CN110438018B - 一种快速构建曲霉重组菌株的方法 - Google Patents

一种快速构建曲霉重组菌株的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速构建曲霉重组菌株的方法，属于基因工程技术领域。本发明通过CRISPR‑Cas9对黑曲霉albA基因和黑曲霉kusA基因同时剪切，通过孢子表型快速筛选出黑曲霉kusA突变菌株，与同源重组方法突变kusA基因相比，显著提高同源重组菌株纯合子概率，白色突变体kusA破坏概率达50％，纯化子概率达100％。

Description

一种快速构建曲霉重组菌株的方法
技术领域
本发明涉及一种快速构建曲霉重组菌株的方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
黑曲霉是一种重要的工业生产菌株，它属于丝状真菌的一种，由于其特殊的生理结构，对其基因编辑较为困难。在黑曲霉中非同源重组(NHEJ)和同源重组(HR)机制并存，共同维护其DNA损伤修复。其中NHEJ的概率明显高于HR，在进行同源臂重组的过程中，转化片段往往以NHEJ的形式进行随机插入，使目的基因靶向替换高表达位点带来了极大的难度。由于在重组基因表达时，整合位点是影响重组基因的表达量的重要因素之一，因此，在以NHEJ途径为主的黑曲霉宿主中，转化的目的基因一般都是随机插入，同源双交换的几率低，重组基因的定点整合概率很低，有必要对其NHEJ途径进行破坏，构建黑曲霉HR菌株。
Ku异二聚体包含Ku70和Ku80蛋白，是真核生物NHEJ修复的关键步骤，对曲霉中Ku蛋白基因的破坏，能消除NHEJ途径，能显著提高曲霉的HR途径。其中黑曲霉调控NHEJ途径Ku异二聚体的重要基因为kusA，同源于米曲霉中的ku70基因。据相关研究报道，对这类NHEJ关键基因的破坏，能有效抑制曲霉中的NHEJ途径，大大提高目的片段HR的概率，可使黑曲霉同源重组概率从7％提高至80％。
利用传统的同源重组打靶技术进行kusA基因的敲除，是一项劳动密集型的工作，由于宿主在未破坏kusA的情况下，其HR的几率很低，难以进行基因打靶；其次，kusA基因的缺失导致菌株异核体形成的概率增加，给菌株的纯化带来难度，且异核体的HR效果不佳。
随着基因编辑技术的发展，CRISPR-Cas9在曲霉中已成功应用，利用CRISPR-Cas可剪切DNA双链，利用DNA自身修复进行突变，为获得Ku异二聚体突变株带来了新的途径。利用kusA-sgRNA能有效地对kusA基因进行剪切，且给菌株的纯化带来便利。而albA(fwnA)基因是曲霉中参与孢子色素沉淀的重要基因，对其的破坏能使黑曲霉孢子表型发生肉眼可察的明显变化，孢子颜色由黑色变为白色，因此常作为黑曲霉CRISPR-Cas9的验证基因。
因此，提供一种快速构建曲霉同源重组菌株的方法，有利于对曲霉基因编辑菌株的开发利用。
发明内容
本发明通过CRISPR-Cas9对黑曲霉albA基因和黑曲霉kusA基因同时剪切，使kusA基因突变可视化，简化曲霉同源重组转化子的筛选，通过孢子表型快速筛选出黑曲霉kusA突变菌株，简化曲霉同源重组转化子的筛选和纯化，并显著提高构建黑曲霉同源重组菌株的效率。
本发明的第一个目的是提供一种重组曲霉，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术对曲霉中的基因进行敲除，所述基因包括敲除前后无表型变化的基因和albA基因。
在本发明的一种实施方式中，所述敲除前后无表型变化基因包括Ku蛋白基因。所述Ku蛋白基因包括kusA基因，所述kusA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，宿主为黑曲霉(Aspergillus niger)。
在本发明的一种实施方式中，宿主为Aspergillus niger CCTCC M 2018881。
在本发明的一种实施方式中，所述albA基因如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，黑曲霉密码子优化的Cas9基因序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的第二个目的是提供一种构建曲霉同源重组菌株的方法，是利用CRISPR-Cas9基因编辑技术对曲霉中的Ku蛋白基因与曲霉albA基因进行敲除。
本发明的第三个目的是提供一种可视化筛选曲霉中的Ku蛋白基因突变菌株的方法，是利用CRISPR-Cas9基因编辑技术对曲霉中的Ku蛋白基因与曲霉albA基因进行敲除，通过孢子颜色变化实现对突变菌株的可视化筛选，孢子颜色由黑色变为白色。
本发明的第四个目的是提供上述的重组曲霉的构建方法，所述构建方法是通过构建Cas9表达质粒与含kusA-sgRNA与albA-sgRNA的sgRNA表达框，将Cas9表达质粒与sgRNA表达框转入黑曲霉中共表达。
在本发明的一种实施方式中，将重组质粒转入黑曲霉采用的是原生质体转化法。
在本发明的一种实施方式中，所述kusA-sgRNA是指根据kusA基因序列设计得到的sgRNA，所述albA-sgRNA是根据albA基因序列设计得到的sgRNA。
本发明的第五个目的是提供上述的重组曲霉在生产外源蛋白或内源蛋白中的应用。
本发明的有益效果：
本发明通过CRISPR-Cas9对黑曲霉albA基因和黑曲霉kusA基因同时剪切，通过孢子表型快速筛选出黑曲霉kusA突变菌株，与同源重组方法突变kusA基因相比，显著提高同源重组菌株纯合子概率，白色突变体kusA破坏概率达50％，纯化子概率达100％。
附图说明
图1：黑曲霉Cas9表达质粒pUC19-Cas9。
图2：黑曲霉sgRNA共表达质粒pUC19-sgRNA。
图3：黑曲霉kusA同源重组替换质粒pUC19-KU。
图4：同源重组与CRISPR-Cas9方法构建黑曲霉同源重组菌株对比图。△kusA表示kusA突变菌株。
具体实施方式
(一)培养基
PDA培养基：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，加水定容至1L。
LB培养基：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g NaCl，加水定容至1L。
(二)试剂配方
STC缓冲液：1.2M山梨糖醇，50mM CaCl2，10mM Tris,pH 7.5-8。
PEG缓冲液：25％PEG 6000，50mM CaCl2，10mM Tris,pH 7.5-8。
实施例1：利用CRISPR-Cas9构建黑曲霉同源重组菌株
CRISPR-Cas9系统包括Cas9基因、sgRNA以及筛选标记。
利用曲霉启动子Pgla或Ptef等曲霉强启动子表达Cas9蛋白。
利用PgpdA或Pu6启动子、albA-sgRNA和kusA-sgRNA(sgRNA序列表见表1)、gRNAbackbone序列
(GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC)、终止子TtrpC或Tu6构建sgRNA表达框。
表1目标基因sgRNA序列表
目标基因 目标基因序列
albA AGTGGGATCTCAAGAACTAC
kusA CGAGCACTGGTAGATGATGA
选择标记包括曲霉中常用的潮霉素B(hyg)、乳清酸核苷-5’-磷酸脱羟酶、乙酰胺酶等具有类似功效的丝状真菌标记。重组质粒中的潮霉素抗性基因由质粒PAN7-1中获得，表达框引物如下(Hyg-F/R，见表2)，若要选择其他抗性可替换表达框中的hyg进行构建。
表2引物表
引物名称 引物序列
Hyg-F GAATTCCCTTGTATCTCTACACACAG
Hyg-R TGAAGAACGAATACCGCGACATCCAACCCATC
利用Vazyme的
Figure BDA0002174297130000031
II One Step Cloning Kit，以pUC19为载体骨架，将曲霉启动子序列、Cas9基因序列、抗性基因与AMA1序列分两次进行同源重组合成，得到Cas9表达质粒pUC19-Cas9(质粒图谱见图1)。其中，Cas9基因(如SEQ ID NO.3所示)的N端或C端添加NLS序列(CCCAAGAAGAAGCGCAAGGTC)。
利用Vazyme的
Figure BDA0002174297130000041
II One Step Cloning Kit，以pUC19为载体骨架，构建sgRNA表达质粒，同时表达kusA-sgRNA与albA-sgRNA两个sgRNA时，将两个sgRNA进行反向串联(质粒图谱见图2)。
采用原生质体转化方法将Cas9表达质粒和sgRNA表达框转入宿主：
在PDA培养基中过夜培养黑曲霉菌丝，收集菌丝体，用生理盐水清洗菌丝体三遍；用Lysozyme酶解3h，用四层擦镜纸过滤后制备原生质体；4℃，1000rpm离心收集原生质体，用预冷的STC洗涤原生质体2-3次；取制备好的原生质体100μL加入10μL Cas9表达质粒和10μL sgRNA表达框混匀，加入2mL PEG 6000，在培养基中加入相应抗性进行筛选。30℃培养5-7天，挑单菌落转板，每个单菌落转板三次。
当单独进行kusA敲除时，利用不同的kusA-sgRNA(利用在线软件设计kusA基因上的sgRNA序列，共设计4条，包括K1-sgRNA,K2-sgRNA,K3-sgRNA,K4-sgRNA)，其中K1-sgRNA的效率为4.16％，均为纯合子。
当albA-sgRNA和kusA-sgRNA共表达时，白色突变变体的kusA突变率约为50％，均为纯合子。
实施例2：利用黑曲霉同源重组构建非同源重组缺陷菌株
利用Vazyme的
Figure BDA0002174297130000042
II One Step Cloning Kit，以pUC19为载体骨架，将SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的kusA上、下同源臂以及抗性基因进行重组合成，得到kusA敲除质粒pUC-KU(质粒图谱见图3)
采用原生质体转化方法将kusA敲除框转入宿主：
在PDA培养基中过夜培养黑曲霉菌丝，收集菌丝体，用生理盐水清洗菌丝体三遍；用Lysozyme酶解3h，用四层擦镜纸过滤后制备原生质体；4℃，1000rpm离心收集原生质体，用预冷的STC洗涤原生质体2-3次；取制备好的原生质体100μL加入10μL kusA敲除框混匀，加入2mL PEG 6000，在培养基中加入相应抗性进行筛选。30℃培养5-7天，挑单菌落转板，每个单菌落转板三次。
利用kusA同源重组质粒，筛选100个转化子，其中有1株为双交换杂合子，6株为单交换杂合子，没有得到kusA敲除的纯合子。
结果如表3和图4所示。
表3通过同源重组和CRISPR-Cas9构建重组缺陷菌株
Figure BDA0002174297130000051
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种快速构建曲霉重组菌株的方法
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 6680
<212> DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 1
atggagggtc catctcgtgt gtaccttttt ggagaccaga ccagcgacat cgaagctggc 60
ctgcgccgtc tgctccaagc gaagaatagt accattgtcc agtccttttt ccagcaatgc 120
ttccatgcaa ttcgtcaaga gatcgcgaag ctcccgccgt ctcatcggaa gctcttccca 180
cgcttcacga gcatcgttga tctcctttcc aggagtcgtg aatcaggtcc tagccctgtc 240
ctggagagtg cattgacatg catctaccaa ttgggttgtt tcattcagta agtcaatgag 300
ttaccatcta tacttgacaa gtctgaccag ccttcagctt ttacggggat cttggacatg 360
actaccctac accctccaac agccatcttg ttggcctgtg cactggtgtt ctgagctgca 420
cggctgtaag ttgcgccaga aatgttggag agcttattcc agctgcagtg gaatcggttg 480
taattgcact gcgactggga atctgcgttt ttcgagttcg agaactggtg gactccgccg 540
attccgagtc aacatgctgg tcagcgttgg tttctggaat cagtgaagca gaggctagcc 600
acctgatcga cgagtacagt agtaagaagg tgtgctcttc caactttaaa cccccgcatt 660
gtgggatgct gacagatgca ggctactccg ccttcttcga aaccgtatat cagcgcggta 720
agctctaatg gcgttactgt cagcgcacca cctacggtac ttgatgaatt cgtcgagacc 780
tgcatttcca agaattacaa gccagtgaag gcccctattc atggcccgta ccatgcgcca 840
catctgtatg atgataagga tatcgaccgc atcctgcagc agtcctctgc tctagaagga 900
ctgaccggct gttcacccgt tattcccatc atctccagta acactggaaa gccgatcaag 960
gccaagtcca tcaaagatct cttcaaggtc gcactggagg agatactcct acgacgacta 1020
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tgcaaattgt ttccgatctc gagtagcgcc actcaaagtt tgttcacagt cctcaagaag 1140
gccggtgtga gcatcagctt ggagactggg gtaggagaga tcgcgacgaa cccagaaatg 1200
cggaacctta ctggcaaggc agaaaattca aagattgcta tcattggtat gtctggaaga 1260
tttcctgact cggatggtac ggagagcttc tggaacctcc tgtacaaagg actcgacgta 1320
catcgcaaag tccccgcaga ccgttgggac gttgatgccc acgtcgacat gaccgggtca 1380
aagagaaaca caagcaaagt ggcttacggt tgctggatca acgaacccgg cctgtttgac 1440
ccccgattct tcaacatgtc gcctcgggaa gcactccaag cagatcctgc acaacgtctt 1500
gcgttgctta cagcgtacga ggctctcgag atggctggct tcatcccgga tagctctcca 1560
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atcaacagcg gccaggacat tgatacctat ttcatccctg gcggtaaccg agcatttacg 1680
ccgggtcgga taaactacta cttcaaattt agcggcccca gtgtgagcgt tgacacagcg 1740
tgctcgtcta gtcttgctgc tatccacatg gcttgcaatt cgatctggag aaatgactgc 1800
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gccgtgtcaa tcactcgtcc ccatgttggc gcgcaagcat tcatcttcaa caagctgctc 2100
aatgatgcga atatcgaccc taaggacgtg agctacgtgg aaatgcatgg cactggaact 2160
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cggggtcccg gtcaatcgct tcatatcggt tctgccaagg caaacattgg acacggtgaa 2280
tccgcatcag gagtgactgc tcttgtcaag gtcctcctaa tgatgagaga gaacatgatt 2340
cctcctcatt gtggtatcaa gaccaagatc aattccaatt tcccgacaga cttggcgaag 2400
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gcaagatccc agtctgcatt gaagaacaac gtcgaagctc tggtgaagta cattgactct 2640
cagggcaagt cctttggtgt gaaagagact gaattccttc caaacctggc gtacacgacc 2700
accgcacgcc gtatccacca tcccttccgt gtcattgcgg ttggagcgaa cctacaatca 2760
ctgcgtgact cgctgcatgg tgctttgcac cgtgagacat ataccccagt tccctcaacg 2820
gctcctggta ttggtttcgt cttcaccggc caaggagccc aatactccgg aatgggcaag 2880
gaactctacc gcagttgttt ccaattccga accaccattg agcattttga ctgcatcgca 2940
agaagccagg gccttccttc tatccttcct cttgtcgatg gaagcgtggc tgtcgaagaa 3000
cttagccctg tcgtggtaca agtgggaact acctgtgtac aaatggctct agtaaattac 3060
tggactgctc tgggtgtgaa gccggccttt atcatcggac acagtcttgg agactatgca 3120
gcccttaaca cggccggtgt tctatccacc agcgatacaa tctatctttg tggccggcgt 3180
gctcagttgc tgacgaagga atgcaagatt gggacacatt cgatgctggc catcaaggcg 3240
tccctggcag aggtcaaaca tttcctcaga gacgagctcc acgaagtctc ttgtgttaac 3300
gcacctgcgg agaccgtcgt cagcggcctt gtcgctgata tcgacgagtt ggctcagaaa 3360
tgctccacag agggtttgaa gtcaaccaag ctcaaggttc cttacgcgtt ccattcctct 3420
caggttgatc ctatcttgga ggccttcgaa gatattgccc aaggtgtcac cttccacaag 3480
ccgacaacac ctttcgtctc agccctgttc ggggaagtga tcaccgatgc taactgggag 3540
tgtctcggcc ccaagtacct gcgcgatcat tgcagaaaga cggtcaactt ccttggcggc 3600
gtggaggcta cgaggcatgc gaagctgacc aatgacaaga ctctgtgggt tgagatcggc 3660
tcacatacca tttgctctgg aatgatcaaa gcaactcttg gaccgcaagt tacaacggtt 3720
gcatctctac gccgcgaaga agatacctgg aaggtccttt cgaacagtct tgcgagcctt 3780
catctggcgg gtattgatat caactggaag caatatcacc aggactttag ctcctctctc 3840
caggtcctcc gcctcccagc ctacaagtgg gatctcaaga actactggat tccctatacc 3900
aacaacttct gcctgagcaa gggcgctcca gttgcgacag tagcggcagg gccacagcat 3960
gagtacctga caaccgcggc tcagaaggtc attgagactc gaagtgatgg agcaacagct 4020
acagtcgtga tagagaacga cattgctgat cccgagctca accgcgtcat tcaaggccat 4080
aaggtcaacg gtactgcttt gtgtccctca gtaagttacc gctcttgccc aacgactgcg 4140
ttaagattcg tactaatcag gatatagtca ctatatgccg acatctctca aacgcttgca 4200
gagtatctca tcaaaaagta caagcctgag tacgacggac ttggactgga tgtgtgtgag 4260
gtcacagtgc cacgaccact gattgcgaaa ggcggacagc agctctttag agtatctgcg 4320
acagcggatt gggcggagaa gaagacaacc cttcagatat attcagtcac tgcggagggg 4380
aagaagacgg ctgaccacgc aacttgcact gtccgattct ttgactgcgc tgctgcggag 4440
gcggaatgga aacgagtttc ctaccttgtc aagaggagca ttgaccgact gcatgatatc 4500
gccgaaaatg gtgacgctca ccgtcttggt agaggcatgg tttacaaact cttcgctgcc 4560
ttggttgatt atgacgacaa cttcaagtcc attcgcgagg ttattcttga cagtgaacag 4620
cacgaagcga ctgcacgcgt caagttccaa gcaccacaag gcaatttcca ccgaaacccg 4680
ttctggattg acagttttgg acacctgtct gggttcatca tgaacgcaag cgatgcaacc 4740
gactccaaga accaggtctt tgtcaatcac ggatgggact ccatgcgttg tttgaagaag 4800
ttctcgcctg atgtcaccta caggacttat gttagaatgc agccttggaa agactccatc 4860
tgggctggtg atgtctacgt tttcgatggg gatgatatcg ttgcggtgta tggtgcagtc 4920
aaggtgagtt cggcccgcgc tcagttgcat aagattcaag gtgctaatca ttggtgtcac 4980
agttccaagc cttatcacgc aagattctcg atacggtcct acctccagtt ggggcttcga 5040
agggccccgc cagaccagcc gctagcgctc agaaggcggc ccctgctgct gctgccagca 5100
agagtcgtgc tagcgccccg gccccggcga agcctgctgc taagcccagc gccccaagct 5160
tggtcaaacg ggcacttacc atcctcgcag aggaagtggg tctgtctgaa tccgagatta 5220
cggatgatct ggtcttcgca gactacggtg tggactccct tctttcgttg acggtcacgg 5280
gcaggtatcg tgaagagctg gatatcgatc tcgaatcctc catcttcatc gaccagccga 5340
ccgtgaaaga cttcaagcag ttcttggccc caatgagcca gggagaagcc agcgatgggt 5400
ccaccagtga cccagagtct agtagctcct tcaatggtgg ctcttcaaca gacgagtcca 5460
gtgctgggtc ccctgtcagc tcaccaccaa atgagaaggt tacgcaggtc gagcagcatg 5520
ctacgataaa ggagattcgc gccattttgg ccgatgagat tggtgttacg gaggaggagc 5580
tgaaggacga tgagaacttg ggagagatgg ggatggactc tctgctttcg cttacggtgc 5640
ttggtaggat ccgtgagaca ttggatctgg atctaccggg cgagttcttc atcgagaatc 5700
aaactctgaa tgacgtggag gatgcattgg gcctcaaacc caaggcagct cctgcgcctg 5760
cgcctgcgcc tgctcccgta cccgcacccg tgtccgcgcc catattgaag gagcctgtcc 5820
ccaacgcaaa ctctaccatc atggcccggg cgagcccgca ccctcgatca acctccattc 5880
tgttgcaagg aaacccgaaa accgcgacca agaccctgtt cctgttccct gatgggtctg 5940
gctccgcaac atcgtatgca accattcccg gagtgtcccc ggacgtgtgt gtctacggat 6000
tgaactgccc gtacatgaag actccagaga agctcaagta tccccttgct gagatgacat 6060
tcccctatct ggccgagatc cgccgcagac agcccaaggg cccgtacaac ttcggtggat 6120
ggtctgcagg tggtatttgc gcctatgatg ccgctcgcta cctaatcctt gaagagggcg 6180
aacaggttga ccgattgctt cttcttgact cgcccttccc cattggctta gagaagttgc 6240
ccactcggct gtacggcttc atcaactcaa tgggtctctt tggtgaaggc aacaaggctc 6300
ccccggcctg gttgctccct catttcctgg ccttcattga ttccctcgat acctacaagg 6360
ccgtccccct cccctttgac gatccgaagt gggccaagaa gatgccaaag acattcatgg 6420
tctgggccaa ggacggtatc tgcagcaagc cggatgaccc gtggcccgag ccggacccgg 6480
acggcaagcc ggacacgaga gagatggtct ggctcctcaa gaaccggacc gacatgggac 6540
ccaacaagtg ggacacactc gtcgggcccc aaaacgtcgg tggaatcact gtgatagagg 6600
gtgcgaatca tttcaccatg actttgggac ccaaggctaa agaattgggc tcgttcattg 6660
gcaacgccat ggccaattaa 6680
<210> 2
<211> 2284
<212> DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 2
atggcggacg gcaacccaca tcgggaagat gaggcggccg aggaagaaga ggagattgat 60
gagactgtac gcaaatttac ccatgaactt ggactggaac tctggaactg acaataagat 120
cagagctaca aaccagtcaa agatgcggtc ctcttcgcaa tcgatgtcag cgattccatg 180
ttgacgcctc gcccctcagc agatcctaag aaacacaccc aagaatcacc caccacggca 240
gcgctcaaat gcgcctatca cttcatgcaa caacgaatca tatcaaatcc acaagacatg 300
atgggtgttt tgctgttcgg gacccaggcg tccaagttct ttgaagaaga tgaagacagt 360
cggggagacc tgtcctaccc caactgctac ctcttcactg atctggatgt tccttcggct 420
catgaggtca aaggacttcg agcactggta gatgatgaag gagactcaag ggaggttcta 480
tctccagcga aagagcaggt ctctatggca aacgtcctat tttgcgccaa ccagatattc 540
acatccagag cgccaaattt cctctcccgg cgtttgttca tcataaccga caatgacaac 600
ccccatggtg atgataaaac cctgcggtca gcggcgactg tacgtgctaa ggatctttac 660
gatcttggtg tcacaattga gctgtttccg atctcacgcc ctgagcatga gttcaagaac 720
agcaagttct atgacgtaag ctatcatact ctatagcaaa gtggcagggg tcgatactca 780
ctacagatac aaaggatatt atctacaagt cattgcccag cgatccagag gcgcctgcat 840
atctacaatc tgattcaaaa gcggcgactg cgaccgggga cgggatttca ctcctcaaca 900
cgcttctgtc cagtattaat tcgagaacgg ttccgcgtcg cactcatttt tcgaacatgc 960
ctttagaact tggcccagac ttcagaattt cggtatcggg ctatatactc ttacgaaggc 1020
aagcgcccgc tagaaactcc ttcatctggc tgaacggcga gaagcctgtg gtcgcgaaag 1080
gagtgacttc ccactccgca gatgatactg gccggactgt cgagaaatgg gagatcagaa 1140
aggcatataa gttcggtggc gaccaagtaa ccttttcgcc tgatgagcag aaggcgctta 1200
gggatttcgg tgagccagta atccgggtta ttgggttcaa gcctatcact gcgcttccat 1260
tctgggcaaa cgtcaagcac ccatatttta tctatccatc cgaggaagac tatgtaggct 1320
cctcgcgagt attttccgca ttgcatcaga ctcttttgcg ttccaagaag atggcactcg 1380
tctggttcat tgcacgcaag ggtgctggcc ccgttctcgc cgctatgatc gcaggcgaag 1440
aaaagcttga tgagaatggc gtacaaaaat accctcctgg catgtggatt cttcccctcc 1500
ccttcgcaga cgatatccgg cagaaccccg aaacaacgtt gaatgtcgcc ccggagtcat 1560
tgattgatca gatgcgcgtg atcgtccagc aactgcagct gccgaaggga gtgtacgagc 1620
ctctcaaata ccccaatcca tgtaagtcac ttctgtcttg cattgctcgt atacgatgaa 1680
cgagaagctg acagcccgtg atcagccctt caatggcatt accgcatcct acaagctctc 1740
gcattagacg aagatctccc cgaaaaacca gaagacaaaa ccattccgaa ataccgccaa 1800
atcgacaagg taaatccacc acacccaaca cgagaaataa ccctccaggc gtccaactta 1860
ctgacaattg caccacagcg cgccggtgac tacgtattat cctgggccga cgaactcgaa 1920
aagcaatacg ccaaaacctc agcagcggcc cctcgcccaa ccagcaccct cgtgaaacga 1980
ggatcaaaag accgagcaag cgaaaccgag gactccaagc catcgaaaaa gatcaaggtt 2040
gaggaagact ctggaagcct agaggaggaa gtccgcaggc atcacaagaa gggaacgcta 2100
tccaaggtaa gccaccacag gctttctaca cgtcctcgtg atggcaaata tgacatcgta 2160
ttaaccggcg gttttctagc ttacggtcgc tatcctcaag gacttcttga cttccaatgg 2220
acgctcaaat gccggtaaga aggcggatct tattgagcgg gtagaggagt tcttggagca 2280
gtga 2284
<210> 3
<211> 4104
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
atggacaaga agtatagcat cgggctggac attggaacga actcggttgg ttgggctgtg 60
attacggacg aatacaaggt gccatccaag aagtttaagg tcctgggaaa caccgaccgt 120
cactcaatca agaagaatct cattggagcc ctgctcttcg atagtgggga gaccgccgaa 180
gctactcgac tgaagcgaac ggctcgccgg cgttatacac gacgcaagaa tcgcatctgc 240
tacctccagg agattttcag caacgaaatg gctaaggttg atgactcatt ctttcatcga 300
ctcgaagaaa gtttcttggt cgaggaggat aagaagcacg agcgccatcc gatctttggt 360
aacattgtgg atgaggttgc ctatcacgaa aagtacccaa ctatctatca tcttcgtaag 420
aagctggtcg atagcacgga caaggctgat ttgcgactta tctacctggc actcgcgcac 480
atgattaagt tccgcggcca ttttcttatc gagggtgacc tgaaccccga taattctgac 540
gttgataagc tcttcatcca gttggtccaa acctacaatc agctgtttga ggaaaaccct 600
attaatgcat ctggcgtgga cgccaaggct atcctttcgg cgcgcctgtc taagtcgcgg 660
cgtttggaga accttatcgc acaactcccc ggcgaaaaga agaacggcct cttcggtaat 720
ttgattgcgt tgtcacttgg tctgactcct aacttcaaga gtaattttga cctggcagag 780
gatgcgaagc tccagttgtc taaggatacg tatgatgacg atctcgacaa cttgcttgcc 840
caaatcggtg accagtacgc tgatcttttc ctggccgcta agaatctctc agatgcaatc 900
ctgctcagtg acattttgcg ggtcaacacc gagattacta aggcccccct gtcagctagt 960
atgatcaagc ggtatgatga gcaccatcag gacctcacct tgcttaaggc cctcgtgcgt 1020
cagcaattgc ctgagaagta taaggaaatc ttctttgacc aatccaagaa cggatacgca 1080
gggtatattg atggcggtgc gagccaggag gaattctaca agtttatcaa gccgattttg 1140
gagaagatgg acggcactga ggaactgctc gtcaagctga atcgcgaaga tttgcttcgt 1200
aagcaacgaa cgttcgacaa cggctccatc ccgcaccaga ttcatctggg cgagctccac 1260
gccatccttc gacgccagga agatttctac ccatttctga aggacaaccg tgagaagatc 1320
gaaaagattc ttacattccg aatcccctac tatgtgggac ctttggcccg tgggaattcc 1380
cgatttgctt ggatgacccg aaagagcgag gaaaccatca ctccgtggaa cttcgaggaa 1440
gtcgtggaca agggtgcatc cgcgcagagc ttcattgagc ggatgaccaa ttttgataag 1500
aaccttccga atgaaaaggt cctgccaaag cattcgctgc tctacgagta tttcaccgtg 1560
tataacgaac tgactaaggt caagtacgtg acggagggaa tgcggaagcc agccttcctc 1620
tcaggggaac aaaagaaggc tatcgtcgat ttgcttttta agaccaatcg taaagtgact 1680
gttaagcagc tgaaggagga ttatttcaag aagattgaat gtttcgactc cgtcgagatc 1740
agcggcgtgg aagatcgctt taacgcttcc ctcggtacct accacgacct gctcaagatc 1800
attaaggaca aggatttcct cgataacgag gaaaatgagg acatcttgga agatattgtc 1860
ctcacgttga cactttttga ggaccgcgaa atgatcgagg aacggctcaa gacatatgcc 1920
catttgttcg acgataaggt gatgaagcag ctgaagcggc gtcgatacac cggatggggt 1980
cgccttagcc ggaagctgat caacggcatt cgagataagc aatctggtaa gactatcttg 2040
gatttcctta agtcggacgg cttcgccaac cgcaatttta tgcagcttat tcacgacgat 2100
tccctgacgt tcaaggagga catccagaag gcacaagtct caggacaagg ggattccctg 2160
cacgagcata tcgccaacct ggctggatcc ccggcgatca agaaggggat tcttcagacc 2220
gtcaaggttg tcgacgagct ggtcaaggtg atgggccgtc ataagccaga aaacatcgtg 2280
attgagatgg cccgagaaaa tcagaccact caaaagggtc agaagaacag ccgcgagcgg 2340
atgaagcgga tcgaggaagg cattaaggaa cttggttctc agatcctgaa ggagcaccct 2400
gttgaaaaca cacagctcca aaatgagaag ctgtatctct actatttgca aaatggacgc 2460
gacatgtacg tcgatcagga gctcgacatt aaccggttgt cggactacga tgttgaccat 2520
atcgtcccgc aatccttcct taaggacgat agcattgata acaaggtgct gactcgctca 2580
gataagaacc ggggcaagtc cgacaatgtt ccaagcgagg aagtggttaa gaagatgaag 2640
aactactggc gccaattgct taatgccaag ctcatcacac agcgcaagtt tgacaacttg 2700
accaaggccg agcggggagg gctgagtgaa ctcgataagg ctggcttcat caagcgtcaa 2760
ctcgtggaga cgcgacagat cacaaagcac gttgctcaga ttctggactc ccggatgaac 2820
acaaagtacg acgagaatga taagctcatc cgtgaagtta aggtcattac cctcaagtct 2880
aagttggtgt cggatttccg caaggacttc caattttata aggttcggga gatcaacaat 2940
tatcaccatg cacatgatgc gtacctcaac gcagtcgtgg gaactgcgct catcaagaag 3000
tatcccaagt tggagtccga attcgtctac ggggattata aggtttacga cgtccgcaag 3060
atgatcgcca agagtgagca ggaaattggc aaggccacgg ctaagtattt cttttactcc 3120
aacatcatga atttctttaa gacggagatc acactcgcca atggagaaat ccgtaagcga 3180
cctttgattg agaccaacgg cgagactggt gaaatcgttt gggataaggg gcgcgacttc 3240
gctaccgtgc ggaaggttct gagcatgccg caagtcaata tcgtcaagaa aaccgaggtg 3300
cagacaggcg gtttctctaa ggaatcgatt cttccaaagc gtaactctga caagctgatc 3360
gctcgaaaga aggattggga ccccaagaag tatggagggt tcgattctcc tacagtggca 3420
tactcggttc tcgttgtcgc gaaggttgag aagggaaagt ctaagaagct gaagtcggtc 3480
aaggaactgc tcgggatcac cattatggag cgctccagct tcgaaaagaa tcccatcgac 3540
tttctcgagg ccaagggcta taaggaagtc aagaaggatc ttatcattaa gctgcctaag 3600
tactctttgt tcgagcttga aaacggtcga aagcgaatgc tcgcatcggc aggagagttg 3660
cagaagggga atgaattggc acttccctca aagtacgtga acttcctgta tctcgcgtcc 3720
cactacgaga agctgaaggg tagccctgag gacaacgaac agaagcaact ttttgttgag 3780
caacacaagc attatctgga tgagatcatt gaacagattt cagagttcag taagcgcgtc 3840
atcctcgccg atgctaatct cgacaaggtg ttgtcggcct acaacaagca ccgtgacaag 3900
ccgatccgag agcaggctga aaatatcatt catctgttca ccctcactaa cttgggagca 3960
ccagcagcgt tcaagtattt tgatacgaca atcgaccgta agcgatacac gtccacaaag 4020
gaggtgcttg atgcgaccct gattcatcaa tccatcactg ggctctatga aacccgtatc 4080
gaccttagtc aactgggggg cgac 4104
<210> 4
<211> 2081
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
tgtcggtctg tccacgcttc acgtactctt ggacggtatc gcttgtctgc gctcccagcc 60
aagcccttgg tccgacctga gactgccagc agaggcggta agggttgcta aaattgagcc 120
tttgcatcac cgcatgcact gttgccgcaa cctcggccgg gtatggatca cctaaaggag 180
aagttgtcgg ttagctaccg ggagttggtc accaagaccc ttgagactca cctctgttca 240
caacactcat gggcaaactg tgggccgaga acaagagaac cactccattt ctcttatctt 300
ccggataggt tttgagttga tcctcaatgt ttctcgcaaa cgcctccaca aggccagggt 360
gcgtaggcca tctgtcgata acgctccact ggatagctcc ggaagtgtcc acgtttccgt 420
ttgctcgctt gccctccagc cgattcctcc atttccacag ctcattcaga gagctacccg 480
tagtagaaca ggaatactgg gggtattgtg agaacgcgac cgcacgaccg cccttcccat 540
tgccaaagcc atcttccagc aattgtgtgt acatttgttc cgtcagcggg ttggcgtaac 600
ggaaggcaac gtacggcttg tgaggcgcag tctccgggtt gatcttgtcc agcagcttgc 660
acatttcctt gcattggtat tccgaccatt ttcttatggg tgagcctccg ccgatgtccg 720
catactgctt ttgaatcttg ggtgtgcgtc gtttcgaaat aagaggcccg aggtaatgct 780
ggaacttgcc aagaggaatc aaatcgccgt cggccttgaa tagaagtaga atgttagaaa 840
cgtagcaacc agaatgacag cttgccatag tcggagacgt acaaagagcc ggctgaggaa 900
atcctctact tcgtctgtcg tcgagggccc tcccatgttc aggaagacca tggctgtagg 960
gcccttagag cctgttgcat cctgggtaac cggaggcact gttgttgcca gcccacatct 1020
ttgttcttgc ttgtatccga acagggtgcg agaagccggt cgcagcaatt gccggggcag 1080
ggtaaacggg cggcggagag ccatgacagg taattgtact gaattcggtt gacctagtca 1140
atggaggtaa taagaaaaga ccgttcgtat cgcgcaagca gatgaactat tcacgccgca 1200
ttaaatattc aaaagatgga cgagtggcaa gaacaggtag tgggtgtata caacagcgca 1260
aggccttctg gaagctgaaa agtccagaac ggcttgatga cggagcaccg agaccacgac 1320
caactccgac tcccgacagc caatgaccgg ccagctagcg tcatcaatta ccgggcggac 1380
atcacatgat gttcgtgtct ccccgcgtct ttctgcccac cggtttgatc gcgtccctcg 1440
cgaccggatc cagtgacgat atagatagat ctatctccgg ctgcaggcag cagaggccaa 1500
acaggcagac acaacagccc cacttgttcc tggttacgat tcaagttgtc ttaaccttta 1560
tacttccctc tttcaatttc gataatatct tgaatgcttt aaacgattcc acaacattct 1620
actatggcgg acggcaaccc acatcgggaa gatgaggcgg ccgaggaaga agaggagatt 1680
gatgagactg tacgcaaatt tacccatgaa cttggactgg aactctggaa ctgacaataa 1740
gatcagagct acaaaccagt caaagatgcg gtcctcttcg caatcgatgt cagcgattcc 1800
atgttgacgc ctcgcccctc agcagatcct aagaaacaca cccaagaatc acccaccacg 1860
gcagcgctca aatgcgccta tcacttcatg caacaacgaa tcatatcaaa tccacaagac 1920
atgatgggtg ttttgctgtt cgggacccag gcgtccaagt tctttgaaga agatgaagac 1980
agtcggggag acctgtccta ccccaactgc tacctcttca ctgatctgga tgttccttcg 2040
gctcatgagg tcaaaggact tcgagcactg gtagatgatg a 2081
<210> 5
<211> 1967
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
agactcaagg gaggttctat ctccagcgaa agagcaggtc tctatggcaa acgtcctatt 60
ttgcgccaac cagatattca catccagagc gccaaatttc ctctcccggc gtttgttcat 120
cataaccgac aatgacaacc cccatggtga tgataaaacc ctgcggtcag cggcgactgt 180
acgtgctaag gatctttacg atcttggtgt cacaattgag ctgtttccga tctcacgccc 240
tgagcatgag ttcaagaaca gcaagttcta tgacgtaagc tatcatactc tatagcaaag 300
tggcaggggt cgatactcac tacagataca aaggatatta tctacaagtc attgcccagc 360
gatccagagg cgcctgcata tctacaatct gattcaaaag cggcgactgc gaccggggac 420
gggatttcac tcctcaacac gcttctgtcc agtattaatt cgagaacggt tccgcgtcgc 480
actcattttt cgaacatgcc tttagaactt ggcccagact tcagaatttc ggtatcgggc 540
tatatactct tacgaaggca agcgcccgct agaaactcct tcatctggct gaacggcgag 600
aagcctgtgg tcgcgaaagg agtgacttcc cactccgcag atgatactgg ccggactgtc 660
gagaaatggg agatcagaaa ggcatataag ttcggtggcg accaagtaac cttttcgcct 720
gatgagcaga aggcgcttag ggatttcggt gagccagtaa tccgggttat tgggttcaag 780
cctatcactg cgcttccatt ctgggcaaac gtcaagcacc catattttat ctatccatcc 840
gaggaagact atgtaggctc ctcgcgagta ttttccgcat tgcatcagac tcttttgcgt 900
tccaagaaga tggcactcgt ctggttcatt gcacgcaagg gtgctggccc cgttctcgcc 960
gctatgatcg caggcgaaga aaagcttgat gagaatggcg tacaaaaata ccctcctggc 1020
atgtggattc ttcccctccc cttcgcagac gatatccggc agaaccccga aacaacgttg 1080
aatgtcgccc cggagtcatt gattgatcag atgcgcgtga tcgtccagca actgcagctg 1140
ccgaagggag tgtacgagcc tctcaaatac cccaatccat gtaagtcact tctgtcttgc 1200
attgctcgta tacgatgaac gagaagctga cagcccgtga tcagcccttc aatggcatta 1260
ccgcatccta caagctctcg cattagacga agatctcccc gaaaaaccag aagacaaaac 1320
cattccgaaa taccgccaaa tcgacaaggt aaatccacca cacccaacac gagaaataac 1380
cctccaggcg tccaacttac tgacaattgc accacagcgc gccggtgact acgtattatc 1440
ctgggccgac gaactcgaaa agcaatacgc caaaacctca gcagcggccc ctcgcccaac 1500
cagcaccctc gtgaaacgag gatcaaaaga ccgagcaagc gaaaccgagg actccaagcc 1560
atcgaaaaag atcaaggttg aggaagactc tggaagccta gaggaggaag tccgcaggca 1620
tcacaagaag ggaacgctat ccaaggtaag ccaccacagg ctttctacac gtcctcgtga 1680
tggcaaatat gacatcgtat taaccggcgg ttttctagct tacggtcgct atcctcaagg 1740
acttcttgac ttccaatgga cgctcaaatg ccggtaagaa ggcggatctt attgagcggg 1800
tagaggagtt cttggagcag tgacatggcg ggattgttgg attcgctagt gcgcttctgt 1860
tggtggatgt cgttatgtgg tgtcttatct cgggttaggc gttcgtgacc tgaggacatg 1920
agcttgtaat taatgatggg ttggatgtcg cggtattcgt tcttcag 1967
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
gaattccctt gtatctctac acacag 26
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
tgaagaacga ataccgcgac atccaaccca tc 32
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
cccaagaaga agcgcaaggt c 21
<210> 9
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60
ggcaccgagt cggtgc 76
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
agtgggatct caagaactac 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
agtgggatct caagaactac 20

Claims (3)

1.一种可视化筛选曲霉中目的基因突变菌株的方法，其特征在于，是利用CRISPR-Cas9基因编辑技术对曲霉中的前后无表型变化的目的基因kusA与曲霉albA基因进行敲除，通过孢子颜色变化实现对突变菌株的可视化筛选；
所述CRISPR-Cas9基因编辑技术为将Cas9蛋白和sgRNA表达框分别表达在两个质粒上；
所述Cas9蛋白由曲霉启动子Pgla或Ptef启动表达；
所述sgRNA表达框包括PgpdA或Pu6启动子、albA-sgRNA和kusA-sgRNA、gRNA backbone序列sgRNA、终止子TtrpC或Tu6；
所述albA-sgRNA和kusA-sgRNA反向串联；
所述albA-sgRNA的核苷酸序列为AGTGGGATCTCAAGAACTAC；
所述kusA-sgRNA的核苷酸序列为CGAGCACTGGTAGATGATGA；
所述方法为将表达Cas9蛋白的质粒和表达sgRNA表达框的质粒共同转入黑曲霉细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将质粒转入黑曲霉采用的是原生质体转化法。
3.权利要求1或2所述方法在筛选曲霉中目的基因突变菌株方面的应用。
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