CN111110865A - 一种腺相关病毒双重载体基因治疗系统及其在治疗黏多糖贮积症ⅱ型中的应用 - Google Patents

一种腺相关病毒双重载体基因治疗系统及其在治疗黏多糖贮积症ⅱ型中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种腺相关病毒双重载体基因治疗系统及其在治疗黏多糖贮积症Ⅱ型中的应用。所述的腺相关病毒双重载体基因治疗系统由第一载体和第二载体组成，其中，所述第一载体为携带有靶向人源白蛋白基因(Albumin,Alb)切割位点的特异性小向导RNA(sgRNA)以及人源艾杜糖醛酸‑2‑硫酸酯酶(iduronate‑2‑sulfatase,IDS)基因的开放阅读框序列的AAV载体，其中，所述的切割位点位于白蛋白基因翻译起始密码子atg的第2、3位碱基之间；所述第二载体为携带Cas9的AAV载体。本发明以CRISPR‑Cas9为基因编辑工具的腺相关病毒双重载体系统可显著提高MPSII模型小鼠血浆的IDS酶活性以及肝脏组织IDS的表达，经治疗后小鼠表型和骨骼发育均得以改善。本发明为黏多糖贮积症Ⅱ型的临床治疗提供了一种有效治疗手段。

Description

一种腺相关病毒双重载体基因治疗系统及其在治疗黏多糖贮 积症Ⅱ型中的应用
技术领域
本发明涉及一种罕见遗传病黏多糖贮积症Ⅱ型的基因治疗系统，特别涉及一种用于黏多糖贮积症Ⅱ型基因治疗的腺相关病毒双重载体系统，还涉及该系统的构建方法和应用。本发明属于医药技术治疗领域。
背景技术
黏多糖贮积症(mucopolysaccharidosis，MPS)是溶酶体贮积病中非常重要的一类，是由于溶酶体水解酶缺陷，造成酸性黏多糖降解受阻，黏多糖在体内积聚而引起一系列临床症状，发病率约为1/25 000。MPS可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅸ型，除了MPSII型外，其余均为常染色体隐性遗传病。
黏多糖贮积症Ⅱ型(mucopolysaccharidosis type II，MPSII)，是一种X连锁隐性遗传的单基因遗传病，其致病基因艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase，IDS)基因位于人染色体Xq28，编码550个氨基酸。MPSII患者体内都缺乏艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase，IDS)，从而导致糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)在溶酶体中的积累。随着组织细胞内GAG沉积的增多，患者将产生一系列功能障碍。MPSII临床表现多样，分为轻型和重型，病情的发展具有进行性加重的特点。重型患者一般2～4岁起病，临床表现为智力落后、侏儒身材、面容丑陋、多发性骨骼畸形、肝脾肿大、心脏病变、少年期死亡等。轻型患者一般10岁前发病，临床症状较轻且寿命一般不受影响。由于MPSII的遗传方式为X连锁隐性遗传，通常只有男性会罹患此病，但在某些极其罕见的病例中，也会出现女性患病的情况。据估计，每10万男性新生儿中有一人罹患MPSII。
MPSII患者的治疗主要包括骨髓移植、酶替代治疗和基因治疗。对于有骨骼畸形或精神缺陷的MPSII患者，骨髓移植可能不是最佳选择。重组IDS用于酶替代治疗的安全性和有效性得到了一致的证明。然而，酶替代治疗并不能彻底治愈MPSII，且价格昂贵，患者需终身治疗，普通家庭难以负担得起高昂的费用。基因治疗仍处于探索阶段。
目前，腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)是基因治疗领域的热门病毒，它是微小病毒科的成员之一，为无包膜的单链线状DNA病毒。通常情况下，AAV需要腺病毒、疱疹病毒等辅助病毒的帮助，才能进行自我复制。在没有辅助病毒的情况下，AAV可在哺乳动物中长期潜伏。AAV病毒载体可感染分裂和非分裂细胞，毒性和免疫原性低，适合以相对较高的转染效率在非分裂细胞中长期表达和在分裂细胞中短期表达基因。重组AAV不整合到染色体，可长期表达外源基因，单纯注射含有目的基因开放阅读框的AAV治疗方案并非是一劳永逸的。重组AAV载体的外源基因容量有限，两个末端重复序列(ITR)之间的空间只有4.7kb，因此可插入的外源基因约为3.5kb，甚至更小，故而本发明设计了双重AAV病毒载体系统。需要注意的是，体内存在的中和抗体可阻断AAV感染，严重影响治疗效果。AAV的各血清型在人群和各种实验动物中均存在较高的流行率，人群中AAV2的流行率可达30％～60％，AAV7/8/9的流行率可达15％～30％；而实验动物猴群中的AAV7/8/9的流行率甚至接近100％。为了避免中和抗体阻断AAV感染，优选的，本发明选用的AAV血清型为人工合成的AAV-DJ(Structure of AAV-DJ,a Retargeted Gene Therapy Vector:Cryo-ElectronMicroscopy at
Figure BDA0002291885000000021
resolution,Thomas F.Lerch.et.al,Structure.2012 Aug 8；20(8):1310–1320.),以CRISPR-Cas9为基因编辑工具设计腺相关病毒(AAV)双重载体系统对MPSII进行基因治疗。CRISPR/Cas9系统主要由Cas9蛋白和小向导RNA(small guide RNA，sgRNA)两个元件组成，而crRNA和tracrRNA又组成了sgRNA。研究已经证明，Cas9是由sgRNA引导的能对目的基因进行切割的核酸内切酶，通过与crRNA和tracrRNA形成复合物起作用。Cas9由核酸酶(NUC)叶以及α-螺旋识别(REC)叶组成，NUC叶包含三个结构域：HNH核酸酶结构域，切割DNA的正义链(与小向导RNA互补)；RuvC样核酸酶结构域，切割DNA的反义链；PAM(protospacer associated motif)相互作用结构域(PI结构域)，通过与DNA的PAM区域的碱基特异性相互作用，有助于Cas9的DNA靶特异性(Jinek M,Chylinski K,Fonfara I,etal.A programmable dual-RNA–guidedDNA endonuclease in adaptive bacterialimmunity.Science,2012,337(6096):816-821.)。针对罕见遗传病MPSII，2017年，Sangamo公司宣布，FDA授予公司临床阶段体内基因组编辑候选产品SB-913快速通道地位，用于治疗MPSII。11月，Sangamo公司宣布，其在研疗法SB-913完成了首例患者给药。SB-913以锌指核酸酶(ZFN)为基因编辑工具，将目的基因插入到肝细胞中白蛋白基因的特定位点，从而实现治疗的目的。与ZFN相比，本发明中使用的基因编辑工具CRISPR-Cas9系统具有简便、经济、耗时短等优点。针对罕见遗传病的基因治疗，有的放矢，将会成为一种重要的治疗方案。
发明内容
针对目前黏多糖贮积症Ⅱ型的治疗效果欠佳的问题，本发明的目的在于提供一种以CRISPR-Cas9为基因编辑工具的腺相关病毒(AAV)双重载体基因治疗系统，以及该载体系统在用于治疗黏多糖贮积症Ⅱ型中的应用，本发明的腺相关病毒(AAV)双重载体基因治疗系统能够从根本上提高艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的活性，从而有效改善MPSII遗传病的临床症状。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
为了证明以CRISPR-Cas9为基因编辑工具设计的腺相关病毒(AAV)双重载体系统对于MPSII的治疗作用，本发明建立了MPSII小鼠模型，以该腺相关病毒(AAV)双重载体系统对MPSII小鼠进行基因治疗。该治疗系统由第一载体和第二载体组成，其中一种载体设计为携带靶向小鼠白蛋白基因(Albumin，Alb)切割位点的特异性小向导RNA(small guide RNA，sgRNA)以及人源艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase，IDS)基因的开放阅读框(ORF)序列的AAV载体，该AAV载体靶向于黏多糖贮积症Ⅱ疾病小鼠的肝细胞，sgRNA特异性识别小鼠肝细胞中白蛋白基因(Alb)的特定切割位点(切割位点位于白蛋白基因翻译起始密码子atg的第2、3位碱基之间)；另一种载体为携带Cas9的AAV载体，用于在sgRNA特异性识别的切割位点进行特异性的切割，然后将人源艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase，IDS)基因的开放阅读框(ORF)序列插入其中。我们将两种病毒载体按一定比例通过尾静脉注射，将病毒靶向至MPSII模型小鼠肝脏，并使其得以表达，以补充疾病小鼠缺陷的IDS酶。基因治疗后，我们通过荧光底物4-Methylumbelliferyl a-L-idopyranosiduronic acid 2-sulphate disodium salt二次孵育法对小鼠血浆IDS酶活性进行检测，观察小鼠表型及骨骼发育状况，观察小鼠肝脏组织IDS表达情况，对该治疗方案进行分析与评估。
通过针对MPSII模型小鼠的早期AAV基因治疗实验，我们发现未经治疗的MPSII疾病模型小鼠(n＝3)的血浆IDS酶活性约为野生型小鼠(n＝3)的10.56％，而经腺相关病毒双重载体系统治疗10天后、1个月后及3个月后的MPSII疾病模型小鼠(n＝3)的血浆IDS酶活性分别为野生型小鼠的578.05％、556.27％及527.24％。我们在以往文献报道和本实验中均未见明显副作用。通过对小鼠的观察，我们发现MPSII疾病模型小鼠存在着少毛，背部凸起，有的个体甚至出现了运动困难等现象。与未经治疗的MPSII小鼠相比，基因治疗后的MPSII小鼠毛发明显丰富，无严重的背部凸起现象。此外，疾病型小鼠脊柱存在严重变形，基因治疗后的小鼠则骨骼发育接近于野生型小鼠。免疫荧光结果显示，经腺相关病毒双重载体系统治疗后MPSII小鼠肝脏组织IDS表达接近甚至高于野生型小鼠，而未经治疗的MPSII小鼠肝脏组织IDS表达则显著低于野生型小鼠。此外，MPSII携带者的肝脏组织IDS表达低于野生型小鼠。Western blot结果亦显示治疗后MPSII小鼠肝脏组织IDS表达增加。从以上数据可以看出，以CRISPR-Cas9为基因编辑工具的腺相关病毒双重载体系统治疗方案可显著提高MPSII小鼠血浆的IDS酶活性，并改善模型小鼠的MPSII表型，判断此治疗方案效果良好并具备可行性。
在上述研究的基础上，本发明提出了一种以CRISPR-Cas9为基因编辑工具的腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)双重载体基因治疗系统，其由第一载体和第二载体组成，其中，所述的第一载体为携带有靶向人源白蛋白基因(Albumin，Alb)切割位点的特异性小向导RNA(small guide RNA，sgRNA)以及人源艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase，IDS)基因的开放阅读框(ORF)序列的AAV载体，其中，所述的切割位点位于人源白蛋白基因翻译起始密码子atg的第2、3位碱基之间；
所述的第二载体为携带Cas9的AAV载体，用于在所述sgRNA靶向识别的切割位点进行特异性的切割。
靶向人源白蛋白基因剪接位点的特异性小向导RNA(sgRNA)可通过sgRNA设计网站进行设计(网址：https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design)，优选的，所述的靶向人源白蛋白基因剪接位点的特异性小向导RNA的序列如SEQ ID NO.1-3中任一所示。
其中，优选的，所述AAV载体包含血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或人工合成的AAV-DJ。
更优选的，所述AAV载体为人工合成的AAV-DJ。
其中，优选的，所述的携带Cas9的AAV载体为AAV-DJ.SaCas9(Yang Y,Wang L,BellP,McMenamin D,He Z,White J,Yu H,Xu C,Morizono H,Musunuru K,Batshaw ML,WilsonJM.A Dual Aav System Enables the Cas9-Mediated Correction of a MetabolicLiver Disease in Newborn Mice.Nat Biotechnol.2016；34(3):334-338.)。该载体可购买自北京可瑞生物科技有限公司。
进一步的，本发明还提出了所述的腺相关病毒双重载体系统在制备治疗黏多糖贮积症Ⅱ型药物中的用途。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
1、本发明中使用的基因编辑工具CRISPR-Cas9系统具有简便、经济、耗时短等优点。
2、本发明保留白蛋白基因的启动子，由于使用的是内源启动子，可降低实验未知的风险。基因编辑的切割位点恰好位于白蛋白基因翻译起始密码子atg的第2、3位碱基之间，目的序列插入后将不会形成融合转录本，增强了治疗的安全性。
3、结果以CRISPR-Cas9为基因编辑工具的双重腺相关病毒基因治疗方案可显著提高黏多糖贮积症Ⅱ型疾病小鼠血浆的IDS酶活性，显著提高疾病小鼠肝脏组织IDS的表达，经治疗后小鼠表型和骨骼发育均得以改善，此治疗方案效果良好并具备可行性。
4、本发明的提出为黏多糖贮积症Ⅱ型的临床治疗提供了一种有效的治疗手段。
附图说明
图1是AAV载体基因编辑靶向识别切割位点示意图；
如图所示为小鼠白蛋白基因部分序列，箭头代表在翻译起始密码子atg的第2、3位碱基之间进行靶向切割；
图2是AAV-DJ.sgRNA.hIDS载体图谱；
图3是使用AAV双重载体系统基因治疗后MPSII小鼠血浆IDS酶活性；
图4是使用AAV双重载体系统治疗后MPSII小鼠表型；
(A)小鼠俯视图；(B)小鼠侧视图。从左至右依次为治疗组、野生型及疾病型小鼠；
图5是使用AAV双重载体系统治疗后MPSII小鼠骨骼检查；
从左至右依次为治疗组、野生型及疾病型小鼠；
图6是荧光显微镜观察使用AAV双重载体系统治疗后MPSII小鼠肝脏组织IDS表达情况；
图7是使用AAV双重载体系统治疗后MPSII小鼠肝脏组织IDS蛋白的Western Blot结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但该实施例仅用于说明本发明，并不对本发明的保护范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1腺相关病毒双重载体基因治疗系统的构建
一种用于黏多糖贮积症Ⅱ型基因治疗的腺相关病毒双重载体基因治疗系统，由第一载体和第二载体组成，其中，第一载体设计为携带靶向小鼠白蛋白基因(Albumin，Alb)切割位点的特异性小向导RNA(small guide RNA，sgRNA)以及人源艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(human iduronate-2-sulfatase，hIDS)基因的开放阅读框(ORF)序列(NM_000202.8)的AAV-DJ载体，通过sgRNA设计网站对小鼠白蛋白基因进行分析与评估(网址：https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design)，设计针对小鼠白蛋白基因的sgRNA(序列：5’ACTAGCCTCTGGCAAAATGAA3’)。该AAV-DJ载体靶向于黏多糖贮积症Ⅱ疾病小鼠的肝细胞，sgRNA识别小鼠肝细胞中白蛋白基因(Alb)的特定部位(切割位点位于白蛋白基因翻译起始密码子atg的第2、3位碱基之间，图1)，该设计将保留小鼠白蛋白基因的启动子，由于切割位点恰好位于小鼠白蛋白基因翻译起始密码子atg第2、3碱基之间中，目的序列插入后将不会形成融合转录本，增强了治疗的安全性。构建得到的载体命名为AAV-DJ.sgRNA.hIDS，其载体图谱如图2所示；载体构建及病毒包装由北京可瑞生物科技有限公司完成。
第二载体为携带Cas9的AAV-DJ载体AAV-DJ.SaCas9，可以在上述sgRNA靶向识别的位置进行特异性的切割，然后将人源艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(human iduronate-2-sulfatase，hIDS)基因的开放阅读框(ORF)序列插入其中。购买自北京可瑞生物科技有限公司。
体外实验阶段，公司在体外对实验可行性进行了初步验证以及hIDS敲入情况进行了验证。测序结果显示，在sgRNA识别区中的Cas9切割位点处出现了移码导致的套峰，证明Cas9在该位点处有编辑效果。细胞水平上的验证结果进一步提高了后续基因治疗活体实验的可行性。
实施例2腺相关病毒双重载体基因治疗系统对MPSII疾病小鼠模型的基因治疗实验
MPSII疾病小鼠模型(B6N.Cg-Idstm1Muen/J，货号：024744)购自The JacksonLaboratory(USA)，共计购2只雄性种鼠(IdsX+/Y)和3只Ids基因杂合型雌性种鼠(IdsX+/X-)。在SPF级动物实验中心常规饲养配繁，生育雄性MPSII疾病小鼠(IdsX-/Y)。在疾病小鼠6周龄时进行基因治疗。我们选择腺相关病毒双重载体系统(实施例1构建)，将AAV-DJ.SaCas9：2×1011GC和AAV-DJ.sgRNA.hIDS：2×1012GC为MPSII疾病小鼠模型基因治疗AAV用量。我们通过尾静脉按此用量注射病毒载体，将其靶向至MPSII小鼠肝脏。
1、MPSII疾病小鼠模型基因治疗后IDS酶活性分析
我们通过荧光底物4-Methylumbelliferyl a-L-idopyranosiduronic acid 2-sulphate disodium salt二次孵育法对小鼠血浆IDS酶活性进行检测。具体操作如下：①取8μl超纯水于1.5ml EP管中，加入2μl血浆样本并混匀；②取20μl 1.25mmol/L的荧光底物4-Methylumbelliferyl a-L-idopyranosiduronic acid 2-sulphate disodium salt(溶于0.1mol/L sodium acetate buffer pH＝5)，加入①中，混匀，金属浴37℃孵育4h；③置于冰浴中，加入40μl McIlvain’s buffer(0.4mol/L Na-phosphate0.2mol/L citrate,pH＝4.5)以及10μl终浓度为1μg/ml的Recombinant Human alpha-L-Iduronidase/IDUAProtein，充分混匀后，金属浴37℃孵育24h；④置于冰浴中，加入200μl 0.5mol/L Na2CO3/NaHCO3(pH＝10.7)，充分混匀。吸取200μl至96孔板内，多功能酶标仪(激发波长365nm，发射波长460nm)进行检测并读取荧光值。
在MPSII疾病小鼠模型基因治疗阶段，我们发现未经治疗的MPSII疾病模型小鼠(n＝3)的血浆IDS酶活性约为野生型小鼠(n＝3)的10.56％，而经腺相关病毒双重载体系统治疗10天后、1个月后及3个月后的MPSII疾病模型小鼠(n＝3)的血浆IDS酶活性分别为野生型小鼠的578.05％、556.27％及527.24％(图3)。
我们对未经治疗的MPSII小鼠与AAV双载体治疗10天后、1个月后及3个月后的MPSII小鼠血浆IDS酶活性进行了One-way ANOVA和Tukey's multiple comparisons test分析，P值分别为0.0284、0.0353及0.0472，具有统计学意义。
从以上数据可以看出，通过本发明的基于CRISPR-Cas9基因编辑的腺相关病毒双重载体系统基因治疗，可显著地提高MPSII疾病模型小鼠血浆IDS酶活性，从而达到治疗的目的。
2、MPSII疾病小鼠模型基因治疗后表型分析
通过对小鼠的观察，我们发现MPSII疾病模型小鼠存在着少毛，背部凸起，有的个体甚至出现了运动困难等现象。与未经治疗的MPSII小鼠相比，经过腺相关病毒双重载体系统治疗4.5个月后的MPSII小鼠毛发明显丰富，无严重的背部凸起现象(图4)。
3、MPSII疾病小鼠模型基因治疗后骨骼检测
MPSII疾病模型小鼠在约4个月时可出现骨骼畸形。疾病型小鼠脊柱(65.1°)存在严重变形，而同龄经过腺相关病毒双重载体基因治疗系统治疗4.5个月后的小鼠(75.9°)则接近于野生型小鼠(79.8°)(图5)。
4、MPSII疾病小鼠模型基因治疗后肝脏组织IDS表达情况
制备野生型小鼠、MPSII未经治疗的疾病模型小鼠以及MPSII疾病模型经腺相关病毒双重载体基因治疗系统治疗后的小鼠肝脏组织冰冻切片，进行免疫荧光实验。具体操作如下：(1)从-80℃中取出冰冻切片，缓至室温，用丙酮泡一下；(2)用PBS清洗3次，每次5min；(3)4℃的环境下，在0.1％～0.15％Triton X-100中孵育30min，增强细胞通透性；(4)用PBS清洗3次，每次5min；(5)4％BSA(PBS配制)，37℃孵箱内孵育30min；(6)加入一抗anti-LAMP2抗体(abcam公司，货号ab13524，美国，大鼠抗小鼠抗体)，4℃摇床过夜；(7)用PBS清洗3次，每次5min；(8)加二抗anti-rat抗体，37℃孵箱内避光孵育1.5h；(9)用PBS清洗3次，每次5min；(10)加入一抗anti-IDS抗体(Cloud-Clone Corp公司，货号PAH833Hu01，美国，兔抗人抗体)，4℃摇床过夜；(11)用PBS清洗3次，每次5min；(12)加二抗anti-rabbit抗体，37℃孵箱内避光孵育1.5h；(13)加入DAPI，封片；(14)荧光显微镜下进行观察。
提取野生型小鼠、MPSII未经治疗的疾病模型小鼠以及MPSII疾病模型经腺相关病毒双重载体基因治疗系统治疗后的小鼠肝脏组织的蛋白，进行Western Blot实验。具体操作如下：(1)制备10％聚丙烯酰胺凝胶；(2)通过SDS-PAGE电泳将蛋白分离开；(3)将蛋白转至用甲醇激活过的0.45μm的PVDF膜上，设置电流300mA，时间1h；(4)TBS洗膜3次，每次5min；(5)5％脱脂奶粉(TBS配制)室温封闭1h；(6)TBST洗膜3次，每次5min；(7)加入一抗anti-IDS抗体(Cloud-Clone Corp公司，货号PAH833Hu01，美国，兔抗人抗体)，4℃孵育过夜；(8)TBST洗膜3次，每次5min；(9)加二抗anti-rabbit抗体，室温避光孵育1h；(10)TBST洗膜3次，每次5min；(11)扫膜，获取图像；(12)加入一抗anti-β-actin抗体(Proteintech公司，货号60008-1-Ig，美国，抗人/小鼠抗体)，4℃孵育过夜；(13)TBST洗膜3次，每次5min；(14)加二抗anti-mouse抗体，室温避光孵育1h；(15)TBST洗膜3次，每次5min；(16)扫膜，获取图像。
结果发现经腺相关病毒双重载体基因治疗系统治疗后的小鼠肝脏组织IDS的表达水平显著高于MPSII未经治疗的疾病模型小鼠(图6，图7)。
从以上数据可以看出，以CRISPR-Cas9为基因编辑工具的腺相关病毒双重载体基因治疗方案可显著提高MPSII小鼠血浆的IDS酶活性，显著提高疾病小鼠肝脏组织IDS的表达，因此，此治疗方案效果良好，具备可行性。本发明为MPSII的临床治疗提供了一种新的、有效的治疗手段。
序列表
<110> 哈尔滨医科大学
<120> 一种腺相关病毒双重载体基因治疗系统及其在治疗黏多糖贮积症Ⅱ型中的应用
<130> KLPI190558
<160> 3
<170> PatentIn 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 1
acacgccttt ggcacaatga a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 2
ctctttagct cggcttattc c 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 3
cttcattgtg ccaaaggcgt g 21

Claims (6)

1.一种以CRISPR-Cas9为基因编辑工具的腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)双重载体基因治疗系统，其特征在于，由第一载体和第二载体组成，其中，所述的第一载体为携带有靶向人源白蛋白基因(Albumin，Alb)切割位点的特异性小向导RNA(small guideRNA，sgRNA)以及人源艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase，IDS)基因的开放阅读框(ORF)序列的AAV载体，其中，所述的切割位点位于人源白蛋白基因翻译起始密码子atg的第2、3位碱基之间；
所述的第二载体为携带Cas9的AAV载体，用于在所述sgRNA靶向识别的切割位点进行特异性的切割。
2.如权利要求1所述的腺相关病毒双重载体基因治疗系统，其特征在于，所述的靶向人源白蛋白基因切割位点的特异性小向导RNA的序列如SEQ ID NO.1-3中的任一所示。
3.如权利要求1所述的腺相关病毒双重载体基因治疗系统，其特征在于，所述AAV载体包含血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或人工合成的AAV-DJ。
4.如权利要求3所述的腺相关病毒双重载体基因治疗系统，其特征在于，所述AAV载体为人工合成的AAV-DJ。
5.如权利要求1所述的腺相关病毒双重载体基因治疗系统，其特征在于，所述的携带Cas9的AAV载体为AAV-DJ.SaCas9。
6.权利要求1-5任一项所述的腺相关病毒双重载体基因治疗系统在制备治疗黏多糖贮积症Ⅱ型药物中的用途。
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