CN104877993B - 两种植物eIF4A基因及其用于制备转基因耐水稻条纹病毒植物体的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用植物eIF4A基因获得耐水稻条纹病毒侵染的水稻的应用。本发明利用植物eIF4A基因及其vsiRNA结合位点突变体，构建了双元表达载体，成功转化水稻和本氏烟，获得耐受水稻条纹病毒侵染的转基因植株。实验结果说明植物eIF4A基因或其vsiRNA结合位点突变体在植物体内表达，可赋予植物体对水稻条纹病毒的耐受性。

Description

两种植物eIF4A基因及其用于制备转基因耐水稻条纹病毒植 物体的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域及植物病害防治领域，尤其涉及植物eIF4A基因在植物耐受水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)病中的应用领域。

背景技术

RSV是由灰飞虱传播的一种重要水稻病毒，由该病毒导致的水稻条纹叶枯病在我国持续发生，造成严重经济损失。近年来，我国科学家针对RSV的生物学和分子生物学研究开展了一系列细致而深入的工作：测定了病毒全基因组序列、鉴定了病毒沉默抑制蛋白、运动蛋白、开展了水稻互作蛋白的分离筛选工作、建立了灰飞虱饲毒、检测技术、综合防治技术等工作，这些工作所取得的进展加深了人们对于RSV致病机制的了解。

在以往抗病毒转基因研究中，多将病毒来源的基因转入植物体内诱发植物的抗病效应。但存在着抗性水平不高、抗谱不宽、抗性逐步丧失等弊端，由此得不到广泛的应用。RNA干扰（RNA interference， RNAi）机制的发现为分子生物学和遗传学等领域带来巨大贡献。RNAi是植物体抵御外来核酸入侵的一种天然防御机制。基于RNAi技术的植物抗病毒研究成为近年来植物抗病毒领域的研究热点。然而，仅依赖单一抗性策略不利于抗性植株种质的可持续应用，并且具有病毒变异导致抗性丧失的潜在风险。由此不断发掘植物体内抗病毒途径的关键基因，并利用这些基因来设计新型抗病毒或耐受病毒策略、应用于转基因育种，达到提高植物抗、耐病毒能力，丰富抗、耐新种质的目的。

eIF4A基因是植物一种翻译起始因子，我们在研究中发现本氏烟和水稻体内的该基因能够被RSV侵染时产生的病毒来源的siRNA靶向作用，从而被降解，导致该基因在RSV侵染植物体内的表达下调。而分析发现，该基因在本氏烟体内的表达下调导致植株叶片皱缩、植株矮化的表现。为了对抗RSV对eIF4A的降解作用，我们将该基因在本氏烟和水稻体内超表达，发现超表达植物体在RSV侵染后、症状减轻，发病率下降。由此，我们认为eIF4A在植物体内的超表达会赋予植物对RSV的耐受性。因而，本发明将植物eIF4A在植物体内超表达，并通过抗性鉴定获得耐RSV转基因植物，这是首次将eIF4A基因作为一种耐RSV基因用于转基因耐病植物创制。

发明内容

本发明的第一个目的是提供2个植物eIF4A基因。本发明的第二个目的是提供上述基因的用途。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

本氏烟（Nicotiana benthamiana）eIF4A基因（NbeIF4A），该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。该基因来源于本氏烟。该基因序列是利用引物，以本氏烟cDNA为模版，通过普通PCR扩增而来。

水稻（Oryza Sativa）eIF4A基因（OseIF4A），该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示。该基因来源于水稻。该基因序列是利用引物，以水稻cDNA为模版，通过普通PCR扩增而来。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

将上述2个基因分别构建到双元植物表达载体pCV1300，分别命名为pCV1300-NbeIF4A和pCV1300-OseIF4A。将两个载体分别导入农杆菌菌株EHA105。用含有pCV1300-NbeIF4A的农杆菌，利用传统的叶盘法转化本氏烟，获得转NbeIF4A基因本氏烟；用含有pCV1300-OseIF4A的农杆菌，利用传统的成熟胚诱导的愈伤组织转化方法转化水稻日本晴，获得转OseIF4A基因水稻。

对上述两种转基因植物进行RSV的接种鉴定，获得耐受RSV的转基因植物。

本发明获取的eIF4A超表达转基因植物，主要应用于植物RSV侵染，避免病毒病害的为害。本发明对培育高耐病毒转基因植物具有重要的理论及实际意义，对植物病害防治其他领域也有指导作用。与通过其他抗病毒策略获得的抗性株系相比，本发明的最主要优势是eIF4A基因是植物体本身存在的基因，相对于其他病毒来源的抗性基因或片断，具有明显的安全性。

附图说明

图1：分别含有NbeIF4A、OseIF4A和NbeIF4Am基因的载体图谱。

图2：转NbeIF4A基因本氏烟的Real-time PCR检测结果。

图3：转NbeIF4A基因本氏烟的RSV接种鉴定。

图4：转OseIF4A基因水稻的PCR检测结果。

图5：转OseIF4A基因水稻的RSV接种鉴定。

图6：转OseIF4Am基因水稻接种RSV后的株高变化。

具体实施方式

实施例1 转NbeIF4A本氏烟的获得与RSV接种分析

本发明所转烟草品种为本氏烟。

1.重组农杆菌的获得

1）NbeIF4A的克隆

利用引物ATGGCAGGCTTGGCACCAGA和TCAAAGGAGATCAGCAACATT，以本氏烟cDNA为模版，通过普通PCR扩增而来。本氏烟的cDNA由通过Trizol方法提取的总RNA反转而来，反转体系和条件如下：

首先在无RNA酶的微量EP管中加入前四种试剂，混匀，70 ℃变性5 min;立即放入冰上，放置2 min。再依次加入后面三种试剂，混匀后按以下条件在PCR仪中进行反转。

42 ℃ 59 min

42 ℃ 59 min

72 ℃ 10 min

2）载体构建

利用引物CTCTAGAATGGCAGGCTTGGCACCAGA（下划线表示XbaI酶切位点）和CGTCGACTCAAAGGAGATCAGCAACATT（下划线表示SalI酶切位点），以上述获得的NbeIF4A全长为模版，与上述同样的条件下扩增获得含有酶切位点的NbeIF4A序列，通过常规的酶切、连接连入双元表达载体pCV1300的多克隆位点。构建完成的载体pCV1300-NbeIF4A图谱如图1A显示。

3）转化农杆菌

取-70 ℃保存的EHA105农杆菌感受态，置冰上融解。取1μl抽纯OsXrn4-Pcv-2N质粒加入到100 μl感受态中，混匀，加入到处理好的电击杯。设置2.2V电压，电击转化。点击完成加入900 μl的液体培养基（YEP）。28 ℃，200 rpm摇床培养2 h，菌液涂布在含50 μg/ml卡那霉素 (Kan) 和100 μg/ml利福平 (Rif) 平板上，28 ℃培养至形成单菌落。

4）阳性克隆的鉴定与保存

挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50 μg/ml Kan、100 μg/ml Rif的液体培养基中，28 ℃，200 rpm摇培16 h，取1μl菌液进行PCR检测。检测引物为Rxrb4f、RXrn4r。取检测结果为阳性的菌液，混合15-30%甘油，置甘油管中，于-70℃超低温冰箱中保存。

PCR体系如下：

混匀后按以下条件进行PCR循环：

2. 农杆菌介导的烟草遗传转化

本发明利用烟草叶盘法进行遗传转化，具体操作内容如下。

1) 菌液的准备

取-70 ℃保存的阳性转化菌株，于含50 μg/ml卡那霉素 (Kan) 和100 μg/ml利福平 (Rif) 平板上划线，28 ℃培养至形成单菌落，挑取单菌落于含50 μg/ml Kan、100 ug/ml Rif的YEP液体培养基中培养，28℃，220rpm振荡培养24 h；将菌液按1:100用YEP 培养基稀释，继续震荡培养至OD₆₀₀为0.6左右。5000 rpm离心5 min，收集菌体备用。

2）烟草叶片预培养

选取五叶期本氏烟生长状况良好的叶片，用无菌水冲洗数遍，70 %乙醇表面消毒1min，无菌水冲洗3遍25%的次氯酸钠消毒2-3min，无菌水冲洗数遍；用无菌滤纸吸干表面水分后，利用无菌手术刀将叶片切成1cm²小块，置于含有6-BA（2 mg/L）的MS培养基上进行预培养2-3d。

3）烟草叶片与农杆菌共培养

将收集好的菌体用100ml MS液体培养基（含200μl 200μM AS）悬浮30min，取出预培养后的烟草叶片，放入MS悬浮的农杆菌液中浸泡约10 min，不间断的轻轻晃动。之后取出叶片置于无菌滤纸上吸干，置于含6-BA (3 mg/L)、NAA(0.2 mg/L)、AS（100μM）的共培养培养基上，26℃暗培养2-3d。

4）筛选培养

将共培养后的叶片取出，无菌水清洗数遍，无菌滤纸吸干残余的水分，置于含抗生素（50 mg/L Carb和50 mg/L Hyb）的MS筛选培养基上，26℃，16 h光照培养，每两周更换一次筛选培养基，直至长出绿色小芽。

5）生根培养与移栽

待小芽长到1 cm以上单独成株后，切去芽基部的愈伤组织，转移到含有(50 mg/LCarb和50 mg/L Hyb)的1/2MS生根培养基上培养。待幼苗长至5 cm左右，根部长出后，清洗掉根部的培养基，将苗移栽到营养土中，暗光条件练苗1-2天，使其适应外界环境后再转移到正常光照环境下培养。

3. 转基因再生本氏烟的NbeIF4A表达量检测

Trizol方法提取3个转基因株系（NbeIF4A-OE-4，-9，-13）的总RNA，反转获得cDNA，以为上下游引物GTTATCCAGCAGGCACAAT和TGGCATAGTGGCAGAGAA进行real-time PCR，分析NbeIF4A在转基因本氏烟体内的表达水平。结果表明NbeIF4A基因在转基因本氏烟体内的表达水平显著高于对照非转基因植株（WT），说明NbeIF4A基因已经在转基因植株体内超表达（图2）。

4. 转基因烟草RSV接种鉴定

本发明选取T3代的3个转NbeIF4A本氏烟株系，通过RSV水稻病汁液摩擦接种5叶期苗，进行RSV接种鉴定。分析结果如图3所示，相对于对照植株（WT）全部表现矮缩、叶片皱缩等病毒症状，转基因植株的3个株系（NbeIF4A-OE-4，-9，-13）均只有约30%的植株表现出病毒症状，发病率显著降低，表现了转基因植株对RSV的耐受性。

实施例2 转OseIF4A水稻的获得与RSV接种分析

本发明所转水稻品种为日本晴。

1. 重组农杆菌的获得

1）OseIF4A的克隆

利用引物ATGGCGGGAATGGCACCAG和TCACAGAAGGTCAGCGACGT，以水稻cDNA为模版，通过普通PCR扩增而来。水稻的cDNA合成、PCR反应条件与实例1相同。

2）载体构建

利用引物CTCTAGAATGGCGGGAATGGCACCAG（下划线表示XbaI酶切位点）和CGTCGACTCACAGAAGGTCAGCGACGT（下划线表示SalI酶切位点），以上述获得的OseIF4A全长为模版，与上述同样的条件下扩增获得含有酶切位点的OseIF4A序列，通过常规的酶切、连接连入双元表达载体pCV1300的多克隆位点。构建完成的载体图谱如图1B显示。

3）农杆菌转化、阳性克隆的鉴定与保存

按实例1中的方法进行。

2. 农杆菌介导水稻成熟胚的遗传转化

1) 菌液的准备

取-70 ℃保存的阳性转化菌株，于含50 μg/ml卡那霉素 (Kan) 和100 μg/ml利福平 (Rif) 平板上划线，28 ℃培养至形成单菌落，挑取单菌落于含50 μg/ml Kan、100 ug/ml Rif的YEP液体培养基中培养，28℃，220rpm振荡培养24 h；将菌液按1:100用YEP 培养基稀释，继续震荡培养至OD₆₀₀为0.6左右。

2) 水稻成熟胚愈伤组织的诱导与培养

取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子。将种子放入100 ml无菌烧杯中，倒入70%酒精消毒1分钟，无菌水洗3遍；加入100 ml 20%次氯酸钠（NaClO）溶液，浸泡30分钟；倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟；种子放在无菌滤纸上吸干，置入成就胚诱导培养基中，每皿12－14颗；操作完毕用封口膜（Micropore ^TM Surgical Tape）封好培养皿，在28℃光照培养箱，培养3周；在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），置入继代培养基中，在28℃光照培养箱，继代培养1周。

3）愈伤组织与农杆菌的共培养

收集菌体，用含200 µmol/L As的AAM感菌液制成悬浮液，使菌液OD₆₀₀的终浓度为0.1左右；将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5分钟；将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40分钟；将愈伤组织置于共培养基上。26℃暗培养2.5天。

4）抗性愈伤的筛选与分化

将愈伤组织取出，用无菌水清洗1遍，再用含500 mg/L头孢拉定（或头孢噻肟钠）的无菌水浸泡30 min，清洗3遍，置于无菌滤纸上沥干2小时。随后将晾干的愈伤转入选择培养基上进行第一轮选择，28℃，光照培养14天；将长有抗性愈伤的初始愈伤进行第二轮选择，28℃，光照培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出；挑取颜色鲜黄的抗性愈伤3-4颗，移入装有分化培养基的塑料广口瓶中（每瓶放置4颗），放入恒温培养室中，等待分化成苗（15-30天）。

5）生根壮苗和移载

当抗性愈伤组织分化的芽长至约2 cm时,将小苗移到生根培养基上,培养两周左右。选择高约10 cm、根系发达的小苗，洗去培养基，在温室内移栽入土。水面以不淹没小苗为度。

3. 转基因再生水稻的分子生物学检测

利用Trizol方法提取3个转基因株系（OE-3-1，-9-8，-11-1）的总RNA，反转获得cDNA，以为上下游引物ATCTGGGTGTGAAGGTTCAT和CTTGAAACCTCTAGAGAGCA进行real-timePCR，分析OseIF4A在转基因本氏烟体内的表达水平。结果表明OseIF4A基因在转基因本氏烟体内的表达水平显著高于对照非转基因植株，说明OseIF4A基因已经在转基因植株体内超表达（图4）。

4. 转基因水稻RSV接种鉴定

本发明选取T2代阳性转OseIF4A水稻进行RSV接种鉴定。具体操作内容如下：

1）利用携带RSV灰飞虱对转OseIF4A水稻进行饲毒

选取转OseIF4A水稻3个株系，进行浸种与催芽，每个株系选取20-30粒健康种子。种子露白之后进行种植，每株系分别种植在7cm×10cm的营养钵中。用未转基因的野生株（日本晴）作为对照。

植株生长到1.5-2叶期，将其转入接虫笼中，按照有效接虫量3-5头/株，将2-4龄的带毒灰飞虱转入接虫笼，对转基因植株与野生株进行饲毒48-72h。接虫期间，每天赶虫2次，确保接种的稻苗均匀获毒。

饲毒完成后，移除所有灰飞虱，将植株移栽到大田，进行病害调查与分析。

2）转OseIF4A水稻的RSV接种鉴定

跟踪观察转基因植株与野生株的表型差异与发病情况。发现转基因植株（OE-3-1，-9-8，-11-1）的存活率明显高于对照株，统计数据分析发现对照组（WT）多数为感病植株，健康植株少，且感病植株很多都已死亡枯萎，其余感病株生长矮小，叶片枯黄严重；而超表达转基因株系中感病株明显少于对照，多数能够正常生长，感病株死亡率明显低于对照（图5）。

实施例3 转突变结合位点的OseIF4A基因（OseIF4Am）水稻的获得与RSV接种分析

实施例1和2表明分别转有NbeIF4A和OseIF4A的本氏烟和水稻都表现对RSV的耐受性。由于病毒来源的vsiRNA针对OseIF4A基因的切割和降解作用是通过与该基因的第439-460位核苷酸互补配对方式完成的，因而，我们推测表达结合位点突变了的eIF4A基因也应该能赋予植物对RSV的耐受性。对此，我们开展了试验。

1.重组农杆菌的获得

1）OseIF4Am的克隆

利用引物ATGGCGGGAATGGCACCAG和AAGAATCCTTTGGTCCTGTG CCACAGAAGTACCTCCAACACAA，以pCV1300-OseIF4A为模板，进行第一次PCR；利用引物TTGTGTTGGAGGTACTTCTGTGGCACAGGACCAAAGGATTCTT和TCACAGAAGGTCAGCGACGT，以pCV1300-OseIF4A为模板，进行第二次PCR；利用引物CTCTAGAATGGCGGGAATGGCACCAG（下划线表示XbaI酶切位点）和CGTCGACTCACAGAAGGTCAGCGACGT（下划线表示SalI酶切位点），以第一次和第二次PCR产物分别稀释10000倍后的混合物为模板进行第三次PCR，获得结合位点发生突变的OseIF4Am全长片段，该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：3。

2）载体构建

通过常规的酶切、连接将上述片段连入双元表达载体pCV1300的多克隆位点。构建完成的载体pCV1300-OseIF4Am图谱如图1C显示。

3）农杆菌转化、阳性克隆的鉴定与保存

按实例2中的方法进行。

2. 农杆菌介导的水稻遗传转化

按实例2中的方法进行。

3. 转基因再生水稻的OseIF4Am表达量检测

按实例2中的方法进行。

4. 转基因水稻RSV接种鉴定

本发明选取T3代的3个转OseIF4Am水稻株系（OseIF4Am-OE-1，-2，-3），按实例2的接种方法接毒，进行RSV接种鉴定。结果与转OseIF4A基因水稻相似，相对于对照植株全部矮化，转基因植株3个株系平均株高显著高于对照植株（图6），表现了转基因植株对RSV的耐受性。

<110>浙江省农业科学院

<120>两种植物eIF4A基因及其用于制备转基因耐水稻条纹病毒植物体的应用

<130>无

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<141>

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<210> 1

<211> 1242

<212> DNA

<213> 本氏烟（Nicotiana benthamiana）

<400> 1

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1081 gagaactacc tgcatcgcat tggtcgtagt ggtcgttttg gtaggaaagg tgttgccatt

1141 aactttgtga cccgtgacga tgagaggatg ctgtttgaca tccagaggtt ctacaatgtg

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Claims (2)

1.水稻OseIF4A基因的用途，该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示，其特征在于：该基因用于制备转基因耐受水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)侵染的水稻。

2.水稻OseIF4A基因突变体的用途，该基因突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示，其特征在于：该基因突变体用于制备转基因耐受水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)侵染的水稻。