CN105296492B

CN105296492B - 一种爪哇根结线虫效应基因Mj-1-1，相关蛋白及其应用

Info

Publication number: CN105296492B
Application number: CN201510719028.5A
Authority: CN
Inventors: 廖金铃; 扈丽丽; 卓侃; 林柏荣
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2015-10-28
Filing date: 2015-10-28
Publication date: 2018-11-27
Anticipated expiration: 2035-10-28
Also published as: CN105296492A

Abstract

本发明公开了一种爪哇根结线虫效应基因Mj‑1‑1，相关蛋白及应用。该效应基因Mj‑1‑1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示，其相关蛋白MJ‑1‑1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明证明了基因Mj‑1‑1在爪哇根结线虫的寄生中发挥重要作用，本发明还成功构建了RNAi植物表达载体，转化农杆菌EHA105后，通过烟草组织培养的方法将该载体转入植物，在植物中产生Mj‑ 1‑1的dsRNA，该植株能显著抑制根结线虫的寄生，获得了良好的抗根结线虫植物。本发明为根结线虫的防治提供了新靶标，对实践中培育抗根结线虫作物具有很好的理论和指导意义。

Description

一种爪哇根结线虫效应基因Mj-1-1，相关蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域。更具体地，涉及一种爪哇根结线虫效应基因Mj-1-1，相关蛋白及其应用。

背景技术

根结线虫是一类世界性分布的重要植物病原物，其寄生范围广，环境适应性强，几乎可以危害所有农作物。随着现代化农业的发展，根结线虫引起的农业危害损失不断增加。我国地处温带和亚热带,气候条件良好，适宜于根结线虫的活动和繁殖，世界性重要根结线虫病害在我国均有发生，而固着性内寄生的爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)是危害最严重的根结线虫种类之一。目前根结线虫的防治方法主要有轮作、化学防治和选用抗病品种，但是在实际生产中，由于轮作的局限性和化学防治给环境造成的巨大污染，以及抗线虫种质资源的缺乏，寻找高效的、可持续的根结线虫防治方法是目前植物寄生线虫研究领域的重点，依赖于分子生物学的抗线虫转基因工程也是目前植物线虫研究的热点。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种转录后的基因沉默现象，最早在秀丽小杆线虫中发现。RNAi技术通过dsRNA对特异性的靶标mRNA进行识别和降解，影响或抑制靶标基因的功能，从而对靶标基因所在生物的生长、发育和繁殖产生影响，有时甚至会产生致死作用。由于根结线虫专性寄生的特点，正向遗传学的研究方法在根结线虫中受到很大限制，RNAi作为一种反向遗传学技术，在根结线虫的研究中得到广泛的应用。利用RNAi的方法对根结线虫的特定基因进行沉默，可以抑制根结线虫的侵染、寄生和繁殖，从而减少根结线虫的危害。这为开发可持续性、高效的根结线虫防治方法提供了科学依据。

因此，通过农杆菌介导，应用传统的组织培养方法，可以获得稳定的、纯合的RNAi转基因抗线虫植株，而靶基因的选择至关重要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有爪哇根结线虫防治技术的不足，提供一种新的爪哇根结线虫效应基因Mj-1-1。

本发明的另一目的是提供上述效应基因Mj-1-1的相关蛋白MJ-1-1。

本发明的再一目的提供上述效应基因Mj-1-1在防治爪哇根结线虫中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种爪哇根结线虫效应基因Mj-1-1，其DNA全长核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(即Mj-1-1基因的全基因序列，包括5’端非编码区、3’端非编码区、内含子和外显子)；其编码区序列如SEQ ID NO.2所示(包括内含子和外显子)；其cDNA序列如SEQ ID NO.3所示(即编码序列，仅为外显子)。

在严格条件下与上述效应基因Mj-1-1杂交且编码与爪哇根结线虫寄生相关蛋白的DNA分子，或者与上述爪哇根结线虫效应基因Mj-1-1有90％以上同源性且编码根结线虫寄生相关蛋白的DNA分子，也在本发明的保护范围之内。所述严格条件为：可在0.1×SSC、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述效应基因Mj-1-1编码的蛋白MJ-1-1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。同时，经过一个或一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加并且与爪哇根结线虫寄生相关的衍生蛋白，也在本发明的范畴之内。

进一步地，为了使爪哇根结线虫效应蛋白MJ-1-1便于纯化，可以在SEQ IDNO.4所示氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接上特定标签，所述特定标签为5～6个精氨酸，或2～12个组氨酸，或为序列DYKDDDK，或为序列WSHPQFEK，或为序列EQKLISEEDL。如表1所示，但不限于表1。

表1标签序列

标签	残基数量	序列
			Poly-Arg	5～6(常为5个)	RRRRR
Poly-His	2～12(常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDK
Strep-TagⅡ	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述蛋白可以人工合成，也可以先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

一种重组表达载体，由基因Mj-1-1的片段插入到植物表达载体的多克隆位点构建而成，所述基因Mj-1-1的序列如SEQ ID NO.1所示。

具体地，可以是一种重组RNAi植物表达载体(如重组表达载体1300-RNAi-Mj1)，所述重组RNAi植物表达载体是由出发载体pMin(出发载体pMin由本发明人构建)的多克隆位点插入上述爪哇根结线虫效应基因Mj-1-1，即该基因的部分外显子片段如SEQ ID NO.31所示序列构建而成。该SEQ IDNO.31所示序列为SEQ ID NO.3的5’端的第62～380bp所示的DNA分子。

所述出发载体pMin是一种植物RNAi载体的中间载体，将含有爪哇根结线虫效应基因Mj-1-1的该RNAi中间载体的RNAi表达盒进一步克隆到植物表达载体中，最终的RNAi植物表达载体转化农杆菌后，通过植物组织培养的方法转化到植物体内，可以在植物中产生所述基因的dsRNA，当根结线虫侵染该植株后，dsRNA进入根结线虫的体内，使所述基因的mRNA降解，引发所述基因的失活，严重的减弱了线虫的寄生能力，从而抑制线虫的侵染、寄生、繁殖和传播。

一种重组菌，包含上述爪哇根结线虫效应基因Mj-1-1或者上述重组载体。

另外，含有上述爪哇根结线虫效应基因Mj-1-1的重组基因表达盒、转基因细胞系等，均在本发明的保护范围之内。

上述爪哇根结线虫效应基因Mj-1-1及其蛋白MJ-1-1在防治根结线虫(尤其是爪哇根结线虫)方面的应用也在本发明的保护范围之内。

进一步地，上述爪哇根结线虫效应基因Mj-1-1及其蛋白MJ-1-1可应用于提高植物抗根结线虫(尤其是爪哇根结线虫)的能力。优选地，所述竹植物为双子叶植物或单子叶植物，尤其是烟草，如本生烟。

更进一步地，上述爪哇根结线虫效应基因Mj-1-1在可应用于构建抗根结线虫植物，进一步地，是应用于构建抗爪哇根结线虫的转基因植物。

优选地，所述转基因植物的目的植物优选为双子叶植物或单子叶植物，尤其是烟草，如本生烟。

作为上述应用的一个方面，可以将含有爪哇根结线虫效应基因Mj-1-1的重组表达载体利用农杆菌导入至目的植物中，或者通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导入或基因枪等生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株，得到抗根结线虫的转基因植物。

作物一种优选的可实施方案，上述构建抗根结线虫转基因植物的步骤如下：

S1.构建重组表达载体1300-RNAi-Mj1

S11.以爪哇根结线虫二龄幼虫cDNA为模板，分别以引物对Mj1Sac和Mj1Pst，以及Mj1Sph和Mj1Kpn，进行PCR扩增，

S12.将得到的PCR产物分别使用限制性内切酶Sac I和Pst I、Sph I和Kpn I进行酶切，纯化回收后，均连接至经限制性内切酶Sac I和Pst I、以及Sph I和Kpn I酶切的载体pMin，获得重组表达载体pMin-Mj-1-1；

S13.使用限制性内切酶BamH I和HindⅢ对重组表达载体pMin-Mj-1-1进行双酶切，纯化回收后连接至经限制性内切酶BamH I和HindⅢ双酶切的植物表达载体pCambia1300，获得重组表达载体1300-RNAi-Mj1；重组表达载体1300-RNAi-Mj1中酶切位点BamH I和HindⅢ之间插入了基因Mj-1-1的双链DNA片段；

S2.将重组表达载体1300-RNAi-Mj1转化根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌A；

S3.重组农杆菌A经叶盘法转化烟草，进行组织培养，用引物HygF和HygR，以及IntronF和IntronR检测为阳性的转基因植株即为Mj-1-1RNAi转基因烟草；

其中，步骤S11所述引物Mj1Sac的序列如SEQ ID NO.23所示，引物Mj1Pst的序列如SEQ ID NO.24所示，引物Mj1Sph的序列如SEQ ID NO.25所示，引物Mj1Kpn的序列如SEQ IDNO.26所示；

步骤S12所述载体pMin的构建方法为：

(1)载体中各个元件的获得

以载体pCambia1300的质粒为模板，以引物35SF和35SR扩增得到双35S启动子的序列，序列如SEQ ID NO.38所示；其中，所述引物35SF的序列如SEQID NO.32所示，加有酶切位点BamH I；引物35SR的序列如SEQ ID NO.33所示，加有酶切位点HindⅢ、Sph I、Pst I、XhoI和Sac I；

以载体pMD18T-IGS的质粒为模板，以引物IntronF和IntronR扩增得到Intron的序列，序列如SEQ ID NO.39所示；其中，所述引物IntronF的序列如SEQ ID NO.34所示，加有酶切位点Pst I；引物IntronR的序列如SEQ ID NO.35所示，加有酶切位点Sph I、Sal I和KpnI；

以载体pCambia1300的质粒为模板，以引物NosF和NosR扩增得到Nos终止子的序列，序列如SEQ ID NO.40所示；其中，所述引物NosF的序列如SEQ ID NO.36所示，加有酶切位点Sph I；引物NosR的序列如SEQ ID NO.37所示，加有酶切位点HindⅢ；

(2)pMin载体的构建

1)以TA克隆的方式把带有合适酶切位点的双35S启动子的序列(如SEQ ID NO.38所示)克隆到T载体(pMD18-T simple，Takara)中，测序和酶切验证，得到质粒pMD18T-35S。

2)采用双酶切的方法，用Pst I和Sph I两个内切酶分别对带有酶切位点的Intron扩增产物(Intron的序列，如SEQ ID NO.39所示)和质粒pMD18T-35S进行双酶切，把两个酶切后的Intron和质粒pMD18T-35S连接并转化大肠杆菌，测序和酶切验证，得到质粒pMD18T-35S-Intron。

3)采用双酶切的方法，用Sph I和HindⅢ两个内切酶分别对带有酶切位点的NOS终止子的序列(如SEQ ID NO.40所示)和质粒pMD18T-35S-Intron进行双酶切，把两个酶切后的Nos和质粒pMD18T-35S-Intron连接并转化大肠杆菌，测序和酶切验证，得到质粒pMD18T-35S-Intron-Nos，并命名为pMin；

步骤S3所述引物HygF的序列如SEQ ID NO.27所示，引物HygR的序列如SEQ IDNO.28所示，引物IntronF的序列如SEQ ID NO.29所示，引物IntronR的序列如SEQ ID NO.30所示。

优选地，步骤S11所述PCR扩增的程序：94℃ 3min；94℃ 30s，55℃ 30s，68℃2min，30个循环；68℃ 5min。

另外，步骤S13所述基因Mj-1-1的双链DNA片段如SEQ ID NO.31所示，为SEQ IDNO.3的5’端的第62～380bp所示的DNA分子。

更优选地，步骤S3的具体操作方法如下：

S31.本生烟植物材料的生长条件：本生烟种子用70％无水乙醇消毒1min，用无菌水冲洗数次，每次至少1min，然后用1％的次氯酸钠消毒30min，中间不断摇动容器，使种子与次氯酸钠充分接触，然后用无菌水冲洗数次，每次至少1min，最后用灭菌的滤纸吸干种子上的水分；尖头镊子在70％酒精中浸泡消毒，在酒精灯上烧过后，晾干，用于播种烟草种子；每个组培瓶中倒入大约50mL基本MS固体培养基(不含抗生素)，每个瓶子中放入一粒或几粒种子；组培瓶放置于组培室内，组培室内培养条件为：白天28℃、80％光照，黑夜25℃、无光照，16h光照，8h黑夜；培养1个半月的烟草无菌苗用于叶盘法转化；

S32.重组农杆菌A的培养：重组农杆菌A在含有50μg/mL Rif和50μg/mL Kan的2YT平板培养基上划线活化，倒置培养2d后挑取单菌落接种于800μL含有50μg/mL Rif和50μg/mL Kan的2YT液体培养基，28℃下250r/min培养12h，然后接种到100mL相同的2YT液体培养基中，28℃培养12h至OD₆₀₀＝0.5，收集菌体，4000g离心5min，收集到的菌体用等体积的基本MS液体培养基重悬后，用于叶盘法的转化；

S33.重组农杆菌A叶盘法转化烟草：烟草叶片去掉主脉和叶缘，切成1cm²的小块，放入含有农杆菌的MS基本培养基中，每100mL MS菌悬液中大约放入80个左右的叶盘，侵染15min，期间不停地摇动，侵染完后用灭菌滤纸吸干叶盘表面的菌液，背面朝下，放在共培养培养基上，25℃黑暗条件下共培养2-3d，直到叶盘周围有农杆菌长出；

S34.烟草的组织培养：共培养2-3d后的烟草叶盘，先用无菌水冲洗数次，再分别用250mg/L的Carb和250mg/l的Cef各洗15min，用灭菌滤纸吸干叶盘表面的水分，转到筛选培养基上，每两周继代培养一次，直到长出愈伤组织和小芽；小芽长到2cm时，切下丛生的芽，处理干净周围的愈伤组织，转到生根培养基上，生根1个月后，用水清洗掉小苗根周围的培养基，转到温室的基质土里进行培养。

其中，所述2YT液体培养基的配方为：16g胰蛋白胨，10g酵母抽提物，5g NaCl，加入到800mL去离子水中，搅拌溶解后，用5N NaOH调节pH值至7.0，最后用去离子水定容到1L，121℃高温高压灭菌，4℃保存。

2YT平板培养基的配方为：在2YT液体培养基的基础上，按照15g/L琼脂粉的用量加入琼脂粉，121℃高温高压灭菌，4℃保存。

基本MS液体培养基的配方：大量元素(0.332g CaCl₂、0.17g KH₂PO₄、1.9g KNO₃、0.1805g MgSO₄、1.65g NH₄NO₃)、微量元素(0.025mg CoCl₂·6H₂O、0.025mg CuSO₄·5H₂O、36.70mg FeNaEDTA、6.2mg H₃BO₃、0.83mg KI、16.9mg MnSO₄·H₂O、0.25mg Na₂MoO₄·2H₂O、8.60mg ZnSO₄·7H₂O)和有机元素(2.0mg甘氨酸、100.0mg肌肉肌醇(myo-Inositol)、0.50mg烟酸、0.50mg盐酸吡哆醇、0.10mg盐酸硫胺)。

基本MS固体培养基的配方为：在MS液体培养基的基础上，按照15g/L琼脂粉的用量加入琼脂粉，121℃高温高压灭菌，4℃保存。

共培养培养基的配方为：1L基本MS固体培养基中加入终浓度为1mg/L的6-BA、终浓度为0.1mg/L的NAA和0.1g肌醇。

筛选培养基的配方为：1L基本MS固体培养基中加入终浓度为300mg/L的Cef和Carb、终浓度为1mg/L的6-BA、终浓度为0.1mg/L的NAA和终浓度为10mg/L的潮霉素B。

生根培养基的配方为：1/2大量元素的基本MS固体培养基加入终浓度为0.1mg/L的NAA。

本发明首先利用qRT-PCR研究该基因在线虫不同发育阶段表达量的水平，结果表明，Mj-1-1基因在爪哇根结线虫各个发育阶段均有表达，在侵染前二龄幼虫时期表达量最低，侵染后表达量明显升高，三龄阶段(侵染番茄10天后)表达量最高，证明了该基因在爪哇根结线虫的寄生中发挥重要作用。

本发明还通过外源dsRNA浸泡方法沉默了Mj-1-1基因，证明了Mj-1-1基因的沉默能显著地抑制爪哇根结线虫的寄生能力。

在此研究基础上，为了更好的指导爪哇根结线虫的防治工作，本发明还开展了Mj-1-1基因的RNAi转基因植物的构建研究。RNAi现象有着复杂的机理和过程，这对其在转基因植物中的应用造成了诸多不便。大量研究表明，RNA干扰过程是一个由dsRNA诱导的多因素参与的过程，其中siRNA(small interference RNA)发挥着核心作用，在RNAi转基因植物的构建过程中，靶标基因序列的性质和长短，以及目标植物的选择，都是至关重要的因素。同时，如何构建一个高效的RNAi表达载体，对转基因植物中产生RNAi的效率也是非常重要的。构建植物RNAi表达载体时，首先要考虑启动子和间隔子(spacer)的影响。启动子强弱严重影响外源基因的表达水平，对目标基因的干扰程度和干扰效果有重要的影响作用。而间隔子的类型、片段大小对于RNAi的效率也有影响。因此RNAi的效果与靶标基因、表达载体和表达系统是息息相关的。

另外，由于hpRNA(hairpin RNA)需要借助构建的表达载体导入细胞，然后整合进核基因组DNA并获得转录才能产生RNAi的效应，涉及的环节较多，其中不同的转化方法也会影响RNAi的效应。因此，在RNAi转基因植物的构建工作中，需要针对靶标基因序列的特性，探索出一个协调完整的构建体系，才能针对烟草，成功构建RNAi转基因植物，提高效率。

本发明通过大量的研究和探索，成功构建了Mj-1-1基因的RNAi植物表达载体，转化农杆菌EHA105后，通过烟草组织培养的方法将该载体转入烟草，在烟草中产生了Mj-1-1的dsRNA，该植株能显著抑制根结线虫的寄生，获得了性能优异的抗根结线虫烟草，为根结线虫，尤其是爪哇根结线虫的防治，提供了坚实的理论基础和实践指导。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种新的爪哇根结线虫效应基因Mj-1-1及其相关蛋白，并证明了该基因在爪哇根结线虫的寄生中发挥重要作用，有利于提高植物抗根结线虫的能力，为根结线虫，尤其是爪哇根结线虫的防治，提供了新靶标。

本发明还成功构建了RNAi植物表达载体，转化农杆菌EHA105后，通过烟草组织培养的方法将该载体转入植物，在植物中产生Mj-1-1的dsRNA，获得了抗根结线虫植物，该植株能显著抑制根结线虫的寄生，对培育抗根结线虫作物具有很好的理论和指导意义，为进一步培育有广谱抗虫性的植物新品种奠定基础。

附图说明

图1为cDNA编码区扩增片段的电泳结果。

图2为扩增Mj-1-1基因的电泳结果。

图3为爪哇根结线虫不同发育阶段Mj-1-1基因的相对表达量。

图4为Mj-1-1基因沉默效率检测。A：RT-PCR结果的琼脂糖电泳检测；M：DNA MarkerDS2000；1，2，3分别为CK，dsgfp和ds Mj-1-1的Mjβ-actin扩增；4，5，6分别为CK，dsgfp和dsMj-1-1的Mj-1-1扩增；B：Mj-1-1相对表达量变化的柱状图；1：CK；2：dsgfp；3：ds Mj-1-1。

图5为离体RNAi方法沉默Mj-1-1基因对植株抗根结线虫能力差异的影响。A：不同处理根内虫数的比较；B：不同处理根结数的比较；C：不同处理根上卵囊数的比较；CK：M9Buffer处理的线虫；dsgfp：dsgfp处理的线虫；dsMj-1-1：dsMj-1-1处理的线虫。

图6为载体pMin和重组表达载体pMin-Mj-1-1的示意图。

图7为pCambia1300载体示意图。

图8为重组表达载体1300-RNAi-Mj1的示意图。

图9为阳性RNAi转基因植株检测；图A为转有Mj-1-1基因RNAi载体烟草；图B为转有空载体的烟草；M：DS2000；P：阳性对照(以质粒为模板)；N：阴性对照(水为模板)；1-5：Mj-1-1RNAi转基因植株。

图10为Mj-1-1基因沉默效率检测；CK：野生型本生烟；pC1300：转化有空载体的植株；Mj-1-1：阳性转基因烟草。

图11为in planta RNAi方法沉默Mj-1-1基因对植株抗根结线虫能力差异的影响；A不同时间点根内线虫数；B不同时间点根结数；C不同时间点卵囊数；CK野生型本生烟；pC1300转化有空载体的植株；Mj-1-1阳性转基因烟草。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

以下实施例中定量实验均设置三次重复，结果取平均值。

以下实施例中所用生物材料来源如下(公众可以从申请人处获得)：

本生烟：华南农业大学植物线虫研究室保存。爪哇根结线虫(Meloidogynejavanica)：华南农业大学植物线虫研究室保存。载体pEGFP、载体pMin、载体pCambia1300均为华南农业大学植物线虫研究室保存。根癌农杆菌EHA105：参考文献：Ryu,C.M.,A.Anand,L.Kang,et al.Agrodrench:a novel and effective agroinoculation method forvirus-induced gene silencing in roots and diverse Solanaceous species.PlantJournal,2004,40(2):322-331。

以下实施例中，其中，所述2YT液体培养基、2YT平板培养基、基本MS液体培养基、基本MS固体培养基、共培养培养基、筛选培养基、生根培养基的配方乳上文发明内容中所述。

实施例1爪哇根结线虫MJ-1-1蛋白及其编码基因的克隆

1、使用TRIZOL法提取爪哇根结线虫二龄幼虫RNA，并反转录为cDNA。

2、设计下游引物DC6R2(序列如SEQ ID NO.5所示)，与反式剪接序列SL1(序列如SEQ ID NO.6所示)相配对，以步骤1获得的cDNA为模板进行扩增，获得Mj-1-1的cDNA编码序列。

PCR扩增体系：cDNA 2μL，两条引物各3μL，10×KOD plus Buffer 5μL，MgSO₄ 2μL，dNTP 5μL，Kod plus Neo DNA polymerase 1μL，ddH₂O 34μL。PCR扩增程序：94℃ 3min，30×(94℃ 30s，55℃ 30s，68℃ 2min)，68℃ 5min，20℃保存。琼脂糖电泳检测扩增结果如附图1所示。

3、以DNA为模板，使用引物对Mj1DNAF(序列如SEQ ID NO.7所示)和Mj1DNAR(序列如SEQ ID NO.8所示)进行扩增，PCR扩增程序同(2)，电泳结果如附图2所示，

4、经过上述扩增测序得到，爪哇根结线虫Mj-1-1基因的全基因序列(包括5’端非编码区、3’端非编码区、内含子和外显子)如SEQ ID NO.1所示；其编码区序列(包括内含子和外显子)如SEQ ID NO.2所示；其编码序列(即cDNA序列，仅为外显子)如SEQ ID NO.3所示；爪哇根结线虫Mj-1-1基因编码的蛋白质命名为MJ-1-1蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.4所示。

实施例2Mj-1-1基因在爪哇根结线虫不同发育阶段的表达分析

1、提取不同发育阶段的爪哇根结线虫的RNA，并反转录为cDNA。

2、使用引物qMj1F(序列如SEQ ID NO.9所示)和qMj1R(序列如SEQ ID NO.10所示)对基因Mj-1-1进行荧光定量PCR分析。以爪哇根结线虫β-actin基因为内参，引物为qActinF(序列如SEQ ID NO.11所示)和qActinR(序列如SEQ ID NO.12所示)。反应条件：94℃ 30s，40×(94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s)。

3、结果如附图3所示。结果表明，Mj-1-1基因在爪哇根结线虫各个发育阶段均有表达，在侵染前二龄幼虫时期表达量最低，侵染后表达量明显升高，三龄阶段(侵染番茄10天后)表达量最高。证明该基因在爪哇根结线虫的寄生中发挥重要作用。

实施例3外源dsRNA浸泡方法沉默Mj-1-1基因分析其功能

1、外源dsRNA的获得参照Li等(2011)的方法进行。

(1)合成Mj-1-1基因正反义链：使用引物对Mj1ST7(序列如SEQ ID NO.15)和Mj1A(序列如SEQ ID NO.16)，以及Mj1S(序列如SEQ ID NO.17)和Mj1AT7(序列如SEQ IDNO.18)；PCR扩增退火温度55℃，1min的延伸时间。

(2)合成阳性对照GFP基因正反义链：使用引物对GFPST7(序列如SEQ ID NO.19)和GFPA(序列如SEQ ID NO.20)，以及GFPS(序列如SEQ ID NO.21)和GFPAT7(序列如SEQ IDNO.22)；PCR退火温度55℃，1min的延伸时间。

(3)dsMj-1-1和dsGFP的合成参照ScriptMAX Thermo T7 Transcription Kit说明书进行操作。

2、dsRNA的纯化按如下方法进行：(1)加入1/10体积的8moL/L氯化锂，2倍体积的无水乙醇，混匀，-70℃放置10h；(2)4℃12000g离心10min，弃去上清；(3)加入1mL预冷的70％乙醇洗涤，4℃12000g离心5min，弃去上清；(4)重复步骤(3)一次；(5)37℃放置数分钟烘干酒精；(6)加入40μL DEPC水溶解；(7)电泳检测产物，余下的dsRNA置于-70℃保存。

3、使用浸泡方法沉默爪哇根结线虫的Mj-1-1基因，具体方法如下：将新鲜孵化的20000条二龄幼虫收集到DEPC处理过的离心管中，对照组和实验组各收集约20000条二龄幼虫，M9buffer清洗两遍后，吸干水，对照组分别加入50μL的M9 buffer，50μL的dsGFP，实验组直接浸泡在50μL的含有dsRNA(2μg/μL)的溶液中，20℃浸泡4h，每隔一段时间轻微的摇动试管。浸泡结束后用M9 buffer清洗两次。然后提取RNA及进行反转录实验，再用引物对qMj1F(序列如SEQ ID NO.9所示)和qMj1R(序列如SEQ ID NO.10所示)，通过定量PCR方法验证沉默效果，结果如附图4所示，Mj-1-1基因的表达被成功抑制。

4、把不同处理(dsMj-1-1、dsGFP、CK)的爪哇根结线虫接种到生长35d的番茄上，每个处理30株，每株番茄接种200条根结线虫。分别在接种2d、7d、14d、21d、28d和35d后，每个处理取5株番茄根洗净后进行染色，参照冯志新(2000年)介绍的次氯酸钠-酸性品红染色法，分别统计番茄根部线虫、根表面的根结和卵囊的数量，分析沉默后爪哇根结线虫侵染能力的变化，结果如附图5所示，结果表明Mj-1-1基因的沉默，能显著地抑制爪哇根结线虫的寄生能力。

实施例4 in planta RNAi方法沉默Mj-1-1基因分析其功能

1、构建重组表达载体1300-RNAi-Mj1

(1)构建出发载体pMin

pMin载体为发明人自己构建，是构建RNAi转基因植物的中间载体，与常用的RNAi载体不同的是，该载体中用于形成发夹结构的Intron是从爪哇根结线虫的IGS序列中扩增得到。经过实验验证，该载体可以有效形成RNAi的基因沉默效果。pMin载体的具体构建方法如下：

1)载体中各个元件的获得

根据双35S启动子、Intron和Nos终止子的序列，设计特异性引物，并在引物的两端加上合适的酶切位点。

具体是35SF(序列如SEQ ID NO.32，加有酶切位点BamH I)和35SR(序列如SEQ IDNO.33，加有酶切位点HindⅢ、Sph I、Pst I、Xho I和Sac I)，IntronF(序列如SEQ IDNO.34，加有酶切位点Pst I)和IntronR(序列如SEQ ID NO.35，加有酶切位点Sph I、Sal I和Kpn I)，NosF(序列如SEQ ID NO.36，加有酶切位点Sph I)和NosR(序列如SEQ ID NO.37，加有酶切位点HindⅢ)。

以含有双35S启动子序列的载体pCambia1300的质粒为模板，以引物35SF和35SR，用高保真的KOD-Plus-Neo酶扩增得到双35S启动子的序列(序列如SEQ ID NO.38所示)。

以含有Intron的载体pMD18T-IGS质粒为模板，以引物IntronF和IntronR，用高保真KOD-Plus-Neo酶扩增得到Intron的序列(序列如SEQ ID NO.39所示)。

以含有Nos终止子序列的载体pCambia1300的质粒为模板，以引物NosF和NosR，用高保真KOD-Plus-Neo酶扩增得到Nos终止子序列(如SEQ ID NO.40所示)。(载体pCambia1300质粒同时含有双35S启动子和Nos终止子序列)。

具体上述扩增按照如下体系进行：

10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL、2mmol/L dNTPs 5μL、25Mmol/L MgSO⁴3μL、35SF/NosF/IntronF(10μmol/L)1.5μL、35SR/NosR/IntronR(10μmol/L)1.5μL、KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL、模板1μL、dd H₂O 32μL，总体积50μL。

PCR反应条件：94℃预变性2min，40个循环(98℃ 10s、55℃ 30s和68℃ 30s)。

PCR产物的纯化回收采用TIANGEN公司的Universal DNA Purification Kit，具体操作步骤如下：

a.柱平衡步骤：向吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，12000g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

b.向PCR反应液或酶切反应液中加入等体积溶液PC，充分混匀，切胶回收时向胶块中加入等倍体积溶液PC(如果凝胶重0.1g，其体积可视为100μL，则加入100μL溶液PC)，50℃水浴放置10min左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解(若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)；

c.将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)，12000g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中；

d.向吸附柱CB2中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中；

e.重复步骤d；

f.将吸附柱CB2放入收集管中，12000g离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干。

g.将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液EB(如果回收片段＞4kb，则洗脱缓冲液EB应置于65-70℃水浴预热)，室温放置2min，12000g离心2min，收集DNA溶液(洗脱液不应少于30μL，体积过少会影响回收的效率)。

2)pMin载体的构建

a.以TA克隆的方式把带有合适酶切位点的双35S启动子的序列(如SEQ ID NO.38所示)克隆到T载体(pMD18-T simple，Takara)中，测序和酶切验证，得到质粒pMD18T-35S。

b.采用双酶切的方法，用Pst I和Sph I两个内切酶分别对带有酶切位点的Intron扩增产物(Intron的序列，如SEQ ID NO.39所示)和质粒pMD18T-35S进行双酶切，把两个酶切后的Intron和质粒pMD18T-35S连接并转化大肠杆菌，测序和酶切验证，得到质粒pMD18T-35S-Intron。

c.采用双酶切的方法，用Sph I和HindⅢ两个内切酶分别对带有酶切位点的NOS终止子的序列(如SEQ ID NO.40所示)和质粒pMD18T-35S-Intron进行双酶切，把两个酶切后的Nos和质粒pMD18T-35S-Intron连接并转化大肠杆菌，测序和酶切验证，得到质粒pMD18T-35S-Intron-Nos，并命名为pMin。

以上所有酶切反应按照以下步骤进行：10×Buffer 5μL、DNA(质粒或回收产物)约3μg、内切酶1 3μL、内切酶2 3μL、H₂O补足到50μL。

在37℃条件下酶切过夜后立即在65℃条件下孵育15min使内切酶失活，质粒载体酶切后进行去磷酸化，即在反应体液中加入适量的CIAP，反应30min，进行切胶回收，对回收得到的酶切产物浓度测定后，用连接酶进行连接反应。

所有连接反应按照以下步骤进行：酶切后的目的片段4μL、酶切后的载体1μL、连接酶SolutionⅠ5μL、总体积10μL。在PCR仪上16℃条件下连接过夜。

(2)使用TRIZOL法提取爪哇根结线虫二龄幼虫RNA，并将RNA反转录为cDNA，使用引物对Mj1Sac(序列如SEQ ID NO.23，前7位为酶切位点SacI)和Mj1Pst(序列如SEQ IDNO.24，前8位为酶切位点PstI)，以及Mj1Sph(序列如SEQ ID NO.25，前10位为酶切位点SphI)和Mj1Kpn(序列如SEQ ID NO.26，前8位为酶切位点KpnI)，分别进行PCR扩增，PCR扩增程序：94℃3min，30×(94℃30s，55℃30s，68℃2min)，68℃5min。将得到的PCR产物分别使用限制性内切酶Sac I和Pst I、Sph I和Kpn I进行酶切，并纯化回收。

(3)同时使用限制性内切酶Sac I和Pst I、Sph I和Kpn I酶切载体pMin，并纯化回收。

(4)将(2)和(3)得到的产物进行连接，获得重组表达载体pMin-Mj-1-1；载体pMin和重组表达载体pMin-Mj-1-1的示意图如附图6所示。

(5)使用限制性内切酶BamH I和HindⅢ对重组表达载体pMin-Mj-1-1进行双酶切，并纯化回收。

同时使用限制性内切酶BamH I和HindⅢ双酶切植物表达载体pCambia1300(载体pCambia1300的示意图如附图7所示)，并纯化回收。

(6)将(4)和(5)得到的产物进行连接，获得重组的RNAi植物表达载体1300-RNAi-Mj1。

根据测序结果，对重组表达载体1300-RNAi-Mj1(示意图如附图8所示)的结构描述如下：骨架为pCambia1300，在骨架载体BamH I和HindⅢ酶切位点之间插入了Mj-1-1基因片段的RNAi表达盒。插入片段如SEQ ID NO.31所示序列，即为SEQ ID NO.3的5’端的第62～380bp所示的DNA分子。

将载体质粒1300-RNAi-Mj1转化根癌农杆菌EHA105得到重组农杆菌A，将载体pCambia1300转化根癌农杆菌EHA105得到对照农杆菌。

2、植物材料和生长条件：本生烟为华南农业大学植物线虫研究室保存。种子用70％无水乙醇消毒1min，无菌水冲洗数次，每次至少1min，然后用1％次氯酸钠消毒30min，中间不断摇动容器，使种子与次氯酸钠充分接触，然后用无菌水冲洗数次，每次至少1min，最后用灭菌滤纸吸干种子上的水分。尖头镊子在70％酒精中浸泡消毒，在酒精灯上烧过后晾干，用于播种烟草种子。每个组培瓶中倒入大约50mL基本MS固体培养基(不含抗生素)，每个瓶子中放入一粒或几粒种子。组培瓶放置于组培室内培养，条件为：白天28℃80％光照，黑夜25℃无光照，16h光照，8h黑夜。培养1个半月的烟草无菌苗用于叶盘法转化。

3、工程农杆菌的培养：从-80℃冰箱中取出工程农杆菌和相应的空载体对照农杆菌菌液，在2YT平板上进行划线活化(含有50μg/mL Rif和50μg/mL Kan)，倒置培养2d后提取单菌落接种于800μL 2YT液体培养基(含有50μg/mL Rif和50μg/mL Kan)，28℃下250r/min培养12h，然后接种到100mL 2YT液体培养基(含有50μg/mL Rif和50μg/mL Kan)中，28℃培养12h，OD₆₀₀≈0.5，用50mL离心管收集菌体，4000g离心5min，收集到的菌体用等体积的基本MS液体培养基重悬后，用于叶盘法的转化。

4、农杆菌叶盘法转化烟草：烟草叶片去掉主脉和叶缘，切成1cm²的小块，放入含有农杆菌的MS基本培养基中，每100mL MS菌悬液中大约放入80个左右的叶盘，侵染15min，期间不停地摇动，侵染完后用灭菌滤纸吸干叶盘表面的菌液，背面朝下，放在共培养培养基上，25℃黑暗条件下共培养2-3d，直到叶盘周围有农杆菌长出。

其中，对共培养培养基中细胞分裂素6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)和生长素萘乙酸(NAA)的使用浓度进行探索，实验结果显示，两种植物激素的使用浓度对愈伤组织和分化芽的形成具有非常关键的作用，经过探索实验结果显示，最终筛选到不同培养阶段两种植物激素的比例为：1mg/L的6-BA和0.1mg/L的NAA，在这一组合条件下，能够分化出较多的转化苗，因此，在本试验的共培养和下一步的分化阶段中都使用1mg/L的6-BA和0.1mg/L的NAA。

5、烟草的组织培养：共培养2-3d后的烟草叶盘，先用无菌水冲洗数次，再分别用250mg/L的Carb和250mg/L的Cef各洗15min，用灭菌滤纸吸干叶盘表面的水分，转到筛选培养基上，每两周继代培养一次，直到长出愈伤组织和小芽。小芽长到2cm时切下丛生的芽，处理干净周围的愈伤组织，转到生根培养基上，生根约1个月后，用水清洗掉小苗根周围的培养基，转到温室基质土进行培养。

同时，研究过程中发现，抗生素Carb和Cef的使用浓度同样对愈伤组织和小芽具有很关键的作用，大量探索筛选实验得出：分别用250mg/L的Carb和250mg/L的Cef各洗15min的效果最好。

6、T₀代Mj-1-1RNAi转基因烟草的检测：提取T₀代转基因烟草的叶片总RNA，反转录成cDNA，采用RT-PCR的方法，用引物对HygF(序列如SEQ ID NO.27)和HygR(序列如SEQ IDNO.28)以及IntronF(序列如SEQ ID NO.29)和IntronR(序列如SEQ ID NO.30)检测阳性转基因烟草，PCR扩增程序：94℃3min，30×(94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 2min)，72℃ 5min。结果如附图9所示。

7、检测为阳性的转基因烟草在温室里栽培管理，收获T1代种子，重新播种后，用同样的方法检测阳性植株，用于接种试验，同时播种野生型本生烟和转化有空载体的转基因烟草做为对照。每株烟草接种200条刚刚孵化的爪哇根结线虫二龄幼虫，接种爪哇根结线虫2d时提取转基因烟草整个根部的总RNA，用引物对qMj1F(序列如SEQ ID NO.9)和qMj1R(序列如SEQ ID NO.10)，以及内参引物qActinF(序列如SEQ ID NO.11)和qActinR(序列如SEQID NO.12)检测Mj-1-1基因沉默效率，PCR扩增程序：94℃ 3min，30×(94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 2min)，72℃ 5min。结果如图10，Mj-1-1基因的表达被成功抑制。

8、分别在接种后2d、7d、14d、21d、28d和35d时进行调查，每个处理在每个时间点设置5个重复，记录根内虫的数量和根结数量，结果取平均值。结果如图11，沉默爪哇根结线虫的Mj-1-1基因后，能显著地减少每株植株上侵染虫的数量，即沉默Mj-1-1基因后，能显著地抑制根结线虫的寄生能力。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种爪哇根结线虫效应基因Mj-1-1，相关蛋白及其应用

<160> 40

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1200

<212> DNA

<213> 爪哇根结线虫Mj-1-1基因的全基因序列

<400> 1

acgatggact ccagagcggc cgcgttattg gttacgatgg actccagagc ggccgcctta 60

atggttacga tggactccag agcggccgct attttggtta cgatggactc cagagcggcc 120

gctgttttgg ttacgatgga ctccagagcg gccgcttttt gggttacgat ggactccaga 180

gcggccgctt ttacggttaa tccgattttt agatttccct gatttgctta aaacgaaact 240

gtttttgtcc aatttttttt aatttgggaa taaaatgtat aaatttgttg atataaaggc 300

ttctatgtat tgtatttaag aaatttaaat gtaaattacg atgttttgat atctaatttt 360

attttaaaat tatttttcca ctttgaatat taccgtttat cgttttaacg caaataatat 420

ttacaaaaaa tcaccaaaat ttcaaaatct gaatcaattt ttgatttata aatttgtttt 480

ttagaaatga aattttcctt atctcttggg gtgaaacgat gcagaaggaa tgttgaagat 540

tggtttcgca gagtttggga agttggttat gttgggccgt cacttccaaa gaagaaatgg 600

tgggagtttt tgaaattatt ttgtctgtta attttttctt ttttagtact ggcaagcagg 660

aagttccaat aacgtgagtt tttttaaatt aattttgggg agttatgtag ttttgtttgt 720

tcttcacttt tgtaaaagtt tttgagtttt gtttagttga cttttttatg ttttgaataa 780

aagctttttt tagtgaagaa tcagttgata caacaagaca acaattaatg agagaatgga 840

atgttatgca atggttagca aatccatatt taaatgctga acgtgagagg ccatatattg 900

aacaatatgg agatgttgtt gatcaatgga gacaatcaca aattgaagct aagcaacgca 960

aaatgccaaa taaaccaaaa atttttaaag tttatgatgg aaatttggaa aagagacggg 1020

caaatgttgg aaatatgttg cattcgcata gaactgttga agaacaaatg aaagatttaa 1080

ttagattgac aagatgggat taaatgagag attttttgaa tagttgtgga ttgtttttaa 1140

ataaaatatt ttgttttaaa agttttggaa caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200

<210> 2

<211> 617

<212> DNA

<213> 爪哇根结线虫Mj-1-1基因的编码区序列

<400> 2

atgaaatttt ccttatctct tggggtgaaa cgatgcagaa ggaatgttga agattggttt 60

cgcagagttt gggaagttgg ttatgttggg ccgtcacttc caaagaagaa atggtgggag 120

tttttgaaat tattttgtct gttaattttt tcttttttag tactggcaag caggaagttc 180

caataacgtg agttttttta aattaatttt ggggagttat gtagttttgt ttgttcttca 240

cttttgtaaa agtttttgag ttttgtttag ttgacttttt tatgttttga ataaaagctt 300

tttttagtga agaatcagtt gatacaacaa gacaacaatt aatgagagaa tggaatgtta 360

tgcaatggtt agcaaatcca tatttaaatg ctgaacgtga gaggccatat attgaacaat 420

atggagatgt tgttgatcaa tggagacaat cacaaattga agctaagcaa cgcaaaatgc 480

caaataaacc aaaaattttt aaagtttatg atggaaattt ggaaaagaga cgggcaaatg 540

ttggaaatat gttgcattcg catagaactg ttgaagaaca aatgaaagat ttaattagat 600

tgacaagatg ggattaa 617

<210> 3

<211> 450

<212> DNA

<213> 爪哇根结线虫Mj-1-1基因的cDNA编码序列

<400> 3

atgaaatttt ccttatctct tggggtgaaa cgatgcagaa ggaatgttga agattggttt 60

cgcagagttt gggaagttgg ttatgttggg ccgtcacttc caaagaagaa atgtactggc 120

aagcaggaag ttccaataac tgaagaatca gttgatacaa caagacaaca attaatgaga 180

gaatggaatg ttatgcaatg gttagcaaat ccatatttaa atgctgaacg tgagaggcca 240

tatattgaac aatatggaga tgttgttgat caatggagac aatcacaaat tgaagctaag 300

caacgcaaaa tgccaaataa accaaaaatt tttaaagttt atgatggaaa tttggaaaag 360

agacgggcaa atgttggaaa tatgttgcat tcgcatagaa ctgttgaaga acaaatgaaa 420

gatttaatta gattgacaag atgggattaa 450

<210> 4

<211> 149

<212> PRT

<213> 爪哇根结线虫MJ-1-1蛋白的氨基酸序列

<400> 4

Met Lys Phe Ser Leu Ser Leu Gly Val Lys Arg Cys Arg Arg Asn Val

1 5 10 15

Glu Asp Trp Phe Arg Arg Val Trp Glu Val Gly Tyr Val Gly Pro Ser

20 25 30

Leu Pro Lys Lys Lys Cys Thr Gly Lys Gln Glu Val Pro Ile Thr Glu

35 40 45

Glu Ser Val Asp Thr Thr Arg Gln Gln Leu Met Arg Glu Trp Asn Val

50 55 60

Met Gln Trp Leu Ala Asn Pro Tyr Leu Asn Ala Glu Arg Glu Arg Pro

65 70 75 80

Tyr Ile Glu Gln Tyr Gly Asp Val Val Asp Gln Trp Arg Gln Ser Gln

85 90 95

Ile Glu Ala Lys Gln Arg Lys Met Pro Asn Lys Pro Lys Ile Phe Lys

100 105 110

Val Tyr Asp Gly Asn Leu Glu Lys Arg Arg Ala Asn Val Gly Asn Met

115 120 125

Leu His Ser His Arg Thr Val Glu Glu Gln Met Lys Asp Leu Ile Arg

130 135 140

Leu Thr Arg Trp Asp

145

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 下游引物DC6R2

<400> 5

ctctcattta atcccatctt gtca 24

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 反式剪接序列SL1

<400> 6

ggtttaatta tccaagtttg a 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物Mj1DNAF

<400> 7

atgaaatttt ccttatctct t 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物Mj1DNAR

<400> 8

ttaatcccat cttgtcaatc 20

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物qMj1F

<400> 9

ttccttatct cttggggtga aacga 25

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物qMj1R

<400> 10

gaacttcctg cttgccagta catt 24

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物qActinF

<400> 11

tgtcaatgtc gcacttcatg atc 23

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物qActinR

<400> 12

ccgttgccca gaatctctct t 21

<210> 13

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物Mj1DWF

<400> 13

acgcgtcgac atgaaacgat gcagaaggaa tgttg 35

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物Mj1DWR

<400> 14

catgccatgg cccatcttgt caatctaatt 30

<210> 15

<211> 46

<212> DNA

<213> 引物Mj1ST7

<400> 15

ggatcctaat acgactcact ataggggcag agtttgggaa gttggt 46

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物Mj1A

<400> 16

tttccaacat ttgcccgtct 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物Mj1S

<400> 17

gcagagtttg ggaagttggt 20

<210> 18

<211> 46

<212> DNA

<213> 引物Mj1AT7

<400> 18

ggatcctaat acgactcact atagggtttc caacatttgc ccgtct 46

<210> 19

<211> 50

<212> DNA

<213> 引物对GFPST7

<400> 19

ggatcctaat acgactcact ataggggtga gcaagggcga ggagctgttc 50

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物GFPA

<400> 20

tcacttgtac agctcgtcca tgccg 25

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物GFPS

<400> 21

ggtgagcaag ggcgaggagc tgttc 25

<210> 22

<211> 50

<212> DNA

<213> 引物GFPAT7

<400> 22

ggatcctaat acgactcact ataggtcact tgtacagctc gtccatgccg 50

<210> 23

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物Mj1Sac

<400> 23

cgagctcgca gagtttggga agttggt 27

<210> 24

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物Mj1Pst

<400> 24

aactgcagtt tccaacattt gcccgtct 28

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物Mj1Sph

<400> 25

acatgcatgc gcagagtttg ggaagttggt 30

<210> 26

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物Mj1Kpn

<400> 26

ggggtacctt tccaacattt gcccgtct 28

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物HygF

<400> 27

tccggagcct ccgctcgaag tag 23

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物HygR

<400> 28

ctgaactcac cgcgacgtct gtc 23

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物IntronF

<400> 29

ataacaataa acttctaaca atc 23

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物IntronR

<400> 30

tgaattaccg agactgctgg taa 23

<210> 31

<211> 319

<212> DNA

<213> 重组RNAi植物表达载体1300-RNAi-Mj1中插入的基因Mj-1-1的双链DNA片段

<400> 31

gcagagtttg ggaagttggt tatgttgggc cgtcacttcc aaagaagaaa tgtactggca 60

agcaggaagt tccaataact gaagaatcag ttgatacaac aagacaacaa ttaatgagag 120

aatggaatgt tatgcaatgg ttagcaaatc catatttaaa tgctgaacgt gagaggccat 180

atattgaaca atatggagat gttgttgatc aatggagaca atcacaaatt gaagctaagc 240

aacgcaaaat gccaaataaa ccaaaaattt ttaaagttta tgatggaaat ttggaaaaga 300

gacgggcaaa tgttggaaa 319

<210> 32

<211> 32

<212> DNA

<213> 引物35SF

<400> 32

cgcggatccc gagagagata gatttgtaga ga 32

<210> 33

<211> 54

<212> DNA

<213> 引物35SR

<400> 33

ccaagcttgc atgcctgcag ctcgaggagc tcaggcggtt tgcgtattgg ctag 54

<210> 34

<211> 31

<212> DNA

<213> 引物IntronF

<400> 34

aactgcagat aacaataaac ttctaacaat c 31

<210> 35

<211> 45

<212> DNA

<213> 引物IntronR

<400> 35

acatgcatgc gtcgacggta cctgaattac cgagactgct ggtaa 45

<210> 36

<211> 31

<212> DNA

<213> 引物NosF

<400> 36

acatgcatgc tcgatgaatt cccgatctag t 31

<210> 37

<211> 29

<212> DNA

<213> 引物NosR

<400> 37

ccaagctttt ccccgatcgt tcaaacatt 29

<210> 38

<211> 821

<212> DNA

<213> 35S启动子的序列

<400> 38

cgagagagat agatttgtag agagagactg gtgatttcag cgtgtcctct ccaaatgaaa 60

tgaacttcct tatatagagg aaggtcttgc gaaggatagt gggattgtgc gtcatccctt 120

acgtcagtgg agatatcaca tcaatccact tgctttgaag acgtggttgg aacgtcttct 180

ttttccacga tgctcctcgt gggtgggggt ccatctttgg gaccactgtc ggcagaggca 240

tcttgaacga tagcctttcc tttatcgcaa tgatggcatt tgtaggtgcc accttccttt 300

tctactgtcc ttttgatgaa gtgacagata gctgggcaat ggaatccgag gaggtttccc 360

gatattaccc tttgttgaaa agtctcaata gccctttggt cttctgagac tgtatctttg 420

atattcttgg agtagacgag agtgtcgtgc tccaccatgt tatcacatca atccacttgc 480

tttgaagacg tggttggaac gtcttctttt tccacgatgc tcctcgtggg tgggggtcca 540

tctttgggac cactgtcggc agaggcatct tgaacgatag cctttccttt atcgcaatga 600

tggcatttgt aggtgccacc ttccttttct actgtccttt tgatgaagtg acagatagct 660

gggcaatgga atccgaggag gtttcccgat attacccttt gttgaaaagt ctcaatagcc 720

ctttggtctt ctgagactgt atctttgata ttcttggagt agacgagagt gtcgtgctcc 780

accatgttgg caagctgctc tagccaatac gcaaaccgcc t 821

<210> 39

<211> 268

<212> DNA

<213> Intron的序列

<400> 39

ataacaataa acttctaaca atcctttatt gactctcgct gcaaaattaa tttggcttct 60

ggcaattgtc aggaatttag ccgattataa cttttgtgaa tttataatta taattaatta 120

ttgacattct tttgcaaagg atatttagta tgttatcagc tgtcattaat ttttaatttt 180

cgacttttat ttcgggattt tgaattctaa aattatcaat gtaatcatta ttaatgacag 240

cttaattacc agcagtctcg gtaattca 268

<210> 40

<211> 272

<212> DNA

<213> Nos终止子的序列

<400> 40

tcgatgaatt cccgatctag taacatagat gacaccgcgc gcgataattt atcctagttt 60

gcgcgctata ttttgttttc tatcgcgtat taaatgtata attgcgggac tctaatcata 120

aaaacccatc tcataaataa cgtcatgcat tacatgttaa ttattacatg cttaacgtaa 180

ttcaacagaa attatatgat aatcatcgca agaccggcaa caggattcaa tcttaagaaa 240

ctttattgcc aaatgtttga acgatcgggg aa 272

Claims

1. 一种爪哇根结线虫效应基因Mj-1-1，其特征在于，所述效应基因Mj-1-1的cDNA序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一种权利要求1所述效应基因Mj-1-1编码的蛋白MJ-1-1，其特征在于，所述蛋白MJ-1-1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.权利要求1所述爪哇根结线虫效应基因Mj-1-1或权利要求2所述蛋白MJ-1-1在防治根结线虫和/或在提高植物抗根结线虫能力方面的应用。

4.权利要求1所述爪哇根结线虫效应基因Mj-1-1在构建抗根结线虫植物中的应用，其特征在于，所述应用的方法是将含有爪哇根结线虫效应基因Mj-1-1的重组表达载体利用农杆菌导入至目的植物中，或者通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导入或基因枪的生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株，得到抗根结线虫的转基因植物。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述应用的方法为：

S1.构建重组表达载体1300-RNAi-Mj1

S11.以爪哇根结线虫cDNA为模板，分别以引物对Mj1Sac和Mj1Pst，以及Mj1Sph和Mj1Kpn，进行PCR扩增；

S12.将得到的PCR产物分别使用限制性内切酶Sac I和PstI、Sph I和Kpn I进行酶切，纯化回收后，均连接至经限制性内切酶Sac I和Pst I、以及Sph I和Kpn I酶切的载体pMin，获得重组表达载体pMin-Mj-1-1；

S13.使用限制性内切酶BamH I和Hind Ⅲ对重组表达载体pMin-Mj-1-1进行双酶切，纯化回收后连接至经限制性内切酶BamH I和Hind Ⅲ双酶切的植物表达载体pCambia1300，获得重组表达载体1300-RNAi-Mj1；重组表达载体1300-RNAi-Mj1中酶切位点BamH I和HindⅢ之间插入了基因Mj-1-1的双链DNA片段；

S3.重组农杆菌A转化烟草，进行组织培养，用引物HygF和HygR，以及IntronF和IntronR检测为阳性的转基因烟草植株即为Mj-1-1 RNAi转基因烟草；

其中，步骤S11所述引物Mj1Sac的序列如SEQ ID NO.23所示，引物Mj1Pst的序列如SEQID NO.24所示，引物Mj1Sph的序列如SEQ ID NO.25所示，引物Mj1Kpn的序列如SEQ IDNO.26所示；

步骤S3所述引物HygF的序列如SEQ ID NO.27所示，引物HygR的序列如SEQ ID NO.28所示，引物IntronF的序列如SEQ ID NO.29所示，引物Intron R的序列如SEQ ID NO.30所示。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，步骤S13所述基因Mj-1-1的双链DNA片段如SEQ ID NO.31所示。

7.根据权利要求5所述应用，其特征在于，步骤S12所述载体pMin的构建方法为：

（1）载体中各个元件的获得

以载体pCambia1300的质粒为模板，以引物35SF和35SR扩增得到双35S启动子的序列，序列如SEQ ID NO.38所示；其中，所述引物35SF的序列如SEQ ID NO.32所示，加有酶切位点BamH I；引物35SR的序列如SEQ ID NO.33所示，加有酶切位点Hind Ⅲ、SphI、Pst I、Xho I和Sac I；

以载体pMD18T-IGS的质粒为模板，以引物IntronF和IntronR扩增得到Intron的序列，序列如SEQ ID NO.39所示；其中，所述引物IntronF的序列如SEQ ID NO.34所示，加有酶切位点Ps t I；引物IntronR的序列如SEQ ID NO.35所示，加有酶切位点SphI、Sal I和KpnI；

以载体pCambia1300的质粒为模板，以引物NosF和NosR扩增得到Nos终止子的序列，序列如SEQ ID NO.40所示；其中，所述引物NosF的序列如SEQ ID NO.36所示，加有酶切位点Sph I；引物NosR的序列如SEQ ID NO.37所示，加有酶切位点Hind Ⅲ；

（2）pMin载体的构建

1）把SEQ ID NO.38所示的双35S启动子的序列克隆到pMD18-T载体中，得到质粒pMD18T-35S；

2）用Pst I和Sph I两个内切酶把SEQ ID NO.39所示的Intron序列连接到载体pMD18T-35S中，得到质粒pMD18T-35S-Intron；

3）用Sph I和Hind Ⅲ两个内切酶把SEQ ID NO.40所示的NOS终止子序列连接到质粒pMD18T-35S-Intron中，得到质粒pMD18T-35S-Intron-Nos，并命名为pMin。

8.根据权利要求5所述应用，其特征在于，步骤S3的具体方法如下：

S31.本生烟种子依次用70%无水乙醇和1%的次氯酸钠消毒后，播种在不含抗生素的基本MS固体培养基上，培养1个半月后，用于叶盘法转化；

S32.重组农杆菌A在含有50μg/mLRif和50μg/mLKan的2YT平板培养基上划线活化，挑取单菌落接种于含有50μg/mLRif和50μg/mLKan的2YT液体培养基进行培养，收集菌体，用于叶盘法转化；

S33.步骤S31培养的烟草叶片去掉主脉和叶缘，切成1cm²的小块，放入含有农杆菌的MS基本培养基中，每100mL重组农杆菌A菌悬液中放入75～85个叶盘，侵染完后背面朝下，放在共培养培养基上，直到叶盘周围有农杆菌长出；

S34.步骤S33得到的烟草叶盘依次用无菌水、250mg/L的Carb和250mg/l的Cef清洗后，转到筛选培养基上，每两周继代培养一次，直到长出愈伤组织和小芽；再切下丛生的芽转到生根培养基上，生根1个月后，即可转到温室的基质土里进行培养。