CN106191116A - 基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系统及其建立方法和应用 - Google Patents

基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系统及其建立方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系统及其建立方法和应用，系统包括同时具有报告/供体功能的载体及Cas9表达载体，所述报告/供体载体包括两条目标基因同源臂以及位于两条目标基因同源臂之间的外源序列片段；两条目标基因同源臂在目标基因上的同源序分别列位于目标基因靶序列的两侧并与目标基因靶序列相接；外源序列片段包括依次排列的启动子、抗性基因、剪切肽序列、报告基因以及polyA尾，抗性基因内部插入有两段该抗性基因的SSA修复同源序列，并且在两段SSA修复同源序列之间插入有目标基因靶序列。本发明构建了一套能够高效定点精确靶向整合外源基因到內源基因序列的敲入系统，而且能够进行较高效率的双染色体等位基因的双敲入。

Description

基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系统及其建立方法和 应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及由CRISPR/Cas9介导的外源基因敲入整合到內源等位基因，具体涉及应用基因工程技术向动物细胞内特定基因位点整合外源功能基因，得到稳定遗传的转基因细胞系。
背景技术
基因定点编辑是研究基因功能的重要手段，这种方法目前广泛的运用于动植物功能基因的研究，人类疾病的治疗和研究以及转基因动植物生产等领域。基因靶向修饰主要基于基因打靶和DNA修复机制，DNA修复机制有非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HDR)两种，在动物细胞中，NHEJ是占主要的修复方式，而精确的基因编辑主要是基于HDR的修复机制。由于基因打靶的的效率非常的低，只有10-6，其运用自然受到了制约，直到人工核酸酶的出现，自此，进行精确的基因操作成为可能，以此实现特定细胞组织的遗传操作。
目前，最新的一代核酸酶就是来源于产脓链球菌具有一类成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPRs)，与一些功能相关蛋白(CRISPR-associated，Cas)组成的CRISPR-CAS系统。其结构由三部分构成，5'端为tracrRNA基因，中间为一系列Cas蛋白编码基因，包括Cas9、Cas1、Cas2和Csn2，3'端为CRISPR基因座，由启动子区域和众多的间隔序列(spacers)和重复序列(direct repeats)顺序排列组成。因为CRISPR/Cas9系统对DNA分子具有靶向切割特性，所以可以被用于定向的基因修饰。CRISPR/Cas9由于其可操作、成本低、效用高而迅速的被用于人、小鼠、斑马鱼、苍蝇等细胞基因操作上，使得转基因动物的生产变得更方便可行，并取得了一定的研究进展。
尽管CRISPR/Cas9的介导使基因组修饰变得可操作，但是对于精确的基因组编辑，还是需要利用HDR的修复机制才能做到，而在动物细胞中不占主导地位的HDR机制效率更低。因此，由CRISPR/Cas9介导的HDR修复机制的基因组编辑技术的效率仍然是该项技术的一个重要的制约因子。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系统及其建立方法和应用。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系统，该敲入整合系统包括第一报告/供体载体，所述报告/供体载体包括两条目标基因同源臂以及位于两条目标基因同源臂之间的外源序列片段；两条目标基因同源臂在目标基因上的同源序列分别位于目标基因靶序列的两侧并与目标基因靶序列相接；外源序列片段包括依次排列的启动子、抗性基因、剪切肽序列、报告基因以及polyA尾，抗性基因内部具有两段该抗性基因的SSA修复同源序列，并且在两段SSA修复同源序列之间插入有目标基因靶序列。
所述启动子选自CMV、CAG或U6启动子；所述抗性基因选自puromycin或zeocin抗性基因；所述剪切肽序列选自T2A；所述报告基因选自荧光蛋白类报告基因eGFP或RFP；所述polyA尾选自polyA、SV40polyA或BGH polyA。
所述SSA修复同源序列的大小为150～200bp，同源序列太短则不利于发生SSA修复，200bp重复序列足够SSA修复的发生。
所述敲入整合系统还包括与所述第一报告/供体载体共转染宿主细胞的第二报告/供体载体。第一、第二报告/供体载体具有不同的抗性基因和报告基因，所述不同至少包括：对于抗性基因，针对不同的抗性筛选条件，对于报告基因，对应不同的检测信号。
所述宿主细胞为真核细胞。例如哺乳动物细胞。
所述敲入整合系统还包括Cas9表达载体。
上述基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系统的建立方法，该敲入整合系统的建立方法包括以下步骤：
1.1)以包括外源序列区段Ⅰ的载体a为骨架载体，所述外源序列区段Ⅰ内设置有顺次排列的启动子、抗性基因Ⅰ、剪切肽序列、报告基因Ⅰ以及polyA尾，其中抗性基因Ⅰ的内部具有两段该抗性基因的SSA修复同源序列，将目标基因靶序列插入外源序列区段Ⅰ，插入位置位于载体a的抗性基因Ⅰ内两段SSA修复同源序列之间，从而使抗性基因Ⅰ的阅读框保持打乱状态；
1.2)经过步骤1.1)后，以包括目标基因同源臂Ⅰ、多克隆酶切位点和目标基因同源臂Ⅱ三个顺次排列的元件的载体b为骨架载体，目标基因同源臂Ⅰ、Ⅱ在目标基因上的同源序列分别位于目标基因靶序列的两侧并与目标基因靶序列相接，利用多克隆酶切位点将载体a上的外源序列区段Ⅰ插入载体b上目标基因同源臂Ⅰ、Ⅱ之间，从而构建得到第一报告/供体载体。
所述敲入整合系统的建立方法还包括以下步骤：
2.1)在载体a的基础上构建载体c，载体c包括外源序列区段Ⅱ，所述外源序列区段Ⅱ内设置有顺次排列的启动子、抗性基因Ⅱ、剪切肽序列、报告基因Ⅰ以及polyA尾，其中抗性基因Ⅱ与所述抗性基因Ⅰ对应不同的抗性筛选条件，且抗性基因Ⅱ的内部具有两段该抗性基因的SSA修复同源序列；
2.2)将目标基因靶序列插入外源序列区段Ⅱ，插入位置位于载体c的抗性基因Ⅱ内两段SSA修复同源序列之间，从而使抗性基因Ⅱ的阅读框保持打乱状态；并将载体c的外源序列区段Ⅱ中的报告基因Ⅰ替换为报告基因Ⅱ，报告基因Ⅰ和报告基因Ⅱ对应不同的检测信号；然后将载体c上的外源序列区段Ⅱ插入载体b上目标基因同源臂Ⅰ、Ⅱ之间，从而构建得到第二报告/供体载体。
所述步骤2.1)具体包括以下步骤：
2.1.1)克隆抗性基因Ⅱ，克隆过程中在抗性基因Ⅱ内部增加两段该抗性基因的SSA修复同源序列；
2.1.2)经过步骤2.1.1)后，用具有SSA修复同源序列的抗性基因Ⅱ替换所述载体a中的抗性基因Ⅰ，得到载体c。
上述基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系统在双染色体等位基因的双敲入中的应用。
上述基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系统在制备纯系转基因细胞系或转基因动物中的应用。
本发明的有益效果体现在：
本发明运用基因工程技术，构建了一套能够高效定点精确靶向整合外源基因到內源基因序列的敲入系统，而且能够进行较高效率的双染色体等位基因的双敲入，能使整合进基因组的外源基因稳定遗传表达，得到双敲入的转基因细胞系。本方法能够用于研究基因功能和纯系转基因细胞系及转基因动物的生产。
附图说明
图1为pB-CMV-DsRed-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP载体的质粒图谱。
图2为pB-CMV-DsRed-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP双酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图。
图3为pXL-L/R.CCR5 arm-MCS载体的质粒图谱。
图4为pXL-L/R.CCR5 arm-MCS载体双酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图。
图5为pXL-L/R.CCR5 arm-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP载体的质粒图谱。
图6为pXL-L/R.CCR5 arm-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP载体双酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图。
图7为pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-MCS)-T2A-eGFP双酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图。
图8为pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP质粒图谱。
图9为pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图。
图10为pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP载体质粒图谱。
图11为pB-CMV-DsRed-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP双酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图。
图12为pXL-L/R.CCR5 arm-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP载体的质粒图谱。
图13为pXL-L/R.CCR5 arm-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图。
图14为HEK293T细胞转染后24小时细胞图。
图15为流式细胞检测图。
图16为puromycin和zeocin筛选后得到的单克隆细胞图。
图17为5'端连接处PCR检测琼脂糖凝胶电泳图。
图18为3'端连接处Rep/Don ZR系统整合PCR检测电泳图。
图19为3'端连接处Rep/Don PG系统整合PCR检测凝胶电泳图。
图20为pXL-BacII-MCS载体的质粒图谱。
具体实施方式
为使本发明的技术方案便于理解，下面结合靶向CCR5基因(Genbank登录号NC_000003.12)的具体实施例对本发明通过基于CRISPR/Cas9的双敲系统整合敲入外源基因的方法作进一步说明。
表I.构建双敲系统所需引物
表I中，引物名称后括号内标注的限制性内切酶对应酶切位点在序列中以斜体表示。CCR5a annealing f以及CCR5a annealing r中包含的CCR5靶序列以下划线标出。
(一)报告及供体系统载体pXL-L/R.CCR5 arm-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP(Rep/Don PG)和pXL-L/R.CCR5 arm-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP(Rep/Don ZR)的构建。
(1)将引物CCR5a annealing f和CCR5a annealing r拟合，得到CCR5片段，拟合得到的CCR5片段为含有目标基因CCR5靶序列(CCR5a)的片段(该片段还具有悬臂)。把载体pB-CMV-DsRed-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-MCS)-T2A-eGFP(简称RPG，构建方法参考Ren C,Xu K,Liu Z,Shen J,Han F,Chen Z,et al.Dual-reporter surrogate systems forefficient enrichment of genetically modified cells.Cell Mol Life Sci.2015；72(14):2763-72.doi:10.1007/s00018-015-1874-6.PubMed PMID:25725802)用BamHI和NotI双酶切后与上述CCR5片段连接，酶切体系如表1，连接体系如表2，16℃连接过夜，构建载体pB-CMV-DsRed-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP(简称RPG-CCR5)，PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)是指目标基因CCR5的靶序列插入到具有两段200bp SSA修复同源序列的puromycin抗性基因中，具体插入位置为两段200bp SSA修复同源序列之间，puromycin抗性基因的阅读框被200bp SSA修复同源序列和CCR5的靶序列打乱。然后将RPG-CCR5转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂LB/Amp平板，挑取单克隆并在LB/Amp液体培养基中37℃培养12h。
表1.RPG双酶切反应体系
表2.RPG和CCR5片段连接体系
所构建的pB-CMV-DsRed-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP载体的质粒图谱如图1所示，提取质粒pB-CMV-DsRed-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP，并经EcoRV和EcoRI酶切鉴定，结果如图2所示，其中泳道M为DNA Marker；泳道1为pB-CMV-DsRed-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP经EcoRV和EcoRI酶切的产物(3637bp+5666bp)。送阳性质粒到南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序分析，保存测序正确的质粒备用。
(2)把引物MCS-F和MCS-R拟合，得到片段MCS。将片段MCS与经NotI/SalI双酶切的pXL-BacII(Addgene)载体连接，得到pXL-BacII-MCS(图20)。酶切体系见表3，连接体系见表4，16℃连接过夜，再转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂LB/Amp平板，挑取单克隆并在LB/Amp液体培养基中37℃培养12h。
表3.pXL-BacII双酶切反应体系
表4.pXL-BacII和MCS连接体系
用引物CCR5a-l-arm-f和CCR5a-l-arm-r在人的基因组上扩增CCR5基因的左臂(CCR5 L arm)，即5′臂，再用引物CCR5a-r-arm-f和CCR5a-r-arm-r在人基因组上扩增CCR5基因的右臂(CCR5R arm)，即3′臂，左右两臂在人基因组上的同源序列位于目标基因CCR5靶序列的两侧并与靶序列相接，将左、右两同源臂(CCR5L arm、CCR5R arm)分别利用SpeI/BamHI双酶切以及PacI/HindIII双酶切克隆到pXL-BacII-MCS，得到载体pXL-L/R.CCR5arm-MCS(质粒图谱如图3)。该载体包含了CCR5基因的左右同源臂及两个同源臂之间的多克隆酶切位点。提取质粒，并经BamHI和PacI酶切鉴定，结果如图4所示，其中泳道M为DNAMarker，泳道1～3为pXL-L/R.CCR5 arm-MCS经BamHI和PacI酶切的产物(4712bp+774bp)。送阳性质粒到南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序分析，保存测序正确的质粒备用。
(3)将上述方法所得载体pXL-L/R.CCR5 arm-MCS和pB-CMV-DsRed-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP用SpeI/PacI双酶切，把酶切得到的CAG-PuroR(200bprepeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP-polyA片段(3602bp)插入到酶切后的pXL-L/R.CCR5 arm-MCS中，得到目的载体pXL-L/R.CCR5 arm-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP(Rep/Don PG)。酶切体系和连接体系分别见表5和表6。再转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂LB/Amp平板，挑取单克隆并在LB/Amp液体培养基中37℃培养12h。所构建的pXL-L/R.CCR5arm-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP载体的质粒图谱如图5所示，此载体包括位于左右两侧的CCR5基因同源臂(CCR5L arm、CCR5R arm)，以及位于同源臂之间从5′到3′方向依次排列的启动子CAG、PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)、剪切肽T2A、增强的绿色荧光蛋白eGFP以及polyA。提取质粒，并经EcoRI和XhoI酶切鉴定，结果如图6所示，其中泳道M为DNA Marker；泳道1～2为pXL-L/R.CCR5 arm-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP经EcoRI和XhoI酶切的产物(136bp+850bp+1382bp+2351bp+4355bp)。
表5.pXL-L/R.CCR5 arm-MCS和RPG-CCR5双酶切反应体系
表6.pXL-L/R.CCR5 arm-MCS和RPG-CCR5片段连接体系
(4)以pSLIK-Zeo(Addgene，Plasmid#25736)为模板，分别用引物对Zeo-F1/Zeo-R1和引物对Zeo-F2/Zeo-R2PCR扩增得到片段Zeo-1和Zeo-2，扩增体系见表7。再用BamHⅠ酶切两个片段，酶切体系见表8，将Zeo-1和Zeo-2酶切后的片段用T4连接酶连接2h，连接体系见表9。取1μL Zeo-1和Zeo-2连接后的产物做模板，用引物对Zeo-F1/Zeo-R2进行PCR扩增得到Zeo-SSA，Zeo-SSA是指序列中具有两段相互间隔的200bp SSA修复同源序列的zeocin抗性基因，200bp SSA修复同源序列将zeocin抗性基因的阅读框打乱。扩增体系见表10。用EcoRI/XhoⅠ双酶切片段Zeo-SSA和RPG，酶切体系见表11。将酶切后的Zeo-SSA片段(617bp)连进酶切后的RPG骨架(替换PuroR(200bp repeat.SSA-MCS))得到pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-MCS)-T2A-eGFP(RZG)，连接体系见表12。再转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂LB/Amp平板，挑取单克隆并在LB/Amp液体培养基中37℃培养12h。提取质粒，并经EcoRI/XhoⅠ酶切鉴定，结果如图7所示，其中泳道M为DNA Marker；泳道1为pB-CMV-DsRed-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-MCS)-T2A-eGFP经EcoRI/XhoⅠ酶切的产物，泳道2～5为pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-MCS)-T2A-eGFP经EcoRI/XhoⅠ酶切的产物(605bp+8438bp)。送阳性质粒到南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序分析，保存测序正确的质粒备用。
表7.Zeo片段PCR扩增体系
表8.Zeo-1和Zeo-2酶切体系
表9.Zeo-1和Zeo-2连接体系
表10.Zeo-SSA PCR扩增体系
表11.Zeo-SSA和RPG双酶切体系
表12.RPG和Zeo-SSA片段连接体系
(5)将引物CCR5a annealing f和CCR5a annealing r拟合，得到CCR5片段。把载体pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-MCS)-T2A-eGFP(RZG)用BamHI和NotI双酶切后与上述CCR5片段连接，酶切体系如表13，连接体系如表14，16℃连接过夜，构建质粒pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP(RZG-CCR5)。ZeoR(200bprepeat.SSA-CCR5)是指被包含CCR5基因靶序列的200bp SSA修复同源序列打乱阅读框的zeocin抗性基因，即将目标基因CCR5的靶序列插入到具有两段200bp SSA修复同源序列的zeocin抗性基因中，具体插入位置为两段200bp SSA修复同源序列之间。然后将RZG-CCR5转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂LB/Amp平板，挑取单克隆并在LB/Amp液体培养基中37℃培养12h。
表13.RZG双酶切反应体系
表14.RZG和CCR5片段连接体系
pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP(RZG-CCR5)图谱见图8。提取质粒pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP，并经EcoRV和EcoRI酶切鉴定，结果如图9所示，其中泳道M为DNA Marker；泳道1、2为pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP经EcoRV和EcoRI酶切的产物(3637bp+5423bp)。
(6)以pcDNA3-mRFP(Addgene，Plasmid#13032)为模板，用mRFP-F1和mRFP-R扩增得到mRFP1的片段，扩增体系见表15。再以得到的mRFP1为模板，用引物mRFP-F2和mRFP-R扩增得到T2A-mRFP-BGH-PA-terminator polyA片段，扩增体系见表16。用XhoI/PacI分别酶切载体pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP(RZG-CCR5)和上述得到的T2A-mRFP-BGH-PA-terminator polyA片段(酶切体系见表17)，将酶切后的T2A-mRFP-BGH-PA-terminator polyA(1041bp)连接到酶切后的pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bprepeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP骨架片段(8017bp)，16℃过夜连接，连接体系见表18，得到pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP(RZR-CCR5)。
表15.mRFP1 PCR扩增体系
表16.T2A-mRFP-BGH-PA-terminator polyA PCR扩增体系
表17.T2A-mRFP-BGH-PA-terminator polyA和RZG-CCR5双酶切体系
表18.RZG-CCR5和T2A-mRFP-BGH-PA-terminator polyA连接体系
所构建的pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP(RZR-CCR5)载体的质粒图谱如图10所示，提取质粒pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP，并经AgeI和PacI酶切鉴定，结果如图11所示，其中泳道M为DNA Marker；泳道1、3、4为pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP经AgeI和PacI酶切的产物(9048bp，载体构建好之后AgeI就被消掉了，所以酶切鉴定的时候，只能切出来一条带)。泳道2、5为pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP经AgeI和PacI酶切的产物。
(7)用SpeI/PacI分别双酶切载体pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP(RZR-CCR5)和pXL-L/R.CCR5 arm-MCS，将前者酶切的大约3.3Kb的片段(CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP-BGH polyA)胶回收后连接到酶切后的pXL-L/R.CCR5 arm-MCS中得到pXL-L/R.CCR5 arm-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP(Rep/Don ZR)。此步骤酶切体系和连接体系见表19和表20。
所构建的pXL-L/R.CCR5 arm-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP(Rep/Don ZR)载体的质粒图谱如图12所示，此载体包含了CCR5基因的左右同源臂、以及位于左右同源臂之间的按照从5′到3′方向依次排列的启动子CAG、ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)、T2A、红色荧光蛋白RFP以及BGH polyA。提取质粒pXL-L/R.CCR5arm-CAG-ZeoR(200bprepeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP，并经SpeI和PacI酶切鉴定，结果如图13所示，其中泳道M为DNAMarker；泳道1～2为pXL-L/R.CCR5 arm-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP经SpeI和PacI酶切的产物(3362bp+5472bp)。
表19.RZR-CCR5和pXL-L/R.CCR5 arm-MCS酶切体系
表20.RZR-CCR5片段和pXL-L/R.CCR5 arm-MCS连接体系
上述构建过程中，所有限制性内切酶及连接酶均采用New England Biolabs(NEB)公司产品。所用Taq酶、pfu酶、DNA Marker及dNTPs均采用北京全式金生物技术有限公司产品。CCR5片段以及MCS片段拟合(annealing)反应条件为：94℃5min；72℃5min；降1℃/秒；4℃保存。Zeo片段PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。Zeo-SSA PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。mRFP1PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。T2A-mRFP-BGH-PA-terminator polyA PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
(二)在HEK293T中验证CRISPR/Cas9活性及报告和供体系统工作性能
HEK293T细胞置于含DMEM，10％胎牛血清，100μg/mL青链霉素的培养基中，37℃，5％的CO2培养箱培养。以24孔板为例，将HEK293T细胞接种至24孔板中，当细胞密度达到60％时，用sofast转染试剂(厦门太阳马生物有限公司)将CRISPR/Cas9表达载体pX330-U6-CCR5a-CBh-hSpCas9(构建方法参考Ren C,Xu K,Liu Z,Shen J,Han F,Chen Z,etal.Dual-reporter surrogate systems for efficient enrichment of geneticallymodified cells.Cell Mol Life Sci.2015；72(14):2763-72.doi:10.1007/s00018-015-1874-6.PubMed PMID:25725802)、报告和供体系统pXL-L/R.CCR5 arm-CAG-ZeoR(200bprepeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP(Rep/Don ZR)和pXL-L/R.CCR5 arm-CAG-PuroR(200bprepeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP(Rep/Don PG)共转染到HEK293T细胞中。按照Cas9表达载体:Rep/Don ZR:Rep/Don PG三者之间摩尔比为(1～1.5):(1～1.5):(1～1.5)(例如，1.2:1:1)的比例进行转染。转染体系见表21。按说明书进行转染，将0.6μg DNA质粒稀释于30μL OptiMEM(Invitrogen)中，轻轻混匀，得DNA稀释液。1.5μL Sofast稀释于30μL Opti MEM中，轻轻混匀，得Sofast稀释液。然后将30μL Sofast稀释液滴加到30μL DNA稀释液中，一边滴加一边混匀。充分混匀后，将混合物置于室温孵育20min，然后将60μL Sofast/DNA复合物加到一个24孔中并轻轻摇动使均匀混合。放置37℃，5％CO2培养箱，8小时后换新鲜DMEM培养基。24小时后在倒置荧光显微镜下观察荧光，验证CRISPR/Cas9活性，见图14。一共分为四组进行验证试验，组一是空白对照组(Control)，组二是单敲系统的Rep/Don PG组，组三是单敲系统的Rep/Don ZR组，组四是双敲系统的Rep/Don ZR和Rep/Don PG共转染组(HRPI)。组二的绿色荧光代表Rep/Don PG系统工作效率，组三红色荧光代表Rep/Don ZR系统工作效率，组四既有绿色荧光又有红色荧光，各组试验结果说明Rep/Don PG和Rep/Don ZR系统工作正常，且效率较高。48小时后收集细胞，用移液器把一个孔中的DMEM吸出，弃掉，再用PBS洗两遍，再加入0.25％的胰蛋白酶-EDTA消化细胞，当细胞形状变成圆形并不贴壁时，加入DMEM终止消化。将消化下来的细胞一半接种到100mm培养皿中继续培养用于挑选单克隆，另一半用于流式细胞检测。把用于流式检测的细胞1000r/min离心三分钟，将上清液移除，用1mLPBS重悬备测。流式细胞检测测定双敲系统的工作情况见图15。流式检测结果显示，Cas9活性非常好，双敲系统中的每个载体工作正常，效率较好。图15中Control代表的是对照组；Rep/Don PG系统经流式检测，有50.1％出现在代表绿光的象限，说明在本系统工作下，有50.1％的细胞是阳性细胞；流式数据分析显示Rep/Don ZR系统组，有37.6％带有红光的阳性细胞出现在了红光象限里面。
表21.CRISPR/Cas9表达载体、Rep/Don ZR和Rep/Don PG共转染体系
(三)生产CCR5基因位点的双等位基因敲入细胞系及双敲系统工作效率验证
(1)HEK293细胞转染、药物筛选
将上述部分(二)中分出来在100mm培养皿中的细胞继续培养，当细胞贴壁后，加入3μg/mL的puromycin和/或600mg/mL的zeocin进行药物筛选(与具有的抗性基因对应)。每两天更换一次新鲜的DMEM培养基(培养基中含puromycin和/或zeocin)。每次换液前在显微镜下观察，当单克隆形成，及时的挑取单克隆到24孔板的一个孔中，加入含puromycin和/或zeocin的DMEM培养基500μL继续培养，单克隆细胞见图16，从图中可以看出，Rep/Don PG组的单克隆细胞是发绿光的，Rep/Don ZR系统敲入得到的细胞克隆是发红光的，而Rep/DonPG和Rep/Don ZR双系统经筛选后得到的克隆细胞既发红光又发绿光。当24孔板里每一孔细胞长到约90％密度时，消化细胞，将一半的细胞转移接种到12孔板中继续培养，当密度达到70％时冻存；另一半细胞用于提取基因组DNA备用。(2)引物设计与合成
根据预计整合的CCR5基因序列，按照一条引物在CCR5基因同源臂外侧，另一条引物在外源序列上的原则用Primerprimer6设计引物。一对引物在5’端，两对引物在3’端，其中一对用于检测Rep/Don PG整合，另一对用于检测Rep/Don ZR插入。
(3)PCR扩增检测双敲系统的工作效率
将上述单克隆细胞提取的基因组DNA进行PCR扩增检测双敲系统的工作效率。设计了三对引物(F1和R1；F2和R2；F3和R3)用于确认外源基因是否为定点整合。确定为定点插入后，结合三对引物扩增的条带再确定是否是双敲的细胞。以上述单克隆细胞提取的基因组为模板，分别用设计的引物对进行扩增，PCR反应体系为如表22所述。5'连接端反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。3'连接端Rep/Don PG整合PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min 10s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。3'连接端Rep/Don ZR插入PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测片段大小正确结果，如图17、18、19所示。图17中，泳道M为Trans2K Plus DNA Marker，泳道1、2、4中箭头所指的为目的片段的PCR扩增产物，泳道3为对照组。图18中，泳道M为Trans2K Plus DNA Marker，泳道1、2为对照组，泳道3～7为目的片段的PCR扩增产物。图19中，泳道M为Trans2K Plus DNA Marker，泳道3、7为对照组，泳道1、2、4～6为目的片段的PCR扩增产物。
综合3对检测引物扩增的情况来看，在44个单克隆细胞中，双敲的单克隆细胞有15个，本系统的工作效率为34.09％。亦即，通过本发明的双敲系统，能够获得34.09％的可稳定遗传的双等位基因敲入整合转基因细胞。
表22.5'3'连接端PCR扩增检测反应体系
以上实施例中，以人CCR5基因为例，对CCR5基因进行靶向整合。给出了敲入整合系统的构建和转基因细胞系生产两部分。
双敲系统(HRPI)包括两个独立的载体(Rep/Don PG和Rep/Don ZR)。其中每个载体既可以作为报告载体又可以作为供体载体为下述(Ⅰ)Rep/Don PG或(Ⅱ)Rep/Don ZR：
(Ⅰ)外源puromucin和GFP基因
pXL-L/R.CCR5 arm-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP(Rep/DonPG)，包含了真核细胞启动子CAG、功能基因PuroR、GFP和polyA信号片段。
(Ⅱ)外源zeocin和RFP基因
pXL-L/R.CCR5 arm-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP(Rep/Don ZR)包含了启动子CAG、功能基因ZeoR、RFP和BGH polyA信号片段。
将这两个载体与CRISPR/Cas9表达载体共转染到人293T细胞中，在转染48小时后，更换含有puromycin和的zeocin的DMEM培养基进行抗生素药物筛选。鉴于载体系统和细胞基因组上均有能被CAS9识别的靶序列，当CAS9蛋白表达后，会先靶向载体上的靶序列，导致插入并打断puromycin或zeocin抗性基因中间的靶序列双链断裂，由于靶序列两边有200bp的SSA重复序列，当SSA修复进行后，puromycin或zeocin抗性基因密码子恢复正常编码，抗性基因发挥作用。又因为载体系统含有同源臂序列，5’3’同源臂之间的外源基因在细胞基因组出现断裂后，通过同源重组的方式将外源基因整合到细胞基因组中，被整合的细胞就能抵抗puromycin和zeocin抗生素而存活下来，经过15天筛选后能得到双等位基因敲入的293T细胞系。
如果更换敲入的目标基因，则只需对目标基因的同源臂及目标基因靶序列进行更换，其它部分保持不变。
本发明证实了基于CRISPR/Cas9的双敲系统能够快速有效的得到双敲的细胞系，在此过程中此套系统不仅有报告载体的作用也同时具备作为供体载体发挥将外源基因整合进细胞內源基因的功能。本发明具有应用基因工程载体系统作为外源DNA供体载体，靶向整合进入细胞內源基因组并且形成稳定可遗传的细胞系的功能，可以将本实验所用的CCR5基因靶序列及其同源臂序列更换成其它功能基因或非编码RNA及其同源臂，能够用于有效的建立各种特定研究需求的细胞系。

Claims (10)

1.基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系统，其特征在于：该敲入整合系统包括第一报告/供体载体，所述报告/供体载体包括两条目标基因同源臂以及位于两条目标基因同源臂之间的外源序列片段；两条目标基因同源臂在目标基因上的同源序列分别位于目标基因靶序列的两侧并与目标基因靶序列相接；外源序列片段包括依次排列的启动子、抗性基因、剪切肽序列、报告基因以及polyA尾，抗性基因内部具有两段该抗性基因的SSA修复同源序列，并且在两段SSA修复同源序列之间插入有目标基因靶序列。
2.根据权利要求1所述基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系统，其特征在于：所述启动子选自CMV、CAG或U6启动子；所述抗性基因选自puromycin或zeocin抗性基因；所述剪切肽序列选自T2A；所述报告基因选自荧光蛋白类报告基因eGFP或RFP；所述polyA尾选自polyA、SV40polyA或BGH polyA。
3.根据权利要求1所述基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系统，其特征在于：所述SSA修复同源序列的大小为150～200bp。
4.根据权利要求1所述基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系统，其特征在于：所述敲入整合系统还包括与所述第一报告/供体载体共转染宿主细胞的第二报告/供体载体。
5.根据权利要求4所述基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系统，其特征在于：所述宿主细胞为真核细胞。
6.基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系统的建立方法，其特征在于：该敲入整合系统的建立方法包括以下步骤：
1.1)以包括外源序列区段Ⅰ的载体a为骨架载体，所述外源序列区段Ⅰ内设置有顺次排列的启动子、抗性基因Ⅰ、剪切肽序列、报告基因Ⅰ以及polyA尾，其中抗性基因Ⅰ的内部具有两段该抗性基因的SSA修复同源序列，将目标基因靶序列插入外源序列区段Ⅰ，插入位置位于载体a的抗性基因Ⅰ内两段SSA修复同源序列之间，从而使抗性基因Ⅰ的阅读框保持打乱状态；
1.2)经过步骤1.1)后，以包括目标基因同源臂Ⅰ、多克隆酶切位点和目标基因同源臂Ⅱ三个顺次排列的元件的载体b为骨架载体，目标基因同源臂Ⅰ、Ⅱ在目标基因上的同源序列分别位于目标基因靶序列的两侧并与目标基因靶序列相接，利用多克隆酶切位点将载体a上的外源序列区段Ⅰ插入载体b上目标基因同源臂Ⅰ、Ⅱ之间，从而构建得到第一报告/供体载体。
7.根据权利要求6所述基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系统的建立方法，其特征在于：所述敲入整合系统的建立方法还包括以下步骤：
2.1)在载体a的基础上构建载体c，载体c包括外源序列区段Ⅱ，所述外源序列区段Ⅱ内设置有顺次排列的启动子、抗性基因Ⅱ、剪切肽序列、报告基因Ⅰ以及polyA尾，其中抗性基因Ⅱ与所述抗性基因Ⅰ对应不同的抗性筛选条件，且抗性基因Ⅱ的内部具有两段该抗性基因的SSA修复同源序列；
2.2)将目标基因靶序列插入外源序列区段Ⅱ，插入位置位于载体c的抗性基因Ⅱ内两段SSA修复同源序列之间，从而使抗性基因Ⅱ的阅读框保持打乱状态；并将载体c的外源序列区段Ⅱ中的报告基因Ⅰ替换为报告基因Ⅱ，报告基因Ⅰ和报告基因Ⅱ对应不同的检测信号；然后将载体c上的外源序列区段Ⅱ插入载体b上目标基因同源臂Ⅰ、Ⅱ之间，从而构建得到第二报告/供体载体。
8.根据权利要求7所述基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系统的建立方法，其特征在于：所述步骤2.1)具体包括以下步骤：
2.1.1)克隆抗性基因Ⅱ，克隆过程中在抗性基因Ⅱ内部增加两段该抗性基因的SSA修复同源序列；
2.1.2)经过步骤2.1.1)后，用具有SSA修复同源序列的抗性基因Ⅱ替换所述载体a中的抗性基因Ⅰ，得到载体c。
9.如权利要求4所述基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系统在双染色体等位基因的双敲入中的应用。
10.如权利要求1或4所述基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系统在制备纯系转基因细胞系或转基因动物中的应用。
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