EA038896B1 - Способ осуществления сайт-направленной модификации растительных геномов с использованием ненаследуемых материалов - Google Patents

Способ осуществления сайт-направленной модификации растительных геномов с использованием ненаследуемых материалов Download PDF

Info

Publication number
EA038896B1
EA038896B1 EA201792036A EA201792036A EA038896B1 EA 038896 B1 EA038896 B1 EA 038896B1 EA 201792036 A EA201792036 A EA 201792036A EA 201792036 A EA201792036 A EA 201792036A EA 038896 B1 EA038896 B1 EA 038896B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
plant
gene
target
site
nuclease
Prior art date
Application number
EA201792036A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201792036A1 (ru
Inventor
Каиксиа Гао
Жен Лианг
Янпенг Ванг
Киуей Шан
Кианна Сонг
Original Assignee
Институт Генетики И Биологии Развития Академии Наук Китая
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Институт Генетики И Биологии Развития Академии Наук Китая filed Critical Институт Генетики И Биологии Развития Академии Наук Китая
Publication of EA201792036A1 publication Critical patent/EA201792036A1/ru
Publication of EA038896B1 publication Critical patent/EA038896B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
    • C12N15/8207—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated by mechanical means, e.g. microinjection, particle bombardment, silicon whiskers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/06—Processes for producing mutations, e.g. treatment with chemicals or with radiation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

В изобретении раскрывается способ осуществления сайт-направленной модификации растительного генома с использованием ненаследуемых материалов. Способ по данному изобретению включает, в частности, следующие этапы: введение ненаследуемого материала в клетку или ткань либо часть растения интереса, при этом ненаследуемый материал представляет собой нуклеазу, специфичную в отношении целевого фрагмента, либо mРНК, экспрессирующую нуклеазу, целевой фрагмент расщепляется нуклеазой, и сайт-направленная модификация целевого фрагмента достигается путем репарации ДНК растения. Путем введения ненаследуемого материала последовательность-специфической нуклеазы может быть достигнута сайт-направленная мутация гена растения, при этом получаемое растение не будет содержать внедренные экзогенные гены или фрагменты нуклеиновой кислоты. Таким образом, настоящее изобретение может способствовать более точному исследованию функций генома и повышению биобезопасности в селекционной деятельности.

Description

Область техники
Настоящее изобретение относится к области генетической инженерии растений и касается способа осуществления сайт-направленной модификации растительных геномов с использованием ненаследуемых материалов, в частности нетрансгенного метода осуществления сайт-направленной модификации растительного генома с использованием белка или mРНК.
Предпосылки создания изобретения
Технология редактирования генома является наиболее обещающим инструментом для исследования функции генов и генетического улучшения культурных растений. Технологии редактирования генома, которые используются в настоящее время, включают нуклеазы цинковые пальцы (ZFN), эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN) и короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами/CRISPR-ассоциированные системы (CRISPR/Cas9), которые называются последовательность-специфическими нуклеазами (SSN). Их общим признаком является то, что они могут действовать в качестве эндонуклеазы для расщепления специфических последовательностей ДНК с образованием в ДНК двухцепочечных разрывов (DSB). DSB способны активировать внутренний механизм репарации клеток - негомологичное соединение концов (NHEJ) и гомологичную рекомбинацию (HR) - для репарации повреждений ДНК. Сайт-направленная замена или инсерция может обеспечивать получение мутантов. В настоящее время технологии редактирования геномов эффективно используются в отношении некоторых растений (например, риса, Arabidopsis, кукурузы, пшеницы) для модификации растительных геномов и демонстрируют значительный потенциал в плане улучшения агрономических признаков важнейших сельскохозяйственных культур.
Тем не менее, несмотря на то, что редактирование геномов подает большие надежды на улучшение сельскохозяйственных культур, с его применением связаны и большие вызовы. Для осуществления редактирования генома необходимо, чтобы последовательность-специфическая нуклеаза экспрессировалась в клетке. В настоящее время метод экспрессии последовательность-специфической нуклеазы в растительных клетках заключается в доставке экспрессионного вектора или фрагмента ДНК, экспрессирующего нуклеазу, в клетки посредством стандартных методов трансформации (Agrobacteriumопосредованной трансформации, бомбардировки частицами, микроинъекций и т.п.). Такие наследуемые материалы случайно интегрируются в растительную хромосому и транскрибируются для осуществления редактирования. Указанные стандартные подходы к трансформации связаны с внедрением экзогенных генов в растительный геном и требуют присутствия селективных маркеров (селективное давление) в процессе трансформации, что может приводить к нежелательным фенотипам. Использование получаемых в результате растений подпадает под регулирование ГМО. Таким образом, существует необходимость в разработке метода осуществления редактирования генома растений без введения наследуемого материала ДНК.
Краткое изложение сущности изобретения
Целью изобретения является обеспечение способа осуществления сайт-направленной модификации целевого фрагмента гена-мишени растения.
Способ осуществления сайт-направленной модификации целевого фрагмента гена-мишени растения по данному изобретению, в частности, включает следующие этапы: введение ненаследуемого материала в клетку или ткань либо часть растения интереса; при этом ненаследуемый материал представляет собой нуклеазу, специфичную в отношении целевого фрагмента, или mРНК, экспрессирующую нуклеазу, целевой фрагмент расщепляется нуклеазой, и сайт-направленная модификация целевого фрагмента достигается путем репарации ДНК растения.
В способе по настоящему изобретению ненаследуемый материал вводится в клетку или ткань либо часть растения интереса. Ненаследуемый материал может экспрессировать нуклеазу для осуществления сайт-направленной модификации целевого фрагмента либо ненаследуемый материал может направлять на целевой фрагмент действие нуклеазы и приводить к сайт-направленной модификации. В процессе модификации или после нее ненаследуемый материал может деградировать вследствие метаболизма в клетке. Модифицированная клетка или ткань могут быть регенерированы в интактное растение путем использования традиционного метода культуры ткани. В результате получают нетрансгенное растение, в котором модифицирован только целевой фрагмент и отсутствует введенный экзогенный наследуемый материал.
В способе по настоящему изобретению нуклеаза представляет собой нуклеазу TALEN, нуклеазу цинковые пальцы, нуклеазу CRISPR/Cas9 либо любую другую нуклеазу, с помощью которой может достигаться редактирование генома.
Соответственно выбираемый ненаследуемый материал может представлять собой любой из следующих (а)-(с):
(a) ненаследуемый материал представляет собой нуклеазу TALEN или mРНК, способную экспрессировать спаренные белки TALEN; при этом белок TALEN состоит из ДНК-связывающего домена, способного узнавать целевой фрагмент и связываться с ним, и домена Fok I.
В варианте осуществления изобретения (пример 1) ненаследуемый материал включает mРНК, содержащие последовательности SEQ ID NO: 3 и 4. В еще одном варианте осуществления изобретения
- 1 038896 (пример 2) ненаследуемый материал включает белки SEQ ID NO: 7 и 8;
(b) ненаследуемый материал представляет собой нуклеазу цинковые пальцы или mРНК, способную экспрессировать спаренные белки ZFN; при этом белок ZFN состоит из ДНК-связывающего домена, способного узнавать целевой фрагмент и связываться с ним, и домена Fok I.
(c) ненаследуемый материал включает белок Cas9 или mРНК, способную экспрессировать белок Cas9, а также направляющую РНК; при этом направляющая РНК представляет собой РНК палиндромной структуры, образующуюся путем частичного спаривания оснований между сгРНК и tracrРНК; сгРНК содержит фрагмент РНК, способный комплементарно связываться с целевым фрагментом.
В варианте осуществления изобретения (пример 3) ненаследуемый материал включает белок, как показано в SEQ ID NO: 10, и sgРНК, как показано в SEQ ID NO: 11. В еще одном варианте осуществления изобретения (пример 4) ненаследуемый материал включает белок, как показано в SEQ ID NO: 10, и sgРНК, как показано в SEQ ID NO: 12.
В способе по настоящему изобретению клетка может представлять собой любую клетку, в которую может быть введен ненаследуемый материл и которая может быть регенерирована в интактное растение посредством культуры ткани. Ткань может представлять собой любую ткань, в которую может быть введен ненаследуемый материал и которая может быть регенерирована в интактное растение посредством культуры ткани. Часть растения представляет собой часть интактного растения (не ex vivo часть), в которую может быть введен ненаследуемый материал.
В частности, клетка может представлять собой протопласт клетки или суспензию клетки. Ткань может представлять собой каллус, незрелый зародыш либо зрелый зародыш. Часть может представлять собой лист, вершину побега, гипокотиль, молодое соцветие или пыльцевую трубку.
В способе по настоящему изобретению подходами, применяемыми для введения ненаследуемого материала в клетку или ткань либо часть растения интереса, могут быть бомбардировка частицами, PEGопосредованная трансформация протопласта, трансформация с использованием прорастающих пыльцевых трубок, а также любые другие подходы введения ненаследуемого материала.
В способе по настоящему изобретению сайт-специфическая модификация представляет собой инсерцию, делецию и/или замену нуклеотида в целевом фрагменте.
Еще одной целью изобретения является способ получения нетрансгенного мутантного растения.
Способ получения нетрансгенного мутантного растения по данному изобретению может, в частности, включать следующие этапы: осуществление сайт-направленной модификации целевого фрагмента гена-мишени растения интереса и получение, таким образом, растения, в котором функции гена-мишени утрачены или изменены и геном которого свободен от внедренного экзогенного гена.
Согласно настоящему изобретению растение может быть однодольным или двудольным растением. В некоторых вариантах осуществления изобретения таким растением является рис, кукуруза, пшеница или табак.
В отличие от наследуемого материала ДНК белок и mРНК представляют собой два вида ненаследуемых материалов, которые могут легко деградировать в клетке при помощи механизма защиты. Посредством транзиентного введения mРНК или белка последовательность-специфической нуклеазы могут быть получены мутанты с нокаутом генов без внедрения гена последовательность-специфической нуклеазы или фрагмента вектора в геном плоскостного расположения, в частности, свободные от трансгена. Способ по данному изобретению позволяет достичь более высокой биобезопасности. Сорта культурных растений, полученные в соответствии с данным способом, не подлежат регулированию как содержащие ГМО. Настоящее изобретение имеет исключительно большое значение для фундаментальных исследований и для селекции сельскохозяйственных культур.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показано получение мутаций гена TaGW2 путем трансформации незрелого зародыша пшеницы с использованием mРНК Cas9 и sgРНК. А: гельэлектрофореграмма Cas9-mРНК, in vitro транскрибированной с помощью набора для транскрипции mРНК (AM1344, Ambion). В: результаты ПЦР-RE, показывающие мутации в целевом участке TaGW2 у растений Т0, полученные при помощи шРНК Cas9 и sgРНК-GW2-С14. С: результаты секвенирования, указывающие на то, что in vitro транскрибированная шРНК Cas9 и sgРНК-GW2-C14 индуцировали мутации в целевом участке. WT означает последовательность гена дикого типа, - означает последовательность с делецией, + означает последовательность с инсерцией, -/+ означает количество делетированных или инвертированных нуклеотидов.
На фиг. 2 показано получение мутаций гена OsBADH2 путем транзиентной трансформации протопластов риса с использованием шРНК-TALEN. А: гельэлектрофореграмма, показывающая in vitro транскрипцию T-BADH2b-L и T-BADH2b-R с помощью набора для транскрипции шРНК (AM1344, Ambion), и что к З'-концу шРНК добавлен PolyA-хвост. В: результаты ПЦР-RE, показывающие мутации в целевом участке, полученные при помощи in vitro транскрибированной шРНК в протопластах. С: результаты секвенирования, указывающие на то, что in vitro транскрибированная шРНК индуцировала мутации в целевом участке. WT означает последовательность гена дикого типа, - означает последовательность с делецией, + означает последовательность с инсерцией, -/+ означает количество делетированных или инсертированных нуклеотидов.
- 2 038896
На фиг. 3 показан мутагенез гена MLO пшеницы путем трансформации протопластов пшеницы с использованием белков MLO-TALEN. А: результаты SDS-PAGE, показывающие прокариотическую экспрессию и очистку T-MLO-L и T-MLO-R в отношении целевого участка MLO. В: результаты ПЦР-RE, показывающие мутации в целевом участке, полученные при помощи белков TALEN в протопластах. С: результаты секвенирования, указывающие на то, что полученные in vitro белки TALEN индуцировали мутации в целевом участке. WT означает последовательность гена дикого типа, - означает последовательность с делецией, + означает последовательность с инсерцией, -/+ означает количество делетированных или инсертированных нуклеотидов.
На фиг. 4 показан мутагенез гена TaGASR7 пшеницы путем трансформации протопластов пшеницы с использованием белка Cas9 и in vitro транскрибированной sgРНК. А: результаты SDS-PAGE, показывающие прокариотическую экспрессию и очистку белка Cas9. В: результаты ПЦР-RE, показывающие мутации в целевом участке, полученные при помощи белка Cas9 и in vitro транскрибированной sgРНК. С: результаты секвенирования, указывающие на то, что полученный in vitro белок Cas9 и in vitro транскрибированная sgРНК индуцировали мутации в целевом участке. WT означает последовательность гена дикого типа, - означает последовательность с делецией, + означает последовательность с инсерцией, -/+ означает количество делетированных или инсертированных нуклеотидов.
На фиг. 5 показано получение мутаций гена NtPVY путем котрансформации белком Cas9 и in vitro транскрибированной sgРНК в протопластах табака, а также получение мутантных растений путем регенерации. А: результаты ПЦР-RE протопластов, показывающие мутации в целевом участке, полученные при помощи белка Cas9 и in vitro транскрибированной sgРНК. В: результаты секвенирования, указывающие на то, что котрансформация полученным in vitro белком Cas9 и in vitro транскрибированной sgРНК в протопластах табака индуцировала мутации в целевом участке. С: детекция мутантных растений, регенерированных из протопластов, и результаты секвенирования целевых участков. WT означает последовательность гена дикого типа, - означает последовательность с делецией, + означает последовательность с инсерцией, -/+ означает количество делетированных или инсертированных нуклеотидов.
Подробное описание вариантов осуществления изобретения
Все экспериментальные способы, использованные в следующих примерах, представляют собой традиционные способы, если не указано иное.
Все материалы и реагенты, использованные в следующих примерах, получены из коммерческих источников, если не указано иное.
Сорт пшеницы Bobwhite раскрыт в Weeks, J.T. и соавт. Быстрое производство множества независимых линий фертильной трансгенной пшеницы. Plant Physiol. 102: 1077-1084, (1993) и может быть получен в Институте генетики и биологии развития Китайской академии наук.
Вектор T-MLO для таргетирования гена TaMLO пшеницы с помощью TALENs раскрыт в Wang, Y., Cheng, X., Shan, Q., Zhang, Y., Liu, J., Gao, С. и Qiu. J.L. (2014). Совместное редактирование трех гомеоаллелей в гексаплоидной мягкой пшенице придает наследуемую устойчивость к мучнистой росе. Nature Biotechnology. 32, 947-951 и может быть получен в Институте генетики и биологии развития Китайской академии наук.
Прокариотический экспрессионный вектор pGEX-4T получен от Shanghai BeiNuo Biotechnolgy Co. Ltd., Cat. No. 1110024.
Вектор pXT7-Cas9, in vitro транскрибированной Cas9-mРНК, раскрыт в Chang N., Sun C., Gao L., Zhu D., Xu X. и соавт., 2013. Редактирование генома РНК-направляемой нуклеазой Cas9 в эмбрионах данио-рерио. Cell research 23:465-72 и может быть получен у авторов.
Вектор pT7-gRNA раскрыт в Программируемая двухкомпонентная РНК-направляемая ДНКэндонуклеаза в адаптивной иммунной системе бактерий. Science 337(6096):816-821 и может быть получен в Институте генетики и биологии развития Китайской академии наук.
Кукуруза сорта HiII раскрыта в Armstrong, C.L., Green, C.E. & Phillips, R.L. Создание и доступность идиоплазмы с высоким уровнем формирования культур класса II. Maize Genet. Coop. News Lett. 65,92-93 (1991) и может быть получена в Институте генетики и биологии развития Китайской академии наук.
Растворы, использованные для приготовления и трансформации протопласта риса, представлены в табл. 1-5.
- 3 038896
50-мл раствор для энзимолиза
Таблица 1
Добавляемое количество Окончательная концентрация
Целлюлоза R10 0,75 г 1,5%
Мацерозим R10 0,375 г 0,75%
Маннитол 5,4651 г 0,6 М
2-(N- морфолино)этансульфоновая кислота 0,1066 г 10 мМ
доводили раствор водой двойной дистилляции до 50 мл, pH регулировали до 5,7 с помощью КОН; инкубировали на водяной бане при 55°C в течение 10 мин и охлаждали при комнатной температуре перед добавлением
СаС12 0,0735 г 10 мМ
BSA 0,05 г 0,1%
фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм
500-мл W5
Таблица 2
Добавляемое количество Окончательная концентрация
NaCl 4,5 г 154 мМ
СаС12 9,189 г 125 мМ
КС1 0,1864 г 5 мМ
2-(N- морфолино)этансульфоновая кислота 0,2132 г 2 мМ
доводили раствор водой двойной дистилляции до 500 мл, pH регулировали до 5,7 с помощью NaOH
10-мл раствор MMG
Таблица 3
Добавляемое количество Окончательная концентрация
Маннитол (0,8 М) 5 мл 0,4 М
MgCl2 (1 М) 0,15 мл 15 мМ
2-(N- морфолино)этансульфоновая кислота 0,2 мл 4 мМ
Вода двойной дистилляции Доводили до 10 мл
4-мл раствор PEG
Таблица 4
Добавляемое количество Окончательная концентрация
PEG4000 1,6 г 40%
Маннитол (0,8 М) 1 мл 0,2 М
СаС12 (1 М) 0,4 мл 0,1 М
Вода двойной дистилляции Доводили до 4 мл
Таблица 5
250-мл раствор WI ______________
Добавляемое количество Окончательная концентрация
Маннитол 27,324 г 0,6 М
КС1 0,0745 г 4 мМ
2-(N- морфолино)этансульфоновая кислота (200 мМ) 0,2135 г 4 мМ
доводили раствор водой двойной дистилляции до 250 мл, pH регулировали до 5,7 с помощью КОН
В табл. 1-5 выше % раствора означает количество единиц массы в единице объема, т.е. выражение 1% раствор означает, что в 100 мл жидкости находится 1 г вещества.
Среды, применяемые для культивирования ткани пшеницы, включают гипертонический раствор: минимальная среда MS с добавлением 90 г/л маннитола, 5 мг/л 2,4-D, 30 г/л сахарозы и 3 г/л фитогеля, рН 5,8;
индукционную среду: минимальная среда MS с добавлением 2 мг/л 2,4-D, 0,6 мг/л сульфата меди, 0,5 мг/л казеиновых гидролизатов, 30 г/л сахарозы и 3 г/л фитогеля, рН 5,8;
среду для дифференциации: минимальная среда MS с добавлением 0,2 мг/л кинетина, 30 г/г сахарозы и 3 г/л фитогеля, рН 5,8;
среду для корнеобразования: 1/2 минимальной среды MS с добавлением 0,5 мг/л метансульфоновой кислоты, 0,5 мг/л α-нафтилуксусной кислоты, 30 г/л сахарозы и 3 г/л фитогеля, рН 5,8.
Пример 1. Сайт-направленное редактирование TaGW2 путем трансформации незрелого зародыша пшеницы при помощи in vitro транскрибированной mРНК Cas9 и sgРНК.
- 4 038896
I. Дизайн целевого фрагмента: мишень-С14.
Мишень-С14: 5’-CCAGGATGGGGTATTTCTAGAGG-3, (в консервативной области экзона 8 гена TaGW2 пшеницы, группы А, В и D).
II. In vitro транскрипция и очистка Cas9-mPHK.
1. Вектор pXT7-Cas9 переваривали при помощи Xbal. Переваренный продукт очищали с использованием набора для очистки (Axygen) до концентрации, превышающей 100 нг/мкл, и обозначали как pXT7-Cas9-XbaI.
2. Очищенный продукт pXT7-Cas9-XbaI транскрибировали с применением набора для in vitro транскрипции (АМ1344, Ambion). Продукт очищали с использованием набора для очистки mPHK (АМ1908, Ambion) до концентрации, превышающей 500 нг/мкл. Электрофореграмма в агарозном геле in vitro транскрибированной Cas9-mPHK показана на фиг. 1А.
III. In vitro транскрипция sgPHK против целевого участка.
1. Целевой участок TaGW2 встраивали в вектор pTaU6-gRNA.
Были синтезированы следующие одноцепочечные олигонуклеотиды с липкими концами (подчеркнуты):
С14F: 5’-CTTGCAGGATGGGGTATTTCTAG-3’;
С14R: 5’-AAACCTAGAAATACCCCATCCTG-3'.
Образовали двухцепочечную ДНК с липкими концами посредством расщепления C14F и C14R и инсертировали между двумя сайтами рестрикции BbsI плазмиды pTaU6-gRNA, в результате получали плазмиду pTaU6-gRNA, содержащую сайт С14. Позитивный контроль плазмиды выполняли путем секвенирования. Рекомбинантная плазмида, полученная инсертированием фрагмента ДНК, как показано в 5'- CTTGCAGGATGGGGTATTTCTAG-3 в прямом направлении в сайт рестрикции BbsI плазмиды pTaU6-gRNA, была позитивной и была обозначена как pTaU6-gRNA-C14.
2. In vitro амплификация и очистка фрагмента ДНК T7-TaGW2-gRNA.
Дизайн праймера.
T7-GW2-F: TAATACGACTCACTATAGGCAGGATGGGGTATTTCTAG;
gRNA-PCR-R: AGCACCGACTCGGTGCCACTT.
ПЦР-амплификацию проводили с использованием pTaU6-gRNA-C14 в качестве матрицы. Продукт ПЦР очищали с использованием набора для очистки продуктов ПЦР (AP-GX-250G, Axygen) до концентрации, превышающей 100 нг/мкл. Получаемый в результате продукт ПЦР представлял собой sgPHK, содержащую промотор Т7 и целевой участок TaGW2, и был обозначен как T7-TaGW2-gRNA.
3. In vitro транскрипция sgPHK, содержащей целевой участок TaGW2 sgRNA-GW2-C14 (как показано в SEQ ID NO: 17) in vitro транскрибировали с использованием набора для in vitro транскрипции, содержащего Т7 (E2040S, NEB).
IV. Сайт-направленное редактирование гена TaGW2 пшеницы путем трансформации бомбардировкой частицами in vitro транскрибированной Cas9-mPHK и in vitro транскрибированной sgPHK.
1. Загрузка in vitro транскрибированной Cas9-mPHK и in vitro транскрибированной sgPHK в 0,6 нм золотой порошок.
мкл 0,6 нм золотого порошка, 3 мкл Cas9-mPHK, 1 мкл sgRNA-GW2-C14, 1 мкл 5 М уксуснокислого аммония, 20 мкл изопропанола смешивали и осаждали при -20°С в течение 1 ч, чтобы обеспечить соединение Cas9-mPHK и sgRNA-GW2-C14 с золотым порошком. Смесь центрифугировали 5 с при 1000 об/мин и промывали 100 мкл дегидратированного спирта после удаления супернатанта, затем снова центрифугировали 5 с при 1000 об/мин и ресуспендировали в 20 мкл дегидратированного спирта после удаления супернатанта.
2. Трансформация материалов-реципиентов пшеницы с использованием бомбардировки частицами.
1) Брали незрелые зародыши пшеницы сорта KN199 и погружали на 4 ч в гипертонический раствор.
2) Обстрел незрелых зародышей пшеницы, культивировавшихся в гипертоническом растворе на этапе 1), проводили посредством устройства для бомбардировки частицами. 20 мкл смеси sgPHK-Cas9mPHK загружали на мембрану и проводили бомбардировку; расстояние от источника частиц составляло 6 см, сила давления - 1100 psi, диаметр ствола источника частиц -2 см.
3) Незрелые зародыши пшеницы, подвергшиеся бомбардировке частицами на этапе 2), затем культивировали в гипертоническом растворе в течение 16 ч.
4) Незрелые зародыши пшеницы, культивировавшиеся в гипертоническом растворе на этапе 3), затем последовательно подвергали культивированию в индукционной среде в течение 14 дней для образования каллусной ткани, культивированию в среде для дифференциации в течение 28 дней и культивированию в среде для корнеобразования в течение 14-28 дней для получения растений пшеницы.
5) ДНК выделяли из проростков пшеницы, полученных на этапе 4), и проводили детекцию мутантов с генным нокаутом (сайт-направленных) посредством ПЦР/RE-tcctob (что касается конкретного метода, см. этап IV). Пшеницу сорта KN199 дикого типа использовали в качестве контроля.
Поскольку в целевом фрагменте эндогенного гена TaGW2 пшеницы имеется последовательность,
-5038896 узнаваемая эндонуклеазой рестрикции XbaI, XbaI использовали для проведения ПЦР-RE тестов. Праймеры, использовавшиеся для ПЦР-амплификации, представляли собой праймеры, специфичные в отношении групп А, В и D, и имели следующие последовательности:
TaGW2-AF: 5'-CTGCCATTACTTTGTATTTTGGTAATA-3';
TaGW2-BF: 5'-GTTCAGATGGCAATCTAAAAGTT-3';
TaGW2-DF: 5'-GCATGTACTTTGATTGTTTGCGTGA-3';
TaGW2-R: 5'-TCCTTCCTCTCTTACCACTTCCC-3'.
Результаты некоторых тестов детекции указывали на то, что в целевом участке гена TaGW2 пшеницы произошли мутации. Полоски выделяли для секвенирования. Результаты секвенирования показали, что в целевом участке гена TaGW2 пшеницы имела место инсерция/делеция (индел) (фиг. 1В и С).
Пример 2. Сайт-направленное редактирование гена OsBADH2 путем трансформации протопластов риса при помощи in vitro транскрибированной mРНК TALEN.
I. Целевой фрагмент TALEN.
Последовательность гена BADH2 риса показана в SEQ ID NO: 1.
Целевой фрагмент TALEN расположен в 4 экзоне гена BADH2 риса и имеет следующую последовательность:
5'-GCTGGATGCTTTGAGTActttgcagatcttgcagaATCCTTGGACAAAAGGC-3' (позиции 1589-1640 последовательности SEQ ID NO: 1); строчными буквами в центре обозначена последовательность спейсера; фланкирующие прописные буквы означают последовательности, узнаваемые TALEN-модулями (обозначены как L-b и R-b). Подчеркнутые буквы представляют собой последовательность, узнаваемую BglII.
II. Дизайн и синтез кодирующих генов TALEN.
Белок TALEN, который узнает L-b в целевой последовательности, был обозначен как T-BADH2b-L, кодирующая последовательность показана в позициях 7-2952 SEQ ID NO: 2. В позициях 7-27 последовательности SEQ ID NO: 2 кодируется сигнал ядерной локализации (NLS); в позициях 463-2154 кодируется последовательность L-b, узнающая белок модуля; в позициях 2350-2953 (603 п.о.) кодируется эндонуклеаза Fok I.
Белок TALEN, который узнает R-b в целевой последовательности, был обозначен как T-BADH2b-R, кодирующая последовательность показана в позициях 3085-6018 SEQ ID NO: 2. В позициях 3085-3105 последовательности SEQ ID NO: 2 кодируется сигнал ядерной локализации (NLS); в позициях 3541-5232 кодируется последовательность L-b, узнающая белок модуля; в позициях 5428-6018 (591 п.о.) кодируется эндонуклеаза Fok I.
В позициях 2953-3006 последовательности SEQ ID NO: 2 кодируется Т2А, состоящий из 18 аминокислот, который обеспечивает разделение Т-BADH2b-L и T-BADH2b-R, экспрессируемых в той же экспрессионной кассете, на два отдельных белка.
III. In vitro синтез mРНК гена TALEN.
Два компонента TALEN гена BADH2 риса, BADH2b-L и T-BADH2b-R, in vitro транскрибировали при помощи набора для транскрипции шРНК (Ambion) с использованием промотора Т7 для инициации транскрипции. Получали mRNA-L-T-OsBADH2b и mRNA-R-T-OsBADH2b, к их 3'-концам добавляли PolyA-хвосты, чтобы увеличить стабильность mРНК.
Последовательность mRNA-L-T-OsBADH2b показана в SEQ ID NO: 3, а последовательность mRNA-R-T-OsBADH2b - в SEQ ID NO: 4.
IV. Введение смеси двух mРНК TALEN, полученных путем in vitro транскрипции, в протопласты риса.
1. Приготовление материалов.
Использовали рис сорта Nipponbare. Семена промывали 75%-ным этанолом, затем обрабатывали 2,5%-ным гидрохлоридом натрия в течение 20 мин, более 5 раз промывали стерильной водой и культивировали на среде 1/2 MS в течение 7-10 дней при 26°C и длительности освещения 12 ч/сут (150 мкмоль/мАс1). В большом стеклянном культуральном сосуде можно выращивать 15 семян. Для одного эксперимента требуется 40-60 сеянцев, и количество выделяемых протопластов достаточно для трансформации 6 плазмид.
2. Выделение протопластов.
1) Протопласты выделяли из проростков и листовых влагалищ, из которых нарезали 0,5 мм нити;
2) нити сразу же помещали в 0,6 М раствор маннитола и выдерживали в течение 10 мин в темноте;
3) раствор маннитола удаляли путем фильтрации, нити помещали в раствор для энзимолиза, проводили обработку в вакуумном насосе в течение 30 мин при -15—20 (mmHg) в темноте;
4) пробы дополнительно переваривали в течение 4-5 ч при бережном встряхивании (на шейкере при скорости 10 об/мин);
5) после переваривания добавляли равный объем раствора W5 и раствор встряхивали 10 с для высвобождения протопластов;
- 6 038896
6) протопласты фильтровали в 50-мл круглодонную центрифужную пробирку с использованием нейлоновой фильтровальной мембраны с размером пор 40 мкм и добавляли раствор W5 для промывки;
7) проводили центрифугирование 3 мин при 250 г для осаждения протопластов и супернатант сливали;
8) протопласты ресуспендировали в 10 мл W5, центрифугировали 5 мин при 250 г и супернатант сливали;
9) протопласты ресуспендировали путем добавления соответствующего количества раствора MMG. Концентрация протопластов составила 2х106/мл, подсчет проводился при помощи гемоцитометра.
Примечание: все вышеуказанные этапы осуществлялись при комнатной температуре.
3. Трансформация протопластов.
1) 10 мкг mRNA-L-T-OsBADH2b и 10 мкг mRNA-R-T-OsBADH2b вносили в 2 мл центрифужную пробирку. Добавляли 200 мкл протопластов (около 4х105 клеток). Добавляли 220 мкл свежего раствора PEG и перемешивали. Трансформацию осуществляли 10-20 мин при комнатной температуре в темноте;
2) после трансформации медленно прибавляли 880 мкл W5 и перемешивали путем реверсивного вращения, проводили центрифугирование (250 г, 3 мин), супернатант сливали;
3) протопласты ресуспендировали путем добавления 1 мл WI и переносили в 6-луночный культуральный планшет (с заранее добавленным в луночки 1 мл раствора WI) и затем культивировали при комнатной температуре или 28°C в темноте в течение 6-16 ч (в течение 48 ч, если протопласты использовались для выделения геномной ДНК);
4. Проведение ПЦР/RE-экспериментов для анализа мутагенеза эндогенного гена BADH2 риса, получаемого в результате in vitro транскрипции TALEN.
Через 48 ч после трансформации протопластов выделяли геномную ДНК, которую использовали в качестве матрицы для проведения ПЦР/RE (полимеразная цепная реакция/рестриктное расщепление). Одновременно протопласты риса сорта Nipponbare дикого типа использовали в качестве контроля. Анализ методом ПЦР/RE основывается на работе Shan, Q. и соавт. Быстрая и эффективная модификация генов риса и Brachypodium с использованием TALENs. Molecular Plant (2013). Поскольку целевой фрагмент эндогенного гена BADH2 риса содержит последовательность узнавания эндонуклеазы рестрикции BglII, то эндонуклеазу рестрикции BglII использовали в эксперименте по проведению ПЦР/RE-теста. Для проведения ПЦР-амплификации использовались следующие праймеры:
OsBADH-F: 5'-GATCCCGCAGCGGCAGCTCTTCGTCG-3';
OsBADH2-R: 5'-GAGGAATAAAATCTCAAATGTCTTCAACTT-3'.
Результаты ПЦР/RE экспериментов можно видеть на фиг. 2В. Эти результаты показали, что в целевом участке гена BADH2 происходили мутации, эффективность мутагенеза составила около 5%. Полоски на фигуре были выделены и секвенированы, результаты секвенирования показали, что в целевом участке гена BADH2 имела место инсерция/делеция (индел) (фиг. 2С).
Пример 3. Экспрессия и очистка белков TALEN в прокариотической системе экспрессии и их трансформация в протопластах пшеницы или незрелых зародышах для сайт-направленной модификации гена MLO.
I. Отбор целевых последовательностей и дизайн TALENs.
Консервативную область в экзоне 2 гена MLO пшеницы использовали в качестве целевой последовательности для дизайна пары TALENs (состоящей из белка TAL-MLO-L и белка TAL-MLO-R; белок TAL-MLO-L включает два функциональных фрагмента, в частности фрагмент, специфически связывающийся с нуклеотидами вверх по течению целевой последовательности, и эндонуклеазу Fok I с мутацией EL; белок TAL-MLO-R включает два функциональных фрагмента, в частности фрагмент, специфически связывающийся с нуклеотидами вниз по течению целевой последовательности, и эндонуклеазу Fok I с мутацией KK). Целевые последовательности этих TALENs в генах TaMLO-A, TaMLO-B и TaMLO-D следующие:
Ген TaMLO-A:
'-TCGCT GCT GCT CGCCGT cacgcaggacccaatccCGGGAT AT GC ATCT C
CCA-3';
Ген TaMLO-B:
5'-TCGCTGCTGCTCGCCGTgacgcaggaccccatctcCGGGATATGCATCTC
CGA-3';
Ген TaMLO-D:
'-TCGCT GCT GCT CGCCGT gacgcaggacccaatctcCGGGAT AT GC ATCT C
CGA-3'.
- 7 038896
В клетке пшеницы, когда фрагмент TAL-L и фрагмент TAL-R связываются с соответствующей связывающей областью, две различные мономерные эндонуклеазы Fok I (эндонуклеаза Fok I с мутацией EL и эндонуклеаза Fok I с мутацией KK) образуют димерную эндонуклеазу Fok I, которая вызывает расщепление в области целевой последовательности (включая как целевую последовательность, так и фланкирующие последовательности) с образованием двухцепочечного разрыва. В процессе репарации такого разрыва клеткой возникает ряд мутаций. В контексте настоящего изобретения мутация имеет широкое значение, включая инсерцию, делецию, замену и т.п., что в большинстве случаев приводит к потере функции гена.
В вышеуказанных целевых последовательностях подчеркнутая часть представляет собой последовательность узнавания эндонуклеазы рестрикции AvaII, которая может расщепляться AvaII. После образования разрыва, если возникает мутация и прерывает последовательность узнавания AvaII, то целевая последовательность не может разрезаться AvaII; если мутация не возникает, то целевая последовательность может разрезаться AvaII.
II. Экспрессия и очистка белков TALEN гена-мишени MLO в прокариотической системе экспрессии.
1. Конструирование прокариотических экспрессионных векторов для экспрессии белков TALEN.
1) Кодирующие области TAL-L (SEQ ID NO: 5) и TAL-R (SEQ ID NO: 6) гена TALEN встраивали в прокариотический экспрессионный вектор pGEX-4T и таким образом получали рекомбинантный вектор с кодирующей областью TAL-L (SEQ ID NO: 5), инсертированной между сайтами BamHI и XbaI pGEX4T в прямом направлении, и кодирующей областью TAL-R (SEQ ID NO: 6), инсертированной между сайтами XbaI и BamHI pGEX-4T в прямом направлении. Рекомбинантным вектором трансформировали штамм BL21 E.coli. Позитивную колонию инокулировали в среде LB с добавлением ампициллина и хлорамфеникола и культивировали в течение ночи при 37°C. Затем культуру инокулировали в 5 мл свежеприготовленной среды LB в соотношении 1:100, культивировали при 37°C и 225 об/мин до оптической плотности OD600®0,5. 1 мл культуры брали в качестве отрицательного контроля (без индукции). Закладывали контроль с пустым вектором pGEX-4T с индукцией или без индукции. К остальной части культуры добавляли IPTG (конечная концентрация 1 мМ) для индуцирования экспрессии при 37°C и 225 об/мин в течение 8 ч.
2) Брали по 1 мл каждой контрольной или индуцированной культуры и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 мин для сбора бактериальных клеток, супернатант сливали. Клетки ресуспендировали путем добавления 50 мкл загружающего белок буфера, кипятили 7 мин. Супернатант анализировали при помощи 10% SDS-PAGE. Молекулярный вес каждого белка TALEN составил 100 кДа. Аминокислотная последовательность белка TAL-MLO-L представлена в SEQ ID NO: 7. Аминокислотная последовательность белка TAL-MLO-R представлена в SEQ ID NO: 8.
2. Очистка белков TALEN.
Культуру бактерий центрифугировали при 4°C в течение 10 мин для сбора бактериальных клеток. К осадку добавляли 10 мл лизисного буфера (50 мМ Трис-HCl, 2 мМ EDTA, 100 мМ NaCl, 1 мг/мл лизоцима, рН 8,5), перемешивали в течение 45 мин на льду. После обработки ультразвуком осадок собирали путем центрифугирования, промывали 4 М имидазолом. Осадок, полученный после последующего центрифугирования, растворяли в 50 мМ фосфатном буфере (содержащем 8 М мочевину), рН 7,4 (фиг. 3A).
III. Введение очищенных белков TALEN в протопласты пшеницы для сайт-направленного редактирования гена MLO.
Очищенные белки TALEN против целевого участка гена MLO вводили в протопласты пшеницы сорта Bobwhite с использованием PEG-опосредованного подхода:
1. Выращивание сеянцев пшеницы.
Семена пшеницы растили в растильне при температуре 25±2°C, освещенности 1000 люкс, фотопериоде день/ночь 14 ч/16 ч, в течение около 1-2 недель.
2. Выделение протопластов.
1) Брали нежные листья пшеницы, из средней части листьев нарезали 0,5-1 мм нити с помощью лезвия, которые помещали в 0,6 М раствор маннитола (с использованием воды в качестве растворителя) и настаивали 10 мин в темноте. Затем смесь фильтровали через фильтр и помещали в 50 мл раствор для энзимолиза на 5 ч для переваривания (0,5 ч энзимолиз проводили в вакууме, затем 4,5 ч при медленном встряхивании при 10 об/мин).
Примечание: температура в течение энзимолиза должна поддерживаться в пределах 20-25°C, реакция должна осуществляться в темноте; после реакции раствор следует аккуратно встряхивать для высвобождения протопластов.
2) Продукт энзимолиза растворяли путем добавления 10 мл W5 и фильтровали в 50 мл круглодонной центрифужной пробирке с использованием нейлоновой фильтровальной мембраны с размером пор 75 мкм.
Примечание: Перед использованием нейлоновую фильтровальную мембрану следует погрузить в 75% (объемный процент) этанола, промыть водой и затем намочить в W5 в течение 2 мин.
- 8 038896
3) Проводили центрифугирование (100 г, 3 мин, 23°C) и супернатант сливали.
4) Осадок суспендировали в 10 мл W5, помещали на лед на 30 мин; наконец, протопласты выпадали в осадок и супернатант сливали.
5) Протопласты суспендировали путем добавления необходимого количества раствора MMG и помещали на лед до трансформации.
Примечание: концентрацию протопластов необходимо определять путем микроскопии (х 100). Количество протопластов составило от 2х105/мл до 1х106/мл.
3. Трансформация протопластов пшеницы.
1) 15 мкг белков TALEN (белок TAL-MLO-L и белок TAL-MLO-R, смешанные в равных количествах) или 20 мкг вектора T-MLO (контроль) вносили в 2 мл цетрифужную пробирку. С помощью пипетки прибавляли 200 мкл выделенных протопластов, содержимое смешивали, слегка постукивая по пробирке пальцем, и затем отстаивали в течение 3-5 мин. Затем прибавляли 250 мкл PEG4000 и перемешивали, слегка постукивая по пробирке пальцем. Трансформация проходила в темноте в течение 30 мин.
2) Прибавляли 900 мкл W5 (комнатной температуры) и перемешивали путем реверсивного вращения, проводили центрифугирование (100 г, 3 мин) и супернатант сливали.
3) Прибавляли 1 мл W5 и перемешивали путем реверсивного вращения, затем содержимое аккуратно переносили в 6-луночный культуральный планшет (с заранее добавленным в луночки 1 мл W5) и культивировали при 23°C на протяжении ночи.
4. Проведение ПЦР/RE-экспериментов для анализа мутагенеза эндогенного гена MLO пшеницы, получаемого из очищенных белков TALEN.
Через 48 ч после трансформации протопластов пшеницы выделяли геномную ДНК, которую использовали в качестве матрицы для проведения ПЦР/RE экспериментального анализа (полимеразная цепная реакция/рестриктное расщепление). Одновременно протопласты, трансформированные плазмидой T-MLO, или протопласты пшеницы сорта Bobwhite дикого типа использовали в качестве контроля. Анализ методом ПЦР/RE основывается на работе Shan, Q. и соавт. Быстрая и эффективная модификация генов риса и Brachypodium с использованием TALENs. Molecular Plant (2013). Поскольку целевой фрагмент эндогенного гена MLO пшеницы содержит последовательность узнавания эндонуклеазы рестрикции Avail, то эндонуклеазу рестрикции AvaII использовали в эксперименте по проведению ПЦР/REтеста. Для проведения ПЦР-амплификации использовались следующие праймеры:
TaMLO-F: 5'-TCATCGTCTCCGTCCTCCTGGAGCA-3';
TaMLO-R: 5'-TGGTATTCCAAGGAGGCGGTCTCTGTCT-3'.
Результаты ПЦР/RE экспериментов показали, что в целевом участке гена MLO происходили мутации. Полоски были выделены и секвенированы, результаты секвенирования показали, что в целевом участке гена MLO имела место инсерция/делеция (индел) (фиг. 3В и С).
IV. Сайт-направленное редактирование гена MLO путем введения белков TALEN с использованием бомбардировки частицами.
Обычно в процессе трансформации клеток экспрессионной плазмидой методом бомбардировки частицами используется золотой порошок в качестве переносчика для доставки в клетки ДНК-плазмиды. Однако в отношении белков золотой порошок не подходит в качестве переносчика, так как он трудно связывается с белком. В настоящем изобретении в качестве переносчика в процессе трансформации белков методом бомбардировки частицами используется кремнезем.
1. Загрузка белков в кремнезем.
В качестве переносчика использовали кремнезем Au-MSN с размером частиц 10 нм. 20 мг Au-MSN добавляли к 5 мл фосфатного буфера (PBS), рН 7,4, для разрушения ультразвуком, и затем прибавляли 7 мг белка TAL-MLO-L и белка TAL-MLO-R. Смесь взбалтывали при 22°C в течение 24 ч, центрифугировали при 12000 об/мин. Супернатант сливали. Осадок суспендировали в PBS-буфере.
2. Трансформация материалов-реципиентов пшеницы с использованием бомбардировки частицами.
1) Брали незрелые зародыши пшеницы сорта Bobwhite и погружали на 4 ч в гипертонический раствор.
2) Обстрел незрелых зародышей пшеницы, культивировавшихся в гипертоническом растворе на этапе 1), проводили посредством специального устройства для бомбардировки частицами. Частицы AuMSN, загруженные белками TALEN (5 мкл, 20 мкг/мкл), загружали на мембрану и проводили бомбардировку; расстояние от источника частиц составляло 6 см, сила давления - 1100 psi, диаметр ствола источника частиц - 2 см.
3) Незрелые зародыши пшеницы, подвергшиеся бомбардировке частицами на этапе 2), затем культивировали в гипертоническом растворе в течение 16 ч.
4) Незрелые зародыши пшеницы, культивировавшиеся в гипертоническом растворе на этапе 3), затем последовательно подвергали культивированию в индукционной среде в течение 14 дней для образования каллусной ткани, культивированию в среде для дифференциации в течение 28 дней и культивированию в среде для корнеобразования в течение 14-28 дней для получения растений пшеницы.
5) ДНК выделяли из сеянцев пшеницы, полученных на этапе 4), проводили детектирование мутан
- 9 038896 тов с генным нокаутом (сайт-направленным) посредством ПЦР/RE-mecmoB (что касается конкретного метода тестирования, см. этап III). Пшеницу сорта Bobwhite дикого типа использовали в качестве контроля.
Результаты детектирования, касающиеся некоторых мутантов, указывали на то, что в целевом участке гена MLO пшеницы произошли мутации. Полоски выделяли и секвенировали. Результаты секвенирования показали, что в целевом участке гена MLO имела место инсерция/делеция (индел).
Вышеуказанные результаты свидетельствуют о том, что сайт-направленное редактирование целевого участка может осуществляться путем введения белка-нуклеазы в пшеницу. Мутанты, получаемые этим методом, свободны от экзогенной ДНК, а вводимый белок разрушается растительной клеткой. Таким образом, мутанты, получаемые при помощи этого метода, представляют собой нетрансгенные растения, обладающие повышенной биобезопасностью.
Пример 4. Сайт-направленное редактирование гена TaGASR7 посредством котрансформации белком Cas9, экспрессированным и очищенным в прокариотической системе экспрессии, и in vitro транскрибированной sgРНК.
I. Дизайн целевого фрагмента: мишень-С5.
Мишень-С5: 5-CCGCCGGGCACCTACGGCAAC-3 ; (в гене TaGASR7, код доступа GenBank: EU095332, положения 248-268).
II. Прокариотическая экспрессия и очистка белка Cas9.
1. Ген Cas9 (оптимизированный по кодоновому составу генов растения и дополненный NLS на обоих концах) встраивали в прокариотический экспрессионный вектор pGEX-4T и получали рекомбинантный вектор с геном Cas9 последовательности SEQ ID NO: 9 (оптимизированный по кодоновому составу генов растения и дополненный NLS на обоих концах), инсертированный между BamHI и SpeI экспрессионного вектора pGEX-4T. Рекомбинантным вектором трансформировали штамм BL21 E.coli. Позитивную колонию инокулировали в среду LB с добавлением ампициллина и хлорамфеникола и культивировали в течение ночи при 37°C. Затем культуру инокулировали в 5 мл свежеприготовленной среды LB в соотношении 1:100, культивировали при 37°C и 225 об/мин до оптической плотности GD600«0,5. 1 мл культуры брали в качестве отрицательного контроля (без индукции). Закладывали контроль с пустым вектором pGEX-4T с индукцией или без индукции. К остальной части культуры добавляли IPTG (конечная концентрация 1 мМ) для индуцирования экспрессии при 37°C и 225 об/мин в течение 8 ч.
2. Брали по 1 мл каждой контрольной или индуцированной культуры и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 мин для сбора бактериальных клеток, супернатант сливали. Клетки ресуспендировали путем добавления 50 мкл загружающего белок буфера, кипятили 7 мин. Супернатант анализировали при помощи 10% SDS-PAGE. Молекулярный вес каждого белка Cas9 составил 200 кДа. Аминокислотная последовательность белка Cas9 представлена в SEQ ID NO: 10.
3. Очистка белка Cas9.
Культуру бактерий центрифугировали при 4°C в течение 10 мин для сбора бактериальных клеток. К клеточному осадку добавляли 10 мл лизисного буфера (50 мМ Трис-HCl, 2 мМ EDTA, 100 мМ NaCl, 1 мг/мл лизоцима, рН 8,5), перемешивали в течение 45 мин на льду. После обработки ультразвуком осадок собирали путем центрифугирования, промывали 4 М имидазолом. Осадок, полученный после последующего центрифугирования, растворяли в 50 мМ фосфатном буфере (содержащем 8 М мочевину), рН 7,4 (фиг. 4А).
III. In vitro транскрипция sgРНК целевого сайта.
1. Целевой сайт TaGASR7 встраивали в вектор pT7-gRNA.
С5 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую РНК, которая способна комплементарно связываться с мишенью-С5.
Были синтезированы следующие одноцепочечные олигонуклеотиды с липкими концами (подчеркнуты):
C5F 5’-CTTGTTGCCGTAGGTGCCCGG-3’;
C5R: 5’-AAACCCGGGCACCTACGGCAA-3’·
Двухцепочечную ДНК с липкими концами создавали путем расщепления олигонуклеотидов и вставляли между двумя сайтами рестрикции BbsI в плазмиду pT7-gRNA, в результате чего получали плазмиду pT7-gRNA, содержащую сайт С5. Позитивный контроль плазмиды выполняли путем секвенирования. Рекомбинантная плазмида, полученная путем инсерции фрагмента ДНК, как показано в 5'CTTGTTGCCGTAGGTGCCCGG-3' в прямом направлении в сайте рестрикции BbsI плазмиды pT7-gRNA, была позитивной и была обозначена как pT7-gRNA-C5.
2. In vitro транскрипция sgРНК, содержащей целевой сайт TaGASR7.
С помощью промотора Т7 для инициации транскрипции sgРНК гена TaGASR7 in vitro транскрибировали с использованием набора для in vitro транскрипции шРНК (Ambion) в sgRNA-GASR7-C5 (SEQ ID NO: 11) и к ее З'-концу добавляли PolyA-хвост для увеличения стабильности шРНК.
IV. Редактирование гена TaGASR7 посредством котрансформации белком Cas9 и in vitro транскрибированной sgРНК протопластов пшеницы.
1. Протопласты приготовляли аналогично тому, как показано в примере 3.
- 10 038896
2. Трансформация протопластов.
1) 15 мкг белка Cas9 и 20 мкг sgRNA-GASR7-C5 вносили в 2 мл цетрофужную пробирку. Прибавляли 200 мкл протопластов (около 4x105 клеток), затем добавляли 250 мкл свежеприготовленного раствора PEG и перемешивали. Трансформация проходила в темноте в течение 30 мин;
2) прибавляли 900 мкл W5 (комнатной температуры) и перемешивали путем реверсивного вращения, проводили центрифугирование (100 г, 3 мин) и супернатант сливали;
3) прибавляли 1 мл W5 и перемешивали путем реверсивного вращения, затем содержимое аккуратно переносили в 6-луночный культуральный планшет (с заранее добавленным в луночки 1 мл W5) и культивировали при 23°C на протяжении ночи.
3. Проведение ПЦР/RE-экспериментов для анализа мутагенеза эндогенного гена TaGASR7 пшеницы, получаемого из очищенного белка Cas9 и in vitro транскрибированной sgРНК.
Через 48 ч после трансформации протопластов пшеницы выделяли геномную ДНК, которую использовали в качестве матрицы для проведения ПЦР/RE экспериментального анализа (полимеразная цепная реакция/рестриктное расщепление). Одновременно протопласты пшеницы сорта Bobwhite дикого типа использовали в качестве контроля. Анализ методом ПЦР/RE основывается на работе Shan, Q. и соавт. Быстрая и эффективная модификация генов риса и Brachypodium с использованием TALENs. Molecular Plant (2013). Поскольку целевой участок (код доступа, GenBank: EU095332, положения 248-268) эндогенного гена TaGASR7 пшеницы (код доступа, GenBank: EU095332) содержит последовательность узнавания (5'-CCSGG-3') эндонуклеазы рестрикции NciI, то эндонуклеазу рестрикции NciI использовали в эксперименте по проведению ПЦР/RE-теста. Для проведения ПЦР-амплификации использовались следующие праймеры:
TaGASR7-F: 5'-GGAGGTGATGGGAGGTGGGGG-3';
TaGASR7-R: 5'-CTGGGAGGGCAATTCACATGCCA-3'.
Результаты ПЦР/RE экспериментов указывали на то, что в целевом участке гена TaGASR7 происходили мутации. Полоски, представленные на фигуре, были выделены и секвенированы, и результаты секвенирования показали, что в целевом участке гена TaGASR7 имела место инсерция/делеция (индел) (фиг. 4 В и С).
V. Сайт-направленное редактирование гена TaGASR7 пшеницы при участии очищенного белка Cas9 и in vitro транскрибированной sgРНК посредством трансформации с использованием бомбардировки частицами.
1. Загрузка очищенного белка Cas9 и in vitro транскрибированной sgРНК в кремнезем.
В качестве переносчика использовали кремнезем Au-MSN с размером частиц 10 нм. 20 мг Au-MSN добавляли к 5 мл фосфатного буфера (PBS), рН 7,4, для разрушения ультразвуком. Затем прибавляли 7 мг белка Cas9. Смесь взбалтывали при 22°C в течение 24 ч, центрифугировали при 12000 об/мин. Супернатант сливали. Клеточный осадок суспендировали в PBS-буфере. 4 мкл in vitro транскрибированной sgРНК (250 нг/мкл) прибавляли к 10 мкл белка-переносчика Cas9-Au-MSN (10 мкг/мкл). Затем добавляли 12,5 мкл 2,5 М CaCl2 и 5 мкл 0,1 М спермидина, центрифугировали при 5000 об/мин в течение 15 с, супернатант сливали. Au-MSN, несущий белок Cas9 и покрытый mРНК, промытый два раза 100%-ным этанолом и ресуспендированный в 5 мкл 100% этанола, обозначили sgRNA-Cas9-Au-MSN.
2. Трансформация материалов-реципиентов пшеницы с использованием бомбардировки частицами.
1) Брали незрелые зародыши пшеницы сорта Bobwhite и погружали на 4 ч в гипертонический раствор.
2) Обстрел незрелых зародышей пшеницы, культивировавшихся в гипертоническом растворе на этапе 1), проводили посредством специального устройства для бомбардировки частицами. 5 мкл sgRNACas9-Au-MSN загружали на мембрану и проводили бомбардировку; расстояние от источника частиц составляло 6 см, сила давления - 1100 psi, диаметр ствола источника частиц - 2 см.
3) Незрелые зародыши пшеницы, подвергшиеся бомбардировке частицами на этапе 2), затем культивировали в гипертоническом растворе в течение 16 ч.
4) Незрелые зародыши пшеницы, культивировавшиеся в гипертоническом растворе на этапе 3), затем последовательно подвергали культивированию в индукционной среде в течение 14 дней для образования каллусной ткани, культивированию в среде для дифференциации в течение 28 дней и культивированию в среде для корнеобразования в течение 14-28 дней для получения растений пшеницы.
5) ДНК выделяли из сеянцев пшеницы, полученных на этапе 4), проводили детектирование мутантов с генным нокаутом (сайт-направленным) посредством ПЦР/RE-тестов (что касается конкретного метода тестирования, см. этап IV). Пшеницу сорта Bobwhite дикого типа использовали в качестве контроля.
Результаты детектирования, касающиеся некоторых мутантов, указывали на то, что в целевом участке гена TaGASR7 пшеницы произошли мутации. Полоски выделяли и секвенировали. Результаты секвенирования показали, что в целевом участке гена TaGASR7 имела место инсерция/делеция (индел).
Пример 5. Сайт-направленное редактирование эндогенного гена ZmIPK кукурузы путем введения очищенного белка Cas9 и sgРНК в растение посредством подхода с использованием прорастающих пыльцевых трубок.
I. Дизайн целевого фрагмента: мишень-С2.
- 11 038896
Мишень-С2: $ -CCGAGCTCGACCACGCCGCCGAC-3 ; (положение 393-415 гена ZmlPK, как показано в GenBank, код доступа AY172635).
II. Прокариотическая экспрессия и очистка белка Cas9.
Идентично примеру 3, этап II.
III. In vitro транскрипция sgРНК целевого участка.
1. Целевой участок гена ZmIPK встраивали в вектор pT7-gRNA.
С2 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую РНК, которая способна комплементарно связываться с мишенью-С2.
Были синтезированы следующие одноцепочечные олигонуклеотиды с липкими концами (подчеркнуты):
С1 -1F: 5’-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3’;
С1R: 5’-AAACAGCTCGACCACGCCGCCGAC-3'.
Путем расщепления олигонуклеотидов формировали двухцепочечную ДНК с липкими концами и инсертировали между двумя сайтами рестрикции BbsI в плазмиду pT7-gRNA, в результате чего получали плазмиду pT7-gRNA, содержащую сайт С2. Позитивный контроль плазмиды выполняли путем секвенирования. Рекомбинантная плазмида, которая была получена путем инсертирования фрагмента ДНК, как показано в 5'-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3 в прямом направлении в сайт рестрикции BbsI плазмиды pT7-gRNA, была позитивной и была обозначена как pT7-gRNA-C2.
2. In vitro транскрипция sgРНК, содержащей целевой участок гена ZmIPK.
С помощью промотора Т7 для инициации транскрипции sgРНК гена ZmIPK in vitro транскрибировали с использованием набора для in vitro транскрипции шРНК (Ambion) в sgRNA-IPK-C2 (SEQ ID NO: 12) и к ее 3'-концу добавляли PolyA-хвост для увеличения стабильности шРНК.
IV. Сайт-направленное редактирование эндогенного гена ZmIPK пшеницы путем введения очищенного белка Cas9 и in vitro транскрибированной sgPI 1К посредством подхода с использованием прорастающих пыльцевых трубок.
В поле отбирали сильные растения инбредной линии кукурузы HiII в качестве материаловреципиентов. Самоопыление растений проводили в 14:00-16:00 в солнечный день. Спустя 16-20 ч после опыления, а именно в 10:00-12:00 следующего дня, у реципиентов надрезали пестики. В надрезы закапывали смесь из 10 мкг/мкл белка Cas9 и 250 нг/мкл sgРНК. На рыльца надевали защитные мешочки до плодоношения. Полученные семена кукурузы растили и выделяли геномную ДНК для использования в эксперименте ПЦР-RE в качестве матрицы. Параллельно кукурузу сорта HiII дикого типа использовали в качестве контроля. Анализ методом ПЦР/RE основывается на работе Shan, Q. и соавт. Быстрая и эффективная модификация генов риса и Brachypodium с использованием TALENs. Molecular Plant (2013). Поскольку целевой фрагмент (код доступа, GenBank: AY172635, положения 393-415) эндогенного гена ZmIPK кукурузы (код доступа, GenBank: AY172635) содержит последовательность узнавания (5'GAGCTC-3') эндонуклеазы рестрикции SacI, то эндонуклеазу рестрикции Sad использовали в эксперименте по проведению ПЦР/RE-теста. Для проведения ПЦР-амплификации использовались следующие праймеры:
ZmIPK-lF: 5'-TCGCAGCCCCTGGCAGAGCAA-3';
ZmIPK-lR: 5’-GAGACCTGGGAGAAGGAGACGGATCC-3’.
Результаты ПЦР/RE экспериментов показали, что в целевом участке гена ZmIPK происходили мутации. Неразрезанные полоски были выделены и секвенированы, результаты секвенирования показали, что в целевом участке гена ZmIPK имела место инсерция/делеция (индел).
Пример 6. Сайт-направленное редактирование гена NtPVY путем котрансформации белком Cas9, экспрессированным и очищенным в прокариотической экспрессионной системе, и in vitro транскрибированной sgРНК протопластов табака, и регенерация растений.
I. Дизайн целевого фрагмента: мишень-Р4.
Мишень Р4: 5’-TGATACCAGCTGGCTATACACGG-3'.
II. Прокариотическая экспрессия и очистка белка Cas9 идентична примеру 3.
III. In vitro транскрипция sgРНК целевого участка.
1. Целевой участок NtPVY встраивали в вектор pHSN401.
Р4 представляет собой последовательность ДНК, кодирующую РНК, которая способна комплементарно связываться с мишенью-Р4.
Были синтезированы следующие одноцепочечные олигонуклеотиды с липкими концами (подчеркнуты):
P4-F: 5’-ATTGTGATACCAGCTGGCTATACA-3’;
P4-R: 5'-AAACTGTATAGCCAGCTGGTATCA-3'.
Путем расщепления олигонуклеотидов формировали двухцепочечную ДНК с липкими концами и инсертировали между двумя сайтами рестрикции BsaI в плазмиду pHSN401, в результате чего получали плазмиду pHSN401, содержащую Р4. Позитивный контроль плазмиды выполняли путем секвенирования. Рекомбинантная плазмида, которая была получена в результате инсертирования фрагмента ДНК, как показано в 5'-ATTGTGATACCAGCTGGCTATACA-3' в прямом направлении вверх в сайт рестрикции
- 12 038896
Bsal плазмиды pHSN401, была позитивной и была обозначена как pHSN401-P4.
2. In vitro транскрипция sgРНК, содержащей целевой участок NtPVY.
С помощью промотора Т7 для инициации транскрипции sgРНК гена NtPVY (SEQ ID NO: 13, 14, 15) in vitro транскрибировали с использованием набора для транскрипции mРНК (Ambion) в sgRNA-PVY-P4 (SEQ ID NO: 16).
IV. Редактирование гена NtPVY путем котрансформации белком Cas9 и in vitro транскрибированной sgРНК протопластов табака.
1. Приготовление материалов.
Использовали табак сорта Honghua Dajinyuan. Семена обрабатывали 20%-ным гипохлоритом натрия в течение 20 мин и промывали стерильной водой 5 раз. Затем семена культивировали на среде 1/2 MS при температуре 25°C и продолжительности освещения 16 ч.
2. Выделение протопластов.
1) Отбирали 6 листьев 30-дневных растений табака и вырезали сегменты длиной 1 см в стерильных условиях. Сегменты помещали в культуральный планшет, содержащий 15 мл раствора для энзимолиза. Планшет запечатывали и держали в темноте при 25°C в течение ночи (наиболее предпочтительно в течение 12 ч).
2) После реакции энзимолиза добавляли подходящее количество раствора W5. Планшет аккуратно встряхивали для высвобождения протопластов. Затем суспензию протопластов фильтровали через стерильный фильтр с размером пор 100 и 40 мкм, центрифугировали при 70 g в течение 5 мин, супернатант сливали.
3) Протопласты ресуспендировали путем добавления 5 мл 22%-го раствора сахарозы. Затем прибавляли 2 мл раствора W5 и центрифугировали при 70 g в течение 5 мин. После этого на границе раздела фаз сформировался слой протопластов.
4) Протопласты удаляли с границы раздела. Прибавляли 5 мл раствора W5 и перемешивали с последующим центрифугированием при 70 g в течение 5 мин.
5) Супернатант сливали. К ресуспендированным протопластам прибавляли 1 мл раствора для MMG трансформации. Выход протопластов определяли путем микроскопии.
3. Трансформация и регенерация протопластов.
1) 20 мкг белка Cas9 и 20 мкг mRNA-PVY-P4 вносили в 14 мл центрифужную пробирку. Добавляли 300 мкл протопластов (около 5х105 клеток), затем 300 мкл свежеприготовленного раствора PEG, перемешивали и держали в темноте 20 мин.
2) Прибавляли 10 мл раствора W5 и перемешивали, проводили центрифугирование при 70 g в течение 3 мин и супернатант сливали; этот этап повторяли.
3) Прибавляли 1 мл среды КЗ:Н, содержащей 0,6% легкоплавкую агарозу (инкубированную на водяной бане при 40-45°C перед использованием), и перемешивали. Смесь использовали для трансформации в 30 мм стерильном культуральном планшете.
4) После затвердевания среды планшет держали в темноте 24 ч при 24°C, затем культивировали в темноте в течение еще 6 дней до начала клеточного деления.
5) Агарозный гель переносили в 90 мм культуральный планшет и добавляли подходящее количество жидкой среды А. Культивирование продолжали при 24°C в темноте.
6) Через 3-4 недели в планшете образовался видимый каллус. После культивирования в течение 5-6 недель диаметры каллуса достигли 8-10 мм.
7) Каллусы переносили в среду для дифференциации и культивировали 1-2 недели до появления на поверхности адвентивных почек.
8) Адвентивные почки длиной 3-4 см срезали и переносили в среду для корнеобразования для индуцирования образования корней до развития интактных растений.
9) По достижении корнями определенной длины сеянцы пересаживали в грунт.
Выделяли ДНК трансгенного табака и использовали в качестве матрицы для проведения ПЦР/RE анализа (полимеразная цепная реакция/рестриктное расщепление). ДНК табака дикого типа использовали в качестве контроля. Анализ методом ПЦР/RE основывается на работе Shan, Q. и соавт. Быстрая и эффективная модификация генов риса и Brachypodium с использованием TALENs. Molecular Plant (2013). Поскольку целевой фрагмент эндогенного гена NtPVY табака содержит последовательность узнавания (5'-CAGCTG-3') эндонуклеазы рестрикции PvuII, то эндонуклеазу рестрикции PvuII использовали в эксперименте по проведению ПЦР/RE-теста. Для проведения ПЦР-амплификации использовались следующие праймеры:
NtPVY-F: 5'-TGGATTAGATGTTTTCAAATGC-3';
NtPVY-R: 5'-CATTCTTTTGGGGACGGACAAA-3'.
Результаты ПЦР/RE экспериментов показали, что в результате котрансформации белком Cas9 и in vitro транскрибированной sgРНК протопластов табака в целевом участке гена NtPVY происходили мутации. Неразрезанные полоски были выделены и секвенированы, результаты секвенирования показали, что в целевом участке гена NtPVY имела место инсерция/делеция (индел) (фиг. 5А и В). Кроме того, в регенерированных трансгенных растениях табака также имела место мутация в целевом участке гена NtPVY. Результаты секвенирования показали, что в целевом участке гена NtPVY произошла инсерция/делеция (индел) (фиг. 5С).
- 13 038896
Используемые растворы для выделения и культивирования протопласта табака указаны в следующих табл. 6-10.
Таблица 6
50-мл раствор для энзимолиза
Добавляемое количество Окончательная концентрация
Целлюлоза R10 0,6 1,2%
Мацерозим R10 0,3 0,6%
доводили раствор до 50 мл добавлением среды К4, pH регулировали до 5,6 с помощью КОН; центрифугировали при 7000 g в течение 10 мин; фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм
Таблица 7
500-мл W5
Добавляемое количество Окончательная концентрация
NaCl 4,5 г 154 мМ
СаС12 9,189 г 125 мМ
КС1 0,1864 г 5 мМ
Глюкоза 0,45 г 5 мМ
доводили раствор водой двойной дистилляции до 500 мл, pH регулировали до 5,8 с помощью КОН, автоклавировали
Таблица 8
10-мл раствор для трансформации
Добавляемое количество Окончательная концентрация
Маннитол (0,8 М) 6,33 мл 0,5 М
MgCl2 (1 М) 0,15 мл 15 мМ
MES 0,01 г 0,1%
доводили раствор водой двойной дистилляции до 10 мл, pH регулировали до 5,8 с помощью КОН
Таблица 9
4-мл раствор PEG
Добавляемое количество Окончательная концентрация
PEG4000 1,6 г 40%
Маннитол (0,8 М) 2 мл 0,4 М
Ca(NO3)2 0,1 М
доводили раствор водой двойной дистилляции до 4 мл, pH регулировали до 8-9 с помощью КОН, автоклавировали
Таблица 10
Маточный раствор для выделения и культивирования протопластов табака
1000 мг/50 мл
Среда (мл/Л) А Н КЗ MS MS морфо
KNO3 50,5 95 125 95 95
NH4NO3 40 30 12,5 82,5
СаС12.2Н2О 22 30 45 22 36,5
MgSO4.7H2O 37 15 12,5 18,5 18,5
1000 мг/100 мл
(NH4)2SO4 0 0 25 0 0
КН2РО 0 13,6 17 0 17
NaH2PO4 0 0 15 0 0
(МН4)сукцинат 5 0 0 0 0
СаНРО4 0 0 0 5 0
Микроэлементы (MS микроэлементы Юх от Sigma, 100 мл/л
| юо I 100 I юо 1100 I юо
Карбогидраты (г/л) в конечной концентрации
Сахароза(+) 30 30 30 20 30
D-сорбитол 0 0 45,5 20 0
D-маннитал 0 0 45,5 20 0
Гормоны (мг/л в конечной концентрации)
2,4-D 0 1,5 5 1,5 0
Кинетин 0 0 0 0 0,2
Витамины (мг/л в конечной концентрации
ПиридоксинНО 0,5 0,5 0,5 1,5 0,5
Тиамин НС1 0,1 ОД 0,1 10 0,1
Витамин ВЗ 0 0,5 0,5 0,5 0,5
Инозитол 100 100 100 100 100
Другие органические вещества (мг/л в конечной концентрации)
Глицин 2 2 2 7,5 2
L-глютамин 0 0 0 877 0
L-аспарагин 0 0 0 266 0
Гидролизат казеина 400 400 400 0 0

Claims (8)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ осуществления сайт-направленной модификации целевого фрагмента гена-мишени растения, включающий введение ненаследуемого материала в ткань либо часть растения интереса с использованием бомбардировки частицами, характеризующийся тем, что ненаследуемый материал состоит из нуклеазы коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами/CRISPRассоциированной системы, специфичной в отношении целевого фрагмента, или mРНК, способной экспрессировать нуклеазу, и направляющей РНК, при этом целевой фрагмент расщепляется нуклеазой, и сайт-направленная модификация целевого фрагмента достигается путем репарации ДНК растения, где направляющая РНК представляет собой РНК палиндромной структуры, образующуюся путем частичного спаривания оснований между сгРНК и tracrРНК, где сгРНК содержит фрагмент РНК, способный комплементарно связываться с целевым фрагментом, где указанная ткань представляет собой каллус, незрелый зародыш либо зрелый зародыш; а указанная часть растения представляет собой лист, вершину побега, соцветие либо пыльцевую трубку.
  2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что нуклеаза представляет собой нуклеазу CRISPR/Cas9.
  3. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что ненаследуемый материал состоит из белка Cas9 либо mРНК, способной экспрессировать белок Cas9, и направляющей РНК, при этом направляющая РНК представляет собой РНК палиндромной структуры, которая представляет собой sgРНК, или образуется путем частичного спаривания оснований между сгРНК и tracrРНК, где сгРНК содержит фрагмент РНК, способный комплементарно связываться с целевым фрагментом.
  4. 4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что часть растения представляет собой часть интактного растения, в которую может быть введен ненаследуемый материал.
  5. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что ненаследуемый материал вводится в ткань либо часть растения интереса транзиентно.
  6. 6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что сайт-направленная модификация представляет собой инсерцию, делецию и/или замену нуклеотида в целевом фрагменте.
  7. 7. Способ получения нетрансгенного мутантного растения, включающий следующие этапы:
    a) осуществление сайт-направленной модификации целевого фрагмента гена-мишени растения интереса согласно способу по любому из пп.1-6,
    b) получение растения, в котором функции гена-мишени утрачены или изменены и геном которого свободен от внедренного экзогенного гена.
  8. 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что на этапе b) клетка или ткань либо часть растения интереса регенерируется в интактное растение посредством культуры ткани.
EA201792036A 2015-03-16 2016-03-14 Способ осуществления сайт-направленной модификации растительных геномов с использованием ненаследуемых материалов EA038896B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510114017 2015-03-16
PCT/CN2016/076244 WO2016155482A1 (zh) 2015-03-16 2016-03-14 一种利用非遗传物质对植物基因组进行定点改造的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201792036A1 EA201792036A1 (ru) 2018-06-29
EA038896B1 true EA038896B1 (ru) 2021-11-03

Family

ID=57005578

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201792036A EA038896B1 (ru) 2015-03-16 2016-03-14 Способ осуществления сайт-направленной модификации растительных геномов с использованием ненаследуемых материалов

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20180163232A1 (ru)
EP (1) EP3279321A4 (ru)
JP (2) JP2018508221A (ru)
KR (1) KR102194612B1 (ru)
CN (1) CN105985943B (ru)
AR (1) AR103926A1 (ru)
AU (1) AU2016239037B2 (ru)
BR (1) BR112017016431A2 (ru)
CA (1) CA2979290A1 (ru)
EA (1) EA038896B1 (ru)
UA (1) UA125246C2 (ru)
WO (1) WO2016155482A1 (ru)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2853829C (en) 2011-07-22 2023-09-26 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US9340800B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College Extended DNA-sensing GRNAS
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US20150166982A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting pi3k point mutations
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
BR112018008109A2 (pt) 2015-10-20 2018-11-06 Pioneer Hi Bred Int métodos para modificar uma sequência de nucleotídeos no genoma de uma célula vegetal, produzir uma planta, produzir tecido de calo de planta que tem uma sequência de nucleotídeos modificada em seu genoma sem o uso de um marcador selecionável, e planta de progênie da planta
EP4269577A3 (en) 2015-10-23 2024-01-17 President and Fellows of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
SG11201900907YA (en) 2016-08-03 2019-02-27 Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
WO2018031683A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
CN110214180A (zh) 2016-10-14 2019-09-06 哈佛大学的校长及成员们 核碱基编辑器的aav递送
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
JP6928416B2 (ja) * 2016-12-27 2021-09-01 株式会社豊田中央研究所 Ｄｎａ二本鎖切断活性を有するタンパク質を用いた真核生物の育種方法
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
EP3592777A1 (en) 2017-03-10 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Cytosine to guanine base editor
CN110914426A (zh) 2017-03-23 2020-03-24 哈佛大学的校长及成员们 包含核酸可编程dna结合蛋白的核碱基编辑器
CN117051035A (zh) * 2017-05-05 2023-11-14 苏州齐禾生科生物科技有限公司 不使用转基因标记序列分离细胞的方法
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
WO2019023680A1 (en) 2017-07-28 2019-01-31 President And Fellows Of Harvard College METHODS AND COMPOSITIONS FOR EVOLUTION OF BASIC EDITORS USING PHAGE-ASSISTED CONTINUOUS EVOLUTION (PACE)
CN107338309A (zh) * 2017-07-28 2017-11-10 华智水稻生物技术有限公司 一种水稻常用栽培品种香味基因badh2的SNP分子标记及应用
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
JP2021500036A (ja) 2017-10-16 2021-01-07 ザ ブロード インスティテュート, インコーポレーテッドThe Broad Institute, Inc. アデノシン塩基編集因子の使用
CN112654710A (zh) 2018-05-16 2021-04-13 辛瑟高公司 用于指导rna设计和使用的方法和系统
GB201809273D0 (en) 2018-06-06 2018-07-25 Vib Vzw Novel mutant plant cinnamoyl-coa reductase proteins
CN109371056B (zh) * 2018-09-16 2022-04-08 云南省烟草农业科学研究院 一种选育对辣椒脉斑驳病毒抗性的烟草植物的方法
GB201820109D0 (en) 2018-12-11 2019-01-23 Vib Vzw Plants with a lignin trait and udp-glycosyltransferase mutation
BR112021018607A2 (pt) 2019-03-19 2021-11-23 Massachusetts Inst Technology Métodos e composições para editar sequências de nucleotídeos
JP7334898B2 (ja) * 2019-04-12 2023-08-29 国立大学法人東海国立大学機構 花粉への物質導入方法
CN116096873A (zh) 2020-05-08 2023-05-09 布罗德研究所股份有限公司 同时编辑靶标双链核苷酸序列的两条链的方法和组合物
JP7345760B2 (ja) * 2020-10-07 2023-09-19 国立大学法人東海国立大学機構 花粉への物質導入方法
CN117683763A (zh) * 2022-09-09 2024-03-12 中国科学院遗传与发育生物学研究所 基于dna聚合酶的基因组编辑系统和方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102812034A (zh) * 2010-01-22 2012-12-05 陶氏益农公司 靶向基因组改造
CN103343120A (zh) * 2013-07-04 2013-10-09 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种小麦基因组定点改造方法
CN103382468A (zh) * 2013-07-04 2013-11-06 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种水稻基因组定点改造方法
CN103667338A (zh) * 2013-11-28 2014-03-26 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种玉米基因组定点改造方法
CN103898099A (zh) * 2012-12-25 2014-07-02 袁晶 一种实现基因组定点修饰的蛋白表达载体的方法
CN103952405A (zh) * 2014-05-13 2014-07-30 扬州大学 一种山羊mstn基因定点修饰系统及其应用
CN104212778A (zh) * 2014-06-26 2014-12-17 绍兴市人民医院 基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统及应用
CN104293828A (zh) * 2013-07-16 2015-01-21 中国科学院上海生命科学研究院 植物基因组定点修饰方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0716708A1 (de) * 1993-09-03 1996-06-19 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Mittelkettenspezifische thioesterasen
US6583335B1 (en) * 1997-04-18 2003-06-24 Texas Tech University Direct transformation of higher plants through pollen tube pathway
US6518487B1 (en) * 1998-09-23 2003-02-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Cyclin D polynucleotides, polypeptides and uses thereof
JP5491039B2 (ja) * 2009-02-13 2014-05-14 国立大学法人岩手大学 リンゴ小球形潜在ウイルスベクターを用いたバラ科果樹の開花促進方法
AU2010234539B2 (en) * 2009-04-07 2015-04-09 Corteva Agriscience Llc Nanoparticle mediated delivery of sequence specific nucleases
EP3808844A1 (en) * 2012-07-25 2021-04-21 The Broad Institute, Inc. Inducible dna binding proteins and genome perturbation tools and applications thereof
UA119135C2 (uk) * 2012-09-07 2019-05-10 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб отримання трансгенної рослини
EP3372679A1 (en) * 2012-10-23 2018-09-12 Toolgen Incorporated Composition for cleaving a target dna comprising a guide rna specific for the target dna and cas protein-encoding nucleic acid or cas protein, and use thereof
CN103898155B (zh) * 2012-12-25 2016-06-15 中国科学院遗传与发育生物学研究所 利用基因枪获得转基因小麦的方法及其专用培养基
DK2938184T3 (en) * 2012-12-27 2018-12-17 Keygene Nv Method of removing a genetic linkage in a plant
CN105121650A (zh) * 2013-04-02 2015-12-02 拜尔作物科学公司 真核生物中的靶向基因组工程
US20150067922A1 (en) * 2013-05-30 2015-03-05 The Penn State Research Foundation Gene targeting and genetic modification of plants via rna-guided genome editing
WO2014199358A1 (en) * 2013-06-14 2014-12-18 Cellectis Methods for non-transgenic genome editing in plants

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102812034A (zh) * 2010-01-22 2012-12-05 陶氏益农公司 靶向基因组改造
CN103898099A (zh) * 2012-12-25 2014-07-02 袁晶 一种实现基因组定点修饰的蛋白表达载体的方法
CN103343120A (zh) * 2013-07-04 2013-10-09 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种小麦基因组定点改造方法
CN103382468A (zh) * 2013-07-04 2013-11-06 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种水稻基因组定点改造方法
CN104293828A (zh) * 2013-07-16 2015-01-21 中国科学院上海生命科学研究院 植物基因组定点修饰方法
CN103667338A (zh) * 2013-11-28 2014-03-26 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种玉米基因组定点改造方法
CN103952405A (zh) * 2014-05-13 2014-07-30 扬州大学 一种山羊mstn基因定点修饰系统及其应用
CN104212778A (zh) * 2014-06-26 2014-12-17 绍兴市人民医院 基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统及应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CURTIN, S.C. et al., "Targeted Mutagenesis of Duplicated Genes in Soybean with Zinc Finger Nucleases", PLANT PHYSIOLOGY, vol. 156, no. 2, 30 June 2011 (30.06.2011), ISSN: 0032-0889, pages 466-473, see abstract, page 469 *
FANG, Rui et al., "New Method of Genome Editing Derived from CRISPR/Cas9", PROGRESS IN BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS, vol. 40, no. 8, 31 August 2013 (31.08.2013), ISSN: 1000-3282, pages 691-702, see the whole document *
LIANG, Zhen et al., "Targeted Mutagenesis in Zea Mays Using TALENs and the CRISPR/Cas System", JOURNAL OF GENETICS AND GENOMICS, 14 November 2013, vol. 41, no. 2, ISSN: 1673-8527, pages 63-68, see abstract, and result and discussion *
XIAO, An et al., "Progress in Zinc Finger Nuclease Engineering for Targeted Genome Modification", HEREDITAS, vol. 33, no. 7, 31 July 2011 (31.07.2011), ISSN: 0253-9772, pages 665-683, see the whole document *
ZHANG, Jinmai et al., "TALENs: A New Genome Site-Specific Modification Technology", CHINESE BULLETIN OF LIFE SCIENCES, vol. 25, no. 1, 31 January 2013 (31.01.2013), ISSN: 1004-0374, pages 126-132, see the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
US20180163232A1 (en) 2018-06-14
KR102194612B1 (ko) 2020-12-23
EP3279321A1 (en) 2018-02-07
AR103926A1 (es) 2017-06-14
CN105985943A (zh) 2016-10-05
AU2016239037B2 (en) 2022-04-21
CN105985943B (zh) 2021-07-06
EA201792036A1 (ru) 2018-06-29
BR112017016431A2 (pt) 2018-04-10
UA125246C2 (uk) 2022-02-09
AU2016239037A1 (en) 2017-08-10
WO2016155482A1 (zh) 2016-10-06
KR20170126502A (ko) 2017-11-17
JP2018508221A (ja) 2018-03-29
JP2023018066A (ja) 2023-02-07
CA2979290A1 (en) 2016-10-06
EP3279321A4 (en) 2018-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA038896B1 (ru) Способ осуществления сайт-направленной модификации растительных геномов с использованием ненаследуемых материалов
US20230242927A1 (en) Novel plant cells, plants, and seeds
CN105802991B (zh) 一种通过基因瞬时表达对植物定点改造的方法
US11421241B2 (en) Method for conducting site-specific modification on entire plant via gene transient expression
US20190338298A1 (en) Method for producing genome-modified plants from plant protoplasts at high efficiency
JP2005500827A (ja) 植物人工染色体、その使用及び植物人工染色体の製造方法
US20200377900A1 (en) Methods and compositions for generating dominant alleles using genome editing
JP7396770B2 (ja) 植物細胞におけるゲノム編集のためのｖ型ｃｒｉｓｐｒ／ヌクレアーゼシステム
EP3630983A1 (en) Compositions and methods for increasing shelf-life of banana
US11814632B2 (en) Modified excisable MON87701 soybean transgenic insect resistance locus
KR20230021743A (ko) 이형접합 cenh3 외떡잎식물 및 반수체 유도 및 동시 게놈 편집을 위한 이의 사용 방법
US20220364105A1 (en) Inir12 transgenic maize
CA3188408A1 (en) Inir12 transgenic maize
WO2022120142A1 (en) Pest and pathogen resistant soybean plants
US11802288B1 (en) Methods for efficient soybean genome editing
JP2023526035A (ja) 標的突然変異生成によって変異体植物を得るための方法