CN105802991B - 一种通过基因瞬时表达对植物定点改造的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通过基因瞬时表达对植物定点改造的方法。本发明提供了一种对植物目的基因中靶位点进行定点改造的方法，包括如下步骤：以目的植物的细胞或组织为瞬时表达对象，在所述目的植物的细胞或组织中瞬时表达序列特异性核酸酶，所述序列特异性核酸酶特异于所述靶位点并切割所述靶位点，由此通过所述植物的DNA修复完成对所述靶位点的定点改造。本发明通过瞬时表达特异性核酸酶实现对目的基因的改造，不仅提高了植物的再生能力，而且产生的突变可以稳定的遗传到后代，更为重要是产生的突变体植物里没有外源基因的整合，具有较高的生物安全性。

Description

一种通过基因瞬时表达对植物定点改造的方法
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，涉及一种通过基因瞬时表达对植物定点改造的方法。本发明具体涉及一种通过瞬时表达体系来实现具有较高生物安全性的植物基因组定点改造的方法。
背景技术
对植物基因组进行改造是研究植物基因组功能或作物遗传改良的主要手段。当前对植物基因组的改造方法主要集中于传统的杂交育种手段和诱变育种手段，传统杂交育种方法需要多个世代，耗时费力，且受物种间生殖隔离限制和不良基因连锁的影响。物理或化学诱变方法，如辐射诱变，EMS诱变等，可以在基因组上随机产生大量突变位点，但是鉴定突变位点十分困难。传统基因打靶方法效率极低(通常只有10-6-10-5)，并且只限于少数物种如酵母、小鼠等。RNAi方法下调基因表达往往不够彻底，而且在后代中的基因沉默效果减弱甚至完全消失，不能稳定遗传。
基因组定点修饰工具是近年来兴起的新技术，主要包括三大类型序列特异性核酸酶(SSN)：锌指核酸酶(Zinc finger nuclease，ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease，TALEN)和成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR associated，CRISPR/Cas9system)。它们的共同特征是能够作为核酸内切酶切割特定的DNA序列，创造DNA双链断裂(Double-strand break，DSB)。DSB能够激活细胞内固有的修复机制非同源末端连接(Non-homologous end joining，NHEJ)和同源重组(Homologous recombination，HR)对细胞中的DNA损伤进行修复。通过NHEJ方式，断裂的染色体会重新连接，但往往是不精确的，断裂位置会产生少量碱基的插入或缺失，造成移码突变或者关键氨基酸缺失，从而产生基因敲除突变体。通过HR方式，在引入人为提供的同源序列的情况下，以同源序列为模板进行合成修复，从而产生基因(或DNA片段)定 点替换或者插入突变体。目前，虽然基因编辑技术对植物基因组的改造已经在部分植物里逐步进行了应用(例如，水稻，拟南芥，玉米，小麦等)，但并没有得到有效的效果，其限制因素主要是植物的遗传转化。
将序列特异性核酸酶转入到植物细胞是实现基因编辑的前提。目前，实现将序列特异性核酸酶转入植物细胞的方法主要是常规的转基因技术，利用常规转基因技术将序列特异性核酸酶整合到植物染色体中，可以实现对植物进行定点改造，同时通过后代分离可获得不含引入的序列特异性核酸酶的定点突变体，这种方法是目前被认可的获得无转基因痕迹定点突变体的重要方法。由于此方法涉及到外源基因先要整合到植物基因组中，而且转化的过程需要添加筛选标记(选择压力)，对于一些遗传转化较为困难的植物，例如小麦，玉米，大豆，马铃薯等，实现其基因组的改造较为困难，这使得基因编辑技术的植物基因组改造上不能发挥其作用。此外，在生物安全方面，虽然美国USDA根据最终产品属性进行评价，使得利用常规转基因技术手段获得的由ZFN、TALEN等序列特异性核酸酶产生的基因改造的产品不再受转基因调控；但是，在GMO调控比较严格的欧盟，依然将此类产品列为转基因的调控范畴。因此，很有必要探索一种更为高效，实用和安全的方法对植物基因组进行改造。
瞬时表达体系是指利用农杆菌、基因枪、PEG诱导原生质体转化等方法将外源基因(序列特异性核酸酶)转入细胞中，但不整合在染色体上，通过外源基因的瞬时表达过程实现对植物基因组改造的目的，植物再生过程是在无选择压力的情况下进行组织培养，提高了植物的再生效率；而没有整合到植物基因组上的外源基因会被植物细胞降解，这样获得的突变体植物具有较高的生物安全性。所以，通过瞬时表达体系更容易，更适合实现对植物基因组的改造，有利于基因编辑技术在植物上的有效利用。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过基因瞬时表达对植物基因组进行定点改造的方法。
瞬时表达体系在对植物目的基因中靶位点进行定点改造中的应用属于本发明的保护范围。
本发明所提供的对植物目的基因中靶位点进行定点改造的方法，具体 可包括如下步骤：以目的植物的细胞或组织为瞬时表达对象，在所述目的植物的细胞或组织中瞬时表达序列特异性核酸酶，所述序列特异性核酸酶特异于所述靶位点并剪切所述靶位点，通过所述植物的DNA修复完成对所述靶位点的定点改造。
所述方法中，在所述目的植物的细胞或组织中瞬时表达所述序列特异性核酸酶的方法具体可包括如下步骤：a)向所述目的植物的细胞或组织中导入用于表达所述序列特异性核酸酶的遗传物质，和b)将步骤a)获得的细胞或组织在无选择压力的情况下进行培养，从而所述序列特异性核酸酶在所述目的植物的细胞或组织中瞬时表达且未整合在植物基因组的所述遗传物质被细胞降解。
所述“遗传物质”为重组载体如DNA质粒，或DNA线性片段或RNA。
所述“选择压力”是指利于转基因植物生长并对非转基因植物致死的药品或试剂。其中，所述转基因植物指外源基因整合到其基因组中的植物；所述非转基因植物指外源基因未整合到其基因组中的植物。
在无选择压力情况下，植物自身的防御机制会抑制外源基因的进入并将已进入的外源基因降解。因而，将所述步骤a)中获得的细胞或组织在无选择压力的情况下进行培养，外源基因(包括用于表达特异于所述靶位点的核酸酶的遗传物质上的任何片段)不会整合入植物基因组中，最终获得的植物体为非转基因的定点改造植物。
在所述方法中，特异于所述靶位点的所述序列特异性核酸酶可为所有能实现基因组编辑的核酸酶，例如锌指核酸酶(ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9核酸酶等。
在本发明的一个实施例中，所述“序列特异性核酸酶”具体为CRISPR/Cas9核酸酶。在一些实施方式中，用于表达特异于所述靶位点的CRISPR/Cas9核酸酶的遗传物质具体包含用于转录向导RNA和用于表达Cas9蛋白的重组载体或DNA片段(或两种分别用于转录crRNA和tracrRNA，并用于表达Cas9蛋白的重组载体或DNA片段)；或包含用于转录向导RNA的重组载体或DNA片段(或两种分别用于转录crRNA和tracrRNA的重组载体或DNA片段)和用于表达Cas9蛋白的的重组载体或DNA片段；或包含向导RNA(或crRNA和tracrRNA两者)和用于表达Cas9蛋白的重组载体或DNA片段；其中所述向导RNA为由crRNA和tracrRNA 通过部分碱基配对结合而成的具有回文结构的RNA；所述crRNA含有能够与所述靶位点互补结合的RNA片段；
进一步，在所述用于转录向导RNA的重组载体或DNA片段中，启动所述向导RNA的编码核苷酸序列转录的启动子为U6启动子或U3启动子。
更加具体的，所述表达向导RNA的重组载体为在pTaU6-gRNA质粒或pTaU3-gRNA质粒的两个酶切位点BbsI之间正向插入所述“能够与所述靶位点互补结合的RNA片段”的编码核苷酸序列后得到的重组质粒。所述表达cas9蛋白的重组载体为pJIT163-2NLSCas9载体或pJIT163-Ubi-Cas9载体。
在本发明的另一个实施方式中，所述“序列特异性核酸酶”具体为TALEN核酸酶。用于表达特异于所述靶位点的序列特异性核酸酶的遗传物质可以为表达成对TALEN蛋白的重组载体或DNA片段或RNA，其中所述TALEN蛋白包含能够识别所述靶位点并与其结合的DNA结合域和Fok I结构域。
进一步，在所述“用于表达特异于所述靶位点的核酸酶的遗传物质为表达成对TALEN蛋白的重组载体或DNA片段”中，启动所述TALEN蛋白的编码核苷酸序列转录的启动子为玉米启动子Ubi-1。
更加具体的，所述表达成对TALEN蛋白的重组载体为T-MLO载体。
当特异于所述靶位点的序列特异性核酸酶为锌指核酸酶时，用于表达所述序列特异性核酸酶的遗传物质可为表达成对ZFN蛋白的重组载体或DNA片段或RNA，其中所述ZFN蛋白包含能够识别所述靶位点并与其结合的DNA结合域和Fok I结构域。
在所述方法中，所述细胞为任何能作为瞬时表达受体并能经过组织培养再生为完整植株的细胞；所述组织为任何能作为瞬时表达受体并能经过组织培养再生为完整植株的组织。具体而言，所述细胞具体为原生质体细胞或悬浮细胞等；所述组织具体为愈伤组织、幼胚、成熟胚、叶片、茎尖、幼穗或下胚轴等。
在所述方法中，向植物细胞或组织中导入所述遗传物质的方法为基因枪法、农杆菌侵染法、PEG诱导原生质体法、电极法、碳化硅纤维介导法、真空渗入法或其他任何导入方法。
在所述方法中，所述定点改造具体为：对植物基因组中靶位点(所述序列特异性核酸酶识别的靶片段)进行插入突变、缺失突变和/或替换突变。在 一些实施方式中，所述靶位点在目的基因的编码区内。在一些实施方式中，所述靶位点在目的基因的转录调控区，例如启动子。在一些实施方式中，所述目的基因可以是结构基因或非结构基因。
在一些实施方式中，所述改造导致所述目的基因丧失功能。在一些实施方式中，所述改造导致所述目的基因获得(或改变)功能。
所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，例如水稻、拟南芥、玉米、小麦、大豆、高粱、马铃薯、燕麦、棉花、木薯、香蕉等。
在本发明的一个实施方式(实施例1)中，所述植物为小麦；所述核酸酶为CRISPR/Cas9；所述目的基因为小麦内源基因TaGASR7；所述靶位点为5’-CCGGGCACCTACGGCAAC-3’；所述表达向导RNA的重组载体具体为在pTaU6-gRNA质粒的两个酶切位点BbsI之间正向插入5’-CTTGTTGCCGTAGGTGCCCGG-3’所示DNA片段后得到的重组载体；表达所述cas9核酸酶的重组载体具体为pJIT163-2NLSCas9载体。
在本发明的另一个实施方式(实施例2)中，所述植物为小麦；所述目的基因为小麦内源基因TaMLO；所述核酸酶为TALENs核酸；所述靶位点为：
TaMLO-A基因:
Figure DEST_PATH_GDA0000978590540000051
cacgcaggacccaatctc
Figure DEST_PATH_GDA0000978590540000052
；
TaMLO-B基因:
Figure DEST_PATH_GDA0000978590540000053
gacgcaggaccccatctc
Figure DEST_PATH_GDA0000978590540000054
；
TaMLO-D基因:
Figure DEST_PATH_GDA0000978590540000055
gacgcaggacccaatctc
Figure DEST_PATH_GDA0000978590540000056
。
其中，下划线部分为限制性内切酶AvaII的识别序列。
所述TALEN核酸酶的重组载体为T-MLO。
采用所述方法对植物的目的基因中的靶位点进行定点改造，从而使所述目的基因丧失功能或获得功能后获得的细胞或组织属于本发明的保护范围。
由本发明的细胞或组织再生得到的经改造的植物也属于本发明的保护范围。
进一步地，从所述经改造的植物筛选获得在基因组不含整合的外源基因且能稳定遗传的经改造的非转基因植物也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了一种培育经改造的非转基因植物的方法。
该方法具体可包括如下步骤：a)采用如上所述方法对目的植物的目的基因中的靶位点进行定点改造，b)从步骤a)的经改造的植物获得所述目的基因 功能丧失或改变、基因组中未整合外源基因及可稳定遗传的植物。
本发明通过瞬时表达特异性核酸酶不仅提高了植物的再生能力，而且产生的突变可以稳定的遗传到的后代，更为重要是产生的突变体植物里没有外源基因的整合，具有较高的生物安全性。
附图说明
图1为原生质体中瞬时表达CRISPR/Cas9系统对小麦的内源基因TaGASR7的定点突变结果。其中，Marker从下往上依次为(100、250、500、750、1000、2000、3000、5000bp)；第1泳道为Marker；泳道2和3为导入了gRNA：Cas9系统的原生质体DNA的PCR产物经内切酶Bcn I酶切结果；泳道4为野生的原生质体DNA的PCR产物经内切酶Bcn I酶切结果；泳道5为野生型的原生质体PCR产物。
图2为基因枪法瞬时表达CRISPR/Cas9系统对小麦的内源基因TaGASR7的定点突变结果。a)为电泳图。其中，Marker从下往上依次为(100、250、500、750、1000、2000、3000、5000bp)；第1泳道为Marker；第2-9泳道为检测突变体BcnI酶切结果，其中第5、6泳道为纯合突变，第10泳道为野生型对照经BcnI酶切结果。b)为回收a)中未切开条带测序结果，表明在TaGASR7基因的靶位点发生了碱基插入/缺失(insertion/deletion,indel)类型的突变。其中，WT表示野生型基因序列，“-”表示发生了缺失突变的序列，“+”表示发生了插入突变的序列，“-/+”后边的数字表示缺失或插入的核苷酸的数量(小写字母为插入的核苷酸)，2-8表示7种突变体。
图3为利用pTaU6-gRNA-C5载体上的引物扩增小麦TaGASR7基因突变体凝胶电泳图。其中，Marker从下往上依次为(100、250、500、750、1000、2000、3000、5000bp)；第1泳道为Marker；第2-24泳道为检测突变体，第25泳道为阳性对照(质粒pTaU6-gRNA-C5)。
图4为利用pJIT163-2NLSCas9载体上的2对引物分别扩增小麦TaGASR7基因突变体凝胶电泳图。a为采用引物对Cas9-1F/Cas9-1R的扩增结果；b为采用引物对Cas9-2F/Cas9-2R的扩增结果。其中，Marker从下往上依次为(100、250、500、750、1000、2000、3000、5000bp)；第1泳道为Marker，第2-24泳道为检测突变体，第25泳道为阳性对照(质粒pJIT163-2NLSCas9)。
图5为用基因枪法瞬时表达CRISPR/Cas9系统获得的TaGASR7突变体T1代的突变结果。其中，Marker从下往上依次为(100、250、500、750、1000、2000、3000、5000bp)；第1泳道为Marker，第2,3,4,9,10为分离到的纯合植物，5为分离到的野生型，6,7,8为分离到的杂合植株。
图6为用基因枪法瞬时表达TALEN获得的TaMLO突变体的检测结果。a为电泳图。其中，Marker从下往上依次为(100、250、500、750、1000、2000、3000、5000bp)；第1泳道为Marker；第2-13泳道为检测突变体，第14泳道为阳性对照,第15泳道为阴性对照。b为回收a中未切开条带测序结果，表明在TaMLO基因的靶位点发生了碱基插入/缺失(insertion/deletion,indel)类型的突变。
图7为利用瞬时表达系统对小麦的内源基因TaMLO进行定点突变的突变体T0-21后代的突变体酶切电泳图。其中，1-48泳道为48个T1代植物分别在A组和D组的酶切结果，泳道49为Maker。A表示TaMLO-A1基因，D表示TaMLO-D1基因。
图8为利用T-MLO载体上特异于玉米启动子Ubi-1的引物扩增小麦TaMLO基因突变体电泳图。a)为T0代植株检测结果,第1泳道为Marker，第2-13为12个T0突变体的PCR扩增情况，第14泳道为阳性对照；b)为T1代植株检测结果。其中，Marker从下往上依次为(100、250、500、750、1000、2000、3000、5000bp)；第1泳道为Marker，第2-49泳道为T0-21突变体的48个后代的PCR电泳图，第50泳道为阳性对照(质粒T-MLO)。
图9通过瞬时表达序列特异性核酸酶在小麦中的非转基因基因组编辑。(a)方法概览。序列特异性核酸酶(SSN)通过基因枪递送至小麦幼胚。瞬时表达后，其被降解，而所述胚产生能够再生成突变体苗的愈伤组织。(b)设计为靶向TaGASR7同源基因的外显子3的保守区域内的位点的sgRNA。显示了分析12个代表性TaGASR7突变体的PCR-RE测定的结果。泳道T0-1至T0-12显示经BcnI消化的扩增自独立的小麦植物的PCR片段的图。标记为WT1和WT2的泳道分别为经BcnI消化和未经BcnI消化的扩增自野生型植物的PCR片段。红色箭头标记的条带是由于CRISPR诱导的突变造成。(c)通过测序鉴定的12株代表性突变体植物的基因型。(d)pGE-sgRNA载体结构和用于检测非转基因突变体的5套引物的图解。SgRNA指的是分别靶向TaGASR7、TaNAC2、TaPIN1、TaLOX2和TdGASR7的sgRNA。(e)使 用5套引物在12株代表性TaGASR7突变体植物中测试非转基因突变体的结果。没有条带的泳道鉴别为非转基因突变体。标记为WT1和WT2的泳道显示分别扩增自野生型植物和pGE-TaGASR7载体的PCR片段。
图10显示小麦原生质体中TaGASR7、TaNAC2、TaPIN1、TaLOX2基因内的靶向突变。泳道1和2：经消化的SSN-转化的原生质体；泳道3和4：经消化的和未消化的野生型对照；M：Marker。在右边显示SSN诱导的突变的序列。野生型序列示于每组序列的上方。侧边的数字表示突变的类型和涉及多少个核苷酸。
图11显示对TaNAC2(a)、TaPIN1(b)和TaLOX2(c)突变体的PCR/RE测定的结果。
图12显示Shimai11(a)和Yumai4(b)中四倍体TdGASR7突变体用特异性引物进行PCR/RE分析的结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
表达载体pJIT163-2NLSCas9和pTaU6-gRNA在文献“Shan,Q.et al.Targetedgenome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system.NatureBiotechnology 31:686-688,(2013)”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
表达载体pJIT163-Ubi-Cas9在文献“Wang,Y.et al.Simultaneous editing ofthree homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance topowdery mildew.Nature Biotechnology.32,947-951(2014)”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
小麦品种Bobwhite在文献“Weeks,J.T.et al.Rapid production of multipleindependent lines of fertile transgenic wheat.Plant Physiol.102:1077–1084，(1993)”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
小麦TaMLO基因靶向TALENs载体T-MLO在文献“Wang,Y.,Cheng,X.,Shan,Q.,Zhang,Y.,Liu,J.,Gao,C.,and Qiu,J.L.(2014).Simultaneous editing of threehomoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance topowdery mildew.Nature Biotechnology.32,947–951”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
小麦原生质体制备和转化所用溶液如表1-表4所示。
表1：50ml酶解液
Figure DEST_PATH_GDA0000978590540000091
表2：500ml W5
Figure DEST_PATH_GDA0000978590540000092
表3：10ml MMG溶液
Figure DEST_PATH_GDA0000978590540000093
表4：4ml PEG溶液
加入量 终浓度
PEG4000 1.6g 40％
甘露醇(0.8M) 1ml 0.2M
CaCl<sub>2</sub>(1M) 0.4ml 0.1M
双蒸水 至4ml
上述表1-表4中的％表示质量体积百分含量，g/100ml。
小麦组织培养所用培养基如下：
高渗培养基：MS基本培养基、90g/L甘露醇、5mg/L2,4-D、30g/L蔗糖和3g/L植物凝胶，pH值为5.8。
诱导培养基：MS基本培养基、2mg/L2,4-D、0.6mg/L硫酸铜、0.5mg/L 水解酪蛋白、30g/L蔗糖和3g/L植物凝胶，pH值为5.8。
分化培养基：MS基本培养基、0.2mg/L激动素、30g/L蔗糖和3g/L植物凝胶，pH值为5.8。
生根培养基：1/2的MS基本培养基、0.5mg/L乙磺酸、0.5mg/Lα-萘乙酸、30g/L蔗糖和3g/L植物凝胶，pH值为5.8。
实施例1、利用基因枪法瞬时表达CRISPR/Cas9核酸酶获得非转基因的tagasr突变体
一、靶位点target-C5的设计
Target-C5：5’-CCGCCGGGCACCTACGGCAAC-3’；(Genbank No.EU095332所示的TaGASR7基因中，第248-268位)
二、含有C5核苷酸片段pTaU6-gRNA质粒的制备
C5是能与靶标target-C5互补结合的RNA的编码DNA。
合成下述带有粘性末端(下划线部分)的单链寡核苷酸：
C5F：5’-CTTGTTGCCGTAGGTGCCCGG-3’；
C5R：5’-AAACCCGGGCACCTACGGCAA-3’。
经过寡核苷酸退火程序形成有粘性末端的双链DNA，插入到pTaU6-gRNA质粒的两个BbsI酶切位点之间，即得含有C5的pTaU6-gRNA质粒，质粒经测序验证阳性质粒，即在pTaU6-gRNA质粒的酶切位点BbsI处正向插入5’-CTTGTTGCCGTAGGTGCCCGG-3’所示DNA片段后得到的重组质粒为阳性，命名为pTaU6-gRNA-C5。
三、将CRISPR/Cas9系统导入至小麦原生质体
将pJIT163-2NLSCas9载体和步骤二获得的pTaU6-gRNA-C5质粒导入至小麦品种Bobwhite的原生质体，具体过程如下：
1.小麦苗的种植
小麦种子种于培养室，温度25±2℃，光照度1000Lx，光照14～16h/d的条件下培养，培养时间约1-2周。
2.原生质体分离
1)取小麦幼嫩的叶片，用刀片将其中间部分切成0.5-1mm的丝，放入0.6M的甘露醇溶液(溶剂为水)中避光处理10分钟，再用滤网过滤，将其放入50ml酶解液中消化5小时(先抽真空酶解0.5h，再10rmp缓慢摇晃4.5h)。
注：酶解温度要保持在20-25℃，且要避光，酶解完轻轻摇晃酶解液，使原生质体释放出来。
2)加10ml W5稀释酶解产物，用75μm尼龙滤膜过滤酶解液于50ml圆底离心管中。
注：尼龙滤膜要浸泡在75％(体积分数)酒精里，用时要用水冲洗，再用W5浸泡2min再过滤。
3)23℃，100g，离心3min，弃上清。
4)用10ml W5轻轻悬起，冰上放置30min；原生质体逐渐沉降，弃上清。
5)加适量MMG溶液悬浮，至于冰上，待转化。
注：此时需要确定原生质体的浓度，镜检(×100)，原生质体数为2×105/ml至1×106/ml。
3.小麦原生质体转化
1)加10μg pJIT163-2NLSCas9载体和10μg pTaU6-gRNA-C5质粒于2ml离心管，用枪头吸取200μl步骤2获得的原生质体轻弹混匀，静止3-5min，再加250μl PEG4000，轻弹混匀，避光诱导转化30min；
2)加900μl W5(室温)颠倒混匀，100g，离心3min，弃上清；
3)加1ml W5，颠倒混匀，轻轻转至6孔板中，已预先加入1ml W5，23℃培养过夜。
四、PCR/RE实验分析CRISPR/Cas9系统对小麦内源基因TaGASR7的突变结果
小麦原生质体转化后48小时提取基因组DNA，以该DNA为模板，进行PCR/RE(Polymerase Chain Reaction/Restriction digestion)实验分析。同时设置野生型小麦品种Bobwhite的原生质体作为对照。PCR/RE分析方法参考了文献Shan,Q.et al.Rapid andefficient gene modification in rice and Brachypodium using TALENs.MolecularPlant(2013)，由于小麦内源基因 TaGASR7(Genbank No.EU095332)的靶位点(GenbankNo.EU095332的第248-268位)上存在限制性内切酶BcnI的识别序列(5’-CCSGG-3’，S为C或G)，因而实验中采用限制性内切酶BcnI进行PCR/RE检测实验。其中，PCR扩增所用引物为：
TaGASR7-F：5’-GGAGGTGATGGGAGGTGGGGG-3’；
TaGASR7-R：5’-CTGGGAGGGCAATTCACATGCCA-3’。
PCR/RE实验分析结果见图1，结果表明在TaGASR7基因靶位点发生了突变，回收测序图中的条带，测序结果表明在TaGASR7基因的靶位点都发生了碱基插入/缺失(insertion/deletion,indel)类型的突变。
五、利用基因枪法瞬时表达CRISPR/Cas9系统对小麦内源基因TaGASR7进行定点编辑
1)取小麦品种Bobwhite幼胚用高渗培养基进行高渗处理4小时；
2)使用基因枪对经步骤1)所述高渗培养的小麦幼胚进行轰击，将pTaU6-gRNA-C5质粒以及pJIT163-2NLSCas9载体导入所述小麦幼胚细胞中；每次所述轰击的轰击距离为6cm，轰击压力为1100psi，轰击直径为2cm，所述轰击使用金粉对待导入DNA进行分散；每次所述轰击中所述金粉的使用量为200μg，所述待导入DNA为0.1μg(pTaU6-gRNA-C5质粒以及pJIT163-2NLSCas9载体各0.05μg)；所述金粉的粒径为0.6μm。
3)将经步骤2)所述轰击的小麦幼胚进行高渗培养16小时；
4)将经步骤3)所述高渗培养的小麦幼胚依次进行14天愈伤组织诱导培养、28天分化培养和14-28天生根培养，获得小麦植株。
5)将经步骤4)产生的400×4株小麦幼苗提取DNA，经PCR/RE(具体检测方法及采用引物序列参见步骤四)检测得到80株基因定点敲除的突变体。同时设置野生型小麦品种Bobwhite作为对照。
部分突变体的检测结果如图2中a所示，结果表明在TaGASR7基因靶位点发生了突变，回收测序图中的条带，测序结果表明在TaGASR7基因的靶位点都发生了碱基插入/缺失(insertion/deletion,indel)类型的突变(测序结果见图2中b)。
6)对经过步骤5)获得的80株突变体进行PCR扩增，检测突变体中是否存在CRISPR/Cas9系统质粒上的片段。设计3对引物，1对位于 pTaU6-gRNA-C5载体上，2对位于pJIT163-2NLSCas9载体上，以80株突变体的DNA模板，分别采用3对引物进行PCR扩增。实验同时设置质粒阳性对照(pTaU6-gRNA-C5载体或pJIT163-2NLSCas9载体)。
pTaU6-gRNA-C5载体上的引物序列为：
U6F：5’-GACCAAGCCCGTTATTCTGACA-3’；
C5R：5’-AAACCCGGGCACCTACGGCAA-3’。
理论扩增片段大小约为382bp，序列为序列表中SEQ ID NO:1的第1-382位。
pJIT163-2NLSCas9载体上的引物序列为：
Cas9-1F：5’-CCCGAGAACATCGTTATTGAGA-3’；
Cas9-1R：5’-AACCAGGACAGAGTAAGCCACC-3’。
理论扩增片段大小约为1200bp，序列为序列表中SEQ ID NO:2的第3095-4264位，SEQ ID NO:2为pJIT163-2NLSCas9载体的全序列。
Cas9-2F：5’-ACCAACGGTGGCTTACTCTGTC-3’；
Cas9-2R：5’-TTCTTCTTCTTTGCTTGCCCTG-3’。
理论扩增片段大小约为750bp，序列为序列表中SEQ ID NO:2的第4237-4980位。
利用pTaU6-gRNA-C5载体上的引物扩增小麦TaGASR7基因突变体凝胶电泳图如图3所示。利用pJIT163-2NLSCas9载体上的引物扩增小麦TaGASR7基因突变体凝胶电泳图如图4中a(对应引物对Cas9-1F/Cas9-1R)及图4中b(对应引物对Cas9-2F/Cas9-2R)所示。从图3和图4的结果，可以看出，步骤5)获得的小麦TaGASR7基因突变体均未扩增到目的片段，证明突变体中已经不存在CRISPR/Cas9系统质粒上的片段。可见，本发明在定点改造植物的同时避免转基因的插入或携带，免除后续的转基因的安全问题及大众担忧。
六、利用基因枪法瞬时表达CRISPR/Cas9系统获得的突变体可以稳定遗传到后代
将以上利用基因枪瞬时表达CRISPR/Cas9系统获得的T0代突变体植株经自交，得到T1植株，用引物通过PCR扩增TaGASR7基因，然后将PCR扩增产物进行BcnI单酶切(参见步骤四)，检测T1代植物的突变情况。
图5为随机挑选的9株T1代植物PCR/RE结果。
实施例2、利用基因枪法瞬时表达TELEN核酸酶获得可遗传和非转基因的Tamlo突变体
一、利用基因枪法瞬时表达T-MLO对小麦MLO基因进行定点编辑
TELEN质粒为T-MLO载体，该载体可表达成对TALEN蛋白，所述TALEN蛋白由能够识别靶位点并与其结合的DNA结合域和Fok I结构域组成。靶位点为：
TaMLO-A基因:TCGCTGCTGCTCGCCGTcacgcaggacccaatctcCGGGATATGCATCTCCCA；
TaMLO-B基因:TCGCTGCTGCTCGCCGTgacgcaggaccccatctcCGGGATATGCATCTCCGA；
TaMLO-D基因:TCGCTGCTGCTCGCCGTgacgcaggacccaatctcCGGGATATGCATCTCCGA。
其中，下划线部分为限制性内切酶AvaII的识别序列。
(1)取小麦品种Bobwhite的幼胚用高渗培养基进行高渗处理4小时；
(2)使用基因枪对步骤(1)所述高渗培养的小麦幼胚进行轰击，将T-MLO载体导入所述小麦幼胚细胞中；每次所述轰击的轰击距离为6cm，轰击压力为1100psi，轰击直径为2cm，所述轰击使用金粉对待导入DNA进行分散；每次所述轰击中所述金粉的使用量为200μg，所述待导入质粒为0.1μg(T-MLO)；所述金粉的粒径为0.6μm。
(3)将步骤(2)所述轰击的小麦幼胚进行高渗培养16小时；
(4)将步骤(3)所述高渗培养的小麦幼胚依次进行14天愈伤组织诱导培养、28天分化培养和14-28天生根培养，获得小麦植株。
(5)将经步骤(4)产生的小麦幼苗提取DNA。用特异引物通过PCR分别扩增TaMLO-A基因(SEQ ID NO:3)、TaMLO-B基因(SEQ ID NO:4)和TaMLO-D基因(SEQ ID NO:5)，然后将PCR扩增产物进行AvaII单酶切(由于成对TALEN蛋白在三个MLO基因上的切割片段上均含有AvaII的识别序列，因此，如果PCR扩增产物不能被切开，说明该位点发生突变)。同时设置野生型小麦品种Bobwhite作为对照。
用于扩增TaMLO-A基因的引物对如下：
上游引物：5’-TGGCGCTGGTCTTCGCCGTCATGATCATCGTC-3’；
下游引物：5’-TACGATGAGCGCCACCTTGCCCGGGAA-3’。
用于扩增TaMLO-B基因的引物对如下：
上游引物：5’-ATAAGCTCGGCCATGTAAGTTCCTTCCCGG-3’；
下游引物：5’-CCGGCCGGAATTTGTTTGTGTTTTTGTT-3’。
用于扩增TaMLO-D基因的引物对如下：
上游引物：5’-TGGCTTCCTCTGCTCCCTTGGTGCACCT-3’；
下游引物：5’-TGGAGCTGGTGCAAGCTGCCCGTGGACATT-3’。
结果表明，得到小麦源MLO基因在经过瞬时表达TALENs质粒T-MLO到小麦幼胚中，使幼胚再生的T0代植物发生定点突变，其中包括只有TaMLO-A基因发生定点突变的杂合株，只有TaMLO-D基因发生定点突变的杂合株，TaMLO-A基因和TaMLO-D基因同时发生定点突变的杂合株(部分杂合株提取基因组DNA并进行AvaII酶切的结果见图6a)，部分测序结果见图6b)。
二、利用基因枪瞬时表达TALENs获得的突变体可以稳定遗传到后代
将利用基因枪瞬时表达T-MLO获得的T0代突变体植株经自交，得到T1植株，用特异引物通过PCR分别扩增TaMLO-A基因、TaMLO-B基因和TaMLO-D基因(具体操作同步骤一)，然后将PCR扩增产物进行AvaII单酶切，检测T1代植物的突变情况。例如，T0-21基因型为AaBBDd，T1代获得48个后代，其中对于A来说有13株AA，26株Aa，9株aa；对于D来说有9株DD，24株Dd，15株dd，基本符合孟德尔遗传规律(图7)。说明利用基因枪瞬时表达TALENs获得的突变体可以将突变以孟德尔法则传递到后代。
三，利用PCR方法检测T0代和T1代植物中是否整合载体T-MLO
T-MLO载体中TALEN是由玉米启动子Ubi-1启动，在Ubi-1上设计一对引物来扩增T0代植物和T1代植物，检测通过基因枪瞬时表达体系的方法获得的突变体的基因组是不是含有TALENs载体的整合。
Ubi-F：5’-CAGTTAGACATGGTCTAAAGGACAATTGAG-3’；
Ubi-R：5’-CCAACCACACCACATCATCACAACCAA-3’。
理论扩增片段大小约为1387bp，序列为序列表中SEQ ID NO:6的第191-1577位，SEQ ID NO:6为TALENs(T-MLO)的全序列。
结果显示，T0代的所有植物都未能扩增出目的条带(图8a)。对于 T1代，同样选取T0-14的后代进行扩增，可以看出48个后代均未能扩增出目的条带(图8b)，说明本发明在定点改造植物的同时避免外源基因的的插入或携带，获得的突变体具有较高的生物安全性，且可稳定遗传。
实施例3.进一步验证基于瞬时表达的基因编辑方法
使用5个不同的小麦基因作为靶标进一步测试本发明的基因编辑方法。
首先，编辑了已知为参与决定谷粒长度和重量1的TaGASR7的三个同源基因(TaGASR7-A1、TaGASR7-B1和TaGASR7-D1)。该三个同源基因各自具有三个外显子和两个内含子(图9b)。设计靶向外显子3的sgRNA，因为该外显子高度保守。在原生质体中初步测试核酸酶活性后2，最有效的sgRNA表达盒(表5)与Cas9组合于单一构建体中(pGE-TaGASR7，图9d)。其通过基因枪导入至两个普通小麦品种(Bobwhite和Kenong199)的幼胚中。胚性愈伤在2周出现，且在4-6周从所述愈伤再生出大量幼苗(高2-3cm)。与大多数的植物基因组编辑实验相反，没有向培养基添加除草剂或抗生素筛选转基因植物(图9a)。在该无选择条件下，幼苗再生的总时间是6-8周，比之前研究3所公开的短2-4周。
通过PCR-RE分析所再生的T0幼苗中的sgRNA靶位点，首先使用识别全部三种TaGASR7同源基因的保守引物组(表6)，然后使用分别特异于三种同源基因的引物对(表6)。在1005株(8.0％)Bobwhite幼苗中共鉴定到80株在靶向区域具有indel(插入缺失)的TaGASR7突变体，而另一组中283株(7.4％)Kenong 199幼苗有21株这样的突变体(表7)。在全部三个同源基因中观察到靶向突变(图9b、9c)。在该80株Bobwhite突变体幼苗中，鉴别到TaGASR7-A1、TaGASR7-B1和TaGASR7-D1突变体的几乎全部组合，包括在全部三种基因组中具有至少一个修饰的等位基因的51株突变体(表8)。该51株突变体中的8株的全部6个等位基因被同时敲除(表8)。这些数据提示本发明的方法在T0群体中高效产生TaGASR7的靶向突变。
然后，靶向了其它小麦基因以确定所述方法是否普遍适用。靶向了水稻NAC2和PIN1的小麦同源基因和小麦脂氧合酶基因(TaLOX2)。在水稻中，已发现NAC2调控苗分枝4，而PIN1为生长素依赖的不定根出现和分蘖所需5。TaLOX2在谷粒发育期间高表达且可以影响小麦谷粒的可储藏性6。开发了针对该四种基因每一种的CRISPR构建体(图10和表5)，且通过瞬时表 达方法获得大量的T0幼苗(图9a，表7)。为了简化，仅仅设计保守引物(表6)来检测TaNAC2、TaPIN1和TaLOX2中的突变，其中后者以单拷贝存在(D基因组中的TaLOX2-D1)。通过PCR-RE分析在T0幼苗中容易地鉴别到全部三种基因的靶向突变(图11)。突变频率为2.5％至9.2％，且在76株突变体植物中鉴别到34株talox2-dd纯合突变体(44.7％)(表7)。除了普通小麦，硬粒小麦(TriticumturgidumL.var.durum,AABB,2n＝4x＝28)也是重要的作物，广泛用于面食。因为GASR7在四倍体和六倍体小麦中高度保守，向两种不同的硬粒小麦品种导入载体pGE-TaGASR7。在这些四倍体小麦品系的T0幼苗中靶向突变的频率超过3％，且能够获得同时编辑全部四个等位基因的纯合突变体(表7和图12)。这些结果表明本发明的基因组编辑方法很可能对于任何小麦基因和小麦品种都是有效的。
由于在不存在选择下再生T0幼苗，有很高的可能性CRISPR构建体将不整合进小麦基因组。这通过使用PCR测试T0幼苗中携带CRISPR构建体的质粒DNA的存在来进行检查。设计特异于每种构建体的5个离散区域的引物组(表6)，代表了它们全部的主要组件(图9d)。基于这种类型的PCR分析，发现对于TaGASR7，在T0突变体中43.8％(cv Bobwhite)(9e)和61.9％(cv Kenong199)不存在所述CRISPR构建体(表7)。对于其它三种基因，非转基因幼苗的频率为75.0％(TaNAC2)、62.5％(TaPIN1)和86.8％(TaLOX2)(表7)。同样，发现在两种硬粒小麦品种的T0突变体幼苗中54.5％至58.3％不存在CRISPR构建体整合(表7)。因此，使用该基因组编辑方法，可以获得不含CRISPR构建体的靶向突变体。
也发现本发明的体系能够用于其他序列特异性核酸酶，例如ZFN和TALEN。本发明人之前描述了在普通小麦中靶向MLO基因座的一对TALEN，并报道了在含有除草剂草铵膦(PPT)以选择TALEN构建体的存在的培养基上再生的幼苗3.4％的编辑效率3。在本研究中，同一对TALEN被递送至幼胚，在没有选择下再生幼苗。在200株再生的T0幼苗中，13株(6.5％)携带靶向突变，且通过PCR评估，全部为非转基因(表5和表7)。
为了研究本发明的方法产生的突变是否能传递至下一代，将代表性的T0TaGASR7、TaMLO和TaLOX2突变体自交，并通过PCR-RE分析T1后代。对于在T0中检测到的纯合突变(包括同时编辑全部6个等位基因的那些)，传递率为100％；对于大多数的杂合突变体，出现孟德尔分离(纯合体/ 杂合体/野生型:1:2:1)(表9)。如所预期，在非转基因T0亲本的T1后代中没有检测到整合的CRISPR或TALEN构建体(表9)。
总的而言，相对于包含转基因中间体的常用基因组编辑方法，本发明的SSN瞬时表达方法提供了若干优势。第一，靶向基因编辑以高频发生，且有可能快速获得纯合的非转基因突变体。之前的研究报道整合进植物基因组的sgRNA/Cas9盒和TALEN保留其活性并能在后代中产生新的突变 7,3；非转基因突变体将降低后续分析的复杂性和脱靶的风险。其也将受到较少的监管审查。第二，通过本发明的方法能够容易地获得难以转化的植物的突变体，因为在大多数物种中能够从愈伤中再生植株。本发明的方法也可用于在营养繁殖的作物中修饰基因，例如马铃薯、木薯和香蕉，其难以或不可能分离掉转基因。本文描述的方法将加速对植物基因功能的理解，并能够产生有价值的新的作物品种。
表5.SSN靶位点和序列
Figure DEST_PATH_GDA0000978590540000181
表6.PCR引物及其应用
Figure DEST_PATH_GDA0000978590540000182
Figure DEST_PATH_GDA0000978590540000191
表7.通过瞬时表达序列特异性核酸酶在小麦中的非转基因基因组编辑。
Figure DEST_PATH_GDA0000978590540000192
表8.80株T0tagasr7突变体对于TaGASR7-A1、TaGASR7-B1和TaGASR7-D1同源等位基因中突变的基因型。
Figure DEST_PATH_GDA0000978590540000193
Figure DEST_PATH_GDA0000978590540000201
N.A.,未获得。这些突变类型不是获得自这些实验；N.D.，未检测。
a“-”表示所指示数目的核苷酸的缺失；“+”表示所指示数目的核苷酸的插入；“-/+”表示在相同位点同时缺失和插入所指示数目的核苷酸。
表9.TaGASR7、TaMLO和TaLOX2同源基因中SSN-诱导的突变及其向T1代传递的分子和遗传学分析。
Figure DEST_PATH_GDA0000978590540000202
Figure DEST_PATH_GDA0000978590540000211
Hetero，杂合；Homo，纯合。
a“-”表示所指示数目的核苷酸的缺失；“+”表示所指示数目的核苷酸的插入；“-/+”表示在相同位点同时缺失和插入所指示数目的核苷酸。b基于携带所观察到的突变的植物数目相对于所测试的植物总数。c基于不携带完整CRISPR和TALEN构建体的突变体植物数目相对于所测试的植物总数。d根据χ2检验(P>0.5)杂合株系的分离符合孟德尔1:2:1的比例。
通用方法
选择sgRNA靶标
对各个基因在小麦的A、B和D基因组的保守结构域设计若干sgRNA靶标。通过将pJIT163-Ubi-Cas9质粒3和TaU6-sgRNA质粒8转化进小麦原生质体来评估所述sgRNA的活性。从经转化的原生质体提取总基因组DNA并通过PCR扩增围绕靶向序列的片段。使用PCR-RE消化筛选测定检测sgRNA活性7(图9)。
原生质体测定
在该研究中使用春小麦品种Bobwhite和冬小麦品种Kenong199。如所描述的8进行原生质体转化。
构建pGE-sgRNA载体
使用具有SpeI限制性位点的引物组U6-SpeI-F/sgRNA-SpeI-R(Table 6)从TaU6-sgRNA质粒8扩增活性TaU6-sgRNA的片段(表5)。PCR产物用SpeI消化并插入至经SpeI消化的pJIT163-Ubi-Cas9(ref.3)以产生融合表达载体pGE-sgRNA(图9d)。
通过瞬时表达体系基因枪转化小麦
如之前所描述的9进行基因枪转化。质粒DNA(pGE-sgRNA或T-MLO3)(图9d)用于轰击小麦胚。在轰击后，将胚转移至愈伤诱导培养基。在第3周，将全部愈伤转移至再生培养基。3-5周后，在愈伤表面出现芽。这些被转移至生根培养基，且在大约1周后获得大量T0幼苗。在组织培养过程中的任何部分都没有使用选择剂(图9a)。
登录号
序列数据可以根据以下登录号在NCBI Genbank获得：KJ000052(TaGASR7-A1)、KJ000053(TaGASR7-B1)、KJ000054(TaGASR7-D1)、AY625683(TaNAC2)、AY496058(TaPIN1)和GU167921(TaLOX2)。
参考文献
1.Ling,H.et al.Nature.496,87-90(2013).
2.Shan,Q.et al.Nat.Protoc.9,2395–2410(2014).
3.Wang,Y.et al.Nat.Biotechnol.32,947-95(2014).
4.Mao,C.et al.New Phytol.176,288–298(2007).
5.Xu,M.et al.Plant Cell Physiol.46,1674–1681(2005).
6.Feng,B.et al.J.Cereal Sci.52,387-394(2010).
7.Lawrenson,T.et al.Genome Biol.16,258(2015).
8.Shan,Q.et al.Nat.Biotechnol.31,686–688(2013).
9.Zhang,K.et al.J.Genet.Genomics.42,39-42(2015)。
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Claims (7)

1.一种获得在目的基因中靶位点处经改造的非转基因植物的方法，包括如下步骤：
a)向所述目的植物的组织中导入用于表达CRISPR/Cas9系统的遗传物质，所述CRISPR/Cas9系统特异于所述靶位点并切割所述靶位点，由此通过所述植物的DNA修复完成对所述靶位点的定点改造；和
b)将步骤a)获得的组织在无选择压力的情况下进行培养，由此所述CRISPR/Cas9系统在所述目的植物的组织中瞬时表达且未整合在所述植物基因组上的所述遗传物质被降解；和
c)将步骤b)获得的组织在无选择压力的情况下进行培养，由此获得经改造的植物，
其中所述组织为愈伤组织、幼胚、成熟胚、叶片、茎尖、幼穗或下胚轴。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述遗传物质为重组载体。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述重组载体为DNA质粒、DNA线性片段或RNA。
4.根据权利要求1所述的方法，所述用于表达特异于靶位点的CRISPR/Cas9系统的遗传物质包含用于转录向导RNA和用于表达Cas9蛋白的重组载体或DNA片段(或两种分别用于转录crRNA和tracrRNA，并用于表达Cas9蛋白的重组载体或DNA片段)；或包含用于转录向导RNA的重组载体或DNA片段(或两种分别用于转录crRNA和tracrRNA的重组载体或DNA片段)和用于表达Cas9蛋白的重组载体或DNA片段；或包含向导RNA(或crRNA和tracrRNA两者)和用于表达Cas9蛋白的重组载体或DNA片段，
其中所述向导RNA为由crRNA和tracrRNA通过部分碱基配对结合而成的具有回文结构的RNA；所述crRNA含有能够与所述靶位点互补结合的RNA片段。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：用于递送所述遗传物质的方法为基因枪法、农杆菌侵染法、电极法、碳化硅纤维介导法、或真空渗入法。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述定点改造为在所述靶位点中进行插入突变、缺失突变和/或替换突变。
7.一种培育经改造的非转基因植物的方法，包括如下步骤：
a)采用权利要求1所述方法获得经改造的植物；
b)从步骤a)所获得的经改造的植物中筛选其中所述目的基因的功能被丧失或改变，基因组中不含外源基因，且能稳定遗传的植物。
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Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3613852A3 (en) 2011-07-22 2020-04-22 President and Fellows of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9228207B2 (en) 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US9068179B1 (en) 2013-12-12 2015-06-30 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting presenilin point mutations
AU2015298571B2 (en) 2014-07-30 2020-09-03 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
CN108513575A (zh) 2015-10-23 2018-09-07 哈佛大学的校长及成员们 核碱基编辑器及其用途
WO2018027078A1 (en) 2016-08-03 2018-02-08 President And Fellows Of Harard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
CA3033327A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
CN106167787B (zh) * 2016-08-23 2020-01-14 浙江农林大学 一种光皮桦木质部原生质体制备及瞬时转化的方法
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US20190225974A1 (en) 2016-09-23 2019-07-25 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Targeted genome optimization in plants
WO2018067977A1 (en) 2016-10-07 2018-04-12 Kansas State University Research Foundation Genetic system for promoting recombination and gene transfer in wheat
KR20240007715A (ko) 2016-10-14 2024-01-16 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵염기 에디터의 aav 전달
CN106755067A (zh) * 2016-12-05 2017-05-31 天津吉诺沃生物科技有限公司 通过瞬时表达对植物基因进行定点插入的方法及获得的瞬时表达细胞、组织和突变植株
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
JP2020510439A (ja) 2017-03-10 2020-04-09 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ シトシンからグアニンへの塩基編集因子
SG11201908658TA (en) 2017-03-23 2019-10-30 Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins
EP3392339A1 (en) * 2017-04-18 2018-10-24 Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule (RWTH) Aachen Improved genome editing in plant cells
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
GB201708662D0 (en) * 2017-05-31 2017-07-12 Tropic Biosciences Uk Ltd Compositions and methods for increasing shelf-life of banana
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
CN111757937A (zh) 2017-10-16 2020-10-09 布罗德研究所股份有限公司 腺苷碱基编辑器的用途
AR113458A1 (es) * 2017-10-19 2020-05-06 Inst Genetics & Developmental Biology Cas Método para regular la expresión génica
WO2019103034A1 (ja) * 2017-11-27 2019-05-31 国立研究開発法人理化学研究所 ゲノム編集植物の生産方法
US11739322B2 (en) 2018-02-01 2023-08-29 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Method for genome editing using a self-inactivating CRISPR nuclease
CN110396523B (zh) * 2018-04-23 2023-06-09 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 一种重复片段介导的植物定点重组方法
JP2021530968A (ja) * 2018-05-24 2021-11-18 モンサント テクノロジー エルエルシー 植物におけるゲノム編集
EP3802810A4 (en) 2018-05-24 2022-03-09 Monsanto Technology LLC GENOME EDITING IN PLANTS
CN108753814B (zh) * 2018-06-11 2022-10-18 北京师范大学 一种加速物种突变的新育种方法
CN108823241A (zh) * 2018-07-17 2018-11-16 武汉伯远生物科技有限公司 一种自动分离基因编辑中t-dna标签的转基因方法
CN109402167A (zh) * 2018-12-07 2019-03-01 北京林业大学 一种在油松下胚轴中进行基因瞬时表达的方法
DE112020001342T5 (de) 2019-03-19 2022-01-13 President and Fellows of Harvard College Verfahren und Zusammensetzungen zum Editing von Nukleotidsequenzen
CN111850029B (zh) * 2019-04-08 2022-04-26 天津吉诺沃生物科技有限公司 一种获得非转基因多年生黑麦草突变体的方法
CN109971785A (zh) * 2019-04-18 2019-07-05 济宁学院 一种智能全基因组范围的植物基因功能鉴定系统及方法
CN112779266A (zh) * 2019-11-06 2021-05-11 青岛清原化合物有限公司 在生物体内创制新基因的方法及应用
CN111110865A (zh) * 2019-11-27 2020-05-08 哈尔滨医科大学 一种腺相关病毒双重载体基因治疗系统及其在治疗黏多糖贮积症ⅱ型中的应用
CN110714030A (zh) * 2019-12-03 2020-01-21 中国农业大学 一种长喙壳菌外源基因转化的方法
CN111575311A (zh) * 2020-04-15 2020-08-25 南京农业大学 一种基于基因枪介导的棉花基因编辑方法及应用
EP4146804A1 (en) 2020-05-08 2023-03-15 The Broad Institute Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013166315A1 (en) * 2012-05-02 2013-11-07 Dow Agrosciences Llc Targeted modification of malate dehydrogenase

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102558309B (zh) * 2012-02-10 2014-09-17 浙江大学 一对转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用
US8697359B1 (en) * 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
CN103382468B (zh) 2013-07-04 2015-04-29 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种水稻基因组定点改造方法
CN103343120B (zh) * 2013-07-04 2015-03-04 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种小麦基因组定点改造方法
CN103667338B (zh) * 2013-11-28 2016-01-27 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种玉米基因组定点改造方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013166315A1 (en) * 2012-05-02 2013-11-07 Dow Agrosciences Llc Targeted modification of malate dehydrogenase

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew;Yanpeng Wang等;《Nature Biotechnology》;20140720;第1-6页 *
Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system;Qiwei Shan等;《Nature Biotechnology》;20130831;第31卷(第8期);第686-688页 *
The CRISPR–Cas system for plant genome editing: advances and opportunities;Vinay Kumar and Mukesh Jain;《Journal of Experimental Botany》;20141104;第66卷(第1期);第47-57页 *
Transcription Activator-Like Effector Nucleases Enable Efficient Plant Genome Engineering;Yong Zhang等;《Plant Physiology》;20130131;第161卷;第20-27页 *

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