CN115605600A - 未成熟花序分生组织编辑 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于植物未成熟花序分生组织(IIM)细胞的发育阶段中的至少一个植物细胞的植物基因组修饰的方法，其中通过提供基因组修饰或编辑系统与可选地至少一种再生加强剂一起实现特异性细胞类型的修饰，优选其中借助于粒子轰击引入效应分子。为此，提供了新的人工和精确可控的加强剂基因和蛋白质(RBP)。进一步，以直接或间接的方式再生经修饰的植物细胞。最后，提供了方法、工具、构建体和策略来有效地修饰植物细胞中的至少一个基因组靶位点，以获得所述经修饰的细胞并从这种经修饰的细胞再生植物组织、器官、植物或种子。

Description

未成熟花序分生组织编辑

技术领域

本发明涉及特异性植物细胞的基因组工程或基因编辑的领域。具体地，本发明涉及植物未成熟花序分生组织(IIM)细胞的发育阶段中的至少一个植物细胞的修饰，其中通过提供基因组修饰或编辑系统与可选地至少一种再生加强剂一起实现特异性细胞类型的修饰，优选其中借助于粒子轰击引入效应分子。为此，提供了新的人工和精确可控的加强剂基因(RBG)和蛋白质(RBP)。进一步，以直接或间接的方式再生经修饰的植物细胞。最后，提供了方法、工具、构建体和策略来有效地修饰植物细胞中的至少一个基因组靶位点，以获得所述经修饰的细胞并从这种经修饰的细胞再生植物组织、器官、植物或种子。

背景技术

为了应对气候变化、食品安全和世界人口增长带来的日益严峻的挑战，必须通过新的分子生物学新技术来改善通常相当耗时的传统植物育种，从而以安全方式提供具有期望性状但需要更少发育时间的新作物植物。

手头拥有越来越多的潜在合适的位点特异性核酸酶工具，转化或转染以及随后的再生仍然是植物基因组工程的主要瓶颈技术，如基因组编辑(GE)。为了获得经修饰的植物，这两个事件必须落在同一细胞上。迄今为止，粒子轰击和农杆菌(Agrobacterium)介导的生物分子递送是最有效的植物转化方法。在农杆菌转化中，农杆菌首先找到合适的细胞并附着于植物细胞壁，这通常称为“接种”。接种后，农杆菌在合适的条件下与植物细胞一起生长一段时间(从几小时至几天)以允许T-DNA转移。农杆菌-植物相互作用、植物组织结构、植物细胞类型等制约农杆菌转化。受植物细胞易感性和可接近性的限制，普遍认为农杆菌介导的转化依赖于植物物种、植物组织类型和植物细胞类型。相反，基于物理作用力粒子轰击(至少在理论上)不依赖于植物物种和植物细胞类型，并且能够在施加适当压力时转化任何细胞。尽管如此，许多植物细胞，特别是根据发育阶段和所来源的组织从植物中新鲜分离出来的植物细胞，在受到各种微粒子或纳米粒子的物理轰击时，会遭受严重的压力或甚至细胞死亡。另外，轰击可能与由严重的细胞损伤或破裂引起的低转化和/或整合频率相关。物理轰击本身提供了很大的优势，因为其容易、快速和通用，并且根据需要允许所插入分子的瞬时和稳定表达。可以避免转染或细菌转化所需的潜在毒性化学物质。

因此，对于基因组修饰，存在着在合适的发育阶段鉴定出如下新的植物细胞和方案的迫切需要：其能够直接从活植物中分离出来，可以被有效地轰击(例如，用于基因编辑，或用于对待稳定或瞬时插入的工具的任何种类的表达)，并且可在以后再生成全植物。

植物细胞在发育上具可塑性，并且很可能再生。植物细胞的再生能力取决于细胞相同性、年龄和环境信号。存在至少两种类型的植物细胞：体细胞和干细胞。体细胞是干细胞的后代。它们是形态上、代谢上和功能上具有特异性特征的分化细胞。体细胞的再生需要经由去分化成为再生细胞的细胞命运重编程。另一方面，植物干细胞是未分化的，并且能够生成新的细胞、组织，并且最终发育成新的植物。植物干细胞主要位于称为植物分生组织的特化组织上，该植物分生组织包括芽、根分生组织和花序分生组织。

对于重要的谷类作物(例如，玉米、小麦、黑麦、燕麦、大麦、高粱、稻)，基因组工程最广泛使用的外植体是未成熟合子胚。来自未成熟胚盾片表面的表皮细胞和表皮下细胞是用于农杆菌介导的转化以及用于粒子轰击的理想受体细胞。然而，从未成熟胚盾片表面上的表皮细胞和表皮下细胞的再生是高度基因型依赖性的，并且谷物作物的基因工程通常依赖于若干再生性基因型，例如，玉米Hi II和A188。此外，未成熟合子胚的产生是一种需要时间和资源的过程。在玉米中，从播种到未成熟胚收获需要至少12周，并且需要装备完善以及高度保持的温室条件和设施。未成熟胚的质量也是温室和季节依赖性的。因此，对于谷类作物基因组工程，高度期望开发具有再生性且不依赖于长温室时段的替代外植体。

植物产生大量的花序分生组织。花序分生组织是含有多能干细胞的经修饰的芽分生组织，并且能够产生花原基，并且最终发育成花序(即，排列在主茎上的一簇花)。如今，用于有效植物基因组编辑的可靠方案不可用于特别且有效地转染花序分生组织(尤其是通过物理手段)，从而以可遗传性的方式快速地将感兴趣的性状引入到给定植物的基因组中。

植物的靶向修饰的另一问题在于，据信转化细胞的可再生性低于野生型细胞。鉴于在引入GE工具后转化/转染的材料可能不够可行这一事实，这些情况可能会导致基因组编辑的速率较差。例如，由于在细胞内存在外源DNA，转化细胞易受程序性细胞死亡的影响。由递送引起的压力(例如轰击损伤)还可能会引发细胞死亡。

植物发育的特征在于分生组织的反复起始、产生新器官的分裂细胞的区域。在侧根(LR)形成期间，新的LR分生组织被指定支持LR沿着新轴长出。关键转录因子的冗余活动阻碍了形成这种新的生长轴所需的顺序事件的确定。三种PLETHORA(PLT)转录因子PLT3、PLT5和PLT7在LR长出期间的效应已经被表征。已发现，在plt3/plt5/plt7三突变体中，在第I阶段和第II阶段之间的转变期间，侧根原基(LRP)的形态、生长素响应梯度和分生组织/组织相同性标记的表达由于“破坏对称性的”周缘细胞分裂而受损，其中细胞首先在由近及远径向轴上获得不同的相同性。特别地，在LR长出期间表达通常晚于PLT3、PLT5和PLT7的PLT1、PLT2和PLT4基因不会在突变体原基中被诱导，从而导致“PLT无效”LRP。突变体原基中任何PLT分支成员的再引入完全恢复了第II阶段的层相同性，并且拯救分生组织和组织建立中的突变体缺陷。因此，所有PLT基因均可以激活形成性细胞分裂，导致从头生分生组织建立和与新生长轴相关的组织模式化(Du和Scheres,PNAS 2017,https://doi.org/10.1073/pnas.1714410114)。尽管如此，尚未对PLT蛋白及其变体在特异性分生组织细胞基因编辑中以协同方式促进基因编辑的作用进行过描述。

再者，可靠且有效的方案缺乏将关于植物再生加强剂的知识与进一步强大的基因编辑机制相结合，特别是当考虑到这两种技术都需要将巨大的分子复合物引入到必须处于易受转化影响的状态中的给定细胞中的事实时更是如此。

如Lowe等人(Plant Cell,2016,28(9))中所公开的，与在植物基因组修饰的人工环境中使用天然存在的再生加强剂相关的另一问题是：再生加强剂通常具有刺激生长的作用，如果没有像在自然环境中那样受到精确的控制，其中转录因子只以严格受控的时空方式表达，则用于植物基因组修饰的再生加强剂的异位表达容易导致对植物生长和育性的多效性效应。然而，这些不确定性和负面影响并不是靶向基因组编辑所期望的。为了解决此问题，Lowe等人提出了一种相当繁琐的技术，即通过去除相关的表达盒来整合并随后灭活加强剂活性。

鉴于当前在相关单子叶植物和双子叶植物的高效植物转化策略和/或有效位点特异性植物基因组编辑方面的障碍，因此，本发明的目的是提供适于被转染/转化的新植物细胞和以限定的方式转化特异性植物组织的有效方案，以通过靶向处于最佳发育阶段的植物细胞来增加转染/转化效率。最后，目的是使用单细胞起源实现基因组修饰(例如基因编辑)，从而允许同质和可再生的基因组编辑而无需常规选择，以加速和推动依赖于繁琐而昂贵的筛选和再生步骤或遭受较差和相当单一的基因编辑事件的当前方案。

发明简述

上述目的是通过阐明以下事实来实现的：植物未成熟花序分生组织(IIM)细胞通常为基因组工程和修饰，并且尤其是为靶向基因组编辑提供理想的替代外植体。本发明涉及将生物分子(例如DNA、RNA、蛋白质、RNP或化学物质)直接递送到作为特异性靶细胞的花序分生组织细胞中，优选由微粒子载体介导。在生物分子的基因枪递送之后，经由直接分生组织再生或经由间接愈伤组织再生，将来自未成熟花序分生组织的转化细胞以灵活的方式再生成整个植物。

在一个方面，提供了一种通过获得至少一个植物未成熟花序分生组织细胞的修饰而用于植物基因组修饰，优选用于至少一个基因组靶序列的靶向修饰的方法，其中该方法包括以下步骤：(a)提供至少一个未成熟花序分生组织(IIM)细胞；(b)将以下各项引入到至少一个未成熟花序分生组织细胞中：(i)至少一种基因组修饰系统，优选基因组编辑系统，该基因组编辑系统包含至少一种位点定向的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶，优选核酸引导的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶、或编码其的序列，以及可选地至少一种引导分子或编码其的序列；(ii)可选地：至少一种再生加强剂或编码其的序列或再生加强剂化学物质，其中步骤(i)和(ii)同时或接连发生，以促进植物细胞增殖和/或协助至少一个基因组靶序列的靶向修饰；(iii)以及可选地至少一种修复模板或编码其的序列；以及(c)在允许表达和/或组装至少一种基因组修饰系统，优选至少一种基因组编辑系统以及可选地至少一种再生加强剂，以及可选地至少一种引导分子和/或可选地至少一种修复模板的条件下，培养至少一个未成熟花序分生细胞；以及(d)获得至少一个经修饰的未成熟花序分生组织细胞；或(e)获得从至少一个经修饰的细胞再生的至少一种植物组织、器官、植物或种子；以及(f)可选地：在携带期望靶向修饰的T0和/或T1代中筛选从至少一个经修饰的细胞再生的至少一种植物组织、器官、植物或种子。

在进一步的方面，提供了分离的核酸序列和编码其的多肽序列，以及包含分离的核酸序列的重组基因、表达盒和表达构建体，其中该多肽序列具有经人工优化的再生加强剂的功能，以完全适合于促进基因组修饰或基因编辑，并且适合于与至少一种进一步的再生加强剂组合使用。

在进一步的方面，提供了用于使用如第一方面中所提供的用于植物基因组修饰方法来再生顽拗型植物/植物基因型的方法。

在又进一步的方面，提供了提供至少一种再生加强剂或再生加强剂的特异性组合或编码其的序列的方法，以有效地产生单倍体或双单倍体植物细胞、组织、器官、植物或种子。

在一个方面，IIM细胞优选通过物理轰击，可选地与至少一种再生促进剂一起转化。

在一个方面，该方法包含再生步骤，其中再生是直接分生组织器官发生，在另一方面，再生步骤包括间接愈伤组织胚发生或器官发生的步骤。

在一个方面，该方法特别地依赖于至少一种再生加强剂或编码其的序列的用途或至少一种再生加强剂化学物质的用途，其中加强剂实现了增强转染/转化后的植物再生和/或增强基因组修饰效率(特别是通过至少一种位点定向的核酸酶诱导靶向DNA断裂(单链或双链)后的基因编辑效率)的双重功能。

在进一步的方面，提供了再生加强剂的特异性组合，该组合在促进植物再生和/或基因组修饰效率，优选基因编辑效率方面具有协同活性。

在一个方面，粒子轰击用于转化或转染至少一个感兴趣的植物未成熟花序细胞。

在进一步的方面，提供了一种能通过或通过根据前述权利要求中任一项所述的方法获得的植物细胞、组织、器官、植物或种子。

在又进一步的方面，提供了基因组修饰系统或基因组编辑系统用于有效地转化或转染至少一个未成熟花序细胞的用途。

在另一方面，提供了表达构建体和表达盒，该表达构建体和表达盒编码基因组修饰系统或编码基因组编辑系统，以被引入到至少一个植物未成熟花序分生组织细胞中。

进一步提供了一种表达构建体组装件，其包含用于进行如本文所公开的方法的相关构建体和盒。

在进一步的方面，为各种相关作物植物提供了用于将植物分阶段的方法，以确定在存在植物未成熟花序分生组织细胞时的正确发育阶段，并因此可用于所提供的植物基因组修饰的方法。

在又另一方面，提供了一种植物细胞，优选IIM细胞，其包含表达构建体组装件，或包含重组基因，或包含如本文所公开的表达盒或表达构建体；或提供了一种包含该植物细胞的植物组织、器官、全植物、或其部分或种子。

提供了用于构建用于根据本发明的用途的多用途表达构建体和表达盒的进一步使用和方法。

附图说明

每当图示出原始荧光图像的黑白图片时，较亮的点代表相应荧光蛋白的累积。

图1(Fig.1)示出了用于玉米幼苗培育的深50孔穴盘(A)和1020温室(无孔)托盘(B)。

图2(Fig.2)示出了生长在温室中的50孔托盘处的处于后期V6阶段的28日龄玉米幼苗已准备好进行未成熟雄穗收获。

图3(Fig.3)示出了新鲜分离的玉米未成熟花序。(A)28日龄玉米A188幼苗的未成熟雄穗；(B)36日龄玉米4V-40171幼苗的未成熟穗；(C)从KWS Bono成熟黑麦植株分离出来的处于AM(花药原基)阶段的未成熟花序。GP指示颖片原基，并且LP指示外稃原基。星号代表雄蕊原基。

图4(Fig.4)示出了基因组编辑核酸酶MAD7表达构建体pGEP837的图。本实例中使用绿色荧光标记(指示为GEP)。取决于要转化和可视化的植物靶细胞/组织，可以使用任何种类的荧光蛋白编码标记基因。MAD7定义了直肠真杆菌(Eubacterium rectale)CRISPR/MAD7基因的玉米密码子优化CDS(Inscripta)。BdUBI10定义了短柄草属泛素(BrachypodiumUbiquitin)10启动子。Tnos定义了nos终止子。

图5(Fig.5)示出了用质粒pGEP837(参见图4)轰击后20小时玉米未成熟花序的荧光图像(使用绿色荧光标记基因，并且相应地其在靶组织中的表达可视化)。(A)-(H)：玉米自交系的29日龄未成熟雄穗。(A)：玉米优良品种4V-40171；(B)：玉米优良品种5V-50269；(C)：玉米优良品种5V-50266；(D)：玉米优良品种3V-30261；(E)：玉米优良品种16V-0089；(F)：玉米优良品种4V-40131；(G)：玉米优良品种2V-20121；(H)：玉米优良品种3V-30315。

图6(Fig.6)示出了基因组编辑crRNA构建体pGEP842的图。m7GEP1定义了靶向玉米HMG13基因的crRNA。ZmUbi1定义了来自玉米泛素1基因的启动子和内含子。Tnos定义了nos终止子。

图7(Fig.7)示出了玉米PLT5表达构建体pABM-BdEF1_ZmPLT5的图。ZMPLT5由来自短柄草属的强组成型EF1启动子(pBdEF1)驱动。

图8(Fig.8)示出了经由玉米A188未成熟雄穗的基因枪轰击和直接分生组织再生进行基因组编辑的工作流程。(A)：已准备好进行轰击的新鲜分离的未成熟雄穗；(B)：用质粒pGEP837(参见图4)轰击后20小时未成熟雄穗的荧光图像(使用绿色荧光标记基因，并且相应地其在靶组织中的表达可视化)；(C)：分生组织增殖步骤I，持续7天；(D)：分生组织增殖步骤II，持续7天；(E)：生芽培养基中的小植株发育，持续7天；(F)：生根培养基中的小植株发育，持续7天。

图9(Fig.9)示出了通过直接分生组织再生从28日龄A188未成熟雄穗再生的T0小植株中的基因组编辑事件的Sanger测序跟踪分解分析。(A)12个具有约100％ SDN-1编辑(双等位基因)的再生小植株中的一个的测序结果；(B)具有约50％SDN-1编辑(单等位基因)的小植株的测序结果。

图10(Fig.10)示出了通过瞬时基因枪转化以及种植后39天收获的玉米优良品种4V-40171植物未成熟穗直接分生组织再生进行的基因组编辑SDN-1。(A)：新鲜分离的来自优良品种4V-40171的未成熟穗；(B)：位于渗透培养基(IM_OSM)上且已准备好进行生物枪轰击的未成熟穗。

图11(Fig.11)示出了KWS_RBP4表达构建体pABM-BdEF1_RBP4的图。KWS_RBP4由来自短柄草属的强组成型EF1启动子(pBdEF1)驱动。

图12(Fig.12)示出了KWS_RBP5表达构建体pABM-BdEF1_RBP5的图。KWS_RBP5由来自短柄草属的强组成型EF1启动子(pBdEF1)驱动。

图13(Fig.13)示出了采用再生加强剂，通过玉米A188未成熟雄穗的基因枪转化和间接愈伤组织再生进行基因组编辑的工作流程。(A)：已准备好进行轰击的新鲜分离的未成熟雄穗；(B)：质粒pGEP837/pGEP842与再生加强剂ZmPLT5和KWS_RBP4或KWS_RBP5共同轰击后20小时未成熟雄穗的荧光图像(使用绿色荧光标记基因，并且相应地其在靶组织中的表达可视化)；(C)：在愈伤组织诱导培养基中20天后诱导的愈伤组织；(D)：生芽培养基中的愈伤组织绿变，持续5天；(E)：生芽培养基中的小植株发育，持续12天；(F)：生根培养基中的小植株发育，持续7天。

图14(Fig.14)示出了KWS_RBP8表达构建体pABM-BdEF1_RBP8的图。KWS_RBP8由来自短柄草属的强组成型EF1启动子(pBdEF1)驱动。

图15(Fig.15)示出了pGEP22表达构建体pGEP1067的图。m7GEP22定义了靶向玉米内源性基因HMG13的crRNA。ZmUbi1定义了来自玉米泛素1基因的启动子和内含子。Tnos定义了nos终止子。

图16(Fig.16)示出了基因组编辑核酸酶MAD7表达构建体pGEP1054的图。tdTomato定义了tdTomato报告基因。MAD7定义了MAD7核酸酶的玉米密码子优化CDS(Inscripta)。BdUBI10定义了短柄草属泛素10启动子。Tnos定义了nos终止子。

图17(Fig.17)示出了荧光报告基因tDTomato在玉米优良品种和具有加强剂KWS_RBP8的F1杂交体中的稳定转化的代表性图像。(A)：指示玉米优良品种MMS18-01495中的稳定转化事件的tDTomato表达愈伤组织；(B)：指示玉米优良品种PJ0-73631中的稳定转化事件的tDTomato表达幼芽；(C)：指示玉米优良品种4V-40171(♀)×A188(♂)的F1杂交体中的稳定转化事件的tDTomato表达小植株。荧光图像示出在顶部图形处，而相应的明场图像示出在底部图形上。

图18(Fig.18)示出了基因组编辑核酸酶Cpf1表达构建体GEMT121的图。tdTomato定义了由双35S启动子和内含子驱动的荧光报告基因tdTomato。LbCpf1定义了毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium)CRISPR/Cpf1(LbCpf1)基因的玉米密码子优化CDS。BdUBI10定义了短柄草属泛素(Brachypodium Ubiquitin)10启动子。Tnos定义了nos终止子。

图19(Fig.19)示出了基因组编辑crRNA表达构建体GEMT099的图。crGEP289定义了靶向小麦CPL3(C末端结构域磷酸酶样3)基因的crRNA。ZmUbi1定义了来自玉米泛素1基因的启动子和内含子。Tnos定义了nos终止子。

图20(Fig.20)示出了用质粒GEMT121(图18)和GEMT099(图19)共同轰击后，小麦(Triticum aestivum L.)栽培品种(Taifun)未成熟花序的tDTomato荧光图像。轰击后16小时小麦未成熟花序的明场图像(A)或tDTomato荧光图像(B)；(C)：在胚性愈伤组织诱导培养基中培养3天的小麦未成熟花序的tDTomato荧光图像；(D)：最初使用的每未成熟花序的tDTomato阳性结构的数量。

图21(Fig.21)示出了34日龄向日葵(Helianthus annuus)栽培品种velvet Queen植物的未成熟花序的图像。(A)：处于R1发育阶段的具有多角星样外观的未成熟花序头；(B)已准备好进行轰击的新鲜分离的未成熟花序分生组织头；(C)：用质粒GEMT121(图18)轰击后14小时未成熟花序头的tDTomato荧光图像。

图22(Fig.22)示出了KWS_RBP2表达构建体pABM-BdEF1_RBP2的图。KWS_RBP2由来自短柄草属的强组成型EF1启动子(pBdEF1)驱动。

图23(Fig.23)示出了玉米A188未成熟中心穗状花序横切面盘(cross-sectiondisc)的基因枪转化和植物再生。轰击后16小时，受轰击盘的明场图像(A)和tDTomato荧光图像(B)。(C)从在愈伤组织诱导培养基中9天的受轰击盘诱导出胚性愈伤组织。(D)在玉米萌发植物托盘(phytotray)中7天的T0植物。

图24(Fig.24)示出了基因组编辑crRNA构建体TGCD087的图。靶标1_1a定义了靶向靶标1处注释为UV-B非敏感性4样基因的玉米基因的crRNA。ZmUbi1定义了来自玉米泛素1基因的启动子和内含子。Tnos定义了nos终止子。

图25(Fig.25)示出了基因组编辑crRNA构建体TGCD088的图。靶标2_2a定义了靶向靶标2处注释为UV-B非敏感性4样基因的玉米基因的crRNA。ZmUbi1定义了来自玉米泛素1基因的启动子和内含子。Tnos定义了nos终止子。

图26(Fig.26)示出了基因组编辑crRNA构建体TGCD089的图。靶标5_2b定义了靶向靶标5处注释为UV-B非敏感性4样基因的玉米基因的crRNA。ZmUbi1定义了来自玉米泛素1基因的启动子和内含子。Tnos定义了nos终止子。

图27(Fig.27)示出了基因组编辑crRNA构建体TGCD090的图。靶标4_2c定义了靶向靶标4处注释为UV-B非敏感性4样基因的玉米基因的crRNA。ZmUbi1定义了来自玉米泛素1基因的启动子和内含子。Tnos定义了nos终止子。

图28(Fig.28)示出了基因组编辑crRNA构建体TGCD091的图。靶标3_2d定义了靶向靶标3处注释为UV-B非敏感性4样基因的玉米基因的crRNA。ZmUbi1定义了来自玉米泛素1基因的启动子和内含子。Tnos定义了nos终止子。

图29(Fig.29)示出了A188中注释为UV-B非敏感性4样基因的玉米靶基因的5个靶位置处的多重基因组编辑SDN-1。(A)：玉米基因结构和靶序列位置；(b)以上玉米靶基因中的多基因组编辑SDN-1效率的汇总。

序列描述

在以下中，术语“RBG”意指再生加强剂基因，并且“RBP”意指再生加强剂蛋白。如本文所用，术语“RBP”可用于互换地指再生加强剂蛋白，而且指编码该再生加强剂蛋白的同源基因。或反过来，“RBG”可指基因和相应地由该基因编码的蛋白质。

定义

除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。

如本申请的上下文中所用，术语“约”意指所叙述值的+/-10％，优选所叙述值的+/-5％。例如，约100个核苷酸(nt)应理解为90至110nt，优选95至105nt的值。

如本文所用，“碱基编辑器”是指具有与其所源自的蛋白质相同的催化活性的蛋白质或其片段，该蛋白质或其片段单独地或当作为分子复合物(在本文中被称为碱基编辑复合物)提供时，具有介导靶向碱基修饰的能力，即感兴趣的碱基的转换导致感兴趣的点突变，如果该碱基转换不导致沉默突变，而是由包含要用碱基编辑器转换的位置的密码子编码的氨基酸的转换，则该点突变转而会导致靶向突变。通常，碱基编辑器因此用作分子复合物。包括例如CBE(介导C向T转换的碱基编辑器)和ABE(介导A向G转换的腺嘌呤碱基编辑器)在内的碱基编辑器是引入直接和可编程突变而无需双链切割的强有力工具(Komor等，Nature,2016,533(7603),420-424；Gaudelli等，Nature,2017,551,464-471)。一般而言，碱基编辑器由至少一种DNA靶向模块以及使胞苷或腺嘌呤脱氨基的催化结构域构成。DNA的所有四种转变(A→T向G→C以及C→G向T→A)都是可能的，只要碱基编辑器可以被引导到靶位点即可。BE和ABE两者最初被开发用于在哺乳动物细胞系统中工作，它们均已被最优化并应用于植物细胞系统。多种植物物种中均示出了有效的碱基编辑(Zong等，NatureBiotechnology,25卷,5期,2017,438-440；Yan等，Molecular Plant,11卷,4,2018,631-634；Hua等，Molecular Plant,11卷,4,2018,627-630)。碱基编辑器已被用于在植物和动物的具有已知或预测表型效应的基因组序列中引入特定的定向替换。但它们尚未用于靶向一个遗传基因座或若干基因座内的多个位点的定向诱变，以识别新型或优化性状。

如本文所用，“CRISPR核酸酶”是位点定向的核酸酶的特殊形式，并且是指已经在天然存在的CRISPR系统中鉴定的任何核酸引导的核酸酶，其随后已经从其天然背景中分离，并且其优选已被修饰或组合成感兴趣的的重组构建体以适合作为靶向基因组工程的工具。任何CRISPR核酸酶均可被使用，并可选地被重编程或另外突变以适于根据本发明的各种实施方案，只要原始野生型CRISPR核酸酶提供DNA识别(即结合特性)即可。CRISPR核酸酶还包含天然存在的CRISPR效应子序列的突变体或催化活性片段或融合体，或编码其的相应序列。CRISPR核酸酶还可以特别地是指在其自然环境中具有内切核苷酸功能的CRISRP切口酶或甚至是CRISRP多肽的核酸酶失效变体。同时，多种不同的CRISPR核酸酶/系统及其变体对于熟练技术人员是已知的，并且尤其包括CRISPR/Cas系统，包括CRISSPR/Cas9系统(EP2771468)、CRISPR/Cpf1系统(EP3009511B1)、CRIPRP/C2C2系统、CRISRP/CasX系统、CRIPPR/CasY系统、CRISOPR/Cmr系统、CRISPR/MAD系统，包括例如CRIPSPR/MAD7系统(WO2018236548A1)和CRISPR/MAD2系统、CRSPSR/CasZ系统和/或其任何组合、变体或催化活性片段。核酸酶可以是DNAse和/或RNAse，特别地考虑到某些CRISPR效应子核酸酶只具有RNA切割活性，或除DNA切割活性之外还具有RNA切割活性。

因此，“CRISPR系统”应被理解为CRISPR核酸酶或CRISPR效应子、或所述核酸酶的切口酶或核酸酶失效变体、或其功能活性片段或变体和引导相关CRISPR核酸酶的同源引导RNA(或pegRNA或crRNA)的组合。

如本文所用，术语“(再生)加强剂”、“加强剂基因”、“加强剂多肽”、“加强多肽”、“加强基因”和“加强因子”是指蛋白质/肽或编码蛋白质/多肽的(多)核酸片段，导致经转化或基因编辑的植物细胞的改进的植物再生，这可能特别适合于改进基因组工程，即基因组工程后经修饰的植物细胞的再生。此种蛋白质/多肽可以增加优选衍生自体细胞组织、胚组织、愈伤组织或原生质体的植物细胞在整个植物(优选可育植物)中再生的能力。由此，它们可以调控体细胞胚形成(体细胞胚发生)和/或它们可以提高植物细胞的增殖率。转化的或经基因编辑的植物细胞的再生可能包括体细胞胚发生的过程，其是一种人工过程，其中植物或胚衍生自单个体细胞或体细胞组。体细胞胚是由通常不参与胚发育的植物细胞形成的，即植物组织，如幼芽、叶、芽等。这一过程的应用可能包括：遗传均匀植物材料的克隆繁殖；病毒的消除；为遗传转化提供源组织；从单个细胞(如原生质体)生成全植物；合成种子技术的发展。可以培养衍生自活性源组织的细胞以形成愈伤组织。此外，术语“再生加强剂”可以是指与未经处理的对照相比，在应用于植物细胞、组织、器官或全植物时具有增殖和/或再生效应的任何种类的化学物质。根据本发明的特定人工创建的再生加强剂多肽可以具有增加植物再生以及增加期望的基因组修饰和基因编辑结果的双重功能。

如本文所用，“侧翼区”是具有与预选位点侧翼(即上游或下游)的DNA区的核苷酸序列同源的核苷酸序列的修复核酸分子的区域。

本文所用，“基因组”应被广泛理解，并且包含活细胞任何区室内的任何种类的遗传信息(RNA/DNA)。在“基因组修饰”的背景下，该术语因此还包括可以在活细胞内被转录和/或翻译的人工引入的遗传材料，例如，游离型质粒或载体，或被整合到天然存在的基因组中的人工DNA。

如本文所用，术语“基因组工程”是指用于对植物细胞的遗传信息(DNA和RNA)或基因组进行遗传修饰的所有策略和技术，包含基因组转化、基因组编辑，但也包括较少的位点特异性技术，包括TILLING等。因此，“基因组编辑”(GE)更具体地是指一种特殊的基因组工程技术，其中对植物细胞的任何遗传信息或基因组进行靶向特异性修饰。因此，这些术语包含对编码基因或蛋白质的区域进行基因编辑，但还包括对除编码基因组区域的基因以外的区域进行编辑。其进一步包含对植物细胞的核(如果存在)以及其他遗传信息进行编辑或工程化改造，即对内含子序列、非编码RNA、miRNA、调控元件(如启动子、终止子)序列、转录激活因子结合位点、顺式或反式作用元件进行编辑或工程化改造。此外，“基因组工程”还包含表观遗传编辑或工程，即对例如可能导致基因表达中的遗传性变化的DNA甲基化或组蛋白修饰(如组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化、组蛋白泛素化、组蛋白磷酸化、组蛋白苏素化(sumoylation)、组蛋白核糖基化或组蛋白瓜氨酸化)进行靶向修饰。

如本文所用，“基因组修饰系统”是指引入到细胞中、合适载体上和/或涂覆在粒子上和/或直接引入的任何DNA、RNA和/或氨基酸序列，其中“基因组修饰系统”引起已引入它的细胞的基因组的修饰。“基因组编辑系统”更具体地是指引入到细胞中、合适载体上和/或涂覆在粒子上和/或直接引入的任何DNA、RNA和/或氨基酸序列，其中“基因组编辑系统”包含至少一种组件，其在修饰和/或修复基因组靶位点中作为、编码或辅助位点定向的核酸酶、切口酶或其灭活变体。

如本文所用，“基因组靶序列”是指植物细胞的核和/或细胞器基因组的任何部分，无论其是否编码基因/蛋白质，该任何部分是位点定向的基因组编辑或基因编辑实验的靶标。

如本文所用，“植物材料”是指在任何发育阶段期间可以从植物中获得的任何材料。植物材料可以从植物体内获得，也可以从植物或其植物组织或器官的体外培养中获得。因此，该术语包含植物细胞、组织和器官以及已发育的植物结构以及亚细胞组件，如核酸、多肽和所有的化学植物物质或代谢物，其可以存在于植物细胞或区室内和/或由植物产生，或可以从处于任何发育阶段的任何植物细胞、组织或植物的提取物中获得。该术语还包含植物材料的衍生物，例如原生质体，其衍生自该植物材料所包含的至少一个植物细胞。因此，该术语还包含植物的分生组织细胞或分生组织。

在分子构建体(例如质粒或表达载体)的上下文中，术语“可操作性地连接”、“可操作地连接”或“功能性地连接”意指一个元件(例如调控元件)或第一蛋白质编码序列以这种方式与另一部分连接，使得蛋白质编码核苷酸序列，即以这种方式相对于例如核酸分子上的蛋白质编码核苷酸序列定位，使得在调控元件控制下的蛋白质编码核苷酸序列的表达可以在活细胞中发生。

如本文所用，“预选位点”、“预定位点”或“预定义位点”指示基因组(例如核基因组或细胞器基因组，包括线粒体或叶绿体基因组)中的特定核苷酸序列，在该位置处，期望插入、替换和/或缺失一个或多个核苷酸。因此，预定位点位于感兴趣的“基因组靶序列/位点”中，并且可以使用位点或序列特异性基因组编辑系统以位点定向的方式来进行修饰。

如本文所用，术语“植物”、“植物器官”、“植物细胞”是指植物生物体、植物器官、分化和未分化的植物组织、植物细胞、种子及其衍生物和后代。植物细胞包括但不限于例如来自种子、来自成熟和未成熟胚、分生组织、幼苗、处于不同分化状态的愈伤组织、叶、花、根、茎芽、雄性或雌性配子体、孢子体、花粉、花粉管和小孢子、原生质体、巨藻和微藻的细胞。不同的真核细胞，例如动物细胞、真菌细胞或植物细胞，可以具有任何程度的倍性，即它们可以是单倍体、二倍体、四倍体、六倍体或多倍体。

如本文所用，术语“植物部分”包括但不限于分离和/或预处理的植物部分，包括器官和细胞，包括原生质体、愈伤组织、叶、茎、根、根尖、花药、雌蕊、种子、谷物、果皮、胚、花粉、孢子母细胞、胚珠、雄性或雌性配子或配子体、子叶、下胚轴、穗、小花、芒、外稃、芽、组织、叶柄、细胞和分生组织细胞。

如本文所用，“Prime Editing系统”是指一种如Anzalone等人,(2019).Search-and-replace genome editing without double-strand breaks(DSBs)or donorDNA.Nature,1-1)中所公开的系统。如上文中所详述的碱基编辑并不会切割双链DNA，而是使用CRISPR靶向机制将额外的酶穿梭到期望的序列中，在此将一个单核苷酸转换为另一个。植物的许多遗传性状以及对植物病原体所引起的疾病的某些易感性都是由单核苷酸变化引起的，因此碱基编辑为GE提供了一种强有力的替代方案。但是该方法具有固有的局限性，并且据说会引入脱靶突变，而这通常不是高精度GE所期望的。相比之下，Prime Editing(PE)系统通过对Cas9蛋白和引导RNA进行重度修饰，克服了早期基于CRISPR的GE技术的缺点。已改变的Cas9只“刻痕”双螺旋的一条单链，而不是切割两条。新的引导RNA被称为pegRNA(prime编辑扩展的引导RNA)，包含一种用于要被添加到靶位置处的基因组中的新DNA序列的RNA模板。这需要第二种蛋白质，其附着于Cas9或一种不同的CRISPR效应子核酸酶：一种逆转录酶，该酶可以从RNA模板生成新的DNA链并将其插入已刻痕的位点。为此，鉴于需要靶标特异性核酸::核酸杂交的进一步步骤这一事实，因此将额外的特异性水平引入到GE系统中。这可以显著降低脱靶效应。进一步地，鉴于以下事实：由于相应系统的本质而导致BE不能覆盖所有预期的核苷酸转变/突变(C→A、C→G、G→C、G→T、A→C、A→T、T→A和T→G)，并且如BE所支持的转变可能需要许多细胞类型和生物体中的DSB，因此PE系统可以显著增加相应GE系统的靶向范围。

如本文所用，“调控序列”或“调控元件”是指不属于蛋白质编码核苷酸序列的一部分，但介导蛋白质编码核苷酸序列的表达的核苷酸序列。调控元件包括例如启动子、顺式调控元件、增强子、内含子或终止子。取决于调控元件的类型，其位于蛋白质编码核苷酸序列之前(即5')或之后(即3')的核酸分子上。调控元件在活的植物细胞中具有功能性。

“RNA引导的核酸酶”是一种位点特异性核酸酶，其需要RNA分子，即引导RNA，来例如在基因组DNA中或在作为靶标的RNA中识别和切割特异性靶位点。RNA引导的核酸酶与引导RNA一起形成核酸酶复合物，然后识别并切割序列依赖性物质中的靶位点。因此，通过设计引导RNA序列，RNA引导核酸酶可以经编程以靶向特异性位点。RNA引导的核酸酶可以选自CRISPR/Cas系统核酸酶，包括CRISPR/Cpf1系统、CRISPR/C2C2系统、CRISPR/CasX系统、CRISPR/CasY系统、CRISPR/Cmr系统、CRISPR/Cms系统、CRISPR/MAD7系统、CRISPR/MAD2系统和/或其任何组合、变体或催化活性片段。此类核酸酶可能会留下钝的或交错的末端。进一步包括RNA引导的核酸酶的切口酶或核酸酶失效变体，其可与融合蛋白或蛋白质复合物组合使用，以例如在碱基编辑器或Prime Editor中改变和修饰此种融合蛋白的功能性。

如本文所用，术语“SDN-1”、“SDN-2”和“SDN-3”分别是平台技术“位点定向的核酸酶”1、2或3的缩写，该核酸酶如由任何感兴趣的位点定向的核酸酶引起，包括例如大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)和CRISPR核酸酶。在不添加外源DNA的情况下，SDN-1在植物基因组中造成双链或单链断裂。因此，“位点定向的核酸酶”能够可选地借助于进一步分子来识别和切割基因组中的特异性序列或感兴趣的分离基因组序列。对于SDN-2和SDN-3，在基因编辑期间将外源性核苷酸模板提供给细胞。然而，对于SDN-2，未将重组外源DNA插入到靶细胞的基因组中，但内源性修复过程复制，例如，如模板中所存在的突变，以诱导(点)突变。相比之下，SDN-3机制在修复DNA断裂期间使用引入的模板，以便将遗传材料引入到基因组材料中。

“位点特异性核酸酶”在本文中是指核酸酶或其活性片段，该核酸酶或其活性片段能够在特定位置处特异性识别并切割DNA。该位置在本文中也被称为“靶序列”。此类核酸酶通常产生双-链断裂(DSB)，然后通过非同源末端连接非同源末端连接(NHEJ)或同源重组同源重组(HR)修复。位点特异性核酸酶包括大范围核酸酶、归巢核酸内切酶、锌指核酸酶、转录激活因子样核酸酶和CRISPR核酸酶、或包括切口酶或其核酸酶失效变体的变体。

术语“转化”、“转染”、“转化的”和“转染的”在本文中可互换地用于通过任何种类的引入相关至少一种材料的物理(例如，轰击)、化学或生物(例如，农杆菌)方式，将包括核酸(DNA/RNA)、氨基酸、化学物质、代谢物、纳米粒子、微粒子等在内的材料以任意方式引入到至少一个感兴趣的细胞中。

如根据本公开所使用的术语“转基因的”是指包含基因或遗传构建体的植物、植物细胞、组织、器官或材料，其包含通过自然手段或借助于来自另一生物体的转化技术转移到植物、植物细胞、组织器官或材料中的“转基因”。术语“转基因”包含核酸序列(包括DNA或RNA)或氨基酸序列或它们的组合或混合物。因此，术语“转基因”并不局限于通常被鉴定为“基因”的序列，即编码蛋白质的序列。例如，其也可以是指非蛋白质编码DNA或RNA序列，或序列的一部分。因此，术语“转基因的”通常意味着各自的核酸或氨基酸序列不是自然地存在于各自的靶细胞中，包括植物、植物细胞、组织、器官或材料。因此，如本文所用，术语“转基因”或“转基因的”是指取自一种生物体的基因组的或合成产生的核酸序列或氨基酸序列，并且然后通过分子生物学、遗传学等人工技术以瞬时或稳定的方式将该核酸序列或氨基酸序列引入到另一生物体中。

如本文所用，术语“瞬时”意味着仅暂时引入和/或表达包括所有种类的基于核酸(RNA和/或DNA)和多肽的分子(可选地包括化学载体分子)在内的工具，并且该工具随后被细胞降解，而“稳定”意味着该工具中的至少一者被整合到待修饰的细胞的核和/或细胞器基因组中。“瞬时表达”是指以下现象：转移的蛋白质/多肽和/或编码蛋白质/多肽的核酸片段在细胞中瞬时表达和/或活化，并且随着细胞生长而不久会关闭和/或降解。因此，瞬时表达也意味着例如在作为调控元件的诱导型启动子的控制下，稳定整合的构建体通过打开或关闭表达以微调的方式调节表达。

如本文所用，“上游”指示核酸分子上更靠近所述核酸分子的5'端的位置。同样，术语“下游”是指核酸分子上更靠近所述核酸分子的3'端的位置。为了避免疑问，核酸分子及其序列通常以其5'至3'方向(从左到右)表示。

术语“载体”或“质粒(载体)”是指尤其包含质粒或(质粒)载体、粘粒、人工酵母或细菌人工染色体(YAC和BAC)、噬菌体、基于细菌噬菌体的载体、农杆菌相容载体、表达盒、分离的单链或双链核酸序列(包含线性或循环型序列)或氨基酸序列、病毒载体、病毒复制子(包括经修饰的病毒)及它们的组合或混合物的构建体，其用于引入或转化、转染或转导到任何真核细胞，包括根据本发明的植物、植物细胞、组织、器官或材料。例如，“核酸载体是一种DNA或RNA分子，其用于将外源遗传材料递送到细胞，在此该外源遗传材料可以被转录并可选地被翻译。优选，该载体是一种包含多个克隆位点的质粒。该载体可以进一步包含“独特的克隆位点”，该克隆位点仅在载体中出现一次，并且允许通过使用特异性限制酶来插入DNA序列，例如核酸盒或其组件。“柔性插入位点”可以是多克隆位点，其允许以一定的布置插入根据本发明的核酸盒的组件，这促进组件的同时转录并允许RNA激活单元的激活。

每当本公开涉及核酸或氨基酸序列彼此相对于彼此要被比较的整个序列长度的同源性或相同性百分比时，其中这些相同性或同源性值定义了如通过使用用于核酸的EMBOSS Water Pairwise Sequence Alignments(核苷酸)程序(www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html)或用于氨基酸序列的EMBOSS Water PairwiseSequence Alignments(蛋白质)程序(www.ebi.ac.uk/Tools/psa/prump_Water/)获得的值。由欧洲分子生物学实验室(European Molecular Biology Laboratory，EMBL)欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute，EBI)提供的用于局部序列比对的那些工具使用改进的Smith-Waterman算法(参见www.ebi.ac.uk/Tools/psa/and Smith,T.F.&Waterman,M.S.“Identification of common molecular subsequences”Journal ofMolecular Biology,1981 147(1):195-197)。当进行比对时，使用由EMBL-EBI定义的默认参数。(i)对于氨基酸序列，这些参数是：矩阵＝BLOSUM62，空位开放罚分＝10，并且空位扩展罚分＝0.5；或(ii)对于核酸序列，这些参数是：矩阵＝DNAfull，空位开放罚分＝10，并且空位扩展罚分＝0.5。

具体实施方式

本发明提供了普遍适用的基因组和基因编辑技术，其依赖于未成熟花序分生组织(IIM)细胞作为待转化/转染的靶材料，从而在多种相关作物植物中提供更好的转化和/或编辑效率。

对于所有种类的有效植物转化或转染，待转化的细胞或材料的恰当年龄和由此的生理状态的确定是至关重要的。另外，对感兴趣的的待转化靶材料的决定不仅影响材料对待插入工具的摄入的易感性，而且还可显著影响转化的结果。转化或转染的效率、转化后的再生能力和引入的分子工具的表达，而且在牵涉到基因编辑时如转化的材料的表观遗传状态的因素可以由于待修饰基因组的可接近性而发挥重要作用。必须避免基因编辑工具的任何脱靶活度。另外，非常重要的因素是，旨在以位点特异性方式(而不一定是瞬时插入的分子工具)在基因编辑期间引入的期望的修饰可以遗传给经修饰细胞的后代。对于植物基因编辑，这额外意味着修饰在相关的生殖细胞中稳定遗传，使得所得的细胞或器官(例如配子、花粉、胚等)可以容易地用于育种新的有价值的植物。鉴于这些特异性特征，在通常相当复杂的植物基因组中的基因编辑仍然经常与严重的问题相关联，并且没有方便且直接的方式将在具有给定基因编辑机制的一个系统中获得的方案转移到另一靶植物和另一待修饰的感兴趣的基因组靶区域。

花序分生组织是含有多能干细胞的经修饰的芽分生组织，并且能够产生花原基，并且最终发育成花序，即排列在主茎上的一簇花。由芽分生组织开始向花序分生组织转变在一些谷类作物中相当早。例如，在玉米中，从播种到IIM收获需要约四周(图2)。玉米种子可以在具有简单光照和温度控制的任何生长区域中的多孔托盘(例如，50孔托盘，图1)中种植和生长。在不需要授粉和受精(即对环境极其敏感且重度依赖于花粉和植物品质的过程)的情况下，IIM制备可以独立于温室和生长季节执行。与使用未成熟合子胚相比，使用IIM作为替代供体外植体进一步消除了花粉污染事件的问题，并且节省了用于供体材料制备的空间、时间、劳动力和其它资源。

在一个方面，提供了一种通过获得至少一个植物未成熟花序分生组织(IIM)细胞的修饰而用于植物基因组修饰，优选用于至少一个基因组靶序列的靶向修饰的方法，其中该方法包括以下步骤：(a)提供至少一个未成熟花序分生组织细胞；(b)将以下各项引入到至少一个未成熟花序分生组织细胞中：(i)至少一种基因组修饰系统，优选基因组编辑系统，该基因组编辑系统包含至少一种位点定向的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶，优选核酸引导的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶、或编码其的序列，以及可选地至少一种引导分子或编码其的序列；(ii)可选地：至少一种再生加强剂或编码其的序列或再生加强剂化学物质，其中步骤(i)和(ii)同时或接连发生，以促进植物细胞增殖和/或协助至少一个基因组靶序列的靶向修饰；(iii)以及可选地至少一种修复模板或编码其的序列；以及(c)在允许表达和/或组装至少一种基因组修饰系统，优选至少一种基因组编辑系统以及可选地至少一种再生加强剂，以及可选地至少一种引导分子和/或可选地至少一种修复模板的条件下，培养至少一个未成熟花序分生细胞；以及(d)可选地通过特异性地针对至少经修饰的细胞进行筛选，获得至少一个经修饰的未成熟花序分生组织细胞；或(e)获得从至少一个经修饰的细胞再生的至少一种植物组织、器官、植物或种子；以及(f)可选地：在携带期望靶向修饰的T0和/或T1代中筛选从至少一个经修饰的细胞再生的至少一种植物组织、器官、植物或种子。

为了提供特别适合且可用于有效粒子轰击并因此允许高效基因组编辑的未成熟花序分生组织细胞，本发明人测试了来自主要作物植物的各种栽培品种的未成熟花序分生组织细胞。发现包含至少一种未成熟花序分生组织细胞的外植体可有利地提供为横切面探针，以更好地充当基因枪转化的外植体并增强后续再生以提高利用效率。该发现对于一些优良品系(包括玉米优良品系)特别重要，其中叶腋分枝的起始和发育明显在中心穗状花序之后，使得因此未成熟雄穗在收获时几乎仅由中心穗状花序组成。因此，使用根据本公开的包含至少一个未成熟花序分生组织细胞的未成熟中心穗状花序的横切面盘通常是这种基因型的有效解决方案，以优化再生和/或同时在多个位置中实现高效基因组编辑。

在某些实施方案中，在以上第一方面的方法中的步骤(a)中所提供的至少一个未成熟花序分生组织细胞因此可以源自穗状花序的横切面、或在发育和总体形态特征方面与穗状花序相当的结构，其中穗状花序包含至少一个未成熟花序分生组织细胞，特别地其中至少一个未成熟花序分生组织细胞源自感兴趣的的作物植物(例如玉米、小麦或大麦植物)的中心穗状花序的横切面。如在植物育种和发育领域中所知，穗状花序是通常由花序分生组织通过细胞分裂以在每个穗轴节产生主茎(穗轴)和小穗分生组织而形成的结构。即使在不同作物植物中的穗状花序和小穗结构以及发育之间存在一些形态学差异，技术人员可以确定感兴趣的的给定作物植物的相关发育阶段以获得如下文所定义的穗状花序(特别是中心穗状花序)的横切面。

在一个实施方案中，引入可以优选是可通过基因枪轰击介导的至少一个植物未成熟花序分生组织(IIM)细胞。

在一个方面，提供了在多种作物植物中对植物和发育的植物细胞(包括IIM细胞)分阶段(即限定)给定发育阶段的方法。

优选，同时或随后提供基因组或基因编辑系统的所有外源性地提供的元件或工具，以及可选地提供的再生加强剂或编码其的序列，以及可选地提供的修复模板序列，其中术语同时和随后是指引入相关的至少一个工具的时间顺序，其可被引入以瞬时地或以稳定方式表达，条件是同时和随后引入都保证同一IIM细胞将以有活性和/或可表达的方式包含相关工具。最终，所有基因组修饰或基因编辑系统元件实际上都因此存在于一个IIM细胞中。

来自禾本科(Poaceae)植物(包括相关作物植物，例如玉米、小麦、黑麦、燕麦、大麦、高粱、稻等)的未成熟花序分生组织(IIM)在花苞原基发育不全的阶段是开放的(参见图3)。因此，IIM细胞适于遗传修饰。IIM细胞呈有丝分裂活性并且准备好进行再生而无需细胞相同性重编程，并因此IIM细胞是高度再生性的并且其再生可能是基因型非依赖性的。IIM细胞是转化和再生的理想受体。此外，IIM细胞处于繁殖期，并在发育上接近减数分裂，并因此IIM细胞可处于HDR(同源定向修复)友好的细胞环境中，并适于基于HDR的基因组编辑。鉴于与易错细胞修复过程相比之下能够实现期望方式的靶向修复的事实，HDR对于不同的GE情形可能是优选的。

同样对于双子叶植物，可以展示根据本文所公开的方法，IIM细胞的分阶段和该特异性细胞类型的有效转化是可能的，例如，如图21所示。

基于特别选择用于转化的IIM细胞的主要发现，以及下文所提供的实施例给出了正确的发育分阶段以鉴定发育的花序中的IIM组织和细胞的指导，本发明的方法可适用于感兴趣的的任何植物物种(包括单子叶植物或双子叶植物)，优选，该方法可以在能够产生具有无梗花的复杂花序(例如，穗状花序、肉穗花序、头状花序(capitulum)或头状花序(head))的植物(例如，玉米、稻、小麦、大麦、高粱、黑麦、向日葵、各种浆果类)中执行。

在根据本发明各种方面的进一步实施方案中，在基因组或基因编辑期间提供至少一种再生加强剂、或编码其的序列、或再生加强剂化学物质，以促进植物细胞增殖和/或协助至少一个基因组靶序列的靶向修饰。

通常代表在植物发育的不同阶段期间活化的转录因子并还被称为植物中的形态发生调控子的某些再生加强剂序列包括Wuschel(WUS)和babyboom(BBM)类加强剂(Mayer,K.F.等人,Role of WUSCHELin regulating stem cell fate in the Arabidopsis shootmeristem.Cell95,805–815(1998)；Yadav,R.K.等人,WUSCHEL protein movementmediates stem cell homeostasis in the Arabidopsis shoot apex.Genes Dev 25,2025–2030(2011)；Laux,T.,Mayer,K.F.,Berger,J.&Jürgens,G.The WUSCHEL gene isrequired for shoot and floral meristem integrity in Arabidopsis.Development122,87–96(1996)；Leibfried,A.等人,WUSCHEL controls meristem function by directregulation of cytokinin-inducible response regulators.Nature 438,1172–1175(2005)；对于BBM：Hofmann,A Breakthrough in Monocot Transformation Methods,ThePlant Cell,28卷:1989,2016年9月)。包括RKD(包括本文中公开为SEQ ID NO:52和53的TaRKD4、或其变体、或密码子优化的形式)和LEC转录因子家族在内的其他再生加强剂序列一直在稳步出现，并且同时也为熟练人员所知(Hofmann,A Breakthrough in MonocotTransformation Methods The Plant Cell,28卷:1989,2016年9月；New Insights intoSomatic Embryogenesis:LEAFY COTYLEDON1,BABY BOOM1 and WUSCHEL-RELATEDHOMEOBOX4 Are Epigenetically Regulated in Coffea canephora,PLos one,2013年8月,8卷(8),e72160；LEAFY COTYLEDON1-CASEIN KINASE I-TCP15-PHYTOCHROMEINTERACTING FACTOR4Network Regulates Somatic Embryogenesis by RegulatingAuxin Homeostasis Plant Physiology_,2015年12月,169卷,2805–2821页；A.Cagliari等人,New insights on the evolution of Leafy cotyledon1(LEC1)type genes invascular plants Genomics 103(2014)380–387，US6825397B1；US7960612B2、WO2016146552A1)。

转录因子的生长调控因子(GRF)家族对植物具有特异性，也是熟练技术人员所知的。已经在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中鉴定出至少九种GRF多肽(Kim等人,(2003)Plant J 36:94-104)，并且在水稻(Oryza sativa)中鉴定出至少十二种(Choi等人,(2004)Plant Cell Physiol 45(7):897-904)。GRF多肽的特征是在其N端半存在至少两个高度保守的结构域，它们以各自结构域内最保守的氨基酸命名：(i)QLQ结构域(InterPro登录号IPR014978，PFAM登录号PF08880)，其中该结构域中最保守的氨基酸是Gln-Leu-Gln；以及(ii)WRC结构域(InterPro登录号IPR014977，PFAM登录号PF08879)，其中该结构域中最保守的氨基酸是Trp-Arg-Cys。WRC结构域进一步含有两个独特的结构特征，即WRC结构域富含碱性氨基酸Lys和Arg，并且在保守间隔(CX9CX10CX2H)中进一步包含三个Cys和一个His残基，其被指定为转录效应子(ET)结构域(Ellerstrom等人,(2005)Plant Molec Biol 59:663-681)。ET结构域中半胱氨酸和组氨酸残基的保守间隔形似锌指(锌结合)蛋白。另外，GRF多肽序列中通常包含核定位信号(NLS)。

另一类潜在的再生加强剂是PLETHORS(PLT)转录因子类别，但尚未对这类再生加强剂在人工基因组/基因编辑中的功能进行详细研究(Aida,M.,等人,(2004).ThePLETHORA genes mediate patterning of the Arabidopsis root stem cellniche.Cell 119:109–120；

A.P.等人,(2014).PLETHORA gradient formationmechanism separates auxin responses.Nature 515:125-129)。动物和植物中的器官形成依赖于对细胞状态转变的精确控制，以将干细胞子代变成完全分化的细胞。在植物中，细胞由于共享细胞壁而无法重新布置。因此，分化进展和伴随的细胞扩增必须在组织间紧密协调。PLETHORA(PLT)转录因子梯度在引导正在生长的拟南芥根的不同位置处的细胞分化进展方面具有独特的能力，这与动物中很好描述的转录因子梯度形成对比，从而在基本静态的背景下指定不同的细胞命运。为了理解PLT梯度的输出，我们研究了由PLT转录地控制的基因集。我们的工作揭示了PLT梯度如何可以通过细胞增殖基因的区域特异性诱导以及分化的抑制来调控细胞状态。此外，PLT靶标包括主要模式化基因和自动调控反馈组件，从而加强了它们作为器官发育主调控子的作用(Santuari等，2016,DOI:https://doi.org/10.1105/tpc.16.00656)。PLT也被称为AIL(AINTEGUMENT-LIKE)基因，是转录调控子AP2家族的成员。转录因子AP2家族的成员在植物的细胞增殖和胚发生方面发挥重要作用(ElOuakfaoui,S.等，(2010)Control of somatic embryogenesis and embryo developmentby AP2 transcription factors.PLANT MOLECULAR BIOLOGY74(4-5):313-326.)。PLT基因主要在芽和根的发育组织中表达，并且是干细胞稳态、细胞分裂和再生以及器官原基模式化所需的。PLT家族包含六个成员的AP2亚分枝(subclade)。四个PLT成员PLT1/AIL3 PLT2/、AIL4、PLT3/A/L6和BBM/PLT4/AIL2在根尖分生组织(RAM)中部分重叠表达，并且是QC(静止中心)标记在干细胞龛内的正确位置处的表达所需的。这些基因在维持细胞分裂和防止根尖分生组织的细胞分化方面发挥冗余功能。三个PLT基因PLT3/AIL6、PLT5/AIL5和PLT7/AIL7在芽顶端分生组织(SAM)中表达，其中它们在侧生器官的定位和外生长方面发挥冗余功能。PLT3、PLT5和PLT7通过控制两个不同的发育事件来调控拟南芥的新芽再生。PLT3、PLT5和PLT7需要在分生组织的外围维持高水平的PIN1表达，并且调控SAM中心区域的局部生长素产生，其是叶序转变的基础。这三个基因功能的累积丧失导致中间细胞团、愈伤组织不能形成芽祖细胞，而PLT5或PLT7的诱导可以以激素非依赖性方式实现芽再生。PLT3、PLT5、PLT7调控并需要芽促进因子CUP-SHAPED COTYLEDON2(CUC2)来完成芽形成程序。PLT3、PLT5和PLT7也在侧根生成细胞中表达，在此它们冗余地激活PLT1和PLT2的表达，并且因此调控侧根的形成。

衍生自天然存在的转录因子(如例如，BBM或WUS)及其变体的再生加强剂可能具有显著的缺点，即植物细胞在特定的时段内不受控制的活性会对植物细胞产生有害影响。因此，本发明人在对各种靶标植物进行一系列多序列比对、结构域混编、截短和密码子优化之后，进行了一系列通过电脑模拟的工作，以创建完全人工再生加强剂蛋白。通过专注于核心共有基序，鉴定自然界中不存在的再生加强剂的新变体成为目的，这些变体特别适用于基因组修饰和基因编辑的方法中。在新的加强剂序列的设计过程中，特别考虑了目前不被认为具有所描述加强剂基因和蛋白质的再生加强剂活性的不同物种中的各种裸子植物序列。

基于这项工作，现已发现，人工创建的特异性再生加强剂(参见SEQ ID NO:1至8、12至19)，以及某些经修饰的天然充当转录因子的再生加强剂(例如，SEQ ID NO:9至11、20至22)与本文公开的方法组合时表现得特别好，因为它们促进再生并且额外具有提高基因组修饰或基因编辑效率的能力。进一步地，人工创建、然后逐步选择和测试的再生加强剂未示出多效性效应，并且特别适合于在任何种类的基因组修饰如基因编辑期间使用。

在一个方面，提供了一种编码再生加强剂多肽的分离的核酸序列，其中该核酸序列包含选自SEQ ID NO:1至8中任一项的序列、或与SEQ ID NO:1至8的相应序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的核酸序列，条件是该序列编码与相应的参比序列具有相同功能的再生加强剂，或编码多肽的核酸序列包含选自EQ ID NO:12至19中任一项的序列、或与SEQ ID NO:12至19的相应序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的序列，条件是该序列具有如相应的参比序列的再生加强剂功能。

在进一步的方面，提供了一种包含编码再生加强剂多肽的分离的核酸序列的重组基因，其中该核酸序列包含选自SEQ ID NO:1至8中任一项的序列、或与SEQ ID NO:1至8的相应序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的核酸序列，条件是该序列编码与相应的参比序列具有相同功能的再生加强剂，或编码多肽的核酸序列包含选自EQ ID NO:12至19中任一项的序列、或与SEQID NO:12至19的相应序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的序列，条件是该序列具有如相应的参比序列的再生加强剂功能。

在一个实施方案中，重组基因可以包含至少一个如下所详述的调控元件。鉴于本文所公开的再生加强剂基因是完全人工的事实，没有经典的“天然”调控元件(例如启动子)被使用。因此，至少一种合适的调控元件的选择将由感兴趣的的宿主细胞和/或感兴趣的的时空表达模式的问题指导，使得可以选择最佳的调控元件以实现至少一种感兴趣的再生加强剂基因的特异性表达。

在使用多于一个再生加强剂基因的一个实施方案中，可以选择不同的启动子，例如，具有不同活性的启动子，使得至少两个基因能够以限定和可控的方式表达，以具有第一再生加强剂蛋白/多肽(RBP)的较强表达和第二RBP的较弱表达，其中差异表达模式可能是期望的。

在一个方面，提供了分离的再生加强剂多肽，其中该多肽包含选自SEQ ID NO:12至19中任一项的序列、或与SEQ ID NO:12至19的相应序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的序列，条件是该序列具有如相应的参比序列的再生加强剂功能。

在又另一方面，提供了一种包含编码再生加强剂多肽的序列的表达盒或表达构建体，该序列包含选自SEQ ID NO:12至19中任一项的核酸序列、或与SEQ ID NO:12至19的相应序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的核酸序列，条件是该序列具有如相应的参比序列的再生加强剂功能，或编码多肽的核酸序列，所述多肽包含选自SEQ ID NO:12至19中任一项的序列、或与SEQ ID NO:12至19的相应序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的序列，条件是该序列具有如相应的参比序列的再生加强剂功能。在某些实施方案中，表达盒或表达构建体可选自SEQ ID NO:23至30、或35至42中任一项，或与相应的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的序列。

在又一方面，提供了一种植物细胞，该植物细胞包含含有编码再生加强剂多肽的核酸序列的重组基因，其中该核酸序列包含选自SEQ ID NO:1至8中任一项的序列、或与SEQID NO:1至8的相应序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的序列，条件是该序列编码与相应的参比序列具有相同功能的再生加强剂，或包含含有编码再生加强剂多肽的序列的表达盒或表达构建体，该再生加强剂多肽包含选自SEQ ID NO:12至19中任一项的序列、或与SEQ ID NO:12至19的相应序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的序列，条件是该序列具有如相应的参比序列的再生加强剂功能。

在一个方面，提供了感兴趣的的单子叶或双子叶植物的植物组织、器官、全植物、或其部分或种子，其包含含有如上定义的重组基因或含有表达盒或表达构建体的植物细胞。

基于如本文所公开的新的再生加强剂或再生加强剂的新组合的效应，可以转化或转染甚至顽拗型植物/植物基因型、或由顽拗型植物/植物基因型(即，通常已知极难以用外源性材料转化或转染和/或已知具有弱再生和/或发育活性的那些植物/植物基因型)所含或获得的细胞、组织或器官。如以下实施例8中所详述，如本文所公开的各种方法特别适用于修饰，即，转化或转染顽拗型植物/植物基因型或植物细胞。

在一个实施方案中，再生加强剂包含至少一种RBP、或编码RBP的再生加强剂基因(RBG)序列或其催化活性片段，其中RBP序列中的至少一种单独地选自SEQ ID NO:13或15至19中的任一项、或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或其中RBP由至少一种RBG序列编码，其中RBP序列中的至少一种单独地选自SEQ ID NO:2或4至8中的任一项、或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列、或同源密码子优化序列。

另外，对根据SEQ ID NO:1至8和12至19的再生加强剂序列或编码其的序列进行详细研究，以鉴定在基因组或基因编辑期间提供的再生加强剂的合适组合，从而在例如任何种类的植物转化期间的促进再生中实现甚至协同活性，和/或优化基因编辑频率。

在一个实施方案中，再生加强剂包含至少一种RBP和至少一种PLT编码序列或其催化活性片段，其中RBP和PLT再生加强剂序列单独地选自SEQ ID NO:12至22中的任一项、或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或其中至少一种再生加强剂序列由以下各项编码：单独地选自SEQ ID NO:1至11中任一项的序列、或与其具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，条件是序列根据SEQ ID NO:12至22编码相应的再生加强剂或其催化活性片段。

在本文所公开的各种方法的另一个实施方案中，引入至少一种进一步的再生加强剂，其中进一步的再生加强剂、或编码其的序列选自BBM、WUS、WOX、(Ta)RKD4、生长调控因子(GRF)、LEC、或其变体。

在本文所公开的各种方法的又一个实施方案中，再生加强剂包含至少一种第一RBG或PLT序列或编码其的序列，优选至少一种RBG序列或编码其的序列，并且其中再生加强剂进一步包含：(i)至少一种进一步的RBG和/或PLT序列、或编码其的序列、或其变体，和/或(ii)至少一种BBM序列、或编码其的序列、或其变体，和/或(iii)至少一种WOX序列(包括WUS1、WUS2、或WOX5)、或编码其的序列、或其变体，和/或(iv)至少一种RKD4序列(包括小麦RKD4)、或编码其的序列、或其变体，和/或(v)至少一种GFR序列(包括GRF1或GRF5)、或编码其的序列、或其变体，和/或(vi)至少一种LEC序列(包括LEC1和LEC2)、或编码其的序列、或其变体，作为不同于第一再生加强剂的至少一种第二再生加强剂，或编码其的序列。

在根据本文所公开的方法的优选的实施方案中，所用的至少第一或唯一再生加强剂、或编码其的序列是分别根据SEQ ID NO:1至8以及12至19的RBP或相应的RBG序列、或与其具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列。

在使用单一再生加强剂的实施方案中，再生加强剂可选自SEQ ID NO:13以及15至19、或编码其的序列、或SEQ ID NO:20至22、或编码其的序列、或与其具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列。

在使用两种再生加强剂的组合的实施方案中，这些组合可选自(i)作为第一加强剂的RBP8、RBP7、RBP5、RBP2、RBP6、RBP4、或RBP3与PLT3、PLT5、或PLT7中的任一种的特异性组合(关于缩写和相应SEQ ID NO的参考，参见上文序列描述)；(ii)作为第一再生加强剂的RBP8、RBP7、RBP5、RBP2、RBP6、RBP4、或RBP3与合适的BBM(例如ZmBBM)；(iii)作为第一再生加强剂的PLT3、PLT5、或PLT7与WUS1、或WUS2(例如ZmWUS1和WUS2)；(iv)作为第一加强剂的RBP8、RBP7、RBP5、RBP2、RBP6、RBP4、或RBP3与RKD4，优选TaRKD4(来自普通小麦，参见SEQ IDNO:52和53)；(v)作为第一再生加强剂的PLT3、PLT5、或PLT7与RKD4，优选TaRKD4；(vi)作为第一加强剂的RBP8、RBP7、RBP5、RBP2、RBP6、RBP4、或RBP3与作为第二加强剂的LEC1或LEC2(例如ZmLEC1或ZmLEC2)；(vii)作为第一再生加强剂的PLT3、PLT5、或PLT7与作为第二加强剂的LEC1或LEC2；(viii)作为第一加强剂的RBP8、RBP7、RBP5、RBP2、RBP6、RBP4、或RBP3与作为第二加强剂的GRF(例如GRF5)；(ix)作为第一再生加强剂的PLT3、PLT5、或PLT7与作为第二加强剂的GRF；(x)作为第一再生加强剂的RKD4(例如TaRKD4)与作为第二加强剂的GRF家族成员；或(xi)作为第一再生加强剂的GRF家族成员与LEC1或LEC2，或编码其的相应序列、或与其具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列。

根据本文公开的各个实施方案和方面，除根据本发明的人工RBP之外，还可以优选使用天然存在的再生加强剂，其中该天然存在的再生加强剂(例如，BBM、WUS1/2、LEC1/2、GRF或PLT)可以衍生自要被转化的靶标植物或衍生自密切相关的物种。例如，对于单子叶植物修饰，可以优选具有单子叶来源(例如，来自玉米(Zm))的加强剂蛋白，而对于双子叶植物修饰，可以优选具有双子叶来源(例如，源自拟南芥(At)或欧洲油菜(Bn))的加强剂蛋白。通过在已发布的基因组数据内进行序列搜索，可以很容易地鉴定出相关的加强剂序列。值得注意的是，来自一种植物物种的再生加强剂可能示出某种跨物种适用性，使得例如小麦衍生的加强剂基因可以用于玉米，反之亦然，或拟南芥或短柄草衍生的加强剂基因可以用于向日葵，反之亦然。因此，如本文所用的PLT、WUS、WOX、BBM、LEC、RKD4或GRF序列，或具有类似再生加强剂功能的蛋白质，可以衍生自任何植物物种，其基因组中含有编码各自加强剂的相应基因。

在使用三种再生加强剂的组合的实施方案中，这些组合可选自(i)作为第一加强剂的RBP8、RBP7、RBP5、RBP2、RBP6、RBP4、或RBP3，作为第二再生加强剂的PLT3、PLT5、或PLT7、或BBM，以及作为第三再生加强剂的RKD4；(ii)作为第一再生加强剂的PLT3、PLT5、或PLT7、或BBM，作为第二再生加强剂的RKD4，以及作为第三再生加强剂的WUS1或WUS2；(iii)作为第一加强剂的RBP8、RBP7、RBP5、RBP2、RBP6、RBP4、或RBP3，作为第二再生加强剂的PLT3、PLT5、或PLT7、或BBM，以及作为第三再生加强剂的LEC1或LEC2；(iv)作为第一再生加强剂的ZmPLT3、ZmPLT5、或ZmPLT7，作为第二再生加强剂的ZmLEC1或ZmLEC2、以及作为第三再生加强剂的WUS1或WUS2；(v)作为第一再生加强剂的RBP8、RBP7、RBP5、RBP2、RBP6、RBP4、或RBP3，作为第二再生加强剂的RKD4，以及作为第三再生加强剂的LEC1或LEC2；(vi)作为第一再生加强剂的PLT3、PLT5、或PLT7，作为第二再生加强剂的RKD4，以及作为第三再生加强剂的LEC1或LEC2；(vii)作为第一再生加强剂的RBP8、RBP7、RBP5、RBP2、RBP6、RBP4、或RBP3，作为第二再生加强剂的GRF，以及作为第三再生加强剂的PLT3、PLT5、PLT7或BBM；(viii)作为第一再生加强剂的PLT3、PLT5、或PLT7，作为第二再生加强剂的GRF，以及作为第三再生加强剂的WUS1或WUS2；(ix)作为第一再生加强剂的RBP8、RBP7、RBP5、RBP2、RBP6、RBP4、或RBP3，作为第二再生加强剂的GRF，以及作为第三再生加强剂的RKD4；或(x)作为第一再生加强剂的PLT3、PLT5、或PLT7，作为第二再生加强剂的GRF，以及作为第三再生加强剂的RKD4，或编码其的相应序列、或与其具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列。

已经发现，与本发明的方法结合使用的至少一种再生加强剂，优选加强剂，或如上所详述的加强剂的特异性组合可以具有双重效应：对其中转基因异位表达的任何种类的瞬时或稳定转化的改进，或在依赖于使用至少一种位点特异性核酸酶的基因编辑的特异性情形中，其中编辑效率通过至少一种如本文所公开的加强剂的存在来改进。

如本文所用，“再生加强剂”不仅可指具有如上所定义的植物增殖活性的蛋白质或其编码序列。而且“再生加强剂”也可以是在IIM细胞或包含其的组织或植物的基因组修饰期间添加的化学物质。

在一个实施方案中，再生加强剂因此可以是选自以下的化学物质：MgCl₂或MgSO₄，例如，在约1至100mM的范围内，优选在约10至20mM的范围内；亚精胺，在约0.1-1mM的范围内，优选在约0.1-0.5mM的范围内；TSA(曲古抑菌素A)，以及TSA样化学物质。

因此，根据本文公开的方法，在人工和受控背景下使用至少一种再生加强剂具有促进植物细胞增殖的效果。这种效果对任何种类的植物基因组修饰都非常有利，因为它在通过转化和/或转染将任何质粒或化学物质引入到该至少一个植物细胞中之后，可以促进细胞再生，因为这些干预必然总是会对植物细胞造成压力。

另外或替代地，根据本文公开的方法的至少一种再生加强剂可以在增强植物基因组编辑效率方面具有特异性作用。具体地，这种由至少一种位点特异性核酸酶、切口酶或其变体引起的干预，会在植物中引起某种修复和压力响应。因此，至少一种再生加强剂的存在也可以通过使植物细胞的再生率在植物基因组修饰后增加来改进基因组修饰或基因编辑的效率。

在一个实施方案中，至少一种再生加强剂或编码其的序列或再生加强剂化学物质，可以与要被插入的其他工具，即至少一种基因组修饰系统，优选基因组编辑系统同时提供，以减少转化/转染对细胞的潜在压力。因此，对于某些对转化/转染敏感的细胞，再生加强剂可以代表一种合适的选项，其可以在转化/转染进一步的基因组或基因编辑工具之前、与此同时或之后不久提供，以通过稳定细胞并因此通过减少潜在有害的细胞压力响应来减少细胞压力并增加转化和/或编辑效率。

在另一实施方案中，可以随后或顺序提供至少一种基因组修饰系统，优选基因组编辑系统，以及至少一种再生加强剂或编码其的序列。通过分离引入步骤，可以避免位点定向的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶编码序列的编辑构建体DNA整合，其中瞬时结果是感兴趣的的。

在某些实施方案中，有利的是，在引入进一步的工具之前，至少一种再生加强剂在细胞中是有活性的，该工具用于在进行基因组或基因编辑之前将该细胞置于低细胞压力状态中。

对于至少一种再生加强剂的任何同时或随后引入，再生加强剂和任选的进一步基因组修饰或基因组编辑系统应该是有活性的，即，存在于活性蛋白质和/或RNA阶段中，存在于一个和同一要被修饰的细胞中，优选存在于该细胞的细胞核中，或存在于包含要被修饰的基因组DNA的细胞器中。

在没有合理的策略来再生(有效地)转化的植物细胞的情况下，GE方案几乎没有影响。如果按照本文所提供的方案在正确的发育阶段转化，则IIM细胞具有以灵活的方式按各种途径再生为植物组织、器官、全植物和种子的固有能力，除了这些细胞可以根据本文所公开的方法以靶向方式修饰的事实之外。

在一个方面，提供了一种产生单倍体或双单倍体植物细胞、组织、器官、植物或种子的方法。

单倍体的生成和使用是改良栽培植物的最有力的生物技术手段之一。对育种者而言，单倍体的优势在于，在双单倍体化后的第一代中就可以实现纯合性，从而产生双单倍体植物，而不需要费时费力的回交步骤来获得高度的纯合性。此外，单倍体在植物研究和育种中的价值在于，双倍单倍体的生成细胞是减数分裂的产物，使得所得群体构成了各种重组体的库，并且同时构成了遗传固定个体的库。因此，双单倍体的生成不仅提供了非常有用的遗传变异性以关于作物改良进行选择，而且也是生成定位群体、重组自交系以及即时纯合突变体和转基因株系的宝贵手段。

单倍体植物可以通过种间杂交获得，其中一个亲本基因组在受精后被消除。已示出，受精后的基因组消除可以通过修饰着丝粒蛋白(拟南芥中的着丝粒特异性组蛋白CENH3)来诱导(Ravi和Chan,Haploid plants produced by centromere-mediated genomeelimination,Nature,464卷,2010,615-619)。对于经修饰的单倍体诱导物系，当单倍体诱导物植物与野生型植物杂交时，后代发生单倍体化。有趣地，单倍体诱导系在自交时是稳定的，这表明正在发育的杂交胚中经修饰的着丝粒与野生型着丝粒之间的竞争导致诱导物亲本的着丝粒灭活，并且因此导致单亲染色体消除。

在一个实施方案中，本发明的方法因此包含生成具有单倍体诱导剂活性的至少一个单倍体细胞、组织或器官，优选其中该单倍体细胞、组织和器官包含愈伤组织、雄配子体或小孢子。在该实施方案中，如本文所公开的方法可以包含引入编码或作为允许生成单倍体诱导物细胞的序列的核苷酸或氨基酸序列，例如编码包含SANTA结构域的KINETOCHORENULL2(KNL2)蛋白的序列，其中该核苷酸序列包含在SANTA域中引起KNL2蛋白氨基酸序列改变的至少一个突变，并且所述改变在用于植物基因组修饰，优选用于至少一个基因组靶序列的靶向修饰，用于获得至少一个植物未成熟花序分生组织细胞的修饰的方法中赋予单倍体诱导物(如EP 3 159 413 A1中所公开的)活性。在该实施方案中，该至少一种基因组修饰系统不包含基因组编辑系统，而是包含允许生成单倍体诱导物系的序列，该单倍体引导物系以构成或可诱导的方式被引入到要被稳定或瞬时修饰的植物细胞中。

在另一实施方案中，根据本发明的方法的经修饰的细胞是单倍体细胞，其中该单倍体细胞通过将基因组编辑系统引入到至少一个待修饰的细胞(优选IIM细胞)中来生成，其中该基因组编辑系统能够将至少一个突变引入到感兴趣的基因组靶序列中，从而产生具有单倍体诱导物活性的细胞。

在又进一步的方面，提供了一种用于产生单倍体或双单倍体植物细胞、组织、器官、植物或种子的方法，其中该方法包含向至少一个要被修饰的细胞提供至少一种再生加强剂或再生加强剂的特异性组合或编码其的序列，其中该至少一个细胞优选是单倍体细胞，例如，配子体或小孢子。在生殖周期期间产生的这些植物固有的单倍体细胞具有对任何种类的染色体加倍和转化都非常惰性的固有特征。因此，如本文所公开的方法可以有利地用于引入或应用至少一种再生加强剂或编码其的序列或再生加强剂化学物质，以促进单倍体植物细胞的再生能力，从而提高单倍体细胞在染色体加倍期间进行转换的能力，因为双单倍体材料对于育种和最终培育植物具有特别意义。因此，如本文所公开的方法克服了处理单倍体植物细胞和组织(包括愈伤组织)的困难，因为可以通过提供至少一个加强剂序列或优选的加强剂序列特定性组合来增加诱导和/或自发染色体加倍的频率，如本文所公开的。

用于植物生物技术中加倍染色体的各种方法对研究各种栽培品系的熟练技术人员而言是可用的。在一个实施方案中，可以通过使用秋水仙素(colchicine)处理来实现染色体加倍。用于染色体加倍的其他化学物质可用于根据本文公开的用途，其中这些化学物质可以选自抗微管除草剂，包括甲基胺草磷(amiprophosmethyl，APM)、拿草特(pronamide)、氨磺乐灵(oryzalin)和氟乐灵(trifluralin)，它们都以其染色体加倍活性而闻名。

在某些实施方案中，提供了包括再生步骤的方法，其中再生可以通过直接分生组织器官发生执行，即，通过直接获得如上所详述修饰的活植物细胞、组织、器官、植物或种子来执行，或其中再生可以间接地执行，即，经由通过愈伤组织器官发生进行的额外细胞培养步骤。进一步提供了用于再生至少一个未成熟花序分生组织细胞的合适方法，在其中根据本文所公开的用于植物基因组修饰的方法通过直接分生组织器官发生或通过间接愈伤组织胚发生或器官发生而插入有至少一个基因组或基因编辑工具。

如下在各种实施例中所详述，可以直接或间接执行再生的事实是一项巨大优势，因为它提供了几种选项和灵活的策略，这取决于感兴趣的的靶植物，以从各种相关作物植物的至少一个经处理的IIM细胞获得活的植物材料，并且当将它们与本文所公开的方法组合时允许育种程序的快速进展。

在一个实施方案中，通过由基因枪轰击介导的转化或转染、农杆菌介导的转化、微粒子或纳米粒子递送，或通过化学转染，或它们的组合，将至少一种基因组修饰系统，优选至少一种基因组编辑系统，以及可选地至少一种再生加强剂或编码其的序列引入到细胞中，优选其中通过基因枪轰击来引入至少一种基因组修饰系统，优选至少一种基因组编辑系统，以及可选地至少一种再生加强剂。

根据本文公开的方法，优选策略可以是粒子或基因枪轰击，因为其允许以精确的方式来直接和靶向地引入外源性核酸和/或氨基酸材料，而不依赖于生物转化工具(包括农杆菌)的生物扩散和表达。

在某些实施方案中，基因枪轰击包括轰击之前和/或之后的渗透处理步骤。渗透处理可高度适用于增强轰击前细胞的转化/转染能力。另外，它可以增加轰击后的转化/转染效率。以下公开了各种渗透处理方案，并且植物生物技术领域的技术人员可获得其它细胞类型特异性方案。

如上所介绍，由于IIM细胞的发育状态和转化/转染技术的物理可接近性，IIM细胞因此代表了用于植物基因组修饰的有效方法的有价值的靶细胞类型。为了提高基因组或基因编辑效率，该方法不仅可以依赖于引入基因组修饰系统，即，包含核酸和/或氨基酸材料的任何载体或预组装的复合物，如本文所公开的方法可以在并行提供至少一种如本文所公开的特异性再生加强剂(引入的或应用的化学物质)以减轻细胞中的应激反应并允许在操作后快速恢复和再生的情况下特别有效。

另外，在某些实施方案中，如本文所公开的用于至少一种IIM细胞的植物基因组的靶向修饰的方法可包括引入基因组修饰系统或基因组编辑系统，该系统包含至少一种位点定向的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶，优选核酸引导的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶、或编码其的序列，以及可选地至少一种引导分子或编码其的序列，可选地一起引入至少一种修复模板或编码其的序列。

鉴于作为各种相关作物植物的有效植物基因组修饰的新靶标的如本文所公开的IIM细胞由此代表有价值且容易接近的靶结构，并且具有再生为活的植物细胞、组织、器官、全植物或其种子的能力的事实，可以在提供或不提供至少一种再生加强剂的情况下提供至少一种基因组编辑系统。

基因组修饰和位点定向的基因组编辑效率在很大程度上受宿主细胞状态的控制。经历快速细胞分裂的细胞，如植物分生组织中的那些，特别是本文所研究的IIM细胞，示出是根据本文所建立的方法用于基因组工程的最适合的受体。进一步示出，通过提供合适的再生加强剂及它们的组合促进细胞分裂增加了DNA复制和分裂过程期间的DNA整合或修饰，并因此显著增加了基因组编辑效率。

在某些实施方案中，至少一种基因组修饰系统，优选基因组编辑系统可以与至少一种再生加强剂或再生加强剂化学物质一起(即同时)或随后提供给仅一个且同一靶细胞。该策略不仅得益于再生加强剂对植物细胞再生能力的一般效应，组合使用还能够以协同方式增加基因组编辑效率。任何种类的位点定向的基因组编辑在感兴趣的的基因组靶序列中留下单链或双链断裂和/或修饰的特定碱基。这种操作引起应激和细胞修复反应，妨碍了通常较高的基因组编辑效率。因此，至少一种基因组编辑系统和至少一种再生加强剂或再生加强剂化学物质的组合引入可以显著增加在高比例的转化/转染的相关靶细胞中可检测到的位点定向的阳性(即期望的)基因组编辑事件的频率。

在根据本文所公开的方法引入至少一种基因组编辑系统的某些实施方案中，该方法包括引入至少一种位点定向的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶或编码其的序列，其中位点定向的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶可选自CRISPR核酸酶或CRISPR系统(包括CRISPR/Cas系统)，优选CRISPR/MAD7系统、CRISPR/Cfp1系统、CRISPR/MAD2系统、CRISPR/Cas9系统、CRISPR/CasX系统、CRISPR/CasY系统、CRISPR/Cas13系统或CRISPR/Csm系统、锌指核酸酶系统、转录激活因子样核酸酶系统、或大范围核酸酶系统，或其任何组合、变体、或催化活性片段。

在引入至少一种基因组编辑系统的某些实施方案中，该至少一种基因组编辑系统可进一步包含至少一种逆转录酶和/或至少一种胞苷或腺嘌呤脱氨酶，优选其中至少一种胞苷或腺嘌呤脱氨酶独立地选自载脂蛋白B mRNA编辑复合物(APOBEC)家族脱氨酶，优选大鼠来源的APOBEC、激活诱导的胞苷脱氨酶(AID)、ACF1/ASE脱氨酶、ADAT家族脱氨酶、ADAR2脱氨酶或PmCDA1脱氨酶、TadA来源的脱氨酶和/或转座子，或编码上述至少一种酶的序列，或其任何组合、变体、或催化活性片段。

可以根据本发明的方法采用的多种合适的基因组编辑系统对熟练技术人员而言是可用的，并且可以容易地进行修改以用于本文使用的方法。

在实施方案中，其中位点定向的核酸酶或其变体是一种核酸引导的位点定向核酸酶，至少一种基因组编辑系统额外地包括至少一种引导分子或编码其的序列。“引导分子”或“引导核酸序列”(通常称为并缩写为引导RNA、crRNA、crRNA+tracrRNA、gRNA、sgRNA，这取决于代表原型核酸引导的位点定向核酸酶系统的相应CRISPR系统)，其识别被核酸酶切割下的靶序列。至少一个“引导核酸序列”或“引导分子”包含“支架区域”和“靶区域”。“支架区域”是一种序列，核酸引导的核酸酶与其结合以形成可靶向核酸酶复合物。支架区域可以包含直接重复序列，其被核酸引导的核酸酶识别和加工以提供成熟的crRNA。pegRNA可以包含引导分子内的进一步区域，即所谓的“引物结合位点”。“靶区域”定义了与旨在要被切割的靶位点的互补性。因此，如本文所用，crRNA在本文中可以与术语引导RNA互换地使用，前提是其统一了同时得到确认的CRISPR核酸酶引导RNA功能的效果。某些CRISPR核酸酶(例如Cas9)可以通过以tracrRNA和crRNA的形式提供两个单独的引导核酸序列来使用，这两个引导核酸序列可以分别提供，或通过共价或非共价键/相互作用连接。引导RNA也可以是如下文所进一步公开的Prime Editing系统的pegRNA。至少一种引导分子可以以一个相干分子或编码其的序列的形式提供，或以两个单独的分子(例如，crRNA和tracr RNA)或编码其的序列的形式提供。

在某些实施方案中，基因组编辑系统可以是碱基编辑器(BE)系统。

在又另一实施方案中，基因组编辑系统可以是Prime Editing系统。

本文公开的基因组修饰或基因组编辑系统所包含的或编码其的任何核酸序列或再生加强剂序列可以针对感兴趣的植物靶细胞的密码子使用进行“密码子优化”。这意指序列适应于它在其中表达的生物体中的优选密码子使用，即“感兴趣的靶细胞”(即IIM细胞)可以起源于不同的靶标植物(例如小麦、玉米、向日葵、甜菜)，使得不同的密码子优化可能是优选的，即使蛋白质水平上的经编码的效应子可能是相同的。如果核酸序列在异源系统中表达，则密码子优化显著增加翻译效率。

在根据如本文所公开的方法的某些实施方案中，可能优选的是实现同源定向修复(HDR)介导的基因组编辑，而不是……。在根据本文公开的各个方面和方法的某些实施方案中，其中引入至少一种基因组编辑系统，该至少一种基因组编辑系统包含至少一种修复模板(或供体)，并且该至少一种修复模板包含或编码双链和/或单链核酸序列。

在根据上文描述的任何实施方案的基因组编辑系统的进一步实施方案中，该系统因此可以额外地包含至少一种修复模板或编码其的序列。“修复模板”、“修复核酸分子”或“供体(模板)”是指外源性提供的模板，其用于引导细胞修复过程，使得修复结果无错误且可预测。在不存在用于辅助靶向同源重组机制(HDR)的模板序列的情况下，细胞通常尝试通过非同源末端接合(NHEJ)这一易错过程来修复基因组DNA断裂。

在一个实施方案中，至少一种修复模板可以包含或编码双链和/或单链序列。

在另一实施方案中，至少一种修复模板可以包含对称或不对称同源臂。

在另一个实施方案中，至少一种修复模板可以包含至少一种经化学修饰的碱基和/或骨架。

在一个实施方案中，同时或一个接一个地提供根据上文描述的任何实施方案的基因组修饰或编辑系统，至少一种位点定向的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶或编码其的序列，和/或任选的至少一种引导核酸或编码其的序列，和/或任选的至少一种修复模板或编码其的序列。

至少一种修复模板可以与至少一种基因组修饰或编辑系统和/或至少一种再生加强剂同时或随后递送，条件是它将呈活性，即，在待修饰的IIM细胞中的基因组靶序列的位点处与至少一种另外感兴趣的的工具一起存在且容易获得。

可以通过在第一次轰击后1-8小时再轰击至少一次来额外引入修复模板，尤其是当基因组编辑组件作为编码其的序列递送时，以增加用于靶向修复过程的修复模板可用性。

在一个实施方案中，至少一种修复模板可以包含对称或不对称同源臂。

在另一实施方案中，至少一种修复模板可以包含至少一个经化学修饰的碱基/或骨架(包括经硫代磷酸酯修饰的骨架)、或附着于修复模板的核酸的荧光标记等等。

在某些实施方案中，瞬时地或稳定地或以它们的组合的方式引入至少一种基因组编辑系统，可选地至少一种再生加强剂，以及可选地至少一种修复模板或编码其的相应序列。鉴于至少一种基因组编辑系统的稳定整合，特别是位点定向的核酸酶或其变体但不一定包括至少一个引导RNA，可以允许该效应子的稳定表达，因此可以以完全瞬时的方式进行如本文所公开的方法。这意味着，除非使用至少一种修复模板，否则工具本身不会整合到要被修饰的细胞基因组中。这种瞬时方案对于高度可控的基因编辑事件可以是优选的。

在优选的实施方案中，可以经受本发明的方法和用途的植物优选是单子叶植物，包括来自禾本目(Poales)的植物，并且最优选来自禾本科的植物，包含以下属：剪股颖属(Agrostis)、银须草属(Aira)、山羊草属(Aegilops)、看麦娘属(Alopecurus)、喜砂草属(Ammophila)、黄花茅属、燕麦草属(Arrhenatherum)、燕麦属(Avena)、菵草属(Beckmannia)、短柄草属、无芒雀麦属(Bromus)、拂子茅属(Calamagrostis)、薏苡属(Coix)、蒲苇属(Cortaderia)、香茅属(Cymbopogon)、狗牙根属(Cynodon)、鸭茅属(Dactylis)、野青茅属(Deyeuxia)、曲芒发草属(Deschampsia)、披碱草属(Elymus)、偃麦草属(Elytrigia)、旱麦草属(Eremopyrum)、蜈蚣草属(Eremochloa)、羊茅属(Festuca)、水甜茅属(Glyceria)、异燕麦属(Helictotrichon)、大麦属(Hordeum)、绒毛草属(Holcus)、洽草属(Koeleria)、滨麦属(Leymus)、毒麦属(Lolium)、臭草属(Melica)、乱子草属(Muhlenbergia)、早熟禾属(Poa)、雀稗属(Paspalum)、棒头草属(Polypogon)、稻属(Oryza)、黍属(Panicum)、芦苇属(Phragmites)、Pryza、碱茅属(Puccinellia)、甘蔗属(Saccharum)、黑麦属、Sesleria、狗尾草属(Setaria)、高粱属(Sorghum)、针茅属(Stipa)、钝叶草属(Stenotaphrum)、三毛草属(Trisetum)、小麦属(Triticum)、玉米属、菰属(Zizania)或结缕草属(Zoysia)。

在某些实施方案中，具有由突变造成的扩大的花序分生组织的植物(例如，花椰菜、青花菜)可以用于本文所公开的方法，即芸苔属(Brassica)植物，特别是Brassicaoleracea var.botrytis L.和Brassica oleracea var.italica。

在另一实施方案中，可以经受本发明的方法和用途的植物优选是双子叶植物，包括来自向日葵目(Heliantheae)或Betoideae的植物，包含向日葵属(Helianthus)或甜菜属(Beta)。

在进一步的实施方案中，本发明的背景下所公开的植物细胞、组织、器官、植物或种子来源于选自以下的属：大麦属、高粱属(Sorghum)、甘蔗属、玉米属、狗尾草属、稻属、小麦属、黑麦属、黑小麦属(Triticale)、苹果属(Malus)、短柄草属、山羊草属、胡萝卜属(Daucus)、甜菜属、桉属(Eucalyptus)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、咖啡属(Coffea)、葡萄属(Vitis)、Erythrante、螺旋狸藻属(Genlisea)、黄瓜属(Cucumis)、Marus、拟南芥属(Arabidopsis)、须弥芥属(Crucihimalaya)、碎米荠属(Cardamine)、独行菜属(Lepidium)、荠属(Capsella)、Olmarabidopsis、南芥属(Arabis)、芸苔属、芝麻菜属(Eruca)、萝卜属(Raphanus)、柑橘属(Citrus)、麻疯树属(Jatropha)、杨属(Populus)、苜蓿属(Medicago)、鹰咀豆属(Cicer)、木豆属(Cajanus)、菜豆属(Phaseolus)、大豆属(Glycine)、棉花属(Gossypium)、紫云英属(Astragalus)、百脉根属(Lotus)、蝴蝶草属(Torenia)、葱属(Allium)、菠菜属(Spinacia)或向日葵属，优选，该植物细胞、组织、器官、植物或种子来源于选自以下的物种：大麦(Hordeum vulgare)、球茎大麦(Hordeumbulbusom)、高丹草(Sorghum bicolor)、甘蔗(Saccharum officinarium)、玉米属包括玉米(Zea mays)、粟(Setaria italica)、小粒野生稻(Oryza minuta)、水稻(Oryza sativa)、澳洲野生稻(Oryza australiensis)、高秆野生稻(Oryza alta)、普通小麦(Triticumaestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、黑麦(Secale cereale)、小黑麦(Triticale)、苹果(Malus domestica)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、海滨大麦(Hordeummarinum)、节节麦(Aegilops tauschii)、Daucus glochidiatus、甜菜属(Beta spp.)包括甜菜(Beta vulgaris)、小胡萝卜(Daucus pusillus)、Daucus muricatus、胡萝卜(Daucuscarota)、巨桉(Eucalyptus grandis)、美花烟草(Nicotiana sylvestris)、绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)、普通烟草(Nicotiana tabacum)、本氏烟(Nicotianabenthamiana)、番茄(Solanum lycopersicum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、中果咖啡(Coffea canephora)、葡萄(Vitis vinifera)、虾衣花(Erythrante guttata)、Genliseaaurea、黄瓜(Cucumis sativus)、川桑(Marus notabilis)、Arabidopsis arenosa、深山南芥(Arabidopsis lyrata)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、须弥芥(Crucihimalayahimalaica)、卵叶须弥芥(Crucihimalaya wallichii)、Cardamine nexuosa、北美独行菜(Lepidium virginicum)、荠菜花(Capsella bursa pastoris)、Olmarabidopsis pumila、Arabis hirsute、甘蓝型油菜(Brassica napus)、甘蓝(Brassica oleracea)、芜菁(Brassica rapa)、萝卜(Raphanus sativus)、印度芥菜(Brassica juncacea)、黑芥(Brassica nigra)、芝麻菜(Eruca vesicaria subsp.sativa)、甜橙(Citrus sinensis)、桐油树(Jatropha curcas)、毛果杨(Populus trichocarpa)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)、Cicer yamashitae、野生鹰嘴豆(Cicer bijugum)、鹰嘴豆(Cicerarietinum)、Cicer reticulatum、Cicer judaicum、Cajanus cajanifolius、蔓草虫豆(Cajanus scarabaeoides)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、大豆(Glycine max)、棉花属(Gossypium sp.)、紫云英(Astragalus sinicus)、百脉根(Lotus japonicas)、蓝猪耳(Torenia fournieri)、洋葱(Allium cepa)、葱(Allium fistulosum)、大蒜(Alliumsativum)、韭菜(Allium tuberosum)、向日葵(Helianthus annuus)、菊芋(Helianthustuberosus)和/或菠菜(Spinacia oleracea)。

一个方面，提供了在可通过或通过如本文所公开的用于植物基因组修饰的方法获得的植物细胞、组织、器官、植物或种子，其中所获得的植物细胞、组织、器官、植物或种子可以是单子叶(单子叶植物)或双子叶(双子叶植物)的植物细胞、组织、器官、植物或种子。

在某些实施方案中，来自待根据如本文所公开的方法修饰的至少一种IIM细胞所源自的植物(例如禾本科植物)的花序可以是圆锥花序、穗状花序、或基于花序的形态特征的总状花序。每种类型具有小穗，然而，其可以具有所有种类的形状。小穗是一对具有所包围的小花的各种形状的苞片(也称为颖片、变态叶)。小花是由以下各项组成的小花朵：包围生殖器官的两个苞片；雄蕊，由具有支撑花丝的花药组成，代表雄性；雌蕊，由柱头、花柱和子房组成，代表雌性。

植物发育通常分为营养阶段、转变阶段和生殖阶段。具体地，对于涉及禾本科植物的实施方案，营养阶段的特征在于产生叶和分枝(分蘖)并保留在土壤表面或其附近的芽分生组织。营养阶段顺序地包括7个发育阶段：种子萌发、初叶发生、初叶、二叶、三叶、初分蘖、分蘖。转变阶段通过顶端分生组织的拔高及其向花序分生组织发育的转变来描述。在转变阶段期间，叶鞘开始伸长，分生组织叶枕区拔高到可放牲的高度。转变阶段包括：芽伸长、第一节、第二节和第三节。生殖阶段定义了产生花和种子的花序分生组织的发育阶段，包括：旗叶(旗叶枕可见，花粉发育开始)、早期花序鞘、花序鞘(其定义为种子穗包围在旗叶鞘内的时间)、种子穗发生、早期开花和开花。

在小麦族(Triticeae tribe)物种(例如，包括重要作物，如小麦、大麦、黑麦)的情况下，植物带有穗状花序形式的花序，其具有直接附连于穗轴的两列侧向无梗对生小穗。花序发育涉及茎尖的一系列形态变化——以穗状花序起始或小穗形成开始，其发生在茎伸长开始之前。茎端分生组织向花序分生组织的转变引发茎伸长。转变后，花序分生组织发育出由苞原基组成的棱(ridges)，随后小穗分生组织发育为腋芽。花序分生组织发育分为四个阶段：1)当小穗分生组织发育起始且第一节可见时的双棱/小穗分生组织(DR)阶段；2)小花分生组织发育开始时的小花分生组织(FM)阶段(以第二节的发生为标志)；3)花药分生组织形成，旗叶出现，并且第三节开始延伸时的花药分生组织(AM)阶段；以及4)花柱刚从雌蕊(TS)中出现，并且旗叶伸长时的幼小花阶段。在幼小花阶段，四分体在伸长花柱中形成。

玉米(玉米)的发育阶段在形态上也分为营养阶段、转变阶段和生殖阶段。

在一个方面，因此提供了对植物分阶段的方法，即，确定能够鉴定并获得根据本公开的方法的如本文所公开修饰的IIM细胞的发育阶段的方法。

营养阶段包括VE(初叶发生)至V14(第14叶的叶枕可见)阶段，转变阶段发生在雄穗发生时，而生殖阶段开始于R1阶段(穗丝发生)至R6阶段(籽粒完全成熟)。玉米植物发育按顺序次序包括以下阶段：

-VE：初叶发生

-V1：第一叶的叶枕可见

-V2至V14：第二叶的叶枕至第14叶的叶枕可见

-VT：雄穗发生

-R1：任何穗丝可见。

-R2至R6：籽粒发育开始至籽粒的生理成熟。

然而，从发育的观点来看，玉米生殖阶段开始得相当早。花序分生组织发育在V5至V6阶段开始(具有5-6个可见叶枕的植物；参见图1)。大约在雄穗开始的同时，叶基节(叶鞘后)处的叶腋分生组织转变成穗原基，在此壳叶发育起始，继之以穗柄尖端处的穗分生组织。叶腋分生组织向穗原基的转变开始于茎秆的低叶节处，并继续朝向顶部，除了植物的上部六至八个节。到V10发育阶段，所有花序原基起始被引发，并且潜在的行数(穗周长)被确定。位于下茎节处的穗芽比位于上茎节处的穗芽要大，因为下茎节较早产生。当发育继续进行时，上部的一个或两个穗芽优先于所有下部穗芽，并最终成为可收获的穗。

技术人员充分意识到以下事实：通常基于形态特征的方案可用于所有相关的作物植物，使得如本文所提供的教导可转移至其它靶植物，用于限定、分离和/或提供未成熟花序细胞以进行转化。

在某些实施方案中，具有发育不全的花苞片(例如颖片、外稃、内稃)的任何未成熟花序可优选作为待转化的未成熟花序分生组织细胞。

在一个实施方案中，例如在小麦族物种作为靶植物(例如小麦、大麦、黑麦)的情况下，在早期双棱/小穗分生组织(DR)至早期幼小花的发育阶段的未成熟花序(优选在晚期DR阶段至晚期花药原基(AM)的未成熟花序)可优选经受本文所公开的方法。在玉米的情况下，未成熟雄穗和穗均适用于本发明的方法。源于V5至V10发育阶段的植物，并优选V6至V8发育阶段的植物的未成熟雄穗可以特别适合于本文所公开的方法。来自V5至V12发育阶段的植物，并优选V6至V10发育阶段的植物的未成熟穗也可适用于如本文所公开使用的方法。

感兴趣的的植物的花序的发育阶段可以通过宏观、微观和/或分子技术来确定，包括植物形态和生长的视觉检查、显微镜检查，例如使用立体显微镜，或通过确定特定发育阶段特征性的标记基因或代谢物的表达。对于所有相关的单子叶和双子叶作物植物，这样的技术是技术人员已知的，并且可基于如本文所公开的将植物分阶段以鉴定IIM细胞的方法加以修改。

根据本文所公开的方法使用的植物细胞可以是体外(in intro)或体内的任何类型的植物花序分生组织的一部分，或可以衍生自或分离自任何类型的植物花序分生组织。可以使用分离的植物细胞以及植物材料，即含有植物细胞的全植物或植物部分。植物的一个或多个部分可以附着于完整植物上，或从完整植物分离出来。

在某些实施方案中，可加入组织培养基中的植物生长调节剂如生长素或细胞分裂素以操作成诱导愈伤组织形成，并随后改变成诱导由愈伤组织形成胚。

已经描述了体细胞胚发生以两种方式发生：直接或间接地。当胚直接从产生相同克隆的外植体组织开始时，发生直接胚发生。当外植体产生未分化或部分分化的细胞(即愈伤组织)，然后维持或分化为植物组织如叶、茎、或根时，发生间接胚发生。

根据本发明的方法，多种递送技术可适用于将基因组修饰或编辑系统的组件和/或至少一种加强剂基因和/或至少一种转基因、或编码其的相应序列引入细胞(特别是IIM细胞)中，该递送方法是技术人员已知的，例如，通过选择直接递送技术，范围为原生质体的聚乙二醇(PEG)处理、程序如电穿孔、显微注射、碳化硅纤维须晶技术、病毒载体介导的方法和粒子轰击。常见的生物学手段和根据本发明的优选载物是用农杆菌属(Agrobacteriumspp.)转化，数十年来已被用于多种不同的植物材料。病毒载体介导的植物转化代表了将遗传物质引入感兴趣的细胞的另一种策略。

特别优选的递送技术可以是通过物理递送方法如(微)粒子轰击或显微注射引入。粒子轰击包括基因枪转染或微粒子介导的基因转移，其是指用于使包含感兴趣的核酸或遗传构建体的包被微粒子或纳米粒子转移到靶细胞或组织中的物理递送方法。物理引入手段适于引入核酸即RNA和/或DNA，以及蛋白质。粒子轰击和显微注射已经演进为用于将遗传物质引入感兴趣的的植物细胞或组织的突出技术。Helenius等，“Gene delivery intointact plants using the Helios^TMGene Gun”,Plant Molecular Biology Reporter,2000,18(3):287-288公开了粒子轰击作为将材料引入到植物细胞中的物理方法。

如本文所用，术语“(微)粒子轰击”，也称为“基因枪转染”或“微粒子介导的基因转移”，是指使包含加强基因、加强剂多肽、基因组工程组件和/或转基因的包被微粒子或纳米粒子转移到靶细胞或组织中的物理递送方法。微粒子或纳米粒子起到抛射体的作用，并且使用通常称为基因枪的合适装置在高压下发射到感兴趣的的靶结构上。通过粒子轰击进行的转化使用一种覆盖有感兴趣的构建体的金属微粒，然后使用一种被称为“基因枪”(Sandford等人,1987)的设备将其以足够快穿透靶组织的细胞壁但不足以导致细胞死亡的高速度(-1500km/h)射到靶细胞上。对于细胞壁被完全去除的原生质体，该条件在逻辑上是不同的。轰击后，至少一个微粒上的沉淀的构建体释放到细胞中。通过高压放电或压缩气体(氦气)来实现微粒的加速。关于所使用的金属粒子，必须是无毒、无反应性的，并且其直径小于靶细胞。最常用的是金或钨。基因枪和相关系统的制造商和供应商提供了大量关于其一般用途的公开可用信息。

在使用粒子轰击的一个实施方案中，基因组修饰或编辑系统的各种组件和/或至少一种加强剂基因和/或至少一种转基因、或编码其的相应序列经由微载体共同递送，该微载体包含尺寸在0.4-1.6微米(pm)，优选0.4-1.0pm范围内的金粒子。在示例性过程中，每次轰击使用10-1,000pg的金粒子，优选50-300pg。

基因组修饰或编辑系统的各种组件和/或至少一种加强剂基因和/或至少一种转基因、或编码其的相应序列可以例如使用Bio-Rad PDS-1000/He粒子枪或手持式Helios基因枪系统而递送到靶细胞中。当使用PDS-1000/He粒子枪系统时，轰击破裂压力为约450psi至2200psi，优选的约450至1800psi，而对于Helios基因枪系统，破裂压力为100-600psi。可以同时将多于一种的化学或构建体与基因组工程组件共同递送到靶细胞中。上述用于转化和转染的递送方法可用于同时引入本发明的工具。同样，存在将感兴趣的的核酸或氨基酸构建体特异性引入植物细胞的特定转化或转染方法，包括电穿孔、显微注射、纳米粒子和细胞穿透肽(CPP)。此外，存在引入遗传构建体和/或核酸和/或蛋白质的基于化学的转染方法，尤其包括用磷酸钙转染、用脂质体例如阳离子脂质体转染、或用阳离子聚合物(包括DEAD-葡聚糖或聚乙烯亚胺或它们的组合)转染。以上递送技术可单独或组合地用于体内(包括植物体内)或体外方法。粒子轰击的优点可在于，这种物理引入形式可以精确地定时，使得插入的材料可以与其它效应子一起以协同方式到达靶区室，以实现最大活性。IIM细胞显示对粒子轰击特别敏感并且很好地容许这种引入。

在一个实施方案中，组合了一种以上如上所公开的不同的转化/转染技术，优选，其中经由粒子轰击引入基因组修饰或编辑系统的至少一种组件和/或至少一种加强剂基因和/或至少一种转基因、或编码其的相应序列。

在某些实施方案中，如本文所公开的用于植物基因组修饰的方法可以包括制备作为优选未成熟花序分生组织(IIM)的一部分的植物细胞以提供至少一个未成熟花序分生组织细胞的在前步骤。

在本文所公开的方法的某些实施方案中，至少一个经修饰细胞的再生可以是直接分生组织再生，包括以下步骤：芽分生组织诱导约1至4周，优选10-25天，芽分生组织繁殖约1至4周，优选10-25天，芽长出约1至4周，优选10-20天，并且根长出约1至4周，优选3-20天。

在本文所公开的方法的其它实施方案中，至少一个经修饰细胞的再生可以是间接分生组织再生，包括以下步骤：诱导胚性愈伤组织形成约1至6周，优选2-4周，最优选3周，芽分生组织发育和长出约1至6周，优选2-4周，最优选10-25天，并且根长出约1至4周，优选3-14天；以及可选地：针对再生的T0植物中的遗传修饰事件进行筛选；并且进一步可选地：使经修饰的T0植物生长以产生T1种子，并可选地筛选T1后代以获得期望的遗传修饰事件。

在另一个方面，提供了一种普遍适用的表达构建体组装件，其可根据本文所公开的方法使用，其中表达构建体组装件包含(i)编码基因组编辑系统的至少一种位点定向的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶的至少一种载体，优选其中基因组编辑系统如上所定义，以及(ii)可选地：编码至少一种再生加强剂的至少一种载体，优选其中再生加强剂如上所定义，以及(iii)可选地，当基因组编辑系统的至少一种位点定向的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶是核酸引导的核酸酶时：编码至少一种引导分子的至少一种载体，该至少一种引导分子将至少一种核酸引导的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶引导到至少一个感兴趣的的基因组靶位点；以及(iv)可选地：编码至少一种修复模板的至少一种载体；其中(i)、(ii)、(iii)和/或(iv)在相同或不同的载体上编码。

在一个实施方案中，表达构建体组装件可以进一步包含编码至少一个标记的载体，优选其中以瞬时的方式引入该标记，参见例如SEQ ID NO:48。

在一个实施方案中，表达构建体组装件包含或编码至少一个调控序列，其中调控序列选自核心启动子序列、近端启动子序列，顺式调控序列、反调控序列、基因座控制序列、绝缘子序列、沉默子序列、增强子序列、终止子序列、内含子序列和/或其任何组合。

值得注意的是，存在于表达载体组装件的同一载体上的基因组修饰或编辑系统的不同组件和/或再生加强剂序列和/或引导分子和/或修复模板可以包含或编码多于一个单独控制转录和/或翻译的调控序列。

在上文描述的表达构建体组装件的一个实施方案中，构建体包含或编码至少一个调控序列，其中调控序列选自核心启动子序列、近端启动子序列，顺式调控序列、反调控序列、基因座控制序列、绝缘子序列、沉默子序列、增强子序列、终止子序列、内含子序列和/或其任何组合。

在上文描述的表达构建体组装件的另一实施方案中，该调控序列包含或编码选自下组的至少一个启动子，该组由以下各项组成：ZmUbi1、BdUbi10、ZmEf1、双35S启动子、水稻U6(OsU6)启动子、水稻肌动蛋白启动子、玉米U6启动子、PcUbi4、Nos启动子、AtUbi10、BdEF1、MeEF1、HSP70、EsEF1、MdHMGR1或它们的组合。

在上文描述的表达构建体组装件的进一步实施方案中，至少一个内含子选自下组，该组由以下各项组成：ZmUbi1内含子、FL内含子、BdUbi10内含子、ZmEf1内含子、AdH1内含子、BdEF1内含子、MeEF1内含子、EsEF1内含子和HSP70内含子。

在根据上文描述的任何实施方案的表达构建体组装件的一个实施方案中，该构建体包含或编码ZmUbi1启动子和ZmUbi1内含子、ZmUbi1启动子和FL内含子、BdUbi10启动子和BdUbi10内含子、ZmEf1启动子和ZmEf1内含子、双35S启动子和AdH1内含子或双35S启动子和ZmUbi1内含子、BdEF1启动子和BdEF1内含子、MeEF1启动子和MeEF1内含子、HSP70启动子和HSP70内含子的组合，或EsEF1启动器和EsEF1内含子的组合。

另外，该表达构建体组装件可以包含至少一个终止子，其介导表达构建体或其组件的末端处的转录终止以及转录物从转录复合物中的释放。

在根据上文描述的任何实施方案的表达构建体组装件的一个实施方案中，该调控序列可以包含或编码选自下组的至少一个终止子，该组由以下各项组成：nosT、双35S终止子、ZmEf1终止子、AtSac66终止子、章鱼碱合成酶(ocs)终止子或pAG7终止子或它们的组合。用于不同植物细胞的表达构建体的多种进一步合适的启动子和/或终止子序列是相关领域的熟练技术人员众所周知的。

如本文所公开的特别是用于IIM细胞的瞬时粒子轰击和直接分生组织再生的方法是高度有效和高效的，并且能够实现单细胞起源的再生和同质基因组编辑而无需常规选择(例如，使用抗生素或除草剂抗性基因)。

本发明的表达载体组装件的示例性元件可以单独组合，可以包含(i)合适的载体骨架，例如根据SEQ ID NO:34，其中多种合适的载体在植物生物技术中可用；(ii)表达盒，即编码效应子序列的盒，例如如本文所公开的至少一种再生加强剂，例如根据SEQ ID NO:23至33中任一项；(iii)表达构建体，即包括表达盒和至少一种另外的载体元件的构建体，例如，如SEQ ID NO:35至43中任一项所代表，或空载体，例如根据SEQ ID NO:34；(iv)包含或编码至少一种位点定向的核酸酶的载体或表达构建体，例如，如SEQ ID NO:46和50中任一项所代表；(v)在使用核酸引导的位点定向核酸酶的情况下，编码引导分子的合适载体，其特定于感兴趣的基因组靶序列，例如根据SEQ ID NO:47、49和50中的任一项的序列，其中相应的引导分子与同源核酸引导的位点定向核酸酶或其变体兼容，其中根据47、49和50中的任一项所包含或编码的相应引导分子可以容易地被靶向不同的感兴趣的基因组靶位点的另一引导分子替换；(vi)编码至少一个感兴趣的修复模板序列的载体；和/或(vii)包含或编码至少一个可表达标记基因的载体或表达构建体，优选标记基因，其可以在宏观或微观上容易地检测到，像如由例如SEQ ID NO:48所编码的荧光标记基因一样。适用于整个光谱，即适用于所有感兴趣的荧光通道，适用于可视化不同区室中的代谢物的植物生物技术的用途的多种合适的荧光标记蛋白和荧光团对熟练技术人员而言是可用的，这可以根据本发明来使用。实例是来自多管水母属(Aequoria Victoria)的GFP、来自日本鳗鲡(Anguillajaponica)的荧光蛋白或其突变体或衍生物)、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、黄绿色荧光蛋白(例如，衍生自来自头索动物文昌鱼(Branchiostoma lanceolatum)的四聚物荧光蛋白的mNeonGreen)、橙色荧光蛋白、红色或远红色荧光蛋白(例如，tdTomato(tdT)或DsRed)，并且可以使用多种荧光和有色蛋白中的任何一种，这取决于在期望的波长处要被激发和/或可视化的靶标组织或细胞或其区室。

表达载体组装件的所有元件都可以单独组合。进一步地，元件可以以稳定或瞬时的方式表达，其中瞬时引入可以是优选的。在某些实施方案中，单个元件可能不作为尚未表达(转录和/或翻译)的表达载体的一部分来提供，但它们可以同时或随后在活化状态下直接转染，并且可以在一个和相同的要被修饰的感兴趣的IIM细胞内形成表达载体组装件。例如，首先转化编码位点定向的核酸酶的表达载体组装件的一部分可能是合理的，这需要一些时间才能表达构建体，其中然后将同源引导分子在其活化RNA阶段中进行转染和/或在单独和随后的引入步骤中将至少一个修复模板在其活化DNA阶段中进行转染以快速可用。也可以将至少一个再生加强剂序列和/或至少一种基因组修饰或编辑系统和/或至少一个标记同时或随后转化为一个载体的一部分，转化为不同载体的一部分。应避免使用过多的单独引入步骤，并且可以将若干组件组合进表达载体组装件的一个载体中，以减少转化/转染期间的细胞压力。在某些实施方案中，在依赖于所有元件的复杂修饰的情况下，可以优选的是，在若干载体上和在若干引入步骤中单独提供至少一个再生加强剂序列和/或至少一种基因组修饰或编辑系统和/或至少一个标记和/或至少一种引导分子和/或至少一种修复模板的元件，以便所有元件在功能上表达和/或存在于要被以协同方式活化的细胞中。

通过以下非限制性实施例进一步说明本发明。

实施例

实施例1：用于不同靶植物的植物未成熟花序制备

A：玉米植物栽培

根据种子的发芽率，将每孔1-2粒种子播种到深50孔穴盘(图1A)中，该穴盘进一步放置在没有孔的托盘内(图1B)。发芽后，每孔仅保存一株幼苗。使用的土壤是MetroMix360/Turface 3:1共混物。使种子发芽并在生长室中白天28℃和夜晚22℃，400-600μmol m^-2s^-1的光强度和14-16小时日长，50％湿度下生长。在每次浇水时使用稀释至150ppm氮的Jack的15-5-15Ca-Mg对玉米植物施肥。根据需要给植物浇水。

该栽培方法与花粉污染事件无关是一项巨大优势，因此，如图2所示，允许多个基因型能够在同一盘中生长。如图2所示的深50孔盘的外部尺寸选择如下：21¹/₄"×11¹/₄"×2¹/₄，单元尺寸：1³/₄"×1³/₄"。显然，这些尺寸可以取决于感兴趣的的靶植物(以及因此其形态特征)而变化。

B：玉米未成熟雄穗分离

使用来自晚期V6阶段至晚期V7阶段植物的玉米未成熟雄穗(图2)。当在上述生长条件下培养时，对于不同基因型，在播种后最可能需要25-32天达到这些阶段。使用例如Zeiss立体显微镜来测定未成熟雄穗的发育阶段。玉米未成熟雄穗分离通常包括以下步骤：

1.通过在基部(接近土壤)和最幼小叶的叶枕之间回收茎秆段并除去所有叶片，从玉米植物收获具有未成熟雄穗的茎秆段；

2.(可选的)用自来水冲洗茎秆段，并用纸巾擦干；

3.用70％乙醇对茎秆段进行表面喷洒，并在层流罩内手动除去茎秆上的第一叶鞘；

4.重复步骤3，并小心地从茎秆上从底部到顶部逐个除去每个叶鞘，直至最后第3个叶鞘；

5.修剪茎秆段并用70％乙醇对它们进行喷洒(最后一次乙醇喷洒)；

6.将各段转移到罩中的透明培养皿上；

7.在解剖显微镜下：小心地除去所有剩余的叶，使得未成熟雄穗准备好进行转化(图3A)。

分离的玉米未成熟雄穗包含主要和分枝花序分生组织，并且还包含小穗分生组织。花苞原基发育不全，并且花序分生组织开放(图3A)。

C：玉米未成熟穗分离

用于本发明方法的玉米未成熟穗来源于处于V8至晚期V10发育阶段的植物。从播种到未成熟穗收获最可能需要5-6周。穗位于每个茎节处，被叶鞘包围，并且通常被壳叶围绕。使用例如Zeiss立体显微镜来测定未成熟穗的发育阶段。玉米未成熟穗分离通常包括以下步骤：

1.通过在基部(接近土壤)和最幼小叶的叶枕之间回收茎秆段并除去所有叶片，从玉米植物收获具有未成熟穗的茎秆；

2.(可选的)用自来水冲洗茎段，并用纸巾擦干；

3.用70％乙醇对茎秆段进行表面喷洒，并在层流罩内手动除去茎秆上的第一叶鞘，并且在第一茎节处小心分离出第一未成熟穗芽；

4.重复步骤3，在罩中从底部到顶部逐个分离每个茎节处的所有未成熟穗芽；

5.用70％乙醇喷洒穗芽(最后一次乙醇喷洒)，将芽转移到干净的培养皿中；

6.在解剖显微镜下：小心地从每个穗芽中除去所有的壳，并且未成熟穗分生组织准备好进行转化。

分离包含成对成排的穗小穗的玉米未成熟穗。花苞原基发育不全，并且花序分生组织开放(图3B)。

D：黑麦植株栽培

KWS bono黑麦在生长室中生长。将两粒KWS bono黑麦种子播种到1801深插穴盆中(置于无孔的18-计数保持托盘中)。发芽后，每盆仅保存一株幼苗。

使用的土壤是Berger 35％ Bark。使种子发芽并在恒定的20℃至21℃的生长室中生长，光强度为400-600μmol m^-2s^-1，并且日长为14小时，湿度为50％。用Jack的15-16-17无土栽培配方以E.C.的1.0+E.C.水对黑麦植物每周施肥三次。每天两次检查植物的浇水需求，并根据需要从顶部浇水。

在植物发芽并产生一至两个分蘖后，将植物移至温度为0℃至5℃的春化室中40天。一旦它们移回正常生长条件，它们将开始其生殖发育。

E：黑麦未成熟花序分离

用Zeiss立体显微镜测定黑麦未成熟花序的发育阶段。当第一茎节可见时，黑麦植株的花序处于DR(双棱/小穗分生组织阶段)阶段。约1周后，第二节发生，小花分生组织发育开始，并且植物处于FM(小花分生组织)阶段。再过5-7天后，第三茎节间开始伸长，并且花药原基可见，并且植物处于AM(花药原基/分生组织)阶段并准备进入孕穗阶段。

在晚期双棱(DR)至晚期花药分生组织(AM)的发育阶段的黑麦未成熟花序用于本发明的方法。在这些阶段，黑麦芽伸长，具有1-3个可见的节。

黑麦未成熟花序的分离包括以下步骤：

1.从茎秆基部(接近土壤)收获处于正确发育阶段的黑麦芽，并除去所有叶片；

2.(可选的)用自来水冲洗茎段，并用纸巾擦干；

3.用70％乙醇对芽进行表面喷洒，并在层流罩内手动除去茎秆上的第一叶鞘；

4.重复步骤3，并小心地从茎秆上从底部到顶部逐个除去每个叶鞘，直至旗叶鞘；

5.修剪茎秆段并用70％乙醇喷洒(最后一次乙醇喷洒)；

6.将各段转移到罩内的透明培养皿上；

7.在解剖显微镜下：小心地除去旗叶鞘和所有未成熟的苞片，并且未成熟花序准备好进行转化(图3C)。

实施例2：来自玉米优良品种的未成熟雄穗的瞬时基因枪转化.

玉米未成熟雄穗的制备如上所详述(实施例1)执行。

微粒子轰击

将来自不同自交优良品系的新鲜分离的未成熟雄穗放置于渗透培养基平板(例如IM_OS培养基)上4小时。使用Bio-Rad PDS-1000/He粒子枪进行粒子轰击。轰击条件为：30mm/Hg真空、1,350psi氦气压力。每次轰击使用亚精胺钙方法将200ng的质粒DNA pGEP837(图4)涂覆到100μg的0.6μm金粒子上。每个样品板执行四次轰击。在轰击后，将轰击的未成熟雄穗在渗透培养基平板上再保持20小时。绿色荧光报告编码基因(图4)用于监测基因枪转化和基因表达。轰击后20小时，在所有测试的自交优良品系中观察到报告基因的有效瞬时表达(图5)。

实施例3：通过玉米A188未成熟雄穗的瞬时基因枪转化和直接分生组织再生进行的有效基因组编辑.

图8A示出了从28日龄A188幼苗新鲜分离的未成熟雄穗，其如实施例1所述制备并如实施例2所详述进行轰击。

构建体pGEP837含有CRISPR核酸酶MAD7的表达盒(图4)，而pGEP842含有靶向玉米内源性HMG13基因的CRISPR sgRNA m7GEP1的表达盒(图6)。构建体pABM-BdEF1_ZmPLT5包含玉米再生加强基因PLT5表达盒(图7)。

使用亚精胺钙方法，将200ng的质粒DNA pGEP837、300ng的质粒DNApGEP842和100ng的pABM-BdEF1_ZmPLT5共同涂覆到100μg的0.4μm金粒子上，并且在1,350psi破裂压力下通过粒子轰击将三种构建体共同递送到A188未成熟雄穗的细胞中(图8A)，每个样品板轰击射击4次。在轰击后，将轰击的A188未成熟雄穗在渗透IM_OS平板上再保持20小时。可展示如图8B所示的报告基因的有效瞬时表达。

A：玉米未成熟雄穗直接分生组织再生

轰击后20小时，使A188未成熟雄穗经受直接分生组织再生，其包括以下步骤：

步骤I：用锋利的刀片将轰击的未成熟雄穗分枝切成3-5mm长的区段，并将它们以12片/平板的密度置于IMSMK5培养基培养皿平板(25×100mm)上。用医用胶带密封平板，并且在27℃于暗处培养2天，然后转移平板，并在25℃于弱光(10～50μmol m^-2s^-1，逐渐增加光强度)，16/8h光/暗循环下培养共14天(图8C)。

步骤II：除去发育的苞片或叶，将来自步骤I的分生组织幼芽分离成直径为2-5mm的小片，并将分生组织幼芽转移到新鲜的IMSMK5培养基上。用医用胶带密封平板，并且在25℃、光照(～100μmol m^-2s^-1)、16/8h光/暗循环下培养2周(图8D)。

步骤III：从步骤II中分离出发育的幼芽，并将幼芽转移到生芽培养基培养皿(25×100mm)上。用医用胶带密封平板，并且在25℃、光照(～100μmol m^-2s^-1)下培养2周(图8E)。

步骤IV：将步骤III的发育的芽移取到植物托盘中的生根培养基上，并在25℃、光照(～100μmol m^-2s^-1)下培养1周(图8F)。

在再生步骤IV一周后，再生的小植株(图8F)已准备好进行叶片取样以用于分子分析，或转移到土壤中以进行T₀植物生长和T₁种子生产。

未成熟雄穗的直接分生组织再生的工作流程汇总于表1中：

表1.经由直接分生组织再生从玉米未成熟雄穗生成SDN-1的工艺流程.

	培养基	培养条件	持续时间
				步骤I：SM诱导	IMSMK5	27℃，暗处	2周
步骤II：SM发育	IMSMK5	25℃，光照	2周
				步骤III：生芽	生芽培养基	25℃，光照	2周
步骤III：生根	生根培养基	25℃，光照	1周

总之，在CRISPR构建体的基因枪转化后，从28日龄A188未成熟雄穗再生72个T₀小植株(图8A)。结果汇总于表2中：

表2.通过直接分生组织再生从28日龄A188未成熟雄穗再生的T0小植株中的SDN-1效率.

使用Sanger测序结合序列跟踪分解分析对SDN-1编辑的分子筛选鉴定了来自72个T₀植物的12个双等位基因和1个单等位基因SDN-1事件，这给出了18％ SDN-1效率(表2)。T₀植物中双等位基因SDN-1(图9A)或单等位基因SDN-1事件的代表性测序结果示于图9B中。这些结果展示，本发明中通过瞬时粒子轰击和作为优选未成熟雄穗的一部分的细胞的直接分生组织再生的方法是高度有效和高效的；最重要的是，该方法能够在玉米A188中实现单细胞起源的再生和同质基因组编辑而无需常规选择(例如使用抗生素或除草剂抗性基因)。

实施例4：来自玉米A188未成熟雄穗的瞬时基因枪转化和直接分生组织再生的基因组编辑事件是完全可遗传的。

将来自实施例3的四个编辑的T₀小植株转移到土壤中，并通过自交或回交到WTA188产生T₁种子。将成熟的T1种子在水中浸泡约24小时，并从T1种子分离T1胚用于单独的DNA提取。通过Taqman实时PCR分析T1后代的SDN-1分离。结果示于下表3中。来自所有测试品系的T1后代中的SDN-1分离比与遗传单位的孟德尔分离定律的预期完全匹配，因此通过使用本发明的方法生成的SDN-1修饰事件是完全可遗传的(表3)。这些结果也支持该方法能够在玉米A188中实现单细胞起源的再生和同质基因组编辑，而无需常规选择。

表3：通过直接分生组织再生从源于28日龄A188未成熟雄穗的4个T0品系的T1后代中的SDN-1分离比.

T<sub>0</sub>编辑的事件	T<sub>0</sub>的SDN-1	杂交	T<sub>1</sub>的SDN-1比(WT:单-：双-)
				xxx-T-0012	双等位基因	自交	0:0:9
xxx-T-0013	双等位基因	回交至WT	0:5:0
				xxx-T-0014	单等位基因	自交	1:3:2
xxx-T-0017	双等位基因	自交	0:0:5

实施例5：经由玉米优良品种的未成熟穗轰击和直接分生组织再生进行基因组编辑SDN-1.

种植后39天，收获三株V8阶段的优良品种4V-40171玉米幼苗用于未成熟穗分离。关于植物未成熟花序的信息，参见实施例1。

从三株幼苗中分离出11个未成熟穗，所述未成熟穗由成对成排的穗小穗组成。花苞原基发育不全，并且花序分生组织开放(图10)。

在轰击前将未成熟穗在IM_OSM培养基中渗透处理4小时(图10B)。对于每次轰击，使用亚精胺钙方法，将200ng的质粒DNApGEP837、300ng的质粒DNA pGEP842和100ng的pABM-BdEF1_ZmPLT5共同涂覆到100μg的0.4μm金粒子上，并且在1,350psi破裂压力下通过粒子轰击将三种构建体共同递送到玉米4V-40171未成熟穗的细胞中，每个样品板轰击射击4次。在IM_OSM平板上轰击后渗透处理20小时后，使轰击的未成熟穗经受直接分生组织再生程序。关于未成熟穗的粒子轰击和直接分生组织再生的详细信息，参见实施例3。

从11个轰击的玉米优良品种4V-40171的未成熟穗再生154个小植株，这展示了使用本发明方法的玉米优良品种的未成熟穗的高再生能力。在植物托盘中的生根培养基中发育1周后，从154个T₀小植株的每片叶上采集5-10mm的叶端以用于DNA提取。使用TaqManDigital Droplet PCR筛选再生的T₀植物中的基因组编辑SDN-1。鉴定了五个具有显著SDN-1修饰的T₀植物。典型的Taqman ddPCR结果如下表4所示。这些结果指示，通过瞬时粒子轰击和作为优选未成熟穗的一部分的细胞的直接分生组织再生，玉米自交优良品系中的直接再生和基因组编辑是可能的。

表.4：经由ddPCR分析从源于4V-40171未成熟穗的154个再生T0小植株鉴定出的阳性SDN-1事件.

与实施例3中从玉米A188获得的结果相比，优良品种T0植物中的高度嵌合SDN-1修饰也表明，优良品种细胞中的有丝分裂活性可能显著低于来自A188细胞的那些(A188是高度再生的玉米基因型)。

实施例6：采用再生加强剂，通过玉米A188未成熟雄穗的瞬时基因枪转化和间接愈伤组织再生进行有效基因组编辑.

关于未成熟雄穗制备和粒子轰击的信息，参见实施例1、2和3。

收获V7阶段的两个A188未成熟雄穗，并在轰击前在两个N6_OSM平板(每平板一个雄穗)中渗透处理4小时。构建体pABM-BdEF1_KWS_RBP4和pABM-BdEF1_KWS_RBP5分别含有玉米再生加强基因KWS_RBP4(图11)和KWS_RBP5表达盒(图12)。对于每次轰击，使用亚精胺钙方法，将200ng的质粒DNA pGEP837和300ng的质粒DNA pGEP842，以及各100ng的pABM-BdEF1_ZmPLT5加上pABM-BdEF1_KWS_RBP4或pABM-BdEF1_KWS_RBP5共同涂覆到100μg的0.4μm金粒子上，并在1,350psi破裂压力下通过粒子轰击将四种构建体共同递送到A188未成熟雄穗细胞中，每个样品板轰击射击4次。在N6_OSM平板上轰击后渗透处理20小时后，使轰击的未成熟穗经受间接愈伤组织再生程序，其包括以下步骤：

步骤I——胚性愈伤组织诱导：用锋利的刀片将轰击的未成熟雄穗切成3-6mm长的区段，并将其置于在培养皿平板(25×100mm)中的愈伤组织诱导培养基N6_5Ag上。用医用胶带密封平板，并在27℃于暗处培养3周。

步骤II——芽发育和长出：将来自步骤I的发育的胚性愈伤组织分离成直径为2-5mm的小片，并将愈伤组织转移到生芽培养基培养皿平板(25×100mm)上。用医用胶带密封平板，并在25℃光照(20-100μmol m^-2s^-1，逐渐增加光强度)下培养18天。

步骤III——根长出：将步骤III的发育的芽移取到植物托盘的生根培养基上，并在25℃光照(100μmol m^-2s^-1)下培养约7天。

间接愈伤组织再生的工作流程展示于图13中且汇总于表5中。

表5：经由间接愈伤组织再生从玉米未成熟雄穗生成SDN-1的工作流程.

	培养基	培养条件	持续时间
				步骤I：愈伤组织诱导	N6_5Ag/IMCIM2*	27℃，暗处	3周
步骤II：生芽	生芽培养基	25℃，光照	2-3周
				步骤III：生根	生根培养基	25℃，光照	1周

在再生步骤III一周后，再生的小植株已准备好进行叶片取样以用于分子分析，或转移到土壤中以进行T₁种子生产。关于取样分子分析的信息，参见实施例3、4和5。

接下来，从采用加强ZmPLT5和KWS_RBP4构建体共同轰击的未成熟雄穗中再生五十八(58)个小植株。通过Sanger测序和跟踪分解分析，针对SDN-1编辑筛选出58个再生植物中的42个，并且从42个筛选的T₀植物中鉴定出总共21个SDN-1事件，从该A188未成熟雄穗中得到50％的SDN-1效率。

从采用加强ZmPLT5和KWS_RBP5共同轰击的A188未成熟雄穗中，再生出80小植株。通过Sanger测序和跟踪分解分析，针对SDN-1筛选出80个T₀植物中的34个。结果显示，34个测试的T₀植物中有30个植物在靶位点具有双等位基因SDN-1编辑，得到88％ SDN-1效率。结果汇总于表6中，来自34个测试植物的Sanger测序和跟踪分解分析结果揭示于表7中，其中在靶侧具有野生型序列的四个T₀植物以粗体突出显示。

表6：采用加强剂，经由间接愈伤组织再生从28日龄A188未成熟雄穗再生的T0小植株中的SDN-1效率.

表7：采用加强剂ZmPLT5和KWS_RBP5通过间接愈伤组织再生从28日龄A188未成熟雄穗再生的34个T0小植株中的基因组编辑事件的Sanger测序跟踪分解分析.

这些结果还展示，通过瞬时粒子轰击和作为优选未成熟雄穗的一部分的细胞的间接愈伤组织再生的本发明方法是高度有效和高效的，并且该方法能够在玉米A188中实现单细胞起源的再生和同质基因组编辑而无需常规选择。

实施例7：采用再生加强剂，通过玉米优良品种未成熟雄穗的瞬时基因枪转化和间接愈伤组织再生进行有效基因组编辑.

使用本发明的方法，经由瞬时粒子轰击和作为优选不成熟雄穗的一部分的细胞的间接愈伤组织再生，测试了五种改良自交优良品系(包括最重要的花粉供体和雌性自交系)的再生和基因组编辑。为此，在种植后27-30天的V7阶段，收获优良品种幼苗用于未成熟雄穗分离。

在轰击前将未成熟雄穗在N6_OSM培养基中渗透处理4小时。构建体pABM-BdEF1_KWS_RBP8含有再生KWS_RBP8表达盒(图14)。对于每次轰击，使用亚精胺钙方法将两种基因组编辑构建体(200ng的质粒pGEP837和300ng的质粒DNA pGEP842)与两种再生加强构建体(各100ng的pABM-BdEF1_ZmPLT5和pABM-BdEF1_KWS_RBP8)共同涂覆到100μg的0.6μm金粒子上。在1,100psi破裂压力下通过粒子轰击，将四种涂覆的构建体共同递送到玉米优良品种未成熟雄穗中，每个样品板轰击射击4次。关于轰击的更多信息见实施例2。在N6_OSM平板上轰击后渗透处理20小时后，用锋利的刀片将轰击的未成熟雄穗切成3-6mm长的区段，并放置到愈伤组织诱导培养基IMCIM2培养皿平板(25×100mm)上。用医用胶带密封平板，并在27℃于暗处培养3周。对于间接愈伤组织再生程序中的以下步骤，参见实施例6。

在植物托盘中的生根培养基中发育一周后，从再生小植株的每片叶上采集5-10mm的叶端以用于DNA提取。使用TaqMan Digital Droplet PCR筛选再生的T₀植物中的基因组编辑SDN-1。

来自测试优良品种的再生率和基因组编辑SDN-1效率的结果呈现于表8中。与A188相比，所有优良品种都具有显著较低的再生性，然而，使用本发明的方法的所有受测试优良品种实际上都是再生性的。这些结果指示了通过使用本发明的方法进行基因型非依赖性再生和基因组编辑的可能性；最重要的是，经由瞬时粒子轰击和间接愈伤组织再生的方法能够直接在玉米优良品种中实现单细胞起源的再生和同质基因组编辑而无需常规选择(例如使用抗生素或除草剂抗性基因)。

表8：采用加强剂ZmPLT5和KWS_RBP8，通过间接愈伤组织再生从最重要玉米优良品种的29日龄未成熟雄穗再生的T0小植株中的SDN-1效率.

实施例8：采用再生加强剂RBP8，通过玉米杂交体未成熟雄穗的瞬时基因枪转化和间接愈伤组织再生进行有效基因组编辑.

用本发明的方法通过瞬时粒子轰击和作为优选未成熟雄穗的一部分的细胞的间接愈伤组织再生来测试来自A188与优良品种4V-40171之间的互交杂交的F1杂交体。在种植后28-29天的V7阶段，收获F1幼苗用于未成熟雄穗分离。

在轰击前将未成熟雄穗在N6_OSM培养基中渗透处理4小时。基因组编辑构建体pGEP1067含有靶向玉米内源性基因HMG13的sgRNA m7GEP22表达盒(图15)。对于每次轰击，使用亚精胺钙方法将两种基因组编辑构建体(200ng的质粒pGEP837和300ng的质粒DNApGEP1067)与100ng的再生加强构建体pABM-BdEF1_KWS_RBP8共同涂覆到100μg的0.6μm金粒子上。关于轰击的更多信息，参见实施例2和实施例7。在N6_OSM平板上轰击后渗透处理20小时后，使轰击的未成熟雄穗经受间接愈伤组织再生，如实施例6和实施例7所述。

在植物托盘中的生根培养基中发育一周后，从再生小植株的每片叶上采集5-10mm的叶端以用于DNA提取。使用TaqMan Digital Droplet PCR，筛选再生T₀植物中的基因组编辑SDN-1，并通过使用基因型特异性引物(例如，特异性扩增A188-或优良品种-特异性等位基因)的Sanger测序进一步证实，以检测基因型特异性等位基因中的SDN-1。

来自杂交体的再生率和基因组编辑SDN-1效率示于表9中。

表9：采用加强剂KWS_RBP8通过间接愈伤组织再生的来自玉米F1杂交体的29日龄未成熟雄穗的再生T0小植株的靶pGEP22(参见图14)处的基因组编辑SDN-1.

与来自A188和优良品种的再生率相比，杂交体示出介于它们之间的再生能力，即比A188更低的再生，但比优良品种更高的再生。令人感兴趣地，来自源于与作为雌性的A188杂交的F1幼苗(A188×4V-40171)的不成熟雄穗比来自与作为雌性的优良品种杂交的不成熟雄穗具有显著更高的再生性。这些结果表明母本对植物再生的影响。

使用基因型特异性引物的Sanger测序提供了区分等位基因特异性SDN-1事件的有效手段。表10中所示的结果暗示基因组编辑对于靶位点处的等位基因偏好可能不具偏性，并且可能是等位基因基因型非依赖性的。植物再生可能是顽拗型优良品种中植物基因组修饰的瓶颈(表10)。

表10：经由SDN-1的ddPCR和Sanger测序分析鉴定，采用加强剂KWS_RBP8通过间接愈伤组织再生的来自玉米F1杂交体的未成熟雄穗再生的T0小植株中单细胞起源的SDN-1事件。

使用Digital Droplet PCR和Sanger测序以及基因型特异性等位基因引物的分子分析提供了支持本发明方法能够在玉米中实现单细胞起源的再生和同质基因组编辑而无需常规选择的实证。

实施例9：采用再生加强剂经由玉米优良品种和杂交体的未成熟雄穗的粒子轰击和间接再生的稳定转化.

构建体pGEP1054含有荧光tdTomato基因表达盒(图16)，用于监测转化而无需常规选择。在种植后28-30天的V7阶段，收获幼苗用于未成熟雄穗分离。关于未成熟雄穗制备的信息，同样参见实施例1。

在轰击前将未成熟雄穗在N6_OSM培养基中渗透处理4小时。对于每次轰击，使用亚精胺钙方法将200ng的质粒DNA pGEP1054和100ng的质粒DNA pABM-BdEF1_KWS_RBP8共同涂覆到100μg的0.6μm金粒子上。关于轰击的更多信息，参见实施例2、实施例6和实施例7。

在N6_OSM平板上轰击后渗透处理20小时后，使轰击的未成熟雄穗在27℃于暗处经受愈伤组织诱导3周(参见实施例6和实施例7)。愈伤组织诱导3周后，在荧光显微镜下检查诱导的愈伤组织的tDTomato荧光信号。tDTomato荧光愈伤组织指示出tDTomato基因的外源DNA整合和稳定转化。记录示出tDTomato荧光信号的愈伤组织数量，并且结果总结汇总于表11中。示出再生结构中荧光报告基因tDTomato的稳定转化的一些代表性图像示于图17中。

这些结果展示了基因型非依赖性稳定转化的可行性，其经由粒子轰击和作为优选不成熟雄穗的一部分的细胞的再生，而无需常规选择。

表11：采用再生经由玉米优良品种和杂交体的未成熟雄穗的粒子轰击和间接再生的稳定转化.

基因型	雄穗数量	稳定tDT事件数量	稳定tDT事件/雄穗
				PJ0-73631	5	9	1.8/雄穗
WS5-33063	8	7	0.875/雄穗
				MMS18-01495	5	4	0.8/雄穗
F1，4V-40171×A188	12	9	0.75/雄穗

实施例10：来自小麦(普通小麦)栽培品种Taifun的未成熟花序的基因枪转化。

小麦植物栽培

小麦(普通小麦)栽培品种Taifun在生长室中生长。将两粒小麦Taifun种子播种到深插穴盆中(置于无孔的18-计数保持托盘中)。发芽后，每盆仅保存一株幼苗。

使用的土壤是Berger 35％ Bark。使种子发芽并在恒定的20℃至21℃的生长室中生长，光强度为400-600μmol m^-2s^-1，并且从9月至4月的日长为14小时，从5月至8月的日长为16小时。湿度为40％-60％。用Jack的15-16-17无土栽培配方以E.C.的1.0+E.C.水对小麦植物每周施肥三次。每天两次检查植物的浇水需求，并根据需要从顶部浇水。

小麦未成熟花序(穗状花序)分离

用Zeiss立体显微镜测定小麦未成熟花序的发育阶段。当第一茎节可见时，小麦植物的花序被定义处于DR(双棱/小穗分生组织阶段)阶段。约1周后，第二节通常发生，小花分生组织发育开始，并且植物然后处于FM(小花分生组织)阶段。再过5-7天后，第三个茎节间开始伸长，并且花药原基变得可见，并且植物然后处于AM(花药原基)阶段并准备进入孕穗阶段。

在晚期双棱(DR)至晚期花药分生组织(AM)的发育阶段的小麦未成熟花序用于本发明的方法。在这些阶段，小麦芽伸长，具有1-3个可见的节。

小麦未成熟花序的分离包括以下步骤：

1.从茎秆基部(接近土壤)收获处于正确发育阶段的小麦芽，并除去所有叶片；

2.(可选的)用自来水冲洗茎段，并用纸巾擦干；

3.用70％乙醇对芽进行表面喷洒，并在层流罩内手动除去茎秆上的第一叶鞘；

4.重复步骤3，并小心地从茎秆上从底部到顶部逐个除去每个叶鞘，直至旗叶鞘；

5.修剪茎秆段并用70％乙醇喷洒(最后一次乙醇喷洒)；

6.将各段转移到罩内的透明培养皿上；

7.在解剖显微镜下：小心地除去旗叶鞘和所有未成熟的苞片，用于提供未成熟花序/穗状花序准备好进行转化。

微粒子轰击

将新鲜分离的小麦未成熟穗状花序在N6OSM培养基中渗透处理2-4小时，如同样在实施例2中所详述。三种质粒共同轰击，它们是：构建体GEMT121(SEQ ID NO:50)，其含有荧光报告基因tDTomato和CRISPR核酸酶LbCpf1的表达盒(图18)；GEMT099(SEQ ID NO:51)，其含有靶向小麦CPL3(C末端结构域磷酸酶样3)基因的CRISPR sgRNA crGEP289的表达盒(图19)；以及构建体pABM-BdEF1_KWS_RBP8(SEQ ID NO:42)，其包含加强基因KWS_RBP8表达盒(图14)。具体地，使用亚精胺钙方法，将200ng的质粒DNA GEMT121、300ng的质粒DNAGEMT099和100ng的pABM-BdEF1_KWS_RBP8共同涂覆到100μg的0.6μm金粒子上，并且在900psi破裂压力下通过粒子轰击将三种构建体共同递送到小麦未成熟花序分生组织的细胞中。小麦Taifun未成熟花序的两行穗状花序垂直排列，一行侧插到渗透性N6OSM培养基上。每个样品板总共进行六次轰击射击(穗状花序的每行侧射击3次)。轰击后，将小麦Taifun未成熟穗状花序在渗透性N6OSM平板上再保持平放16-20小时，然后将轰击的穗状花序切成2-5mm区段并转移到间接愈伤组织再生培养基(例如N6_5Ag)上，用于在27℃于暗处愈伤组织诱导3周。对于细节，参见实施例6、实施例7和实施例9。

通过在轰击后16-20小时在显微镜下观察荧光tDTomato表达来监测基因枪转化效率。如图20B所示，展示了来自小麦未成熟穗状花序的细胞中tDTomato的有效转化。

在荧光显微镜下，沿着愈伤组织诱导过程来监测轰击的未成熟穗状花序中的tDTomato荧光信号。在轰击后3天，出现了来自轰击的小穗生长尖端的强而恒定的tDTomato荧光信号，指示tDTomato基因的稳定转化。代表性结果示于图20C中。tDTomato荧光生长结构的数量示于图20D中。

这些结果展示了本方法用于小麦中快速和有效的基因组修饰的可行性。

实施例11：通过小麦未成熟穗状花序的瞬时基因枪转化和间接愈伤组织再生进行有效基因组编辑.

在N6_OSM平板上轰击后渗透处理16-20小时后，使轰击的小麦未成熟雄穗经受间接愈伤组织再生，如实施例6和实施例7所详述。

在植物托盘中的生根培养基中发育一周后，从再生小植株的每片叶上采集5-10mm的叶端以用于DNA提取。使用TaqMan Digital Droplet PCR筛选再生的T₀小麦植物中的基因组编辑SDN-1，并且通过Sanger测序进一步证实。

实施例12：来自向日葵(Helianthus annuus)栽培品种velvet Queen的未成熟花序的基因枪转化.

向日葵植物栽培：

向日葵(Helianthus annuus)栽培品种velvet Queen在生长室中生长。将两粒向日葵velvet Queen种子播种到深插穴盆中(置于无孔的18-计数保持托盘中)。发芽后，每盆仅保存一株幼苗。

使用的土壤是MetroMix360/Turface 3:1共混物。使种子发芽并在生长室中白天25℃和夜晚22℃，400-600μmol m^-2s^-1的光强度和14小时日长，50％湿度下生长。在每次浇水时使用稀释至150ppm氮的Jack的15-5-15Ca-Mg对向日葵植物施肥。根据需要给植物浇水。

向日葵发育阶段：

1.营养性出苗(VE)：出苗，越过子叶的第一叶长度小于4cm。

2.营养阶段(V)：这些通过从V-1、V-2、V-3、V-4等开始计数长度至少4cm的真叶数来确定。

3.生殖阶段1(R1)：顶芽形成小种花头状花序而非叶簇。当从正上方观察时，未成熟苞片形成多角星样外观。

4.生殖阶段2(R2)：未成熟幼芽在与茎相连的最接近的叶上方伸长0.5至2.0cm。

5.生殖阶段3(R3)：未成熟幼芽在最接近的叶上方伸长超过2.0cm。

6.生殖阶段4(R4)：花序开始打开。当从正上方观察时，未成熟边花是可见的。向日 葵未成熟花序(头状花序)分离：

使用来自R1阶段植物的向日葵未成熟花序头(图21A)。当在上述生长条件下培养时，对于不同基因型，在播种后最可能需要约30-45天达到这些阶段。向日葵未成熟花序头分离通常包括以下步骤：

1.在R1阶段，通过切割相连的最接近叶上方的茎，从向日葵植物收获花序头；

2.(可选的)用自来水冲洗茎秆段，并用纸巾擦干；

3.用70％乙醇对茎秆段进行表面喷洒，并手动除去叶；

4.修剪茎头，小心地除去所有剩余的幼叶并用70％乙醇对它们进行喷洒。

5.将头状花序转移到层流罩内的透明培养皿上；

6.在解剖显微镜下，小心地除去所有苞片以暴露出未成熟花序头，使得未成熟雄穗准备好进行转化(图21B)。

对于轰击方法和荧光观察及成像，请参见实施例2和实施例10。

实施例13：培养基

对于以上实施例，使用以下培养基。如本领域技术人员所知，可以取决于待处理的靶细胞或组织并取决于选择标准对培养基组成进行改变。对于待处理和/或栽培的给定植物、细胞、组织、或器官，本领域可获得多种合适的培养基。

IM_OS：MS盐；LS维生素；1x FeEDTA；100mg/L酪蛋白；0.5mg/L激动素；30g/L蔗糖、36.4g/L的甘露醇、36.4g/L的山梨醇；7g/L的Gelzan；pH:5.8。

N6OSM：N6盐和维生素、100mg/L的酪蛋白、0.7g/L的L-脯氨酸、0.2M甘露醇(36.4g/L)、0.2M山梨醇(36.4g/L)、20g/L蔗糖、15g/L的细菌培养用琼脂，pH 5.8。

IMSMK5：1x MS盐、1x KM维生素、1x FeEDTA、1.25mg/L CuSO₄.5H₂O、1.0g/L的KNO₃、2.0mg/L麦草畏、3.0mg/L BAP、0.5mg/L激动素、0.5g/L的MES、3％蔗糖、3g/L Gelzan，pH：5.8。

IMCIM2：MS盐、LS维生素、1.0g/L的脯氨酸、5mg/L麦草畏、1.0mg/L 2,4D、0.2mg/L的BAP、0.5mg/L激动素、1.0g/L的KNO₃、2.0mg/L的AgNO₃、3％蔗糖、3g/L水晶洋菜，pH：5.8。

N6_5Ag：N6盐和维生素、1.0mg/L的2,4-D、100mg/L的酪蛋白、2.9g/L的L-脯氨酸、20g/L蔗糖、5g/L的葡萄糖、5mg/L的AgNO₃、8g/L的细菌培养用琼脂，pH5.8。

生芽培养基：1x MS盐、1x LS维生素，1x FeEDTA、2.5mg/L CuSO₄.5H₂O、100mg/L肌醇六磷酸、5mg/L玉米素、0.5g/L MES、20g/L蔗糖、3g/L Gelzan，pH：5.8。

生根培养基：1x MS盐、LS维生素、1x FeEDTA、0.5mg/L MES、0.5mg/L IBA、1.25mg/L的CuSO₄、20g/L蔗糖、3g/L Gelzan。

实施例14：来自玉米A188中未成熟雄穗中心穗状花序的横切面盘的有效植物再生.

雄穗花序由对称的多排中心轴(中心穗状花序)和几个不对称的两列分枝(分枝雄穗)组成(图3A)。与雄穗分枝相比，中心穗状花序相对较大，并且是雄穗花序的主要部分。然而，由于其圆柱形状，在雄穗中心穗状花序的基因枪轰击中获得金粒子的均匀分布也相对具有挑战性。为了更好地充当基因枪转化的外植体，可将雄穗中心穗状花序进一步横切成薄盘用于植物转化和再生以提高利用效率。

对于一些玉米优良品种，特别重要的是叶腋分枝的起始和发育明显在中心穗状花序之后，使得因此未成熟雄穗在收获时几乎仅由中心穗状花序组成。使用未成熟中心穗状花序的横切面盘是这种玉米基因型的有效解决方案。

关于未成熟雄穗制备的信息，参见实施例1A和1B。分离后，在无菌条件下，将中心雄穗铺在培养皿中经1X N6缓冲液饱和的Whitman滤纸上，用锋利的刀片快速横切成约0.5mm深的薄盘，并立即转移到渗透培养基平板(N6OSM)上进行4小时的预轰击渗透处理。

关于基因枪轰击和间接愈伤组织再生的信息，分别参见实施例2和6。具体地，使用亚精胺钙方法，将100ng的质粒pGEP1054(含有荧光报告基因tDTomato表达盒，图16)和100ng的含有再生加强基因KWS_RBP2表达盒的pABM-BdEF1_KWS_RBP2(图22)共同涂覆到100μg的0.6μm金粒子上。关于轰击的更多信息，参见实施例2。在N6OSM平板上轰击后渗透处理18小时后，使轰击的未成熟雄穗经受间接愈伤组织再生，如实施例6和7中所述。

图23示出了代表性实验，其中将两个中心雄穗横切成～0.5mm圆盘(图23A)，并从中再生出86个植物。值得注意的是，tDTomato荧光信号主要来源于与小穗对分生组织(SPM)环并置的圆盘的外环(图23B)。该结果表明分生组织细胞适合于基因枪轰击。

实施例15：经由共同轰击和间接愈伤组织再生A188未成熟雄穗的高效多重基因组编辑.

关于未成熟雄穗制备和粒子轰击的信息，参见实施例1和2。具体地，共同轰击由如下7种质粒组成：

-100ng的含有CRISPR核酸酶MAD7核酸酶表达盒的基因组编辑构建体pGEP1054(图16)

-各150ng的五种指导RNA构建体，它们编码五种CRISPR指导RNA表达盒并且靶向至注释为UV-B非敏感性4样基因的玉米靶基因中的五个位置(图29A)。

οTGCD087(图24)，编码靶1指导RNA

οTGCD088(图25)，编码靶2指导RNA

οTGCD089(图26)，编码靶5指导RNA

οTGCD090(图27)，编码靶4指导RNA

οTGCG091(图28)，编码靶3指导RNA

-100ng的含有再生加强基因KWS_RBP2表达盒的pABM-BdEF1_KWS_RBP2。

对于每次轰击，使用亚精胺钙方法将七种以上所提及的质粒(pGEP1054、TGCG087至TGCD091和pABM-BdEF1_KWS_RBP2)共同涂覆到100μg的0.6μm金粒子上。关于轰击的更多信息，参见实施例2。在N6OSM平板上轰击后渗透处理18小时后，使轰击的未成熟雄穗经受间接愈伤组织再生，如实施例6和7中所述。

再生140T0植物。在植物托盘中的生根培养基中发育一周后，从再生植物的每片叶上采集5-10mm叶端以用于DNA提取。通过Sanger测序和测序跟踪分解分析筛选再生的T0植物中的基因组编辑SDN-1。来自T0再生的A188植物的玉米靶基因中的多重基因组编辑SDN-1效率汇总于图29B中。14.3％的T0植物在所有五个靶序列处具有双等位基因SDN-1修饰。这些结果进一步展示，通过瞬时基因枪共同轰击和作为优选不成熟雄穗的一部分的细胞的间接愈伤组织再生的本发明方法是高度有效和高效的，并且该方法能够同时在多个位置中实现高效的基因组编辑。

Claims (24)

1.一种用于植物基因组修饰，优选用于至少一个基因组靶序列的靶向修饰，以获得至少一个植物未成熟花序分生组织细胞的修饰的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(a)提供至少一个未成熟花序分生组织细胞；

(b)将以下引入到所述至少一个未成熟花序分生组织细胞中：

(i)至少一种基因组修饰系统，优选基因组编辑系统，其包含至少一种位点定向的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶，优选核酸引导的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶、或编码其的序列，以及任选存在的至少一种引导分子或编码其的序列；

(ii)任选存在的：至少一种再生加强剂或编码其的序列或再生加强剂化学物质，其中步骤(i)和(ii)同时或相继发生，以促进植物细胞增殖和/或协助至少一个基因组靶序列的靶向修饰；

(iii)以及任选存在的至少一种修复模板或编码其的序列；以及

(c)在允许表达和/或组装所述至少一种基因组修饰系统，优选所述至少一种基因组编辑系统以及任选存在的所述至少一种再生加强剂，以及任选存在的所述至少一种引导分子和/或任选存在的所述至少一种修复模板的条件下，培养所述至少一个未成熟花序分生细胞；以及

(d)获得至少一个经修饰的未成熟花序分生组织细胞；或

(e)获得从所述至少一个经修饰的细胞再生的至少一种植物组织、器官、植物或种子；以及

(f)任选地：在携带期望的靶向修饰的T0和/或T1代中筛选从所述至少一个经修饰的细胞再生的至少一种植物组织、器官、植物或种子。

2.权利要求1的方法，其中所述方法包括再生步骤(e)，并且其中所述再生是直接分生组织器官发生，或间接愈伤组织胚发生或器官发生。

3.权利要求1或2的方法，其中所述再生加强剂包含至少一种RBP或编码所述RBP的RBG序列，其中RBP序列中的至少一种单独地选自SEQ ID NO:13或15至19中的任一项、或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或其催化活性片段，或其中所述RBP由至少一种RBG序列编码，其中RBP序列中的至少一种单独地选自SEQ ID NO:2或4至8中的任一项、或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列、或同源密码子优化序列。

4.权利要求1或2的方法，其中所述再生加强剂包含至少一种RBP和至少一种PLT编码序列，其中RBP和PLT再生加强剂序列单独地选自SEQ ID NO:12至22中的任一项、或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，或其催化活性片段，或其中所述至少一种再生加强剂序列由以下各项编码：单独地选自SEQ ID NO:1至11中任一项的序列、或与其具有至少66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，条件是所述序列编码根据SEQ IDNO:12至22的相应的再生加强剂或其催化活性片段。

5.权利要求3或4的方法，其中引入至少一种进一步的再生加强剂，其中所述进一步的再生加强剂或编码其的序列选自BBM、WUS、WOX、RKD、GRF、LEC或它们的变体。

6.权利要求5的方法，其中所述再生加强剂包含至少一种第一RBG或PLT序列或编码其的序列，优选至少一种RBG序列或编码其的序列，并且其中所述再生加强剂进一步包含以下作为不同于所述第一再生加强剂的至少一种第二再生加强剂，或编码其的序列：

(i)至少一种进一步的RBG和/或PLT序列、或编码其的序列、或其变体，和/或

(ii)至少一种BBM序列、或编码其的序列、或其变体，和/或

(iii)至少一种WOX序列，包括WUS1、WUS2或WOX5，或编码其的序列、或其变体，和/或

(iv)至少一种RKD序列，包括小麦RKD4，或编码其的序列、或其变体，和/或

(v)至少一种GRF序列，包括玉米(Zea mays)GRF5，或编码其的序列、或其变体，和/或

(vi)至少一种LEC序列，包括LEC1和LEC2，或编码其的序列、或其变体。

7.前述权利要求中任一项的方法，其中通过由基因枪轰击介导的转化或转染、农杆菌(Agrobacterium)介导的转化、微粒或纳米颗粒递送，或通过化学转染，或它们的组合，将所述至少一种基因组修饰系统，优选所述至少一种基因组编辑系统，以及任选存在的所述至少一种再生加强剂或编码其的序列引入细胞中，优选其中通过基因枪轰击引入所述至少一种基因组修饰系统，优选所述至少一种基因组编辑系统，以及任选存在的所述至少一种再生加强剂，优选其中所述基因枪轰击包括在轰击之前和/或之后的渗透处理步骤，或其中权利要求1的步骤(a)中提供的所述至少一个未成熟花序分生组织细胞来源于穗状花序的横切面，特别是中心穗状花序的横切面。

8.前述权利要求中任一项的方法，其中至少一种位点定向的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶或编码其的序列被引入，并且选自CRISPR/Cas系统、锌指核酸酶系统、转录激活因子样核酸酶系统、或大范围核酸酶系统，或其任何组合、变体、或催化活性片段，所述CRISPR/Cas系统优选CRISPR/MAD7系统、CRISPR/Cfp1系统、CRISPR/MAD2系统、CRISPR/Cas9系统、CRISPR/CasX系统、CRISPR/CasY系统、CRISPR/Cas13系统、或CRISPR/Csm系统。

9.前述权利要求中任一项的方法，其中引入至少一种基因组编辑系统，其中所述至少一种基因组编辑系统进一步包含至少一种逆转录酶和/或至少一种胞苷或腺嘌呤脱氨酶，优选其中所述至少一种胞苷或腺嘌呤脱氨酶独立地选自载脂蛋白B mRNA编辑复合物(APOBEC)家族脱氨酶，优选大鼠来源的APOBEC、激活诱导的胞苷脱氨酶(AID)、ACF1/ASE脱氨酶、ADAT家族脱氨酶、ADAR2脱氨酶、或PmCDA1脱氨酶、TadA来源的脱氨酶和/或转座子、或编码上述至少一种酶的序列，或其任何组合、变体、或催化活性片段。

10.前述权利要求中任一项的方法，其中引入至少一种基因组编辑系统，其中所述至少一种基因组编辑系统包含至少一种修复模板，并且其中所述至少一种修复模板包含或编码双链和/或单链核酸序列。

11.权利要求10的方法，其中所述至少一种修复模板包含对称或不对称同源臂，和/或其中所述至少一种修复模板包含至少一种经化学修饰的碱基和/或骨架。

12.前述权利要求中任一项的方法，其中引入至少一种基因组编辑系统，其中瞬时地或稳定地或以其组合的方式引入所述至少一种基因组编辑系统、任选存在的所述至少一种再生加强剂以及任选存在的所述至少一种修复模板、或编码其的相应的序列。

13.一种通过前述权利要求中任一项的方法可获得或通过前述权利要求中任一项的方法获得的植物细胞、组织、器官、植物或种子。

14.权利要求13的植物细胞、组织、器官、植物或种子，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物。

15.权利要求13的植物细胞、组织、器官、植物或种子，其中所述植物是单子叶植物，优选来自禾本目(Poales)的植物，更优选来自禾本科(Poacea)的植物，并且最优选来自以下属的植物：剪股颖属(Agrostis)、银须草属(Aira)、山羊草属(Aegilops)、看麦娘属(Alopecurus)、喜砂草属(Ammophila)、黄花茅属(Anthoxanthum)、燕麦草属(Arrhenatherum)、燕麦属(Avena)、菵草属(Beckmannia)、短柄草属(Brachypodium)、无芒雀麦属(Bromus)、拂子茅属(Calamagrostis)、薏苡属(Coix)、蒲苇属(Cortaderia)、香茅属(Cymbopogon)、狗牙根属(Cynodon)、鸭茅属(Dactylis)、野青茅属(Deyeuxia)、曲芒发草属(Deschampsia)、披碱草属(Elymus)、偃麦草属(Elytrigia)、旱麦草属(Eremopyrum)、蜈蚣草属(Eremochloa)、羊茅属(Festuca)、水甜茅属(Glyceria)、异燕麦属(Helictotrichon)、大麦属(Hordeum)、绒毛草属(Holcus)、洽草属(Koeleria)、滨麦属(Leymus)、毒麦属(Lolium)、臭草属(Melica)、乱子草属(Muhlenbergia)、早熟禾属(Poa)、雀稗属(Paspalum)、棒头草属(Polypogon)、稻属(Oryza)、黍属(Panicum)、芦苇属(Phragmites)、Pryza、碱茅属(Puccinellia)、甘蔗属(Saccharum)、黑麦属(Secale)、Sesleria、狗尾草属(Setaria)、高粱属(Sorghum)、针茅属(Stipa)、钝叶草属(Stenotaphrum)、三毛草属(Trisetum)、小麦属(Triticum)、玉米属(Zea)、菰属(Zizania)或结缕草属(Zoysia)，或来自芸苔属(Brassica)的植物，包括花椰菜(Brassica oleracea var.botrytis L).和西兰花(Brassica oleracea var.italic)，或来自向日葵族(Heliantheae)或Betoideae的植物，包括向日葵属(Helianthus)或甜菜属(Beta)。

16.一种表达构建体集合，其包含

(i)编码基因组编辑系统的至少一种位点定向的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶的至少一种载体，优选其中所述基因组编辑系统如权利要求8或9中所定义，以及

(ii)任选存在的编码至少一种再生加强剂的至少一种载体，优选其中所述再生加强剂如权利要求3至6中所定义，以及

(iii)当基因组编辑系统的所述至少一种位点定向的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶是核酸引导的核酸酶时，任选存在的编码至少一种引导分子的至少一种载体，所述至少一种引导分子将所述至少一种核酸引导的核酸酶、切口酶或灭活核酸酶引导到至少一个感兴趣的基因组靶位点；以及

(iv)任选存在的编码至少一种修复模板的至少一种载体；

其中(i)、(ii)、(iii)和/或(iv)在相同的或不同的载体上编码。

17.权利要求16的表达构建体集合，其中所述集合进一步包含编码至少一种标记的载体。

18.一种编码再生加强剂多肽的分离的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自SEQ IDNO:1至8中任一项的序列、或与SEQ ID NO:1至8的相应的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的序列，条件是所述序列编码与相应的参比序列具有相同功能的再生加强剂，或编码包含选自SEQ IDNO:12至19中任一项的序列、或与SEQ ID NO:12至19的相应的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的序列的多肽的核酸序列，条件是所述序列具有如相应的参比序列的再生加强剂功能。

19.一种重组基因，其包含权利要求18的核酸序列。

20.权利要求19的重组基因，其中所述基因与驱动所述基因在感兴趣的植物细胞中的表达的启动子可操作地连接。

21.一种由如权利要求18所定义的分离的核酸序列编码的分离的再生加强剂多肽，其中所述多肽包含选自SEQ ID NO:12至19中任一项的序列、或与SEQ ID NO:12至19中的相应的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的序列，条件是所述序列具有如相应的参比序列的再生加强剂功能。

22.一种表达盒或表达构建体，其包含编码根据权利要求21的再生加强剂多肽的序列。

23.一种植物细胞，其包含权利要求16的表达构建体集合，或包含根据权利要求18的重组基因，或包含根据权利要求22的表达盒或表达构建体。

24.一种包含权利要求23的植物细胞的植物组织、器官、全植物、或其部分或种子。

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