な核酸配列を示す。これは、例えば、予め導入された外来ＤＮＡもしくは導入遺伝子内のまたはそれに連結された内因性遺伝子座または特別なヌクレオチド配列であることができる。予め選択された部位は、１つ以上のヌクレオチドの挿入を行うことを意図した位置の（後方の）特別なヌクレオチド位置であることができる。予め選択された部位はまた、交換（置換）または欠失される１つ以上のヌクレオチドの配列を含むこともできる。

本発明で使用される場合、「フランキング領域」は、予め選択された部位が隣接する（すなわち、上流または下流の）ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列と相同であるヌクレオチド配列を有する修復核酸分子の領域である。フランキング領域の長さおよびパーセンテージ配列同一性は、前記フランキング領域と予め選択された部位の上流または下流のその対応するＤＮＡ領域との間の相同組換えを可能にするように選択されるべきであることは明らかである。修復核酸分子の１つ以上のフランキングＤＮＡ領域と相同性を有する、予め選択された部位に隣接する１つ以上のＤＮＡ領域は、ゲノムＤＮＡにおいて、１つ以上の相同領域とも言われる。

組換えのために十分な相同性を有するために、修復核酸分子のフランキングＤＮＡ領域は、長さが変化してよく、長さは少なくとも約１０ｎｔ、約１５ｎｔまたは約２０ｎｔであるべきである。しかしながら、フランキング領域は、実際に可能な限り長くてよい（例えば、完全な細菌人工染色体（ＢＡＣ）のように最大約１００～１５０ｋｂ）。好ましくは、フランキング領域は、約５０ｎｔ～約２０００ｎｔ、例えば約１００ｎｔ、２００ｎｔ、５００ｎｔまたは１０００ｎｔである。さらに、目的のＤＮＡに隣接する領域は、相同領域（予め選択された部位に隣接するＤＮＡ領域）と同一である必要はなく、予め選択された部位に隣接するＤＮＡ領域に対して約８０％～約１００％の配列同一性、好ましくは約９５％～約１００％の配列同一性を有していてよい。フランキング領域が長ければそれだけ、相同性に対する要件は厳しくなくなる。さらに、隣接するＤＮＡ配列のＤＮＡ配列を変更することなく予め選択された部位で標的ＤＮＡ配列の交換を達成するために、フランキングＤＮＡ配列は、好ましくは、予め選択された部位に隣接する上流または下流のＤＮＡ領域と同一であるべきである。

本発明で使用される場合、「上流」は、核酸分子上の位置であって、前記核酸分子の５’末端により近い位置を示す。同様に、「下流」の用語は、核酸分子上の位置であって、前記核酸分子の３’末端により近い位置に関する。誤解を避けるために、核酸分子およびその配列は、通常では、５’から３’の方向で（左から右へ）表される。

本発明の付加的実施形態は、ヘテロデラ耐性植物を生産する方法であり、この方法は、植物細胞を本発明による核酸分子、組換えＤＮＡ分子、またはベクターもしくは発現カセットで形質転換し、この形質転換された植物細胞からトランスジェニック植物を再生する（例３参照）か、または例えば上述のBeta vulgaris subsp. Maritimaの植物と交配および選択することにより行ってよい。ベクターまたは発現カセット、ならびに植物を形質転換する方法は、既に先に説明されている。

ヘテロデラ耐性植物の生産方法は、それとは別に、上述のように、部位特異的ヌクレアーゼおよび修復マトリックスを植物、好ましくはBeta vulgaris種の植物の細胞内へ導入することを含み、この部位特異的ヌクレアーゼは、細胞のゲノム内で、好ましくは標的領域の上流および／または下流で、ＤＮＡの少なくとも１つの一本鎖切断または少なくとも１つの二本鎖切断を生成することが可能であり、修復マトリックスは、本発明による核酸分子を含む。この方法はさらに、相同指向修復または相同組換えを可能にする条件下でのこの細胞の培養を含み、核酸分子は、修復マトリックスから植物のゲノム内へ取り込まれる。さらに、修飾された植物細胞からの植物の再生も包含される。

好ましい実施形態では、標的領域は、本発明による核酸分子の対立遺伝子変異体であり、この対立遺伝子変異体は、植物中に存在する場合、ヘテロデラに対する耐性を付与しない。この対立遺伝子変異体は、レトロトランスポゾンを含むことが同定されている。

本発明による核酸分子との関連で記載される場合、置換、欠失、挿入、付加、および／または任意の他の変更は、単独でまたは組み合わせて導入されてよく、実際にヌクレオチド配列を変更するが、当初の配列、ここでは、本発明による核酸分子の対立遺伝子変異体のヌクレオチド配列と同じ機能を果たす。したがって、別の実施形態では、本発明は、本発明による核酸分子の対立遺伝子変異体のヌクレオチド配列の誘導体を表すヌクレオチド配列、または本発明による対立遺伝子変異体のアミノ酸配列の誘導体を表すアミノ酸配列を含む。１つ以上の核酸またはアミノ酸の少なくとも１つの置換、欠失、挿入、または付加を有するが、遺伝子の機能は保存されている誘導されたヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の誘導体を表す。したがって、ヌクレオチド配列は、先行技術で公知の従来の方法を用いて、例えば部位特異的突然変異誘発、ＴＩＬＬＩＮＧ、ＰＣＲ媒介突然変異誘発、化学誘導突然変異誘発、ゲノム編集、塩基編集などにより、置換、欠失、挿入、付加および／または任意の他の変更を、単独でまたは遺伝子と組み合わせて導入されてよく、実際にヌクレオチド配列は変更されるが、当初の配列と同じ機能を果たす。

アミノ酸配列に関して、上述の方法による修飾後に、これは、共通の構造ドメインを有し、かつ／または共通の機能的活性を有していてもよい。本発明による核酸分子の引用された対立遺伝子変異体のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、十分に類似していると定義される。したがって、本発明は、ストリンジェントな条件下で、本発明による核酸分子の対立遺伝子変異体のヌクレオチド配列と相補的であるかまたは対応するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む。

別の好ましい実施形態では、本発明による方法は、標的領域の上流および／または下流の、最大で１００００塩基対、好ましくは少なくとも５０００塩基対、より好ましくは少なくとも１０００塩基対の位置で、または本発明による対立遺伝子変異体から、最大で１００００塩基対、好ましくは少なくとも５０００塩基対、より好ましくは少なくとも１０００塩基対離れた位置で、少なくとも１つの二本鎖切断を引き起こすことを特徴とする。

当業者にとって、本発明による核酸分子から誘導されるが、ヘテロデラに対する耐性を付与しない、多数の異なる感受性配列が生じてよいことは明らかであってよく、その結果、先に列挙した配列は、配列の一例として考えられるべきであり、本発明は、本発明による核酸分子の上述の対立遺伝子変異体に限定されるものではない。もちろん、本発明の核酸分子の感受性変異体は、先に記載されたようにレトロトランスポゾンだけを含まなくてよいが、ＤＮＡ配列もしくはｃＤＮＡ配列内のまたはプロモーター領域内の当業者に公知でかつ上述のあらゆる種類の突然変異が、感受性対立遺伝に導いてよい。

上述のように、ＱＴＬの量的遺伝により、ヘテロデラ属の病原体に対する所望の耐性が、しばしば植物内に導入されるだけでなく、付加的遺伝子の継承のために、耐性の肯定的な形質にはつながらない、例えば収穫量の低下のような不所望な形質もしばしば導入される。したがって、好ましい実施形態では、それ自体で既に優勢な耐性効果を示す本発明による核酸分子または本発明による核酸分子の上述の組合せ、またはベクターもしくは発現カセットの導入は、不所望な形質の導入とはつながらず、収穫量は、好ましくは不利な影響を受けない。さらに、このような方法を介して得られた植物も本発明に包含される。

先行技術から既に公知であるＱＴＬ分析は、実際のＱＴＬを検出することができるが、ＱＴＬ効果を示す基礎的ゲノム領域はまた、上述の欠点も媒介するため、「リンケージドラッグ」とも言われ、この文脈でも議論される。同時に、ＱＴＬおよびそれと関連する効果は、それぞれの先行技術に一律に記載されておらず、単に弱い効果を媒介するだけであるため、ヘテロデラ耐性植物の育種におけるこれらの結果の利用は、限られた範囲にだけ可能であり、大抵は不確実であった。標的化された育種およびテンサイの遺伝子プール内への耐性遺伝子の制御された組み込みは、本明細書に記載された耐性遺伝子の同定によって可能となった。これは、糖の収穫量に不利な影響を及ぼすことなく、病原体に対する高い耐性を示す完全に新規なヘテロデラ耐性栽培品種の育種および生成を保証する。

本発明は、同様に、ヘテロデラ病原体に対して耐性であるBeta vulgaris種の植物の同定方法、および場合による供給方法に関し、この方法は、植物もしくはその試料／部分内での本発明による核酸分子もしくは本発明によるポリペプチドの存在および／または発現を検出するステップを含むことを特徴とする。本発明による核酸分子、または本発明によるポリペプチドの存在および／または発現は、当業者に公知の標準的方法により、例えばＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、またはウェスタンブロットにより試験されてよい。

さらに、本発明による同定方法はまた、耐性付与配列、すなわち本発明による核酸分子の配列内の少なくとも１つの多形の検出による本発明による核酸分子の検出も含む。既に上述したように、多数の感受性配列、すなわち本発明による核酸分子の対立遺伝子変異体をコードする多数の配列が存在することは、当業者には明らかであってよい。したがって、本発明による方法の好ましい実施形態は、多形、特に診断的多形を検出する分子マーカーを用いる少なくとも１つの多形の検出を含む。この検出は、好ましくは、多形毎に、特に、診断的多形毎に少なくとも１つの分子マーカーを用いて行われる。対応する多形を検出するためにどのマーカーを適用するか、およびこのために分子マーカーをどのように構築するかは当業者に公知である（Advances in Seed Science and Technology Vol. I, Vanangamudi et al., 2008参照）。さらに、本発明は、本発明による核酸分子の配列中の多形を記述または検出する分子マーカーを包含する。これにより、マーカーは、本発明による核酸分子内で生じるこのような多形を検出することができるが、感受性対立遺伝子を含まない限り、多様な多形を区別しないマーカーを使用することもできる。

それとは別にまたは付加的に、本発明による同定方法は、本発明による核酸分子のヌクレオチド配列内に少なくとも１つのマーカー遺伝子座を検出するステップを含む。この結果として、信号、例えば蛍光信号または配列増幅が生成される。さらに、前述の同定方法はまた、本発明によるヘテロデラに対する耐性を示す植物の選択方法を表す。この選択方法は、耐性植物を選択する最後のステップを含む。

この文脈で、本発明はまた、耐性対立遺伝子の上述の多形を検出するために適した分子マーカーの開発もしくは生産または本発明による核酸分子のヌクレオチド配列と特異的に結合するハイブリダイゼーションプローブの構築、または本発明による核酸分子に対して特異的な領域を、ＰＣＲにおいて、増幅するために適しかつ植物もしくは植物細胞内でこれらを検出するために適した核酸分子のペアの生産を含む。

本発明は、好ましくは、本発明による核酸分子またはこれと相補的な核酸分子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする、長さにおいて、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０、好ましくは、少なくとも２１、２２、２３、２４、または２５、特に好ましくは、少なくとも３０、３５、４０、４５、または５０、殊に好ましくは、少なくとも１００、２００、３００、５００または１０００のヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、または好ましくは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーとして、本発明による核酸分子に対して特異的な領域に付着するためおよびポリメラーゼ連結反応（ＰＣＲ）において増幅するために適した、またはフォワードプライマーまたはリバースプライマーとして、Beta vulgarisにおいて、本発明によるポリペプチドによるかもしくは本発明による核酸分子により付与されるヘテロデラ耐性との同時分離を有する、Beta vulgarisゲノム内の領域とのハイブリダイゼーションのために適した、オリゴヌクレオチドの形の核酸分子のペアを生産する方法を含む。

オリゴヌクレオチド製造方法は、最初に以下のものを含む：本発明による核酸分子のヌクレオチド配列と、耐性を付与しない対応する核酸分子のヌクレオチド配列との比較；これらの２つのヌクレオチド配列の間の配列の相違の同定；および本発明による核酸分子と特異的に結合するが、耐性を媒介しない核酸分子とは結合しない核酸分子（本明細書ではオリゴヌクレオチドを意味する）の生成。

さらに、本発明によるオリゴヌクレオチドは、例えば、対応する波長の光を介した励起下で、蛍光信号を生成するための蛍光染料に接続されていてよい。蛍光染料は、蛍光色素であってよい。本発明によるオリゴヌクレオチドは、信号を生成するために適した他の化合物と結合されていてよい。このようなオリゴヌクレオチドは、天然に生じることはなく、天然から単離することもできない。このように標識されたオリゴヌクレオチドを製造するために、以下のことが実行される：ＤＮＡは、生体直交型に標識されてよい。このため、ＤＮＡは、生体内または試験管内で、ヌクレオシド類似体で標識されてよく、このヌクレオシド類似体は、例えば、引き続き、シュタウディンガー反応毎に蛍光体と連結されてよい。これに加えて、ＤＮＡは、蛍光体と共に化学的に提供されていてもよい。オリゴヌクレオチドは、ホスホラミダイト合成を介して、例えばＱＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、およびインサイチュハイブリダイゼーションで使用される蛍光体によって標識されてよい。さらに、ＤＮＡは、蛍光ヌクレオチドを用いるポリメラーゼ連鎖反応の過程で酵素的に生成されてよいか、またはリガーゼまたは末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを用いて標識されてよい。ＤＮＡは、ビオチン化および蛍光アビジンを介して間接的に検出されてもよい。連結用に、フルオレセイン、蛍光性ランタニド、金ナノ粒子、カーボンナノチューブ、または量子ドットなどが、蛍光体として使用される。最も一般的に使用される蛍光物質の１つは、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）である。したがって、ＦＡＭ標識を有するオリゴヌクレオチド、および特にプライマーは、本発明に包含される。ＦＡＭは、好ましくは、６－ＦＡＭとして存在するが、放射および励起の所望の波長に応じて、他のＦＡＭ変異体、例えば５－ＦＡＭも使用されてよい。付加的蛍光マーカーの例は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ、ＡＴＴＯ、Ｄａｂｃｙｌ、ＨＥＸ、Ｒｏｘ、ＴＥＴ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、およびＹａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗである。使用分野に応じて、オリゴヌクレオチドは、塩基または糖リン酸骨格の修飾を備え付けられていてよい。これらの中で、とりわけ、アミノ－ｄＴ、アジド－ｄＴ、２－アミノプリン、５－Ｂｒ－ｄＣ、２’－デオキシイノシン（ＩＮＯ）、３’－デオキシ－Ａ、Ｃ、Ｇ、５－Ｍｅｔ－ｄＣ、５－ＯＨ－Ｍｅｔ－ｄＣＮ６－Ｍｅｔ－ｄＡ等である。

さらに、本発明はまた、検出するために適した本発明による少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むマーカーチップ（「ＤＮＡチップ」またはマイクロアレイ）にも関する。このマーカーチップは、本発明による１つ以上の検出方法での適用のために適している。

同様に、本発明は、本発明によるタンパク質の製造方法を含む。この方法は、配列番号２、５および８のいずれか１つを含む細胞培養の提供または培養、配列番号２、５および８のいずれか１つによりコードされるタンパク質の引き続く発現を含む。

さらに、本発明はまた、先に記載された方法を介して、同定され、適用可能な場合には選択されたヘテロデラ耐性植物またはその部分にも関する。特に、本発明は、先に記載された本発明による方法の１つにより入手可能であり、好ましくはビートシストセンチュウに対する耐性であり、本発明による核酸分子の存在により特徴付けられる植物を含む植物の個体群に関する。この個体群は、好ましくは少なくとも１０、好ましくは少なくとも５０、より好ましくは少なくとも１００、特に好ましくは少なくとも５００、特に農業栽培において、好ましくは少なくとも１０００の植物を有する。本発明による核酸分子を有しておらずかつ／またはヘテロデラ、特にHeterodera schachtiiによる寄生に敏感である、個体群中の植物の割合は、好ましくは２５％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１５％未満、さらにより好ましくは１０％未満、特に好ましくは存在するとしても５％未満である。

上述のファインマッピングによって、ゲノム内のヘテロデラ耐性付与遺伝子を同定することができた。これは次に、標的領域内のＤＮＡハイブリダイゼーションプローブまたは遺伝子マーカーの開発のための基礎を表し、これを利用して、ヘテロデラ耐性媒介遺伝子を検出することができるか、または耐性を付与しない遺伝子と区別することができる。

ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブは、ヘテロデラ耐性付与遺伝子の配列から誘導されてよく、所望の生物のゲノムおよび／またはｃＤＮＡバンクのスクリーニングのために使用されてよい。このプローブは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の公知のプロセスを介して同定された相同遺伝子を増幅し、ヘテロデラ耐性付与遺伝子が生物内に内因的に存在するか、または異種導入が成功したかどうかを確認するために用いてよい。

当業者は、ここで、例えば Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001に列挙された通常のハイブリダイゼーション、クローニング、および配列決定法に頼ってもよい。当業者はまた、ヘテロデラ耐性付与遺伝子の配列を増幅するために、オリゴヌクレオチドプライマーを合成および使用してもよい。特異的なハイブリダイゼーションを達成するために、このようなプローブは、特異的であるべきであり、少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの長さを有するべきである。核酸のハイブリダイゼーションの詳細なガイドは、Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part 1, Chapter 2, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays.” Elsevier, New York (1993);およびCurrent Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel et al., eds., Greene Publishing and Wiley lnterscience, New York (1995)に見られる。

したがって、長さにおいて少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０、好ましくは少なくとも２１、２２、２３、２４、または２５、特に好ましくは少なくとも３０、３５、４０、４５、または５０、殊に好ましくは少なくとも１００、２００、３００、５００、または１０００のヌクレオチドの核酸分子は、本発明の主題であり、この核酸分子は、特に、ヘテロデラ耐性付与遺伝子を含む本発明による上述のヌクレオチド配列とハイブリダイズする。これはまた、１５～３５のヌクレオチドの範囲も明示的に含む。

よって、本発明はまた、オリゴヌクレオチド、特にプライマーオリゴヌクレオチドとしてのマーカーにも関する。これは、先に定義されたヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする、長さにおいて少なくとも１５のヌクレオチド配列の核酸分子を含む。

特に、本発明は、好ましくはオリゴヌクレオチドの形の、核酸分子のペア、またはオリゴヌクレオチドのそのペアを含むキットを包含し、これは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーとして、本発明による核酸分子に対して特異的な領域へのハイブリダイゼーションのために適していて、かつポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において増幅するために適しているか、またはBeta vulgaris内で、本発明によるポリペプチドまたは本発明による核酸分子により付与されたヘテロデラ属の病原体に対する耐性と同時分離を示すBeta vulgarisゲノム内の領域とのハイブリダイゼーションのためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして適している。好ましくは、Beta vulgarisゲノム内のこの領域は、マーカーｓ５ｅ３００１ｓ０２とマーカーｓ５ｅ４６６８ｘｘｘとの間に位置するか、マーカーｓ５ｅ３００１ｓ０２とマーカーｓ５ｅ４６６８ｘｘｘとに隣接しているか、またはマーカーｓ５ｅ３００１ｓ０２とマーカーｓ５ｅ４６６８ｘｘｘとの間に染色体間隔を含む。

ベタ属の新規耐性植物系統の育種および開発のための以下の利点も、本発明により達成されてよい。配列情報、ならびに開示された遺伝子の耐性対立遺伝子と潜在的感受性対立遺伝子との間の区別を可能にする、すなわちヘテロデラ属の病原体に対する耐性を付与する対立遺伝子とその耐性を付与することができない対立遺伝子との間の区別を可能にする同定された多型は、特に「リンケージドラッグ」なしの最適化されたエリート系統の開発に関して、植物育種者にとって重要な促進を表すマーカー開発を可能にする。さらに、この配列構造に関する知識は、例えば相同またはオルソロガスである、特にヘテロデラに対する付加的耐性遺伝子の同定のために使用されてよい。

したがって、本発明はまた、植物中に存在する場合、ヘテロデラ属の病原体に対する耐性を付与し、ポリペプチドをそれぞれ発現する植物中でヘテロデラ属の病原体に対する耐性を付与することができるポリペプチドまたは付加的タンパク質をコードする付加的核酸分子を同定する方法も包含する。これにより、当業者は、相同配列用のスクリーニングのためまたは配列比較のための適切な検索プロファイルおよびコンピュータープログラムを用いるデータベースを使用してよい。さらに、従来の分子生物学的技術によって、当業者自身は、ヘテロデラ耐性タンパク質をコードする付加的ＤＮＡ配列を導き出し、これらを本発明の範囲内で使用してよい。例えば、適切なハイブリダイゼーションプローブは、本発明による核酸分子の配列から誘導されてよく、所望の生物のゲノムおよびｃＤＮＡバンクのスクリーニングのために使用されてよい。当業者は、ここで、例えば Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001に列挙された通常のハイブリダイゼーション、クローニング、および配列決定法に頼ってもよい。既知の配列を使用して、当業者はまた、ヘテロデラ耐性付与核酸分子の配列を増幅するためにオリゴヌクレオチドプライマーを合成および使用してもよい。

したがって、一実施形態では、本発明は、ポリペプチドを発現するBeta vulgaris種の植物中で、ヘテロデラに対する耐性を付与することができるポリペプチドをコードする核酸分子を同定する方法を包含する。よって、この方法は、Beta vulgaris subsp. vulgaris中でヘテロデラ属の病原体に対する耐性を付与する本発明によるポリペプチドのアミノ酸配列と、配列データベースからのアミノ酸配列とまたはBeta vulgaris種の遺伝子型で本発明によるポリペプチドの対立遺伝子変異体の配列との比較を含む。さらに、本発明による方法は、本発明によるポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列または対立遺伝子変異体の同定、ならびにBeta vulgaris種の植物中への同定されたアミノ酸配列または対立遺伝子変異体をコードする核酸分子の導入；植物内での核酸分子の発現；および場合により、引き続くヘテロデラ属の病原体に対する耐性の検証を含む。

先に記載されたように、付加的にヘテロデラ耐性付与タンパク質またはそのコード遺伝子、すなわち本発明による核酸分子によりコードされるポリペプチドの核酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、殊に好ましくは少なくとも９５％、またはさらに９８％同一である相同体、類似体、およびオルソログは、古典的な生物情報学的アプローチ（データベース検索および相同配列用のスクリーニングのためのコンピュータープログラム）を介して同定されてよい。

本発明の別の実施形態は、本明細書に記載された本発明の核酸を含む植物または種子に関し、この植物またはこのような植物の種子は、２００ｇ、２５０ｇ、３００ｇ、３５０ｇ、４００ｇ、４５０ｇまたは５００ｇの最小新鮮質量および１０００ｇ、１１００ｇ、１２００ｇ、１３００ｇ、１４００ｇ、１５００ｇ、１６００ｇ、１７００ｇ、１８００ｇ、１９００ｇまたは２０００ｇの最大質量を有するビート体の発育を可能にするゲノムを有する。このようなビート体の発育のために対応する遺伝子構成は、例えば、以下の品種ＢＴＳ ８６２９、ＢＴＳ ８７３５、ＢＴＳ ８５００、ＢＴＳ ８７６７またはＢＴＳ ８７４９を介して利用可能である。当業者には、本発明による核酸をこのような遺伝子構成を有する植物中へどのように移すかは公知である。この実施形態における種子は、ペレット種子であってよい。

本発明の別の実施形態は、本明細書に記載された本発明の核酸を含む植物または種子に関し、この植物またはこのような植物の種子は、ビート体の新鮮質量において、少なくとも１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％またはさらに２０％（質量パーセント）のスクロース濃度を有するビート体の発育を可能にするゲノムを有する。このようなビート体の発育のために対応する遺伝子構成は、例えば、以下の品種ＢＴＳ ８６２９、ＢＴＳ ８７３５、ＢＴＳ ８５００、ＢＴＳ ８７６７またはＢＴＳ ８７４９を介して利用可能である。当業者には、本発明による核酸をこのような遺伝子構成を有する植物中へどのように移すかは公知である。この実施形態における種子は、ペレット種子であってよい。

相同の用語は、これにより、関連する遺伝子（２つの異なる植物種に由来）は、本質的に同じ機能および共通の祖先を有し、したがって、通常ではそれらの核酸配列またはコードされたアミノ酸配列において有意な同一性を示すことを意味する。しかしながら、これらは、タンパク質配列が意味のある対のアライメントを生じない互いに相同である遺伝子であってもよい。これに対して、類似の用語は、（同様に）同一または類似の機能を有するが、同じ構造から作製されない、すなわち共通の祖先を有していない遺伝子またはタンパク質を記述する。この場合、しばしば、これらの核酸またはコードされたアミノ酸配列において、または最良の場合には、特別な機能ドメインにおいて、有意な同一性を確立することはできない。

ゲノム配列決定の文脈で、相同は、注釈のために、より細かく分類される。このために、オルソログおよびパラログの用語が紹介される。オルソログは、種分化イベントを介して結びつけられる遺伝子である。パラログは、複製イベントにまで遡る遺伝子である。

よって、遺伝子は、植物中でヘテロデラ耐性を付与することができる場合、本発明の意味で、基本的に相同または類似またはオルソログである。確認のために、当業者に公知の、既に先に記載された方法、例えば、ＰＣＲによる同定された相同体または類似体またはオルソログの増幅、発現ベクター中へのクローニング、標的植物または植物細胞への導入、および耐性の確認が用いられる。

上述のように、シスジェニックまたはトランスジェニックによるアプローチにおける耐性遺伝子対立遺伝子の本明細書に開示された使用法は、用量効果を用いて、高められた耐性を示すか、または開示された遺伝子と他の耐性遺伝子とのスタッキングにより耐性破壊を回避しかつ耐性の開発を最適化したベタ属の新規耐性種の可能性を開く。新規耐性対立遺伝子を開発するためのtillingまたは標的エンジニアリングによる遺伝子の修飾も可能である。

本発明はまた、農業的に有利な特性を付与してよい他の遺伝子エレメントとの遺伝子スタックまたは分子スタックにおいて、同定されたヘテロデラ耐性付与遺伝子対立遺伝子の植物中での使用にも関する。これにより、例えば、同じ遺伝子を有するが、本発明による核酸を与えていない植物と比較して、収穫量性能が高められるように、栽培植物の経済的価値が著しく高められてよい。さらに、強い病原体圧力のような生物的要因のために、以前はこの植物の栽培に利用できなかった植物にとって新たな作物領域が開かれてよい。特に、本発明は、例えば、先に記載された方法の１つを用いたベタ種の植物の同定および選択および／またはこうして選択された植物またはその子孫の栽培を含めた、ベタ種の植物の農業的または園芸的栽培でHeterodera schachtii病原体の寄生を制御する方法における同定されたヘテロデラ耐性を付与する遺伝子対立遺伝子の使用に関する。よって、本発明は、第１のステップで、先に記載された、本発明によるBeta vulgaris種のヘテロデラ耐性植物の提供、または本発明による生産方法によるBeta vulgaris種の植物の生産、または本発明による同定方法によるBeta vulgaris種の植物の同定および選択を含み；第二のステップで、第１のステップからの植物の栽培、または第１のステップからの植物の種子ストックの播種、または第１のステップからの植物の育成を含むBeta vulgaris種の植物の栽培方法を含む。これにより、この栽培方法は、栽培植物のヘテロデラによる寄生を妨げる。この栽培方法は、砂糖を生産する方法の一部であってよい。砂糖の生産方法は、この栽培方法のステップを含み、付加的に、最後から二番目のステップとして栽培された植物の収穫と、最後のステップとして前記植物からの砂糖の抽出とを含む。

この栽培方法は、種子ストックを生産する方法の一部であってもよい。種子ストックの生産方法は、この栽培方法のステップを含み、付加的に、最後から二番目のステップとして栽培された植物の春化処理と、最後のステップとして前記植物からの種子の取り出しを含む。取り出された種子は、場合により、Beta vulgaris種の丸剤化種子ストックを得るために丸剤化されてよい。この事例では、これは、丸剤化種子ストックの製造方法である。

さらに、種子ストックの生産方法は、ヘテロデラ耐性種子ストックの生産方法として設計されてよい。ヘテロデラ耐性種子ストックの生産方法は、種子ストックの生産のための上述の方法のステップを含み、付加的に、最後のステップとして、取り出された種子の少なくとも１つ、好ましくは取り出された種子の少なくとも０．１％または少なくとも１％における本明細書に記載された方法による本発明による核酸の検証を含む。この検証は、特に好ましくは、種子が発芽力を維持するように行われる。これは、種子から検証のために必要なＤＮＡを抽出することが、種子の発芽力を中立化しないことを意味する。このような事例では、本発明による核酸の検証は、取り出された全ての種子の特に大きな割合で行われてよい。例えば、この検証は、取り出された全ての種子の少なくとも２％、好ましくは少なくとも３％、特に好ましくは少なくとも４％で行われてよい。

本発明による植物、それらの細胞、または本発明による種子または種子ストックは、付加的に、農業的に有利な特性を有するかまたはそのような有利な特性を備え付けられていてよい。一例では、グリホサート、グルホシネート、またはＡＬＳ阻害剤のような除草剤に対する許容性または耐性である。グリホサートまたはＡＬＳ－阻害剤除草剤に対する許容性が好ましい。グリホサート耐性の特別な実施形態は、米国特許第７３３５８１６号明細書に開示されている。このようなグリホサート耐性は、例えばアクセス番号ＮＣＩＭＢ ４１１５８またはＮＣＩＭＢ ４１１５９のもとで、NCIMB, Aberdeen (Scotland, UK)に保管された種子ストックから入手可能である。このような種子は、グリホサート許容性テンサイ植物を得るために使用されてよい。グリホサート耐性は、交配によってベタ種の他の種内に導入されてもよい。

よって、本発明はまた、本発明による核酸分子を含み、さらに、植物、部分、またはその種子のゲノムＤＮＡのＤＮＡフラグメントが、第１のプライマーおよび第二のプライマーとのポリメラーゼ連鎖反応によって増幅されてよいことを特徴とする、植物、それらの細胞、または種子または種子ストックも包含する。

ＡＬＳ阻害剤除草剤耐性の特別な実施形態は、国際公開第２０１２／０４９２６８号の文書に開示されている。例えば、このようなＡＬＳ阻害剤除草剤耐性は、NCIMB, Aberdeen, UKの寄託から、ＮＣＩＭＢ ４１７０５の番号の下で入手可能である。さらに、このようなＡＬＳ阻害剤除草剤耐性は、tillingまたは部位特異的突然変異誘発を介して、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの使用によるような遺伝子編集を介して製造されてよい。よって、本発明はまた、本発明による核酸分子を含み、さらに内因性アセトラクテートシンターゼ遺伝子内で突然変異を示し、このアセトラクテートシンターゼ遺伝子は、アセトラクテートシンターゼタンパク質をコードし、位置５６９での突然変異の結果として、トリプトファンとは異なるアミノ酸を有することを特徴とする、植物、その細胞、または種子または種子ストックも包含する。この突然変異の結果として、位置５６９のアミノ酸は、好ましくはアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、バリン、またはアルギニンである。さらに、この突然変異は、植物、その細胞または種子、または種子ストック中で、ヘテロ接合性とホモ接合性の両方で存在してよい。耐性のより安定したまたはより強い表現型の出現を促進するため、突然変異のホモ接合性の存在が推奨される。

多数の付加的除草剤およびその適用性は、先行技術から当業者に公知である。当業者は、植物中に対応する許容性を備え付けるために、どの遺伝的エレメントをどの方法で使用するかという知識を得るために先行技術を頼ってよい。

農業的に有利な特性の別の例は、付加的病原体耐性であり、この病原体は、例えば昆虫、ウイルス、線虫、細菌、または真菌であってよい。例えば、植物についての広範囲な病原体防御は、遺伝子エレメントが互いに相加効果を示してよいため、異なる病原体耐性／許容性の組合せを介して達成されてよい。例えば、このための多様な耐性遺伝子は、遺伝子エレメントとして当業者に公知である。例えば、米国特許出願公開２０１６／０１５２９９９号明細書は、叢根病に対するＲＺ耐性遺伝子を開示している。この病気は、病原体「ビートえそ性葉脈黄化ウイルス（Beet Necrotic Yellow Vein Virus）」により引き起こされる。１つの植物中に含まれる多くの耐病性は、互いに相乗効果を有する。植物が初めて病原体に寄生されると、通常その免疫系は弱まり、外部障壁としての表皮は、しばしば損傷されて、更なる感染の可能性が高まる。農業的に有利な特性の付加的例は、耐寒性または対霜性である。この特性を示す植物は、例えば、その年の早い時期に播種されてよいか、または畑内により長く留まってよく、これは収穫量の増加につながりうる。ここで、当業者は、適切な遺伝子エレメントを見つけ出すために先行技術に頼ってもよい。農業的に有利な特性の付加的例は、水利用効率、窒素利用効率、および収穫量である。このような特性を付与するために使用されてよい遺伝的エレメントは、先行技術に見ることができる。

さらに、病原体防御のための多数の修飾は、当業者に公知である。しばしば記載されるＲ遺伝子のファミリーに加えて、Ａｖｒ／Ｒアプローチ、Ａｖｒ遺伝子相補性（国際公開第２０１３／１２７３７９号）、Ｒ遺伝子の自動活性化（国際公開第２００６／１２８４４４号）、またはＨＩＧＳ（宿主誘導遺伝子サイレンシング）アプローチ（例えば、国際公開第２０１３／０５００２４号）が有利に使用されてよい。特に、Ｒ遺伝子の自動活性化は、本発明に対して重要であってよい。このために、植物中で病原体に対する耐性を生成するための自動活性化耐性タンパク質をコードする核酸を作製する。この場合、この核酸は、ＮＢＳ－ＬＲＲ耐性遺伝子のＮＢＳドメインのコード化を開始するＮＢＳ－ＬＲＲ耐性遺伝子のコード領域の５’末端から下流に延びるｗｂ－Ｒ遺伝子のようなＮＢＳ－ＬＲＲ耐性遺伝子の限られた部分だけを有する。

この文脈で、Ｎ末端領域をコードし、ＮＢＳドメイン内のｐループで始まり、Ｎ末端領域の終端まで延びる本発明による核酸の領域を除去するステップを含む方法も包含される。

このような短縮された核酸によりコードされる耐性タンパク質は、一般に自動活性化され、これらの耐性タンパク質は、関連する病原体の不存在でも植物内での免疫反応を引き起こし、これにより、植物の基本免疫を高める。さらに、本発明による短縮された核酸、およびこれによりコードされるポリペプチドが包含される。

さらに、本発明はまた、上述の修飾の１つ、または２つ以上の農業的に有利な特性を植物内に伝えてよい先に記載された遺伝子エレメントと組み合わせるための、上述の方法で同定されたヘテロデラ耐性付与遺伝子対立遺伝子の使用も含む。

本発明による植物に加えて、本発明はまた、典型的に持続可能な原材料から製造される食料および動物飼料のような製品、好ましくは、砂糖またはシロップ（糖蜜）の生産における種子または子孫、器官、植物部分、組織、またはその細胞にも関し、この糖蜜は、工業的用途のためにも、例えばアルコール製造においてまたは生物工学的製品の製造用の成長培地として、化学工業用の材料または物質、例えば精製された化学薬品、製剤またはその前駆体、診断薬、化粧品、バイオエタノール、またはバイオガスの生産においても使用される。バイオガスプラントにおける生物起源原料としてのテンサイの使用の例は、独国特許出願公開第１０２０１２０２２１７８号明細書に記載されている、例えば第１０段落を参照。

以下の実施例は、本発明を説明するが、本発明の主題を限定するものではない。他に明記されていない限り、標準的な分子生物学的方法が使用される：例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001, Fritsch et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989; Mayer et al., Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, eds., Academic Press, London, 1987およびWeir et al., Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV, Blackwell, eds., 1986参照。

本発明による最も重要な配列のいくつかを、以下に詳細に説明する：
－ 配列番号１：Beta vulgaris subsp. maritima由来のヘテロデラ耐性付与ＬＬＲ２遺伝子のゲノムＤＮＡ配列。
－ 配列番号２：天然には生じないヘテロデラ耐性付与ＬＬＲ２遺伝子のｃＤＮＡ配列。
－ 配列番号３：配列番号１または配列番号２によりコードされるヘテロデラ耐性付与ＬＬＲ２タンパク質のアミノ酸配列。
－ 配列番号４：Beta vulgaris subsp. maritima由来のヘテロデラ耐性付与ＬＬＲ１遺伝子のゲノムＤＮＡ配列。
－ 配列番号５：天然には生じないヘテロデラ耐性付与ＬＬＲ１遺伝子のｃＤＮＡ配列。
－ 配列番号６：配列番号４または配列番号５によりコードされるヘテロデラ耐性付与ＬＬＲ１タンパク質のアミノ酸配列。
－ 配列番号７：Beta vulgaris subsp. maritima由来のヘテロデラ耐性付与ＬＬＲ３遺伝子のゲノムＤＮＡ配列。
－ 配列番号８：天然には生じないヘテロデラ耐性付与ＬＬＲ３遺伝子のｃＤＮＡ配列。
－ 配列番号９：配列番号７または配列番号８によりコードされるヘテロデラ耐性付与ＬＬＲ３タンパク質のアミノ酸配列。
－ 配列番号１０：分子マーカーｓ５ｅ３００１ｓ０２の耐性付与対立遺伝子バージョン
－ 配列番号１１：分子マーカーｓ５ｅ３００１ｓ０２の感受性対立遺伝子バージョン
－ 配列番号１２：分子マーカーｓ５ｅ４６６８ｘｘｘの耐性付与対立遺伝子バージョン
－ 配列番号１３：分子マーカーｓ５ｅ４６６８ｘｘｘの感受性対立遺伝子バージョン
分子マーカーｓ５ｅ３００１ｓ０２と分子マーカーｓ５ｅ４６６８ｘｘｘとは、配列番号１および／または配列番号４による耐性付与遺伝子を含む耐性付与領域の外部フランキングマーカーである。

配列番号１および／または配列番号４による耐性遺伝子を同定するためまたは配列番号３または配列番号６による耐性付与ポリペプチドをコードするゲノム領域を同定するために適した別の分子マーカーを、表４に示す。このマーカーは、本発明による遺伝子の耐性付与対立遺伝子バージョンと耐性を付与しないこれらの遺伝子の対立遺伝子バージョンとを区別するために使用することもできる。

実施例
例１：線虫試験の実施
１） 本発明による植物を温室内で泥炭基質に播種した。

２） この植物を、発芽後の子葉段階で、石英砂を充填した約３０ｍｌ（約２*１*１５ｃｍ）のプラスチック箱内に、単一株（１つの株／箱）で移植した。これとは別に、組織培養からの苗木は、プラスチック箱内に直接移すことができる。温度および光の条件：２３℃／１２℃の温度変化で１６／８時間の明／暗。

３） 移植後一週間で、Heterodera schachtiiの６００匹の幼虫を適用することで寄生をシミュレートした。

４） 植物およびシストの数の評価を、感染後４週間に双眼顕微鏡の下で行った。

例２：遺伝子の組み立て
耐性遺伝子座は、第５染色体上に位置し、標的領域は、いくつかのマッピングステップで、参照物理マップ（ＺＲ＿ＢＰＭｖ７－単胚感受性参照配列）において１１９３４１ｂｐの物理距離を含むフランキングマーカーｓ５ｅ５８６４ｓ０１（組み込まれた遺伝子マップ：９．１７ｃＭ）とｓ５ｅ４５０３ｓ０２（９．７４ｃＭ）に縮小した。耐性ドナー系統のＢＡＣスクリーニングにおいて、標的ゲノム領域についての３つのＢＡＣクローンを同定した。これらのＢＡＣクローンを、ＰａｃＢｉｏ法を用いてシークエンシングした（Fichot, Erin B., and R. Sean Norman. “Microbial phylogenetic profiling with the Pacific Biosciences sequencing platform.” Microbiome 1.1 (2013): 10）。この方法は、比較的長い連続する配列コンティグを生成することを可能にし、これにより反復配列を含むゲノム領域から生成されたコンティグの引き続く組み立てが容易となる。ギャップレス耐性配列が組み立てられ、耐性遺伝子型と感受性参照遺伝子型との間で配列比較を行い、標的領域内の新規のマーカーを開発することが可能になった。利用可能な組換体を用いる新規のファインマッピングステップで、標的領域を、耐性遺伝子型において２６４８４ｂｐおよび感受性遺伝子型において３９５８７ｂｐの配列範囲を含む２つの新規のフランキングマーカーに縮小した。縮小された標的領域は、９つの注釈付き遺伝子だけを含む。これらの遺伝子の中で、３つの直列に繰り返されるＬＲＲ遺伝子を、ＮＲＢＭＨ耐性についての潜在的原因となる候補遺伝子として同定した（ＬＲＲ１、ＬＲＲ２およびＬＲＲ３（図１））。この標的領域は、高度な複雑性を示す：ａ）耐性配列は、大きな配列重複を含む；ｂ）ＬＲＲ遺伝子は、配列類似性を示す；ｃ）感受性遺伝子型ではいくつかのレトロトランスポゾンが、標的領域内に埋め込まれている。この配列複雑性のため、ＲＲ配列と、ｓｓ配列との組み立ては、高度に要求が厳しく、極めて複雑な手順であった。

縮小された標的領域内で、５つの組換体が検出され、これらの組換体の１８０の子孫は、表現型であった。この表現型は、集中的な統計的方法（ｔ検定、検定力分析）によって検定された。これらの５つの組換体から、アイデント毎に１０の植物の試料を、３つのＬＲＲ遺伝子用に開発された特別な優勢マーカーを用いて分析した。機能について３つのＬＲＲ遺伝子を試験することができた。例示的な結果として、ＬＲＲ１遺伝子は、いずれの組換体においても、任意の矛盾するデータを示さず、すなわち、ＬＲＲ１遺伝子を有する全ての組換体は、耐性である。

「マップベースクローニング」プロセスは、以下のステップを含む：遺伝子ファインマッピング、物理マッピング、ＷＨＧ（全ゲノム）配列分析、いくつかの大きな分離個体群の構築、組換えスクリーニング、標的領域内でのマーカー開発、耐性遺伝子型における比較ＢＡＣシークエンシング、耐性遺伝子型配列と感受性遺伝子型配列との分析、生物情報学的分析、タンパク質予測、タンパク質の比較。以下のステップは、本発明にとって重要であった：集中的な表現型決定と組み合わせたファインマッピング、耐性ＢＡＣクローンの同定および配列決定、３つのＬＲＲ遺伝子用の優勢マーカーの開発、配列分析およびＲＲ（耐性）遺伝子型とｓｓ（感受性）遺伝子型との間の配列比較およびタンパク質比較。

例３：Beta vulgaris subsp. vulgaris中での遺伝子形質転換による導入遺伝子としての耐性付与遺伝子の導入
ヘテロデラ耐性植物を生産するための遺伝子導入アプローチは、耐性付与遺伝子としてのＬＲＲ遺伝子の代替的確認だけでなく、新規ヘテロデラ耐性を付与するかまたは既存のヘテロデラ耐性を改善する遺伝子導入耐性イベントを生成する手段としても提供される。

目的のＬＲＲ遺伝子を、以下の標準クローニング手順によってバイナリーベクターｐＺＦＮ－ｎｐｔＩＩ（図２）中へクローニングした：トランスジェニック植物における耐性遺伝子の高い構成的発現レベルを保証するために、このベクターのＴ－ＤＮＡ内で、耐性遺伝子のｃＤＮＡを、複製されたＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターとノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）ターミネーターとの間にクローニングした。Ｔ－ＤＮＡは、さらに、カナマイシンまたはパロモマイシンのようなアミノグリコシド抗生物質の帯域幅に対する耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）を含む。これらの抗生物質耐性を、トランスジェニック植物細胞および組織の選択のために使用した。ＮＯＳプロモーターおよびｐＡＧ７ターミネーターは、ｎｐｔＩＩ遺伝子に隣接する。バイナリーベクターの骨格は、さらに、Escherichia coliまたはAgrobacterium tumefaciens中でのプラスミド複製のためのｃｏｌＥ１およびｐＶＳ１起点を含む。ａａｄＡ遺伝子は、細菌選択のためにストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性を付与する。ｐＺＦＮ－ｎｐｔＩＩ－ＬＲＲプラスミドは、標準手順によりアグロバクテリウム株ＡＧＬ－１中で形質転換された。

テンサイの形質転換は、Lindsey & Gallois (1990), “Transformation of sugarbeet (Beta vulgaris) by Agrobacterium tumefaciens.” Journal of experimental botany 41.5, 529-536に従って行った。このために、同定された遺伝子の感受性対立遺伝子だけを有する遺伝子型０４Ｅ０５Ｂ１ＤＨ５の「マイクロプロパゲーションされた苗条」を出発材料として使用した。苗条を、Lindsey & Gallois (1990)による対応する培地内で増殖した。可能な限り多くの分裂組織を誘導するために、「苗条」を別の培地に移し（Lindsey & Gallois (1990)参照）、暗所で約３０℃で数週間インキュベートした。ベクターｐＺＦＮ－ｎｐｔＩＩ－ＬＲＲを含むアグロバクテリウム株ＡＧＬ－１を、付加的培地（ Lindsey & Gallois (1990)参照）中で培養し、付加的に選択のために対応する抗生物質を提供した。処理される苗条に基づく分裂組織の部分を、付加的培地（Lindsey & Gallois (1990)参照）中でアグロバクテリウムと共に数時間インキュベートした。植物外植体とアグロバクテリウムとを、暗所で培地（Lindsey & Gallois (1990)参照）中で少なくとも２日間共培養し、引き続き接種した外植体を暗所で付加的培地（Lindsey & Gallois (1990)参照）中で約２週間インキュベートした。その後、外植体を、付加的培地（Lindsey & Gallois (1990)参照）中でさらに増殖させ、トランスジェニック組織の選択を可能にするため、継代培養した。次いで、葉の材料を、緑色に成長した「苗条」から取り出し、導入遺伝子の存在についてＰＣＲを用いて調査した。適切な「苗条」が発根し、引き続きＴ１種子ストックの生産のために温室に移した。次いで、Ｔ１植物におけるヘテロデラ耐性は、例１に記載されたプロトコルを用いて試験することができる。結果を表１～３に示す。

線虫は根組織に感染するため、典型的な根の発育を示す植物だけをこれらの表中に示す分析に含めた。分離する植物は、ヘテロ接合トランスジェニック再生体の自殖である。予想した表現型の分離は、３（耐性）から１（感受性）までである。３０以下のシストを示す植物を、表現型的に耐性であると見なし、表１における対応する値を、太字で示す。所定の標準偏差が予想されるため、統計学的評価のために十分に大きな量の系統と固体とを生産した。

表２は、表現型的に耐性植物と見なされる最大３０のシストを有する植物のパーセンテージを示す。系統Ａは、典型的な感受性系統であり、試験した固体の４．８％だけが耐性表現型を示した。系統Ｂは、良好な耐性を示す公知の系統である。系統Ｂの試験した固体の１００％が、耐性表現型を示した。所定の系統だけが、遺伝的形質転換のために使用されるように適合されているため、形質転換のために使用した系統は、耐性についても試験した（非トランスジェニック状態）：試験した４つの系統Ｃ～Ｆは、表現型的に耐性の固体の２４％～３６％を示した。

分離のために、形質転換体の２５％が耐性遺伝子を持たないことが統計的に予想される。このことを考慮すると、表現型的に耐性の植物の７５％の値は、対応する導入遺伝子によって付与される耐性と１００％等しくなる。したがって、表３の最後の２つの系統は、統計的に修正された値を示す（係数１．３３により乗算）。表３の値は、形質転換対照と比較して、配列番号２および配列番号５の形質転換後に、耐性表現型を有する植物の数において有意な増加を示す。

Claims (22)

1. 核酸分子を発現する植物内でヘテロデラ属の線虫に対する耐性を高めるヌクレオチド配列において、前記ヌクレオチド配列は、以下の：
   （ａ） 配列番号１、４および７からなる群から選択される配列を含むヌクレオチド配列またはその機能的フラグメント；
   （ｂ） 配列番号２、５および８からなる群から選択されるコード配列を含むヌクレオチド配列またはその機能的フラグメント；
   （ｃ） ストリンジェントな条件下で（ａ）、（ｂ）、（ｆ）または（ｇ）によるヌクレオチド配列の相補的配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列；
   （ｄ） （ａ）、（ｂ）、（ｆ）または（ｇ）のいずれか１つのヌクレオチド配列の配列に対して少なくとも７０％同一である配列を含むヌクレオチド配列；
   （ｅ） （ａ）、（ｂ）、（ｆ）または（ｇ）の対立遺伝子または１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換、挿入、転移、および／または付加による誘導体であるＤＮＡ配列を含むヌクレオチド配列；
   （ｆ） 配列番号３、６および９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはその機能的フラグメント；
   （ｇ） 配列番号３、６および９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
   （ｈ） 遺伝コードの縮重による（ａ）から（ｇ）までのいずれかのＤＮＡ配列の変異体であるヌクレオチド配列
   からなる群から選択され、
   前記ヌクレオチド配列は、場合によりプロモーターと作動可能に連結されている
   ことを特徴とする、ヌクレオチド配列。
2. 請求項１記載のヌクレオチド配列を含むベクターまたは発現カセット。
3. 請求項１記載の核酸分子、または請求項２記載のベクターまたは発現カセットを含む細胞。
4. 請求項１記載のヌクレオチド配列、請求項２記載のベクターまたは発現カセット、または請求項３記載の細胞を含むペレット種子および／またはプライミング種子。
5. 前記ペレット種子および／またはプライミング種子は、請求項１記載のヌクレオチド配列を含むかまたは同じポリペプチドをコードする配列を内因的にまたは遺伝子導入により含むことを特徴とする、請求項４記載のペレット種子および／またはプライミング種子。
6. 前記ヌクレオチド配列を内因的に含む前記ペレット種子および／またはプライミング種子は、Beta vulgaris種に属するが、B. vulgaris subsp. maritimaではない、請求項４記載のペレット種子および／またはプライミング種子。
7. 以下の：
   （ａ） ポリシング
   （ｂ） インクラステーション
   （ｃ） カラーリング
   からなる群から選択される処理に供された、請求項４、５または６記載のペレット種子および／またはプライミング種子。
8. 以下の：
   （ｉ） 請求項１記載のヌクレオチド配列を、好ましくは部位特異的ヌクレアーゼにより促進される、相同指向修復または相同組換えにより、植物の少なくとも１つの細胞のゲノム内へ組み込み、場合により植物細胞から植物を再生するステップ；または
   （ｉｉ） 植物内での請求項１記載のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの発現を、好ましくはネイティブプロモーターを修飾することによるかまたは配列をコードするポリペプチドを、前記ネイティブプロモーターと比べてより高い活性を示す異種プロモーターと融合することにより、特にヘテロデラ種の病原体による感染時に、高めるステップ；または
   （ｉｉｉ） 請求項１記載のヌクレオチド配列、または請求項１記載のヌクレオチド配列を含むベクターまたは発現カセットを用いて植物細胞を形質転換し、場合により形質転換された植物細胞からトランスジェニック植物を再生するステップ
   を含む、植物中でヘテロデラ属の線虫に対する耐性を高める方法。
9. 以下の：
   （ａ） 請求項１記載のヌクレオチド配列、または請求項１記載のヌクレオチド配列を含むベクターまたは発現カセットで植物細胞を形質転換するステップ；および
   （ｂ） 形質転換された植物細胞からトランスジェニック植物を再生するステップ；または
   （ｉ）植物の細胞内へ、部位特異的ヌクレアーゼおよび修復マトリックスを導入するステップであって、前記部位特異的ヌクレアーゼは、前記細胞のゲノム内のＤＮＡの少なくとも１つの一本鎖切断または少なくとも１つの二本鎖切断を、好ましくは標的領域の上流および／または下流で生成することができ、前記修復マトリックスは、請求項１記載のヌクレオチド配列または請求項１記載のヌクレオチド配列の部分をコードするポリペプチドを含む、部位特異的ヌクレアーゼおよび修復マトリックスを導入するステップ；
   （ｉｉ） 相同指向修復または相同組換えを可能にする条件下で（ｉ）からの細胞を培養するステップであって、前記ヌクレオチド配列は、修復マトリックスから植物のゲノム内に組み込まれる、細胞を培養するステップ；および
   （ｉｉｉ） （ｉｉ）において修飾された細胞から植物を再生するステップ；または
   （Ｉ） 植物、好ましくはベタ属の植物、より好ましくはBeta vulgaris種の植物の細胞内へ、部位特異的ヌクレアーゼまたは塩基エディターを導入するステップであって、部位特異的ヌクレアーゼは、前記細胞の前記ゲノム内のＤＮＡの少なくとも１つの一本鎖切断または少なくとも１つの二本鎖切断を、好ましくは請求項１記載のヌクレオチド配列に対して相同である標的領域の上流、下流または標的領域内で生成する、部位特異的ヌクレアーゼまたは塩基エディターを導入するステップ；
   （ＩＩ） 前記標的領域の修飾を可能にする条件下で、以下のものから選択される（Ｉ）からの細胞を培養するステップ；
   （１） 少なくとも１つのヌクレオチドの置換；
   （２） 少なくとも１つのヌクレオチドの欠失；
   （３） 少なくとも１つのヌクレオチドの挿入；または
   （４） （１）～（３）の任意の組合せ；および
   （ＩＩＩ） （ＩＩ）において修飾された細胞から植物を再生するステップ
   を含む、ヘテロデラ属の線虫に対する耐性を有する植物を生産する方法。
10. 前記標的領域は、
    ａ） 配列番号１０または配列番号１１によるマーカーｓ５ｅ３００１ｓ０２と配列番号１２または配列番号１３によるマーカーｓ５ｅ４６６８ｘｘｘとの間に位置するか、または
    ｂ） 配列番号１０または配列番号１１によるマーカーｓ５ｅ３００１ｓ０２と配列番号１２または配列番号１３によるマーカーｓ５ｅ４６６８ｘｘｘとに隣接するか、または
    ｃ） 配列番号１０または配列番号１１によるマーカーｓ５ｅ３００１ｓ０２と配列番号１２または配列番号１３によるマーカーｓ５ｅ４６６８ｘｘｘとの間に染色体間隔を含み、
    場合により、請求項１記載のヌクレオチド配列の対立遺伝子変異体を含み、前記対立遺伝子変異体は、植物中に存在する場合にヘテロデラ属の線虫に対する耐性を付与しない
    ことを特徴とする、請求項９記載の方法。
11. 前記少なくとも１つの一本鎖切断または前記少なくとも１つの二本鎖切断は、前記標的領域の上流および／または下流の最大１００００塩基対の位置で起こるか、または請求項１０に定義された対立遺伝子変異体から最大１００００塩基対離れた位置で起こることを特徴とする、請求項９または１０記載の方法。
12. ヘテロデラ属の線虫に対して耐性である植物を同定、場合により提供または選択する方法において、前記方法は、少なくとも以下の（ｉ）または（ｉｉ）、
    （ｉ） 前記植物または前記植物の部分中で、請求項１記載のヌクレオチドの存在および／または発現を検出するステップ；および／または
    （ｉｉ） 請求項１記載のヌクレオチド配列内で同時分離する少なくとも１つの領域を検出するステップ；および
    （ｉｉｉ） 場合により、ヘテロデラ属の線虫に対する耐性を有する植物を選択するステップ
    を含むことを特徴とする、植物を同定、場合により提供または選択する方法。
13. 請求項４から７までのいずれか１項記載のペレット種子および／またはプライミング種子から誘導される植物。
14. 以下の
    （ｉ） 請求項１１記載の植物または請求項４から７までのいずれか１項記載の種子を提供するか、請求項９から１１までのいずれか１項記載の方法により植物を生産するか、または請求項１２記載の方法により植物を同定および選択するステップ、および
    （ｉｉ） （ｉ）からの植物またはその子孫を栽培するステップ
    を含み、
    前記方法は、栽培植物にヘテロデラ属の線虫が寄生することを妨げる、
    植物を栽培する方法。
15. 少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０、好ましくは少なくとも２１、２２、２３、２４、または２５、特に好ましくは少なくとも３０、３５、４０、４５、または５０、最も好ましくは少なくとも１００、２００、３００、または５００のヌクレオチド長さのオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドは、請求項１に定義されたヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズし、前記オリゴヌクレオチドは、蛍光色素と直接的または間接的に連結されている、オリゴヌクレオチド。
16. 前記蛍光色素は、ＦＡＭまたはＨＥＸである、請求項１５記載のオリゴヌクレオチド。
17. オリゴヌクレオチドの混合物、好ましくは請求項１６記載のオリゴヌクレオチドの混合物、またはオリゴヌクレオチドの前記混合物を含むキットであって、前記オリゴヌクレオチドは、Beta vulgarisゲノム内の、請求項１記載の核酸分子または請求項２記載のポリペプチドにより付与されるヘテロデラ属の線虫に対する耐性を有するBeta vulgaris内で同時分離する領域に対してフォワードプライマーおよびリバースプライマーとしてのハイブリダイゼーションに適しており、好ましくは前記Beta vulgarisゲノム内の前記領域は、マーカーｓ５ｅ３００１ｓ０２とマーカーｓ５ｅ４６６８ｘｘｘとの間に位置するか、マーカーｓ５ｅ３００１ｓ０２とマーカーｓ５ｅ４６６８ｘｘｘとに隣接するか、またはマーカーｓ５ｅ３００１ｓ０２とマーカーｓ５ｅ４６６８ｘｘｘとの間に染色体間隔を含む、オリゴヌクレオチドの混合物、またはオリゴヌクレオチドの混合物を含むキット。
18. 以下の
    （ａ） ゲノム領域に遺伝子的に連結されたマーカーの存在について前記植物または植物種子のゲノム核酸を同定するステップであって、前記ゲノム領域は、ヘテロデラ属の線虫に対する耐性と関連し、前記ゲノム成熟マーカーは、配列番号１、２、４、５、７、８のいずれかの１２ｃＭ内、または８００００キロベース内にある、前記植物または植物種子のゲノム核酸を同定するステップ；
    （ｂ） （ａ）で与えられたマーカーにハイブリダイズするために適したオリゴヌクレオチドを提供するステップ
    を含む、ヘテロデラ属の線虫に対する耐性について植物または植物種子の選択に有用なオリゴヌクレオチドを製造する方法。
19. 前記オリゴヌクレオチドは、蛍光色素と連結されている、請求項１８記載の方法。
20. 配列番号１０～８７からなる群からの１つの配列番号を有する分子マーカー、オリゴヌクレオチドまたはプライマー。
21. 前記分子マーカー、オリゴヌクレオチドまたはプライマーは、請求項１記載のヌクレオチド配列を含む植物を選択するために適しているか、または請求項１記載のヌクレオチド配列のコード部分を含む植物を選択するために適している、請求項２０記載の分子マーカー、オリゴヌクレオチドまたはプライマーから誘導される分子マーカー、オリゴヌクレオチドまたはプライマー。
22. 以下の：アベイシックヌクレオチド；８’ｏｘｏ ｄＡおよび／または８’ｏｘｏ ｄＧヌクレオチド；その３’末端での逆塩基；２’Ｏ－メチルヌクレオチド；５’末端キャップ；ホスホチオアート修飾、メチルホスホナート修飾、ロック核酸（ＬＮＡ）修飾、Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）修飾、di PS修飾、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）修飾からなる群から選択される主鎖修飾；鎖内架橋；それと接合した蛍光染料；ＧＲＯＮの５’または３’末端でそれと接合した蛍光染料；ハイブリダイゼーションエネルギを高める１つ以上の塩基；その５’末端での２’Ｏ－メチルヌクレオチド；その３’末端での２’Ｏ－メチルヌクレオチド、その５’末端で接合した蛍光染料、その３’末端で接合した蛍光染料、その５’末端でのホスホチオアート残基、その３’末端でのホスホチオアート残基、３’ブロッキング置換基、５’ブロッキング置換基、３’と５’の両方のブロッキング置換基からなる群から選択される１つ以上の化学修飾または付加を含む、請求項２０または２１記載の分子マーカー、オリゴヌクレオチドまたはプライマー。

Images