CN111850051A - 双供体介导的基于药物/荧光协同筛选的双等位基因编辑系统 - Google Patents

双供体介导的基于药物/荧光协同筛选的双等位基因编辑系统 Download PDF

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Abstract

本发明公开了双供体介导的基于药物/荧光协同筛选的双等位基因编辑系统，系统包括两个供体载体，供体载体序列包含左右两段目的基因同源序列和点突变位点及位于左右两段目的基因同源序列之间的外源序列，外源序列分为带有胸腺激酶筛选基因、绿色荧光蛋白、嘌呤霉素抗性基因的若干个表达盒和带有胸腺激酶筛选基因、红色荧光蛋白、博来霉素抗性基因的若干个表达盒。本发明构建的基因编辑系统可以用于对基因组进行精确、高效的双等位编辑。

Description

双供体介导的基于药物/荧光协同筛选的双等位基因编辑 系统
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及基于双链断裂修复机制的基因编辑系统，具体涉及在基因组发生同源重组修复时，向两个双等位基因位点引入突变和外源筛选基因，得到稳定遗传的转基因细胞系。
背景技术
基因组编辑技术依赖人工特异性核酸酶在基因组上制造双链断裂及由此引发的DNA修复途径实现基因编辑。成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白(ClusteredRegularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated genes，CRISPR/Cas)系统与前两代依赖于蛋白模块与核苷酸配对识别的人工序列特异性核酸酶(ZFN和TALEN)系统相比，CRISPR/Cas系统依赖于核苷酸之间配对识别，在基因编辑中具有明显优势。其中来自Ⅱ型系统的Cas9蛋白与Ⅰ型和Ⅲ型系统的多蛋白复合物相比结构简单，只需要表达一个DNA切割蛋白和tracrRNA与crRNA连接而成的导向RNA(Single-guide RNA,sgRNA)序列，即可引发基因组特定位点的双链断裂，启动随后的修复途径。现阶段两种主要的DNA修复途径导致的编辑结果分为：通过非同源末端链接(Nonhomologous end-joining,NHEJ)修复途径产生碱基的随机插入或缺失造成基因敲除，以及通过带有断口两端同源序列的供体DNA参与的同源介导的修复(Homology-directed repair,HDR)途径实现人为可控的特定碱基序列的插入、删除或替换。
双等位纯合基因的细胞系和模式动物具有遗传背景的一致性，因此细胞中靶基因表达量稳定，动物后代也不会发生性状分离，能有效固定优良性状，避免重复的基因型鉴定。另外，双等位敲除能够保证基因的完全沉默，从而更利于研究基因功能。但目前主要使用一种供体编辑两条姐妹染色体的靶基因，导致在利用细胞自身的双链断裂修复机制修复之后，可能会得到三种不同修复结果的基因编辑细胞：1)两条姐妹染色体都经过NHEJ途径修复的细胞；2)一条姐妹染色体经过NHEJ修复、另一条姐妹染色体经过HDR修复的单等位编辑细胞；3)两条姐妹染色体都经过HDR途径修复的双等位编辑细胞。
现有的供体策略获得双等位纯合子的效率较低(例如，中国专利CN 106191116 A，基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系统及其建立方法和应用，张智英等)，亟待开发更高效的双等位基因编辑系统。
发明内容
本发明的目的在于提供一种双供体介导的基于药物/荧光协同筛选的双等位基因编辑系统。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种双等位基因编辑系统，该双等位基因编辑系统包括打靶基因组的载体(例如，Cas9和sgRNA表达载体，简称Cas9-sgRNA表达载体)以及第一供体载体和第二供体载体；
所述第一供体载体包括两段目标编辑基因同源序列及位于该两段同源序列之间的第一外源序列，第一外源序列包括正向筛选基因表达盒和负向筛选基因表达盒(例如，胸腺激酶基因表达盒)，正向筛选基因表达盒包括第一药物抗性基因(例如，嘌呤霉素抗性基因)序列以及第一荧光报告基因(例如，绿色荧光蛋白基因)序列；或者，第一外源序列包括串联筛选基因表达盒，串联筛选基因表达盒包括第一药物抗性基因(例如，嘌呤霉素抗性基因)序列以及负向筛选基因(例如，胸腺激酶基因)序列；
或者，所述第一供体载体包括两段目标编辑基因同源序列及位于该两段同源序列之间的第一外源序列，第一外源序列包括正向筛选基因表达盒，正向筛选基因表达盒包括第一药物抗性基因(例如，嘌呤霉素抗性基因)序列以及第一荧光报告基因(例如，绿色荧光蛋白基因)序列；或者，第一外源序列包括串联筛选基因表达盒，串联筛选基因表达盒包括第一药物抗性基因(例如，嘌呤霉素抗性基因)序列；
所述第二供体载体包括上述两段目标编辑基因同源序列及位于该两段同源序列之间的第二外源序列，第二外源序列包括正向筛选基因表达盒和负向筛选基因表达盒(例如，胸腺激酶基因表达盒)，正向筛选基因表达盒包括第二药物抗性基因(例如，博来霉素抗性基因)序列以及第二荧光报告基因(例如，红色荧光蛋白基因)序列；或者，第二外源序列包括串联筛选基因表达盒，串联筛选基因表达盒包括第二药物抗性基因(例如，博来霉素抗性基因)序列以及负向筛选基因(例如，胸腺激酶基因)序列；
或者，所述第二供体载体包括上述两段目标编辑基因同源序列及位于该两段同源序列之间的第二外源序列，第二外源序列包括正向筛选基因表达盒，正向筛选基因表达盒包括第二药物抗性基因(例如，博来霉素抗性基因)序列以及第二荧光报告基因(例如，红色荧光蛋白基因)序列；或者，第二外源序列包括串联筛选基因表达盒，串联筛选基因表达盒包括第二药物抗性基因(例如，博来霉素抗性基因)序列；
所述两段同源序列包括用于介导单链退火(SSA)的重叠序列，重叠序列包括用于作为基于sgRNA引导的目标编辑基因切割的靶位点。
优选的，所述第一供体载体中，串联筛选基因表达盒还包括第一荧光报告基因(例如，绿色荧光蛋白基因)序列；第二供体载体中，串联筛选基因表达盒还包括第二荧光报告基因(例如，红色荧光蛋白基因)序列。
优选的，所述两段同源序列带有一个以上的突变位点(例如，点突变)。
优选的，所述第一供体载体和第二供体载体中，采用CAG、PGK等作为相应基因表达盒的启动子序列，并采用SV40 polyA、BGH polyA等polyA尾作为相应基因表达盒的终止序列。
优选的，所述第一供体载体和第二供体载体中，负向筛选基因序列由一组启动子和终止序列启动和完成转录，用于正向筛选的药物抗性基因序列和荧光报告基因序列由剪切肽序列(例如，T2A)连接，并由另一组不同的启动子和终止序列启动和完成转录。例如，TPG/TZR(TK-PuroR-eGFP/TK-ZeoR-mRFP)双等位基因编辑系统。其中，TPG内设置的TK-PuroR-eGFP筛选序列作为第一外源序列，包括顺次排列的负向筛选基因表达盒：CAG启动子序列(pCAG)、胸腺激酶基因序列(TK)和SV40T polyA，以及正向筛选基因表达盒：PGK启动子序列(pPGK)、嘌呤霉素抗性基因序列(PuroR)、T2A剪切肽序列、绿色荧光蛋白基因序列(eGFP)和BGH polyA；TZR内设置的TK-ZeoR-mRFP筛选序列作为第二外源序列，包括顺次排列的负向筛选基因表达盒：CAG启动子序列(pCAG)、胸腺激酶基因序列(TK)和SV40T polyA，以及正向筛选基因表达盒：PGK启动子序列(pPGK)、博来霉素抗性基因序列(ZeoR)、T2A剪切肽序列、红色荧光蛋白基因序列(mRFP)和BGH polyA。
优选的，所述第一供体载体和第二供体载体中，用于正向筛选的药物抗性基因序列及荧光报告基因序列与负向筛选基因序列由剪切肽序列(例如，T2A、P2A)连接，并由同一组启动子和终止序列启动和完成转录。例如，PGT/ZRT(PuroR-eGFP-TK/ZeoR-mRFP-TK)双等位基因编辑系统。其中，PGT内设置的PuroR-eGFP-TK筛选序列作为第一外源序列，包括顺次排列的串联筛选基因表达盒元件：PGK启动子序列(pPGK)、嘌呤霉素抗性基因序列(PuroR)、T2A剪切肽序列、绿色荧光蛋白基因序列(eGFP)、P2A剪切肽序列、胸腺激酶基因序列(TK)和SV40T polyA；ZRT内设置的ZeoR-mRFP-TK筛选序列作为第二外源序列，包括顺次排的串联筛选基因表达盒元件：PGK启动子序列(pPGK)、博来霉素抗性基因序列(ZeoR)、T2A剪切肽序列、红色荧光蛋白基因序列(mRFP)、P2A剪切肽序列、胸腺激酶基因序列(TK)和SV40TpolyA。
优选的，所述第一供体载体和第二供体载体中，用于正向筛选的药物抗性基因序列与负向筛选基因序列由剪切肽序列(例如，T2A)连接，并由同一组启动子和终止序列启动和完成转录。例如，PT/ZT(PuroR-TK/ZeoR-TK)双等位基因编辑系统。其中，PT内设置的PuroR-TK筛选序列作为第一外源序列，包括顺次排列的串联筛选基因表达盒元件：PGK启动子序列(pPGK)、嘌呤霉素抗性基因序列(PuroR)、T2A剪切肽序列、胸腺激酶基因序列(TK)和BGH polyA；ZT内设置的ZeoR-TK筛选序列作为第二外源序列，包括顺次排列的串联筛选基因表达盒元件：PGK启动子序列(pPGK)、博来霉素抗性基因序列(ZeoR)、T2A剪切肽序列、胸腺激酶基因序列(TK)和BGH polyA。
优选的，所述第一供体载体中，负向筛选基因序列由一组启动子和终止序列启动和完成转录，第一药物抗性基因序列和第一荧光报告基因序列由剪切肽序列(例如，T2A)连接，并由另一组不同的启动子和终止序列启动和完成转录；所述第二供体载体中，第二药物抗性基因序列及第二荧光报告基因序列与负向筛选基因序列，或者，第二药物抗性基因序列与负向筛选基因序列，由剪切肽序列(例如，T2A、P2A)串联，并采用第一供体载体的两组启动子和终止序列中的任意一组启动和完成转录。例如，TPG/ZT(TK-PuroR-eGFP/ZeoR-TK)双等位基因编辑系统。
优选的，所述第二供体载体中，负向筛选基因序列由一组启动子和终止序列启动转录，第二药物抗性基因序列和第二荧光报告基因序列由剪切肽序列(例如，T2A)连接，并由另一组不同的启动子和终止序列启动和完成转录；所述第一供体载体中，第一药物抗性基因序列及第一荧光报告基因序列与负向筛选基因序列，或者，第一药物抗性基因序列与负向筛选基因序列，由剪切肽序列(例如，T2A、P2A)串联，并采用第二供体载体的两组启动子和终止序列中的任意一组启动和完成转录。例如，PT/TZR(PuroR-TK/TK-ZeoR-mRFP)双等位基因编辑系统双等位基因编辑系统。
上述双等位基因编辑系统在宿主双染色体等位基因的双敲入中的应用。
优选的，所述宿主为真核细胞或真核动物。例如，哺乳动物细胞。
优选的，上述双等位基因编辑系统在制备纯系转基因细胞系或转基因动物中的应用。
本发明的有益效果体现在：
本发明运用基因工程技术，构建了能够对基因组双等位基因进行编辑的双等位敲入系统，能够实现基因组两条姐妹染色单体特定位点或序列的精确编辑(例如，插入、删除、替换)，能够用于高效生产纯合的转基因细胞系或模式动物，从而有效促进基因功能研究及转基因动物生产。
进一步的，针对分别位于两条姐妹染色单体的双等位基因，引入了红绿两种荧光蛋白，和嘌呤霉素、博来霉素两种抗性基因组成外源基因筛选表达盒对同源重组修复之后的细胞进行筛选，考虑到筛选标记的删除问题，添加了胸腺激酶负向筛选基因，为后续筛选序列从基因组中的删除提供筛选标记。
进一步的，带有点突变的同源臂序列用于进行同源重组修复并同时引入精确编辑。
进一步的，为了提高双等位基因编辑效率，在构建基于正负双向筛选基因表达盒的供体载体基础上，提出了基于串联筛选基因表达盒的供体载体，并通过将基于串联筛选基因表达盒的供体载体与基于正负双向筛选基因表达盒的供体载体组合使用，进一步提高双等位基因编辑效率。
进一步的，为了适应没有荧光筛选的平台，基于串联筛选基因表达盒构建了不带荧光蛋白报道基因的供体载体。
附图说明
图1为APP基因靶位点测序结果。
图2为CRISPR/Cas9表达载体pll3.7-sgRNA-Cas9的质粒图谱(a)及APP.sgRNA-Cas9打靶载体效率验证(b)。
图3a为TPG/TZR双等位编辑系统的筛选表达盒元件序列结构示意图(上标R仅用于指示相应抗性基因序列位置)。
图3b为PGT/ZRT双等位编辑系统的筛选表达盒元件序列结构示意图(上标R仅用于指示相应抗性基因序列位置)。
图3c为PT/ZT双等位编辑系统的筛选表达盒元件序列结构示意图(上标R仅用于指示相应抗性基因序列位置)。
图4a为TPG/TZR双等位编辑系统筛选表达盒克隆载体图谱。
图4b为PGT/ZRT双等位编辑系统筛选表达盒克隆载体图谱。
图4c为PT/ZT双等位编辑系统筛选表达盒克隆载体图谱。
图5为TPG/TZR双等位编辑系统在HEK293T细胞中APP基因位点的工作示意图(上标R仅用于指示相应抗性基因序列位置)。
图6为TPG/TZR双等位编辑系统在HEK293T细胞中APP基因位点的打靶结果：(a)Puromycin/Zeocin筛选(镜下挑取单克隆的时候用荧光辅助)获得的细胞单克隆；(b)单克隆基因组PCR结果；(c)单克隆同源臂PCR产物测序。
图7为PT/ZT双等位编辑系统在HEK293T细胞中APP基因位点的工作示意图(上标R仅用于指示相应抗性基因序列位置)。
图8为PT/ZT双等位编辑系统在HEK293T细胞中APP基因位点的打靶结果：(a)Puromycin/Zeocin筛选获得的细胞单克隆；(b)单克隆基因组PCR结果；(c)单克隆同源臂PCR产物测序。
图9为PGT/ZRT双等位编辑系统在HEK293T细胞中APP基因位点的工作示意图(上标R仅用于指示相应抗性基因序列位置)。
图10为PGT/ZRT双等位编辑系统在HEK293T细胞中APP基因位点的打靶结果：(a)Puromycin/Zeocin筛选(镜下挑取单克隆的时候用荧光辅助)获得的细胞单克隆；(b)单克隆基因组PCR结果；(c)单克隆同源臂PCR产物测序。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例以HEK293T细胞的淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein,APP)基因的双等位编辑为例，对本发明中的三套双等位编辑系统进行详细说明。该实施例用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。
1.引物设计
HEK293T细胞中APP基因的双等位编辑试验所涉及的引物如表1所示。
表1.引物列表
Figure BDA0002572009080000061
Figure BDA0002572009080000071
Figure BDA0002572009080000081
注：引物APP-Right arm-F下划线依次是PAM突变(CGG-CTG)、靶位点突变(GA-TC)，及产生Xba
Ⅰ的氨基酸同义突变(G-A)，括号中，“-”前面为原序列，后面为引物带入的突变序列。引物APP-SSA-R中下划线部分的碱基与上述突变位点对应。
2.靶位点纯合性鉴定
以293T细胞(中科院上海细胞库，目录号GNHu17)基因组(提取试剂盒：TIANGENTIANamp Genomic DNA kit，Cat#DP304-02)为模板，使用高保真体系扩增(表2)APP基因序列，体系中上游引物为APP-Left arm-F(EcoRⅠ)，下游引物为APP-Right arm-R(ClaⅠ)。胶回收PCR产物并用引物APP.target-F进行测序，检测靶位点纯合性。检测结果表明靶位点(图1阴影区序列及其下游3bp碱基)峰图单一，说明该位点双等位基因纯合，同时证明用于编辑试验的293T细胞基因组靶位点序列与NCBI序列信息一致。
表2.高保真PCR反应体系
Figure BDA0002572009080000082
附：Touchdown PCR反应程序
Figure BDA0002572009080000083
Figure BDA0002572009080000091
3.靶位点sgRNA设计及效率验证
在sgRNA设计网站(http://www.crisprscan.org/)上输入APPSwe突变位点前后共计200bp的序列进行靶位点筛选，根据前期插入突变距离切割位点的距离研究，平衡序列评分和距离突变位点的位置，最终选择GGGTTGACAAATATCAAGACGG(下划线为PAM序列)作为基因组靶位点(靶位点的序列简称靶序列)。
根据靶序列合成上游引物APP.sgRNA-F和下游引物APP.sgRNA-R，以载体pll3.7-mU6-CMV-NLS-huCAS9-NLS(doi：10.1007/s00018-014-1679-z)为模板，用U6-F(XbaⅠ)/APP.sgRNA-R和APP.sgRNA-F/U6-R(NotⅠ)两对引物分别扩增得到两个片段(参照表2，扩增片段大小268bp和112bp)。经过溶液回收之后，以两个片段(摩尔比1:1、总质量200ng)为模板，用引物对U6-F(XbaⅠ)/U6-R(NotⅠ)进行overlap PCR(参照表2)，最终得到以下完整的sgRNA表达盒序列(361bp，下划线部分为sgRNA序列，斜体为酶切位点)：
Figure BDA0002572009080000092
用XbaⅠ和NotⅠ双酶切(表3)该sgRNA表达盒序列，将双酶切后的sgRNA表达盒序列片段连接(表4)到同样双酶切的pll3.7-sgRNA-Cas9载体(图2a，doi：10.1007/s00018-014-1679-z)中，转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，经过氨苄抗性筛选得到APP基因位点打靶载体pll3.7-pU6-APP.sgRNA-pCBh-hspCas9(11272bp)，简称APP.sgRNA-Cas9。
表3.DNA酶切体系
Figure BDA0002572009080000101
酶切条件：37℃水浴2-4小时
表4.DNA连接体系
Figure BDA0002572009080000102
连接反应条件：16℃2小时，或4℃过夜
参见图2b，所选择的sgRNA序列与实验室之前使用的eGFP位点的sgRNA效率相近(红色荧光)，所以将APP基因位点的sgRNA载体用于后续基因组打靶。
4.TPG/TZR双等位编辑系统在APP基因位点上的应用
4.1 ZeoR-mRFP筛选表达盒载体的构建
(1)用NheⅠ/XhoⅠ双酶切(参照表3)从pB-PuroR-mRFP载体上切出mRFP-BGHpolyA序列，具体如下：
CTAGCGCTACCGGTGCCACCATGGCCTCCTCCGAGGACGTCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCGCATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCCAGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCACCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGATGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCCGAGGTCAAGACCACCTACATGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAAGACCGACATCAAGCTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAGCGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCACCTAAGGCCGGCCAGGCGCGCCGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCC
(2)mRFP-BGH polyA序列连入(参照表4)同样双酶切的JMB81-pCAG-TK-SV40TpolyA-pPGK-PuroR-T2A-eGFP-BGH polyA骨架载体(doi:10.1111/febs.14626，该骨架载体具有胸腺激酶基因表达盒和嘌呤霉素抗性及绿色荧光蛋白基因表达盒，合称TPG筛选表达盒或TK-PuroR-eGFP筛选序列，参见图3a、图4a上部分)中，从而替换骨架载体的eGFP-BGHpolyA序列，转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，经过氨苄抗性筛选得到JMB81-TK-SV40T.PA-PuroR-mRFP-BGH polyA。
(3)用上游引物PGK-F和下游引物PGK-R，从JMB81-pCAG-TK-SV40T polyA-pPGK-PuroR-T2A-eGFP-BGH polyA质粒上扩增(参照表2)得到PGK启动子序列(424bp)。
(4)从pSLIK-Zeo质粒(addgene)上扩增ZeoR-T2A序列(T2A序列用引物序列加在Zeo后面)，具体步骤如下：由于T2A序列较长，先用上游引物Zeo-T2A-F和下游引物Zeo-T2A-R1扩增(参照表2)得到中间片段(409bp)，然后以中间片段为模板，用上游引物Zeo-T2A-F和下游引物Zeo-T2A-R2扩增(参照表2)得到完整的ZeoR-T2A片段(442bp)。
(5)以步骤(3)和(4)中得到的PCR扩增片段(总质量200ng)为模板，其中，PGK启动子和ZeoR-T2A片段摩尔比为1:1，用引物PGK-F和Zeo-T2A-R2进行overlap PCR(参照表2)得到PGK-Zeo-T2A片段(846bp)。
(6)用BamHⅠ/NheⅠ双酶切(参照表3)，将PGK-Zeo-T2A片段连入(参照表4)同样双酶切的JMB81-TK-SV40T.PA-PuroR-mRFP-BGH polyA载体中，转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，经过氨苄抗性筛选得到具有胸腺激酶基因表达盒和博来霉素抗性及红色荧光蛋白基因表达盒(合称TZR筛选表达盒或TK-ZeoR-mRFP筛选序列)的载体JMB81-pCAG-TK-SV40T polyA-pPGK-ZeoR-T2A-mRFP-BGH polyA(参见图3a、图4a下部分)。
4.2 TPG/TZR双等位编辑系统供体载体的构建
(1)用上游引物APP-Left arm-F(EcoRⅠ)和下游引物APP-Left arm-R(NotⅠ)从293T细胞基因组中扩增(参照表2)在APP基因位点介导HDR的左侧同源臂(约1043bp)，经EcoRI和NotI双酶切(参照表3)，连入(参照表4)同样双酶切的骨架载体pXL-BacⅡ(addgene)中，转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，经过氨苄抗性筛选得到载体pXL-BacⅡ-APP.LA。
(2)用上游引物APP-SSA-F(XhoⅠ)和下游引物APP-SSA-R从293T细胞基因组上扩增(参照表2)在APP基因位点介导单链退火的同源臂(即与左侧同源臂中的一段相重叠的序列)APP.SSA arm(约493bp)，用上游引物APP-Right arm-F和下游引物APP-Right arm-R(ClaⅠ)从293T细胞基因组上扩增(参照表2)在APP基因位点介导HDR的右侧同源臂APP.RA(约1111bp)。以PCR产物(总质量200ng)为模板，其中，APP.SSA arm和APP.RA摩尔比为1:1，用引物APP-SSA-F(XhoⅠ)和APP-Right arm-R(ClaⅠ)进行overlap PCR(参照表2)，最终得到SSA-RA同源臂片段(约1591bp)。SSA-RA经XhoI和ClaI双酶切(参照表3)，连入(参照表4)同样双酶切的载体pXL-BacⅡ-APP.LA中，转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，经过氨苄抗性筛选得到载体pXL-BacⅡ-APP.HA，至此同源臂载体构建完成。其中通过PCR引物带入了GA到TC的突变(精确编辑的目的突变，用于产生错误折叠的β淀粉样蛋白)和Xba I酶切位点(此处使用的是氨基酸同义突变，只改变核酸序列，不改变编码区的氨基酸序列，引入目的只是为了后续方便PCR产物酶切鉴定)、PAM序列突变(为了防止二次打靶，使用氨基酸同义突变的办法，更改基因组上核酸序列，使得经过同源重组修复的序列不再受到Cas9蛋白的切割)。
(3)用NotI和XhoI双酶切(参照表3)分别将TPG筛选表达盒和TZR筛选表达盒从4.1中的JMB81-pCAG-TK-SV40T polyA-pPGK-PuroR-T2A-eGFP-BGH poly和JMB81-pCAG-TK-SV40T polyA-pPGK-ZeoR-T2A-mRFP-BGH polyA载体上切出(5081bp和4907bp)，连入(参照表4)同样双酶切的载体pXL-BacⅡ-APP.HA，转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，经过氨苄抗性筛选分别得到APP基因位点TPG筛选表达盒供体载体APP.TPG.donor(简称TPG)和APP基因位点TZR筛选表达盒供体载体APP.TZR.donor(简称TZR)。
4.3 TPG/TZR双等位编辑系统细胞转染及检测
TPG/TZR双等位编辑系统工作原理(参见图5)：在HDR介导的修复中，供体载体APP.TPG.donor和APP.TZR.donor中的TK-PuroR-eGFP筛选序列和TK-ZeoR-mRFP筛选序列分别整合至基因组两条姐妹染色单体各自的APP基因位点上，对两个等位基因同时进行点编辑，在实现GA到TC的突变(会导致编码β-淀粉样蛋白前体蛋白的基因序列发生错义突变(APPSwe)，进而导致β-淀粉样蛋白合成及分泌增加，对脑细胞产生毒性，为后续构建阿兹海默症病理模型奠定基础)同时引入XbaⅠ酶切位点(用于后续酶切检测)，以及为防止二次打靶的PAM序列同义突变。
(1)将供体载体APP.TPG.donor和APP.TZR.donor与APP基因位点打靶载体APP.sgRNA-Cas9(摩尔比为1:1:1.2)共转染至293T细胞系中，转染体系参照Hieff TransTM脂质体核酸转染试剂24孔板说明，细胞转染密度为90％，转染后48h将细胞消化，之后移入100mm培养皿中，转染6天之后开始进行嘌呤霉素(puromycin)和博来霉素(Zeocin)双重筛选，puromycin药物浓度为2μg/mL，zeocin药物浓度为600μg/mL，4天之后puromycin药物浓度降低至1μg/mL，zeocin药物浓度不变，第10天停止加药，更换正常培养基等待单克隆长大。
(2)在荧光倒置显微镜的辅助下，选择双重药物筛选之后，既发绿色荧光又发红色荧光的细胞单克隆，在皿底用记号笔做好标记，挑取单克隆至24孔板进行扩大培养，待细胞长满，留取1/5细胞继续在原孔培养，收取4/5细胞用Tiangen细胞基因组试剂盒提取基因组。
(3)为了通过PCR检测左右侧同源臂的完整性，初步筛选双等位基因整合的细胞，分别在TPG筛选表达盒的eGFP序列和TZR筛选表达盒的mRFP序列各设计了一条上游引物P7和P7-3，并分别与APP.RA外侧的下游引物P8配对检测两条姐妹染色单体整合情况。因为两个筛选表达盒的5’端序列相同，因此两条姐妹染色单体的左侧同源臂PCR鉴定共用P5、P6为上、下游引物。只有左侧同源臂、上游连接有mRFP序列的右侧同源臂、上游连接有eGFP序列的右侧同源臂的扩增结果同时为阳性，才能证明两个筛选表达盒同时敲入双等位基因，方可记录为阳性单克隆(图6a)。
(4)用引物P5/P8扩增APP基因编辑位点全长，证明双荧光和双药物筛选阳性细胞单克隆实现了双等位基因的完全敲入，且没有混入野生型的细胞。通过XbaⅠ分别酶切引物P7/P8和P7-3/P8的PCR胶回收产物，检测右侧同源臂引入的XbaⅠ位点，能在引入的酶切位点切开的单克隆基因组左右侧同源臂的扩增片段通过测序进行确认。PCR鉴定反应体系见表5，PCR反应程序见表6，PCR回收产物酶切体系见表3，电泳结果见图6b，测序结果见图6c。
表5 .2×Taq MasterMix PCR反应体系
Figure BDA0002572009080000141
表6.普通PCR反应程序
Figure BDA0002572009080000142
5.PT/ZT双等位编辑系统在APP基因位点上的应用
5.1 PT/ZT双等位编辑系统供体载体的构建
(1)用ClaⅠ/BamHⅠ双酶切(参照表3)JMB81-pCAG-TK-SV40T polyA-pPGK-PuroR-T2A-eGFP-BGH poly质粒，回收线性化骨架，用EasyPfu补平粘性末端(补平体系见表7；补平反应条件为72℃、15min)后溶液回收，回收产物独自连接成环，得到去除pCAG-TK-SV40T序列的JMB81-pPGK-PuroR-T2A-eGFP-BGH polyA载体。
表7.粘性末端补平反应体系
Figure BDA0002572009080000143
(2)用Cla1/BamH1双酶切(参照表3)4.1中构建的JMB81-pCAG-TK-SV40T polyA-pPGK-ZeoR-T2A-mRFP-BGH polyA质粒，回收线性化骨架，用步骤(1)中方法补平，并独自连接成环，得到去除pCAG-TK-SV40TpolyA序列的JMB81-pPGK-ZeoR-T2A-mRFP-BGH polyA载体。
(3)用上游引物TK-F(NheⅠ)和下游引物TK-R(EcoRⅠ、PmeⅠ、AgeⅠ)从JMB81-pCAG-TK-SV40T polyA-pPGK-PuroR-T2A-eGFP-BGH poly质粒上扩增(参照表2)TK基因片段(1163bp)。用NheⅠ和EcoRⅠ双酶切(参照表3)该片段之后，连入(参照表4)经过同样双酶切的JMB81-pPGK-PuroR-T2A-eGFP-BGH polyA载体中，转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，经过氨苄抗性筛选得到JMB81-pPGK-PuroR-T2A-TK-BGH polyA载体，该载体具有嘌呤霉素抗性和胸腺激酶基因表达盒(简称PT筛选表达盒或PuroR-TK筛选序列)，参见图3c、图4c上部分。同样的PCR来源的TK基因片段经NheⅠ和PmeⅠ双酶切(参照表3)之后，连入经过同样双酶切的JMB81-pPGK-ZeoR-T2A-mRFP-BGH polyA载体中，转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，经过氨苄抗性筛选得到JMB81-pPGK-ZeoR-T2A-TK-BGH polyA载体(参见图3c、图4c下部分)，该载体具有博来霉素抗性基因和胸腺激酶基因表达盒(简称ZT筛选表达盒或ZeoR-TK筛选序列)，参见图3c、图4c下部分。
(4)用NotI和XhoI双酶切(参照表3)将PT筛选表达盒及ZT筛选表达盒分别从(3)构建的JMB81-pPGK-PuroR-T2A-TK-BGH polyA载体及JMB81-pPGK-ZeoR-T2A-TK-BGH polyA载体中切出(2446bp及2244bp)，连入(参照表4)同样双酶切的4.2中载体pXL-BacⅡ-APP.HA，转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，经过氨苄抗性筛选分别得到APP基因位点PT筛选表达盒供体载体APP.PT.donor(简称PT)和APP基因位点ZT筛选表达盒供体载体APP.ZT.donor(简称ZT)。
5.2 PT/ZT双等位编辑系统细胞转染及检测
PT/ZT双等位编辑系统工作原理(图7)：在HDR介导的修复中，供体载体APP.PT.donor和APP.ZT.donor中的PuroR-TK筛选序列和ZeoR-TK筛选序列分别整合至基因组两条姐妹染色单体各自的APP基因位点上，对两个等位基因同时进行点编辑，在实现GA到TC的突变同时引入XbaⅠ酶切位点及PAM序列同义突变。
(1)将供体载体APP.PT.donor和APP.ZT.donor与APP基因位点打靶载体APP.sgRNA-Cas9(摩尔比为1:1:1.2)共转染至293T细胞系中，构建双等位敲入整合细胞系。转染操作、药物筛选、单克隆挑取、扩大培养和基因组提取等操作参照4.3。
(2)由于筛选表达盒序列变动，根据新的筛选表达盒内部序列，重新设计位于PuroR序列上的下游引物P20和位于ZeoR序列上的下游引物P21，以及位于TK基因上的上游引物P22(图7)。用P5和P20检测HDR后PT筛选表达盒整合的左侧同源臂完整性，用P5和P21检测HDR后ZT筛选表达盒整合的左侧同源臂的完整性，用P22和P8检测HDR后右侧同源臂的完整性。两侧同源臂PCR结果均为阳性，统计单克隆为阳性(图8a)。胶回收右侧同源臂基因组PCR产物进行XbaⅠ酶切鉴定，最后将左右侧同源臂扩增序列送测序验证，电泳结果见图8b，测序结果见图8c。
6.PGT/ZRT双等位编辑系统在APP基因位点上的应用
6.1 PGT/ZRT双等位编辑系统供体载体的构建
(1)用上游引物P2A-F1(EcoRⅠ)和下游引物P2A-R从pU6-CBh-Cas9-T2A-mcherry-P2A-Ad4E4orf6质粒(addgene)上扩增(参照表2)P2A剪切肽序列(76bp)。用上游引物TK-F2和下游引物TK-R2(XhoⅠ)从JMB81-pCAG-TK-SV40T polyA-pPGK-PuroR-T2A-eGFP-BGH poly质粒上扩增(参照表2)TK基因序列(1318bp)。经过溶液回收之后，以P2A剪切肽序列、TK基因序列(两个片段摩尔比1:1、总质量200ng)为模板，用P2A-F1(EcoRⅠ)和TK-R2(XhoⅠ)进行overlap PCR(参照表2)，得到P2A-TK-SV40T polyA片段(1374bp)。将该片段经过EcoRI和XhoI双酶切(参照表3)后连入(参照表4)同样双酶切的5.1中的JMB81-PGK-PuroR-T2A-eGFP-bGHpolyA载体中，得到JMB81-pPGK-PuroR-T2A-eGFP-P2A-TK-SV40T polyA载体，该载体具有嘌呤霉素(puromycin)抗性基因、绿色荧光蛋白和胸腺激酶基因表达盒(简称PGT筛选表达盒或PuroR-eGFP-TK筛选序列)，参见图3b、图4b上部分。
(2)用上游引物RFP-F(NheⅠ)和下游引物RFP-R从JMB81-pCAG-TK-SV40T polyA-pPGK-ZeoR-T2A-mRFP-BGH polyA质粒上扩增(参照表2)mRFP荧光蛋白序列(694bp)。用上游引物P2A-F2(RFP)和下游引物TK-R2(XhoⅠ)引物从JMB81-pPGK-PuroR-T2A-eGFP-P2A-TK-SV40T polyA载体上扩增(参照表2)P2A-TK-SV40TpolyA序列(1375bp)。溶液回收两种片段，以mRFP荧光蛋白序列和P2A-TK-SV40TpolyA序列(摩尔比1:1、总质量200ng)为模板，用RFP-F(NheⅠ)和TK-R2(XhoⅠ)进行overlap PCR(参照表2)，得到mRFP-P2A-TK-SV40T polyA片段(2094bp)。将该片段经过NheⅠ和XhoⅠ双酶切(参照表3)后连入(参照表4)同样双酶切的5.1中的JMB81-pPGK-ZeoR-T2A-mRFP-BGH polyA载体中，得到JMB81-pPGK-ZeoR-T2A-mRFP-P2A-TK-SV40T polyA载体，该载体具有博来霉素抗性基因、红色荧光蛋白和胸腺激酶基因表达盒(简称ZRT筛选表达盒或ZeoR-mRFP-TK筛选序列)，参见图3b、图4b下部分。
(3)用NotI和XhoI双酶切(参照表3)将PGT筛选表达盒、ZRT筛选表达盒分别从(1)、(2)中构建的JMB81-pPGK-PuroR-T2A-eGFP-P2A-TK-SV40T polyA载体、JMB81-pPGK-ZeoR-T2A-mRFP-P2A-TK-SV40T polyA载体中切出(3181bp和2887bp)，连入(参照表4)同样双酶切的4.2中载体pXL-BacⅡ-APP.HA，分别得到APP基因位点PGT筛选表达盒供体载体APP.PGT.donor(简称PGT)和APP基因位点ZRT筛选表达盒供体载体APP.ZRT.donor(简称ZRT)。
6.2 PGT/ZRT双等位编辑系统细胞转染及检测
PGT/ZRT双等位编辑系统工作原理(图9)：在HDR介导的修复中，供体载体APP.PGT.donor和APP.ZRT.donor中的PuroR-eGFP-TK筛选序列和ZeoR-mRFP-TK筛选序列分别整合至基因组两条姐妹染色单体各自的APP基因位点上，对两个等位基因同时进行点编辑，在实现GA到TC的突变同时引入XbaⅠ酶切位点和PAM序列同义突变。
PGT/ZRT双等位编辑系统的细胞转染、筛选、单克隆检测过程同5.2，结果如图10所示。
7.结果对比
本发明基于正负筛选表达盒序列设计原则，提出了用于双等位基因编辑的TPG/TZR双等位基因敲入系统，且在293T细胞的APP基因位点得到52.94％的双等位编辑效率。在TPG/TZR双等位编辑系统基础之上，通过优化筛选表达盒长度，构建了PGT/ZRT和PT/ZT两套效率更高的双等位敲入系统，在APP基因位点的双等位基因编辑效率分别为82％和70％。另外，以上双等位编辑系统在不同基因组位点上的效率也有所不同，这可能由于基因组染色体的结构造成的修复效率差异。
8.双等位编辑系统的优化
在本发明的双等位编辑系统中，筛选表达盒中带有负向筛选基因(即TK基因)，目的是完成筛选表达盒敲出的负向筛选。当将TK基因的表达盒或表达盒中的TK基因序列在以上的表达盒构建中省去，则可以进一步提高系统的编辑效率。
为了深入考察表达盒长度对编辑效率的影响，本发明将不同系统的载体交叉组合，例如，TPG/ZT、PT/TZR，其相对于PGT/ZRT，可以进一步提高系统的编辑效率。
总之，本发明应用外源DNA供体载体，靶向整合进入细胞內源基因组并且形成稳定可遗传的细胞系，可以将本发明所用的APP基因位点及其同源臂序列更换成其它结构、功能基因及其同源臂，从而有效的建立满足各种特定需求的细胞系。
<110> 西北农林科技大学
<120>双供体介导的基于药物/荧光协同筛选的双等位基因编辑系统
<160> 36
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> U6-F(XbaⅠ)
<400> 1
cgctctagat ttcccatgat tccttcatat 30
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> U6-R(NotⅠ)
<400> 2
accgcggccg caaaaaagca ccgactcggt gcc 33
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> APP.sgRNA-F
<400> 3
gggttgacaa atatcaagag ttttagagct agaaatagca ag 42
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> APP.sgRNA-R
<400> 4
tcttgatatt tgtcaacccg gtgtttcgtc ctttccacaa g 41
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> APP.target-F
<400> 5
aatgcggccg cgggtaggct ttgtcttaca g 31
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> PGK-F
<400> 6
cgcggatccc cggtaggcgc caa 23
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> PGK-R
<400> 7
tcaacttggc catattggct gcaggtcgaa 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> Zeo-T2A-F
<400> 8
agccaatatg gccaagttga ccagtgccgt 30
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> Zeo-T2A-R1
<400> 9
accgcatgtt agcagacttc ctctgccctc gtcctgctcc tcggccacga 50
<210> 10
<211> 53
<212> DNA
<213> Zeo-T2A-R2
<400> 10
cacgctagct gggccaggat tctcctcgac gtcaccgcat gttagcagac ttc 53
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> APP-Left arm-F(EcoRⅠ)
<400> 11
ccggaattcc aaaggatgga agttacagg 29
<210> 12
<211> 59
<212> DNA
<213> APP-Left arm-R(NotⅠ)
<400> 12
aatgcggccg ccgctaaaga ggaagaggac agggtcagtc ttgatatttg tcaacccag 59
<210> 13
<211> 52
<212> DNA
<213> APP-SSA-F(XhoⅠ)
<400> 13
ccgctcgagc gctaaagagg aagaggacag ggaaagcccc aaagtagcag tt 52
<210> 14
<211> 48
<212> DNA
<213> APP-SSA-R
<400> 14
catctagatt cacttcagag atctcctcag tcttgatatt tgtcaacc 48
<210> 15
<211> 45
<212> DNA
<213> APP-Right arm-F
<400> 15
ctgaggagat ctctgaagtg aatctagatg cagaattccg acatg 45
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> P5
<400> 16
ggcttgctct gtgttgaatc 20
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> P6
<400> 17
tccctattgg cgttactatg g 21
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> P7
<400> 18
tgagcaaaga ccccaacgag 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> P7-3
<400> 19
ctacgacgcc gaggtcaaga 20
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> P8
<400> 20
gcaaatccaa atcccaagtc ag 22
<210> 21
<211> 29
<212> DNA
<213> TK-F(NheⅠ)
<400> 21
ctagctagca tggcctcgta ccccggcca 29
<210> 22
<211> 37
<212> DNA
<213> TK-R(EcoRⅠ、PmeⅠ、AgeⅠ)
<400> 22
ccggaattcg tttaaaccta accggtgtta gcctccc 37
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> P2A-F(EcoRⅠ)
<400> 23
ccggaattcg caacaaactt ctcacta 27
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> P2A-R
<400> 24
acgaggccat aggcccggga ttctcctcca 30
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> TK-F2
<400> 25
tcccgggcct atggcctcgt accccggcca 30
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> TK-R2( XhoⅠ)
<400> 26
ccgctcgagc agacatgata agataca 27
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> P2A-F2(RFP)
<400> 27
caccggcacc gcaacaaact tctcactact 30
<210> 28
<211> 27
<212> DNA
<213> RFP-F(NheⅠ)
<400> 28
ctagctagca tggcctcctc cgaggac 27
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> RFP-R
<400> 29
agtttgttgc ggtgccggtg gagtggcggc 30
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> P20
<400> 30
gcttgtactc ggtcatattg g 21
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> P21
<400> 31
aacggcactg gtcaacttgg 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> P22
<400> 32
ccaacggcga cctgtataac 20
<210> 33
<211> 29
<212> DNA
<213> P22
<400> 33
cccatcgatt taaccctctt actgcacct 29
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> sgRNA
<400> 34
gggttgacaa atatcaaga 19
<210> 35
<211> 361
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 35
cgctctagat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaacaccg ggttgacaaa tatcaagagt tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa 300
ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt gcggccgcgg 360
t 361
<210> 36
<211> 980
<212> DNA
<213> mRFP-BGH polyA
<400> 36
ctagcgctac cggtgccacc atggcctcct ccgaggacgt catcaaggag ttcatgcgct 60
tcaaggtgcg catggagggc tccgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg 120
agggccgccc ctacgagggc acccagaccg ccaagctgaa ggtgaccaag ggcggccccc 180
tgcccttcgc ctgggacatc ctgtcccctc agttccagta cggctccaag gcctacgtga 240
agcaccccgc cgacatcccc gactacttga agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg 300
agcgcgtgat gaacttcgag gacggcggcg tggtgaccgt gacccaggac tcctccctgc 360
aggacggcga gttcatctac aaggtgaagc tgcgcggcac caacttcccc tccgacggcc 420
ccgtaatgca gaagaagacc atgggctggg aggcctccac cgagcggatg taccccgagg 480
acggcgccct gaagggcgag atcaagatga ggctgaagct gaaggacggc ggccactacg 540
acgccgaggt caagaccacc tacatggcca agaagcccgt gcagctgccc ggcgcctaca 600
agaccgacat caagctggac atcacctccc acaacgagga ctacaccatc gtggaacagt 660
acgagcgcgc cgagggccgc cactccaccg gcacctaagg ccggccaggc gcgccgtcta 720
gagggcccgt ttaaacccgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg 780
ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt 840
cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg 900
gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg 960
atgcggtggg ctctatggcc 980

Claims (10)

1.一种双等位基因编辑系统，其特征在于：该双等位基因编辑系统包括第一供体载体和第二供体载体；
所述第一供体载体包括两段目标编辑基因同源序列及位于该两段同源序列之间的第一外源序列，第一外源序列包括正向筛选基因表达盒和负向筛选基因表达盒，正向筛选基因表达盒包括第一药物抗性基因序列以及第一荧光报告基因序列；或者，第一外源序列包括串联筛选基因表达盒，串联筛选基因表达盒包括第一药物抗性基因序列以及负向筛选基因序列；
或者，所述第一供体载体包括两段目标编辑基因同源序列及位于该两段同源序列之间的第一外源序列，第一外源序列包括正向筛选基因表达盒，正向筛选基因表达盒包括第一药物抗性基因序列以及第一荧光报告基因序列；或者，第一外源序列包括串联筛选基因表达盒，串联筛选基因表达盒包括第一药物抗性基因序列；
所述第二供体载体包括上述两段目标编辑基因同源序列及位于该两段同源序列之间的第二外源序列，第二外源序列包括正向筛选基因表达盒和负向筛选基因表达盒，正向筛选基因表达盒包括第二药物抗性基因序列以及第二荧光报告基因序列；或者，第二外源序列包括串联筛选基因表达盒，串联筛选基因表达盒包括第二药物抗性基因序列以及负向筛选基因序列；
或者，所述第二供体载体包括上述两段目标编辑基因同源序列及位于该两段同源序列之间的第二外源序列，第二外源序列包括正向筛选基因表达盒，正向筛选基因表达盒包括第二药物抗性基因序列以及第二荧光报告基因序列；或者，第二外源序列包括串联筛选基因表达盒，串联筛选基因表达盒包括第二药物抗性基因序列；
所述两段同源序列包括用于介导单链退火的重叠序列，重叠序列包括用于目标编辑基因切割的靶位点。
2.根据权利要求1所述一种双等位基因编辑系统，其特征在于：所述第一供体载体中，串联筛选基因表达盒还包括第一荧光报告基因序列；第二供体载体中，串联筛选基因表达盒还包括第二荧光报告基因序列。
3.根据权利要求1所述一种双等位基因编辑系统，其特征在于：所述两段同源序列带有一个以上的突变位点。
4.根据权利要求1所述一种双等位基因编辑系统，其特征在于：所述第一供体载体和第二供体载体中，采用CAG和/或PGK作为启动子序列，采用SV40 polyA和/或BGH polyA作为终止序列。
5.根据权利要求1所述一种双等位基因编辑系统，其特征在于：所述第一供体载体和第二供体载体的中，负向筛选基因序列由一组启动子和终止序列启动和完成转录，用于正向筛选的药物抗性基因序列和荧光报告基因序列由剪切肽序列连接，并由另一组不同的启动子和终止序列启动和完成转录。
6.根据权利要求1所述一种双等位基因编辑系统，其特征在于：所述第一供体载体和第二供体载体中，用于正向筛选的药物抗性基因序列及荧光报告基因序列与负向筛选基因序列由剪切肽序列连接，并由同一组启动子和终止序列启动和完成转录。
7.根据权利要求1所述一种双等位基因编辑系统，其特征在于：所述第一供体载体和第二供体载体中，用于正向筛选的药物抗性基因序列与负向筛选基因序列由剪切肽序列连接，并由同一组启动子和终止序列启动和完成转录。
8.根据权利要求1所述一种双等位基因编辑系统，其特征在于：所述第一供体载体中，负向筛选基因序列由一组启动子和终止序列启动和完成转录，用于正向筛选的药物抗性基因序列和荧光报告基因序列由剪切肽序列连接，并由另一组不同的启动子和终止序列启动和完成转录；所述第二供体载体中，用于正向筛选的药物抗性基因序列及荧光报告基因序列与负向筛选基因序列，或者，用于正向筛选的药物抗性基因序列与负向筛选基因序列，由剪切肽序列串联并采用第一供体载体的两组启动子和终止序列中的任意一组启动和完成转录。
9.根据权利要求1所述一种双等位基因编辑系统，其特征在于：所述第二供体载体中，负向筛选基因序列由一组启动子和终止序列启动转录，用于正向筛选的药物抗性基因序列和荧光报告基因序列由剪切肽序列连接，并由另一组不同的启动子和终止序列启动和完成转录；所述第一供体载体中，用于正向筛选的药物抗性基因序列及荧光报告基因序列与负向筛选基因序列，或者，用于正向筛选的药物抗性基因序列与负向筛选基因序列，由剪切肽序列串联并采用第二供体载体的两组启动子和终止序列中的任意一组启动和完成转录。
10.如权利要求1所述的双等位基因编辑系统在双染色体等位基因的双敲入中的应用。
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