JP7011590B2 - 細胞内での遺伝子組換えおよび相同組換えの増加のための保護ｄｎａ鋳型および使用方法 - Google Patents

細胞内での遺伝子組換えおよび相同組換えの増加のための保護ｄｎａ鋳型および使用方法 Download PDF

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Description

本開示は、分子生物学の分野、特に、細胞のゲノムを改変するための方法に関する。詳細には、本発明は、細胞および生物における遺伝子修飾のためのガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓ複合体と組み合わせた保護ＤＮＡ鋳型の使用に関する。
電子的手段によって提出された配列表の参照
配列表の正式な写しは、２０１６年１０月７日に作成されたファイル名「ＣＬ６６４１ＷＯＰＣＴ２＿ＳＥＱＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔ」を備え、１８８キロバイトのサイズを有し、本明細書と同時に提出されるＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出される。このＡＳＣＩＩフォーマット文献に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１０月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／２４０，１４０号明細書の利益を主張するものである。
組み換えＤＮＡ技術は、ＤＮＡ配列およびゲノム配列における標的位置でＤＮＡ配列を修飾（編集）、挿入、および／または欠失することを可能にしてきた。様々な生物における遺伝子発現を阻害するため、ならびに関心対象のポリヌクレオチドの標的修飾を生成するために、部位特異的組換え系を使用する部位特異的組込み技術ならびに他のタイプの組換え技術が使用されてきた。遺伝子発現の阻害は、例えば、結果として遺伝子の「ノックアウト」を生じさせる、遺伝子のＤＮＡ配列を分断する、または欠失させることによって達成できる（非特許文献１）。遺伝子ノックアウトはほとんどの場合、細菌から哺乳類まで広範囲の生物にわたって適用可能な技術である相同組換え（ＨＲ）を介して実施されてきた。遺伝子の「ノックイン」を生じさせるＤＮＡ配列のゲノム内への挿入もまたＨＲによって実施することができる。標的ゲノム摂動を生成するためには、例えばデザイナー・ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングメガヌクレアーゼもしくは誘導型Ｃａｓ９系などのゲノム編集技術を利用することができる。
ＨＲによる遺伝子組換えは強力なツールであるが、複雑で労働集約的手法であり、一般に費用効果の高い方法で拡大することは困難である可能性がある。この困難は、ＨＲが効率的ではない生物においては深刻になる。そのような低い効率のために、開業医は、典型的には、所望のＨＲ事象が発生する細胞を同定することに役立つように選択可能な表現型もしくは外因性マーカーを信頼せざるを得なくなる。
Ａｕｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３６：９２１－９２４
相同組換えのロバスト性を増加させる、および生物のゲノム内の複数の位置をターゲティングするために手頃である、容易に構成できる、拡張可能および適用可能な新規なゲノムエンジニアリング技術に対する必要性が依然としてある。
細胞のゲノム内のヌクレオチド配列を修飾するための組成物および方法が提供される。本方法および組成物は、ヌクレオチド配列を修飾するため、および／または相同組換え修復の頻度を増加させるために、ガイドポリヌクレオチド、保護ポリヌクレオチド修飾鋳型およびＣａｓエンドヌクレアーゼを使用する。本方法は、さらに任意の修飾鋳型のオフサイト組込みの頻度を減少させるために使用できる。本開示は、さらにそのゲノム内に修飾標的部位を含む細胞を選択するための方法およびそのゲノム内の標的部位内に挿入された関心対象のポリヌクレオチドを含む細胞を選択するための方法についても記載する。
本開示の１つの実施形態では、本方法は、そのゲノム内に修飾ヌクレオチド配列を含む細胞を選択するための方法であって：ａ）ガイドポリヌクレオチド、少なくとも１つの保護ポリヌクレオチド修飾鋳型およびＣａｓエンドヌクレアーゼを細胞に提供する工程であって、ここで前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドポリヌクレオチドは前記細胞のゲノム内の標的部位で一本鎖もしくは二本鎖切断を導入することができる複合体を形成することができ、前記保護ポリヌクレオチド修飾鋳型は、前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含む工程；およびｂ）工程（ａ）から前記修飾ヌクレオチド配列を含む細胞を選択する工程を含む方法を含む。保護ポリヌクレオチド修飾鋳型は、その５’末端、３’末端ならびに５’末端ならびに３’末端の両方で少なくとも１つの保護分子を含む線状ポリヌクレオチドであってよい、または環状分子であってよい。保護分子は、アルカンスペーサー、蛍光体、ＮＨＳエステル、ジゴキシゲン、コレステリル－ＴＥＧ、Ｃ６、Ｃ１２、ヘキシニル、Ｏｘｔａｄｉｙｎｙｌ ｄＵＴＰ、ビオチン、ジチオール、逆ジデオキシ－Ｔ修飾またはそれらの任意の１つの組合せからなる群から選択できる。保護ポリヌクレオチド修飾鋳型は、少なくとも１本の鎖の５’末端で少なくとも１つのホスホロチエート結合を含む二本鎖線状分子であってよい。保護ポリヌクレオチド修飾鋳型は、各鎖の５’末端上で３炭素アルカリスペーサーを含む二本鎖線状分子であってよい。保護ポリヌクレオチド鋳型の少なくとも１つのヌクレオチド修飾は、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換え、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入および（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組合せからなる群から選択することができる。
本開示の１つの実施形態では、本方法は、前記細胞内の相同組換え修復（ＨＤＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の頻度を決定する工程をさらに含む。
本開示の１つの実施形態では、本方法は、前記細胞内の保護ポリヌクレオチド修飾鋳型のオフサイト組込みの頻度を決定する工程をさらに含む。前記細胞内の保護ポリヌクレオチド修飾鋳型のオフサイト組込みの頻度は、非保護（コントロール）ポリヌクレオチド修飾鋳型を使用すること以外は、前記方法と全て同一の成分および工程を有するコントロール法に由来するオフサイト組込みの頻度と比較して減少する可能性がある。
本開示の１つの実施形態では、本方法は、そのゲノム内の標的部位に挿入された関心対象のポリヌクレオチドを含む細胞を選択するための方法であって：ａ）ガイドポリヌクレオチド、保護ポリヌクレオチドドナーＤＮＡおよびＣａｓエンドヌクレアーゼを細胞に提供する工程であって、ここで前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドポリヌクレオチドは前記細胞のゲノム内の標的部位での一本鎖もしくは二本鎖切断を導入することができる複合体を形成することができ、ここで前記保護ポリヌクレオチドドナーＤＮＡは前記細胞のゲノム内に導入すべき関心対象のポリヌクレオチドを含む工程；およびｂ）工程（ａ）からそのゲノム内の標的部位内へ挿入された関心対象のポリヌクレオチドを含む細胞を選択する工程を含む方法を含む。
さらに提供されるのは、本明細書に記載した方法によって生成された関心対象の改変標的部位または関心対象の改変ポリヌクレオチドを有する核酸構築物、酵母、真菌、微生物、植物、植物細胞、外植体、種子および穀粒である。本明細書では、本開示の方法および組成物の追加の実施形態を示す。
図面および配列表の簡単な説明
本開示は、本出願の一部を形成する下記の詳細な説明ならびに本明細書に付随する図面および配列表から、より十分に理解することができよう。本明細書に添付した配列の説明および配列表は、米国特許法第１章８２１節～第１章８２５節に規定された特許出願におけるヌクレオチドおよびアミノ酸配列の開示を規定する規則を順守している。配列の説明は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許法第１章８２１節～第１章８２５節に規定されたアミノ酸についての３文字コードを含有する。
高スループットｇＲＮＡクローニングカセット（例えば、それには限定されないが、ｐＲＦ２９１上の配列番号１２）の構造を示す図である。カセットは、プロモーター（黒一色で示されている）、５’リボザイムをコードするＤＮＡ（灰色一色で示されている）、２つの制限部位に隣接された逆選択カセット（全体に横線フィル（塗りつぶし）で示されている）、ＣＥＲドメインをコードするＤＮＡ（ＣＥＲとして示されている）および転写ターミネーター（ドットフィル）から構成される。正確なオーバーハング末端（ＶＴ、縦縞フィルとして示されている）を備える可変標的ドメインを含有するＤＮＡ二本鎖が制限酵素およびＤＮＡリガーゼの存在下でカセットを含有するプラスミドと混合されると、逆選択カセット（横縞フィル）はＶＴドメイン（縦縞）と置き換えられる可能性がある。これらの事象は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは逆選択カセットの非存在を選択することによって選択することができる。産物は、機能的ｇＲＮＡ発現カセットである。 配列番号１９および配列番号２０を含む高スループットｐＲＦ２９１とともに使用するための可変ターゲティングドメイン二本鎖（配列番号１９および配列番号２０）を示す図である。 図３Ａ－３Ｄは、様々なポリヌクレオチド修飾鋳型を示す図である。図３Ａは、相同性アーム１（黒一色フィル）および相同性アーム２（斜め縞フィル）に隣接されたＣＡＮ１オープンリーディングフレーム（縦縞フィル）を備える野生型（ＷＴ）ＣＡＮ１遺伝子座を示している。図３Ｂは、２つの相同性アーム（アーム１、黒一色フィルおよびアーム２、斜め縞フィル）から構成される非保護（未修飾）ポリヌクレオチド修飾鋳型を示している。図３Ｃは、ＤＮＡ（ドットフィル）への所望の修飾（保護）を含有する５’末端および３’末端を備える２つの相同性アーム（アーム１、黒一色フィルおよびアーム２、斜め縞フィル）から構成される保護ポリヌクレオチド修飾鋳型を示している。図３Ｄは、環状分子内に作製されている２つの相同性アーム（アーム１、黒一色のフィルおよびアーム２、斜め縞フィル）から構成される保護ポリヌクレオチド修飾鋳型を示している。 ＷＴ ＵＲＡ３遺伝子座についての予測サイズでのバンドを備えるインデル突然変異を含有するコロニーおよび予測されたより小さなバンドを含有するＨＤＲによるＵＲＡ３ ＯＲＦの欠失を含有するコロニーを示している、ｐＲＦ４３７を用いて処理された細胞由来のＵＲＡ３遺伝子座の代表的なＰＣＲを示す図である。
Figure 0007011590000001
Figure 0007011590000002
Figure 0007011590000003
Figure 0007011590000004
細胞のゲノム内のヌクレオチド配列を修飾するための組成物および方法が提供される。本方法および組成物は、ヌクレオチド配列を修飾するため、および／または相同組換え修復の頻度を増加させるために、ガイドポリヌクレオチド、保護ポリヌクレオチド修飾鋳型およびＣａｓエンドヌクレアーゼを利用する。本方法は、さらに任意の修飾鋳型のオフサイト組込みの頻度を減少させるために使用できる。
相同組換え修復（ＨＤＲ）および結果として標的化ＤＮＡ切断の修復に基づく遺伝子編集に比して非相同末端結合（ＮＨＥＪ）が優勢である、それらに限定されないが、例えば非従来型酵母、植物、動物などの多数の細胞型は、ポリヌクレオチド修飾鋳型に基づく精密な遺伝子編集に加えてＮＨＥＪ突然変異の高いバックグラウンドを有するであろう。本明細書では、精密な編集（ヌクレオチド修飾）をもたらすＨＤＲの頻度を増加させる、および／または保護修飾鋳型のオフサイト組込みを減少させるために保護ポリヌクレオチド修飾鋳型を使用する方法および組成物について記載する。
引用する全ての特許文献および非特許文献の開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書の用語「細胞」は、原核細胞または真核細胞などの任意のタイプの細胞を意味する。真核細胞は、核および他の膜で包まれた構造（細胞小器官）を有するが、他方、原核細胞には核がない。所定の実施形態における細胞は、哺乳類細胞または非哺乳類細胞であってよい。非哺乳類細胞は、真核性であっても原核性であってもよい。例えば、本明細書の非哺乳類細胞は、微生物細胞、または例えば植物、昆虫、線虫、鳥類、両生類、爬虫類もしくは魚類などの非哺乳類多細胞生物の細胞を意味することができる。本明細書の微生物細胞は、例えば、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、原核細胞、原生生物細胞（例えば、藻類細胞）、鞭毛虫細胞、黄色植物細胞もしくは卵菌細胞を意味することができる。本明細書の原核細胞は、例えば、細菌細胞もしくは古細菌細胞を意味することができる。
本明細書の用語「酵母」は、主として単細胞の形態で存在する真菌種を意味する。または、酵母は、「酵母細胞」と呼ぶこともできる。本明細書の酵母は、例えば、従来型酵母または非従来型酵母のいずれかであると特徴付けることができる。
本明細書の用語「従来型酵母」（「モデル酵母」）は、一般に、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属もしくはシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母種を意味する。所定の実施形態における従来型酵母は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって媒介される修復プロセスよりも相同組換え（ＨＲ）ＤＮＡ修復プロセスを好む酵母である。
本明細書の用語「非従来型酵母」は、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、「出芽酵母」、「パン酵母」および／または「ビール酵母」としても公知であるＳ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））もしくはシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、分裂酵母としても公知であるＳ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ））などの「従来型」（「モデル」）酵母ではない任意の酵母を意味する。本明細書の所定の態様における非従来型酵母は、無性生殖（アナモルフィック）もしくは有性生殖（テレオモルフィック）で繁殖する酵母であってよい。本明細書の非従来型酵母は、典型的には、単細胞の形態で存在するが、これらの酵母の所定のタイプは、任意選択的に、仮性菌糸（出芽細胞が連結した糸）を形成することができる。なおさらに他の態様では、非従来型酵母は一倍体もしくは二倍体であってよい、および／またはこれらの倍数体形のいずれかで存在する能力を有していてよい。非従来型酵母は、参照により本明細書に組み込まれるＮｏｎ－Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｙｅａｓｔｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｋ．Ｗｏｌｆ，Ｋ．Ｄ．Ｂｒｅｕｎｉｇ，Ｇ．Ｂａｒｔｈ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２００３）およびＳｐｅｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５８：１４７－１５６）において記載されている。所定の実施形態における非従来型酵母は、追加して（あるいは）、ＨＲによって媒介される修復プロセスよりもＮＨＥＪ ＤＮＡ修復プロセスを好む酵母である可能性がある。この考えに沿った非従来型酵母の定義－ＨＲよりもＮＨＥＪを好む傾向－は、参照により本明細書に組み込まれるＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８：ｅ５７９５２）によって詳細に開示されている。本明細書の好ましい非従来型酵母は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属の酵母（例えば、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））である。
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座（クラスター化等間隔短鎖回分リピート）（スペーサー散在性ダイレクトリピートとしても公知である）は、１ファミリーのＤＮＡ遺伝子座を構成する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、部分的に回文性である短鎖の高度に保存されたＤＮＡリピート（典型的には、２４～４０ｂｐであり、１～１４０回繰り返される－ＣＲＩＳＰＲリピートとも呼ばれる）からなる。反復配列（通常は種特異的）の隙間は、固定長の可変配列によって埋められる（典型的には、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に依存して、２０～５８ｂｐ（２００７年３月１日に公開された国際公開第２００７／０２５０９７号パンフレット））。細菌および古細菌は、短鎖ＲＮＡを使用して外来核酸の分解を指令するために、クラスター化等間隔短鎖回分リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系と呼ばれる適応的免疫防御を進化させてきた（（（Ｈｏｒｖａｔｈ ａｎｄ Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７：１６７－１７０；Ｋａｒｇｉｎｏｖ ａｎｄ Ｈａｎｎｏｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ３７：７－１９）。２００７年３月１日に公開された国際公開第２００７／０２５０９７号パンフレット）。細菌由来のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＣａｓエンドヌクレアーゼをそのＤＮＡ標的に誘導するためにｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）およびｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）を使用する。ｃｒＲＮＡは、二本鎖ＤＮＡの１本のストランドに相補的な領域およびＣａｓエンドヌクレアーゼにＤＮＡ標的を切断するように指令するＲＮＡ二本鎖を形成するｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）と塩基対合する領域を含有する。
Ｃａｓ遺伝子には、一般に、隣接ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に結合した、関連した、もしくは近接する、または近傍にある遺伝子が含まれる。用語「Ｃａｓ遺伝子」、「ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子」は、本明細書では互換的に使用される。Ｃａｓタンパク質ファミリーの包括的総説は、Ｈａｆｔ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ １（６）：ｅ６０。ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｃｂｉ．００１００６０に提示されている。本明細書に記載したように、４つの以前から公知の遺伝子ファミリーに加えて、４１種のＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子ファミリーが記載されている。この文献は、ＣＲＩＳＰＲ系が、様々な反復パターン、遺伝子セットおよび種の範囲を備える様々なクラスに属することを証明している。所定のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座でのＣａｓ遺伝子の数は、種間で異なる可能性がある。
本明細書の用語「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ」は、Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子によってコードされるタンパク質を意味する。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、好適なポリヌクレオチド成分と複合した場合は、特異的ＤＮＡ標的配列の全部もしくは一部を認識する、結合するおよび任意選択的にニッキングもしくは切断することができる。
本明細書で使用する用語「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体」、「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系」、「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓ複合体」、「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓ系」、「誘導型Ｃａｓ系」は、本明細書では互換的に使用され、複合体を形成することができる少なくとも１つのガイドポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのＣａｓエンドヌクレアーゼを意味しており、ここで前記ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識する、結合する、および任意選択的にニッキングもしくは切断する（一本鎖もしくは二本鎖切断を導入する）ことを指令することができる。本明細書のガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、Ｃａｓタンパク質および例えばＩ型、ＩＩ型もしくはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系などの４つの公知のＣＲＩＳＰＲ系（Ｈｏｒｖａｔｈ ａｎｄ Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７：１６７－１７０）のいずれかの好適なポリヌクレオチド成分を含むことができる。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは標的配列でＤＮＡ二本鎖を解き、およびＣａｓタンパク質との複合体中にある（例えばｃｒＲＮＡもしくはガイドＲＮＡなどであるが、それらに限定されない）ポリヌクレオチドによる標的配列の認識によって媒介されるように、任意選択的に少なくとも１つのＤＮＡ鎖を切断する。Ｃａｓエンドヌクレアーゼによる標的配列のそのような認識および切断は、典型的には、正確なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が、ＤＮＡ標的配列の３’末端に、またはＤＮＡ標的配列の３’末端に隣接して位置する場合に発生する。または、本明細書のＣａｓタンパク質には、ＤＮＡ切断活性もしくはニッキング活性が欠如する可能性があるが、それでも好適なＲＮＡ成分と複合体化されると、ＤＮＡ標的配列に特異的に結合する可能性がある。（さらに、どちらも参照により全体として本明細書に組み込まれる２０１５年３月１９日に公開された米国特許出願公開第２０１５－００８２４７８Ａ１号明細書および２０１５年２月２６日に公開された米国特許出願公開第２０１５－００５９０１０Ａ１号明細書を参照されたい）。
ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ＤＮＡ標的配列の一方または両方の鎖を切断することができる。ＤＮＡ標的配列の両方の鎖を切断できるガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、典型的には、そのエンドヌクレアーゼドメインの全てを機能的な状態で有するＣａｓタンパク質（例えば、各エンドヌクレアーゼドメインにおける一部または全ての活性を保持する野生型エンドヌクレアーゼドメインもしくはその変異体）を含む。したがって、Ｃａｓタンパク質の各エンドヌクレアーゼドメインの一部または全ての活性を保持する野生型Ｃａｓタンパク質（例えば、本明細書において開示したＣａｓ９タンパク質）またはその変異体は、ＤＮＡ標的配列の両方の鎖を切断することができるＣａｓエンドヌクレアーゼの好適な例である。機能的ＲｕｖＣおよびＨＮＨヌクレアーゼドメインを含むＣａｓ９タンパク質は、ＤＮＡ標的配列の両方の鎖を切断することができるＣａｓタンパク質の例である。ＤＮＡ標的配列の１本の鎖を切断することができるガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、本明細書においてニッカーゼ活性（例えば、部分的切断能力）を有すると特徴付けることができる。Ｃａｓニッカーゼは、典型的にはＣａｓがＤＮＡ標的配列の１本の鎖だけを切断する（すなわち、ニックを作成する）ことを許容する１つの機能的エンドヌクレアーゼドメインを含む。例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼは、（ｉ）突然変異による機能不全ＲｕｖＣドメインおよび（ｉｉ）機能的ＨＮＨドメイン（例えば、野生型ＨＮＨドメイン）を含むことができる。また別の例として、Ｃａｓ９ニッカーゼは、（ｉ）機能的ＲｕｖＣドメイン（例えば、野生型ＲｕｖＣドメイン）および（ｉｉ）突然変異による機能不全ＨＮＨドメインを含むことができる。本明細書で使用するために好適なＣａｓ９ニッカーゼの非限定的な例は、参照により本明細書に組み込まれるＧａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０９：Ｅ２５７９－Ｅ２５８６）、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６－８２１）、Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９：９２７５－９２８２）および米国特許出願公開第２０１４／０１８９８９６号明細書によって開示されている。
ＤＮＡターゲティングの特異性を増加させるためには、一対のＣａｓ９ニッカーゼを使用することができる。一般に、これは、異なるガイド配列を備えるＲＮＡ成分と結び付けられることによって、所望のターゲティングのためにその領域内の逆鎖上のＤＮＡ配列を標的としてすぐ近くでニックを入れる２つのＣａｓ９ニッカーゼを提供することによって実施できる。各ＤＮＡ鎖のそのような近隣の切断は、二本鎖切断（すなわち、一本鎖オーバーハングを備えるＤＳＢ）を作り出し、これは次に、非相同末端結合であるＮＨＥＪ（インデル形成をもたらす）または相同組換えであるＨＲのための基質として認識される。これらの実施形態における各ニックは、例えば、相互から少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００（または５～１００の間の任意の整数）塩基離れていてよい。本明細書の１つまたは２つのＣａｓ９ニッカーゼタンパク質は、Ｃａｓ９ニッカーゼ対に使用することができる。例えば、突然変異ＲｕｖＣドメインを備えるが、機能的ＨＮＨドメインを備えていないＣａｓ９ニッカーゼ（すなわち、Ｃａｓ９ ＨＮＨ＋／ＲｕｖＣ－）を使用することができよう（例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ ＨＮＨ＋／ＲｕｖＣ－）。各Ｃａｓ９ニッカーゼ（例えば、Ｃａｓ９ ＨＮＨ＋／ＲｕｖＣ－）は、各ニッカーゼを各特定ＤＮＡ部位にターゲットするガイドＲＮＡ配列を備える本明細書の好適なＲＮＡ成分を使用することによって、相互に近隣の（最大で１００塩基対離れている）特定ＤＮＡ部位に方向付けられるであろう。
Ｃａｓタンパク質は、１つ以上の異種タンパク質ドメイン（例えば、Ｃａｓタンパク質に加えて１つ、２つ、３つ以上のドメイン）を含む融合タンパク質の一部であってよい。そのような融合タンパク質は、任意の追加のタンパク質配列、および任意選択的に任意の２つのドメイン間に、例えばＣａｓと第１異種ドメインとの間にリンカー配列を含む可能性がある。本明細書のＣａｓタンパク質に融合させることのできるタンパク質ドメインの例としては、制限なく、エピトープタグ（例えば、ヒスチジン［Ｈｉｓ］、Ｖ５、ＦＬＡＧ、インフルエンザヘマグルチニン［ＨＡ］、ｍｙｃ、ＶＳＶ－Ｇ、チオレドキシン［Ｔｒｘ］）、レポーター（例えば、グルタチオン－５－トランスフェラーゼ［ＧＳＴ］、ホースラディッシュペルオキシダーゼ［ＨＲＰ］、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ［ＣＡＴ］、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ［ＧＵＳ］、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質［ＧＦＰ］、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質［ＣＦＰ］、黄色蛍光タンパク質［ＹＦＰ］、青色蛍光タンパク質［ＢＦＰ］）、および以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性（例えば、ＶＰ１６もしくはＶＰ６４）、転写抑制活性、転写遊離因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性および核酸結合活性の１つ以上を有するドメインが挙げられる。Ｃａｓタンパク質は、さらにＤＮＡ分子もしくは他の分子、例えばマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ－タグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、ＧＡＬ４Ａ ＤＮＡ結合ドメインおよび単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＶＰ１６と結合するタンパク質と融合することができる。
本明細書のＣａｓタンパク質は、下記の属：アエロピルム（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）属、ピロバクルム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）属、スルフォロブス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）属、アルカエオグロブス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）属、ハロアーキュラ（Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ）属、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎ）属、メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、メタノサルシーナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）属、メタノピルス（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）属、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ピクロフィルス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）属、サーニオプラスニア（Ｔｈｅｒｎｉｏｐｌａｓｎｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、アクゥイフルクス（Ａｑｕｉｆｒｘ）属、ポルフロモナス（Ｐｏｒｐｈｖｒｏｍｏｎａｓ）属、クロロビウム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）属、サームス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、クロストリディウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属、フゾバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アザーカス（Ａｚａｒｃｕｓ）属、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、ニトロソモナス（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）属、デサルフォビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）属、ジオバクター（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）属、マイクロコッカス（Ｍｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、ウォリネラ（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、フォトバクテリウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）属、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属もしくはサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属のいずれか由来であってよい。または、本明細書のＣａｓタンパク質は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／００９３６１７号明細書に開示された配列番号４６２～４６５、４６７～４７２、４７４～４７７、４７９～４８７、４８９～４９２、４９４～４９７、４９９～５０３、５０５～５０８、５１０～５１６または５１７～５２１のいずれかによってコードされてもよい。
所定の実施形態におけるガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ＤＮＡ標的部位配列に結合することができるが、標的部位配列ではどの鎖も切断しない。そのような複合体は、そのヌクレアーゼドメインの全部が突然変異して機能不全であるＣａｓタンパク質を含んでいてよい。例えば、ＤＮＡ標的部位配列に結合することができるが、標的部位配列のいかなる鎖も切断しない本明細書のＣａｓ９タンパク質は、突然変異機能不全ＲｕｖＣドメインおよび突然変異機能不全ＨＮＨドメインの両方を含むことができる。標的ＤＮＡ配列に結合するがこれを切断しない本明細書のＣａｓタンパク質は、例えば、遺伝子発現を調節するために使用することができ、その場合にはＣａｓタンパク質は、転写因子（もしくはその一部）（例えば、本明細書に開示したいずれかなどのリプレッサーもしくは活性化因子）と融合させることができよう。
Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、例えば２００７年３月１日に公開され、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／０２５０９７号パンフレットの配列番号４６２、４７４、４８９、４９４、４９９、５０５および５１８に列挙されたＣａｓ９遺伝子を含むがそれらに限定されないＩＩ型Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子であってよい。Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、Ｃａｓコドン領域の上流のＳＶ４０核ターゲティングシグナルおよびＣａｓコドン領域の下流の両方向性ＶｉｒＤ２核局在化シグナル（Ｔｉｎｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７４４２－６）に機能的に結合することができる。本明細書の「Ｃａｓ９」（以前は、Ｃａｓ５、Ｃｓｎ１もしくはＣｓｘ１２と呼ばれた）は、ＤＮＡ標的配列の全てまたは一部を特異的に認識して切断するために、ｃｒヌクレオチドおよびｔｒａｃｒヌクレオチドと、または単一ガイドポリヌクレオチドとの複合体を形成するＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣａｓエンドヌクレアーゼを意味する。Ｃａｓ９タンパク質は、それぞれが標的配列で１本のＤＮＡ鎖を切断することができるＲｕｖＣヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ（Ｈ－Ｎ－Ｈ）ヌクレアーゼドメインを含む（両方のドメインの協調活動は、ＤＮＡ二本鎖の切断をもたらすが、他方一方のドメインの活性はニックをもたらす）。一般に、ＲｕｖＣドメインは、サブドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩを含むが、ここでドメインＩは、Ｃａｓ９のＮ末端の近くに位置し、サブドメインＩＩおよびＩＩＩは、ＨＮＨドメインに隣接してタンパク質の中央に位置する（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ １５７：１２６２－１２７８））。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、少なくとも１つのポリヌクレオチド成分との複合体中でＣａｓ９エンドヌクレアーゼを利用するＤＮＡ切断系を含む。例えば、Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と複合することができる。また別の例では、Ｃａｓ９は、単一ガイドＲＮＡと複合することができる。
本明細書に記載したＣａｓ９タンパク質ならびに本明細書の所定の他のＣａｓタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｓ．パラサングイニス（Ｓ．ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、Ｓ．オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ）、Ｓ．サリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｓ．マカカエ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ）、Ｓ．ディスガラクティエ（Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｓ．アンギノサス（Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）、Ｓ．コンステラトゥス（Ｓ．ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ）、Ｓ．シュードポルシヌス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ））、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属（例えば、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ））、スピロプラズマ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ）属（例えば、Ｓ．アピス（Ｓ．ａｐｉｓ）、Ｓ．シルフィディコーラ（Ｓ．ｓｙｒｐｈｉｄｉｃｏｌａ））、ペプトストレプトコッカス科（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、アトポビウム（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ）属、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属（例えば、Ｐ．カトニエ（Ｐ．ｃａｔｏｎｉａｅ））、プレボテーラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属（例えば、Ｐ．インターメディア（Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、ベイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）属、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）属（例えば、Ｔ．ソクランスキィ（Ｔ．ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ）、Ｔ．デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ））、カプノシトファガ（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）属、フィネゴルディア（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ）属（例えば、Ｆ．マグナ（Ｆ．ｍａｇｎａ））、コリオバクテリア（Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科（例えばＣ．バクテリウム（Ｃ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ））、オルセネラ（Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ）属（例えば、Ｏ．プロフューザ（Ｏ．ｐｒｏｆｕｓａ））、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属（例えば、Ｈ．スプトルム（Ｈ．ｓｐｕｔｏｒｕｍ）、Ｈ．ピットマニエ（Ｈ．ｐｉｔｔｍａｎｉａｅ））、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属（例えば、Ｐ．ベッティエ（Ｐ．ｂｅｔｔｙａｅ））、オリビバクター（Ｏｌｉｖｉｂａｃｔｅｒ）属（例えば、Ｏ．シティエンシス（Ｏ．ｓｉｔｉｅｎｓｉｓ））、エピリソニモナス（Ｅｐｉｌｉｔｈｏｎｉｍｏｎａｓ）属（例えばＥ．テナックス（Ｅ．ｔｅｎａｘ））、メソニア（Ｍｅｓｏｎｉａ）属（例えば、Ｍ．モビリス（Ｍ．ｍｏｂｉｌｉｓ））、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属（例えばＢ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ））、アクイマリーナ（Ａｑｕｉｍａｒｉｎａ）属（例えば、Ａ．ムエレリ（Ａ．ｍｕｅｌｌｅｒｉ））、クリセオバクテリウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（例えば、Ｃ．パルストレ（Ｃ．ｐａｌｕｓｔｒｅ））、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属（例えば、Ｂ．グラミニソルベンス（Ｂ．ｇｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ））、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属（例えば、Ｎ．メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属（例えば、Ｆ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ））またはフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（例えば、Ｆ．フリギダリウム（Ｆ．ｆｒｉｇｉｄａｒｉｕｍ）、Ｆ．ソリ（Ｆ．ｓｏｌｉ））に由来してよい。本明細書の所定の態様では、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９が好ましい。また別の例として、Ｃａｓ９タンパク質は、参照により本明細書に組み込まれるＣｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：７２６－７３７）の中に開示されたＣａｓ９タンパク質のいずれかであってよい。
したがって、本明細書のＣａｓ９タンパク質の配列は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｇ３ＥＣＲ１（Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、ＷＰ＿０２６７０９４２２、ＷＰ＿０２７２０２６５５、ＷＰ＿０２７３１８１７９、ＷＰ＿０２７３４７５０４、ＷＰ＿０２７３７６８１５、ＷＰ＿０２７４１４３０２、ＷＰ＿０２７８２１５８８、ＷＰ＿０２７８８６３１４、ＷＰ＿０２７９６３５８３、ＷＰ＿０２８１２３８４８、ＷＰ＿０２８２９８９３５、Ｑ０３ＪＩ６（Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、ＥＧＰ６６７２３、ＥＧＳ３８９６９、ＥＧＶ０５０９２、ＥＨＩ６５５７８（Ｓ．シュードポルシヌス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ））、ＥＩＣ７５６１４（Ｓ．オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ））、ＥＩＤ２２０２７（Ｓ．コンステラツス（Ｓ．ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ））、ＥＩＪ６９７１１、ＥＪＰ２２３３１（Ｓ．オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ））、ＥＪＰ２６００４（Ｓ．アンギノサス（Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ））、ＥＪＰ３０３２１、ＥＰＺ４４００１（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＰＺ４６０２８（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＱＬ７８０４３（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ＥＱＬ７８５４８（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＲＬ１０５１１、ＥＲＬ１２３４５、ＥＲＬ１９０８８（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＳＡ５７８０７（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＳＡ５９２５４（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＳＵ８５３０３（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＴＳ９６８０４、ＵＣ７５５２２、ＥＧＲ８７３１６（Ｓ．ディスガラクトシエ（Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ））、ＥＧＳ３３７３２、ＥＧＶ０１４６８（Ｓ．オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ））、ＥＨＪ５２０６３（Ｓ．マカカエ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ））、ＥＩＤ２６２０７（Ｓ．オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ））、ＥＩＤ３３３６４、ＥＩＧ２７０１３（Ｓ．パラサングイニス（Ｓ．ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ））、ＥＪＦ３７４７６、ＥＪＯ１９１６６（ストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＢＳ３５ｂ）、ＥＪＵ１６０４９、ＥＪＵ３２４８１、ＹＰ＿００６２９８２４９、ＥＲＦ６１３０４、ＥＲＫ０４５４６、ＥＴＪ９５５６８（Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ））、ＴＳ８９８７５、ＥＴＳ９０９６７（ストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＳＲ４）、ＥＴＳ９２４３９、ＥＵＢ２７８４４（ストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｐ．）ＢＳ２１）、ＡＦＪ０８６１６、ＥＵＣ８２７３５（ストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＣＭ６）、ＥＷＣ９２０８８、ＥＷＣ９４３９０、ＥＪＰ２５６９１、ＹＰ＿００８０２７０３８、ＹＰ＿００８８６８５７３、ＡＧＭ２６５２７、ＡＨＫ２２３９１、ＡＨＢ３６２７３、Ｑ９２７Ｐ４、Ｇ３ＥＣＲ１もしくはＱ９９ＺＷ２（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））に開示されたＣａｓ９アミノ酸配列のいずれかを含むことができる。これらのＣａｓ９タンパク質配列のいずれの変異体を使用することができるが、本明細書のＲＮＡ成分と結び付けられた場合は、ＤＮＡに向かう特異的結合活性、および任意選択的にエンドヌクレアーゼ分解活性を有していなければならない。そのような変異体は、参照Ｃａｓ９のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含んでいてよい。
または、本明細書のＣａｓ９タンパク質は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／００９３６１７号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）に開示された、配列番号４６２（Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、４７４（Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、４８９（Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ））、４９４（Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ））、４９９（Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ））、５０５（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））もしくは５１８（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））のいずれかによってコードされてもよい。または、さらに、Ｃａｓ９タンパク質は、例えば、上記のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含んでいてよい。そのような変異Ｃａｓ９タンパク質は、本明細書のＲＮＡ成分と結び付けられた場合は、ＤＮＡに向けた特異的な結合活性、および任意選択的に切断またはニッキング活性を有していなければならない。
本明細書で使用されるＣａｓタンパク質（例えばＣａｓ９）の起源は、それにＲＮＡ成分が由来する同一種であってもよい、または異なる種由来であってもよい。例えば、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）もしくはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））に由来するＣａｓ９タンパク質を含むＲＧＥＮは、同一ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種に由来する配列（例えば、ｃｒＲＮＡ反復配列、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）を有する少なくとも１つのＲＮＡ成分と複合体化することができる。さらに、本明細書で使用されるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）の起源は、それにＲＮＡ成分が由来するのとは異なる種であってよい（Ｃａｓタンパク質およびＲＮＡ成分は、相互に異種であってよい）；そのような異種起Ｃａｓ／ＲＮＡ成分ＲＧＥＮは、ＤＮＡターゲティング活性を有するはずである。
特定の標的ＤＮＡ配列に向かう本明細書のＣａｓタンパク質の結合活性および／またはエンドヌクレオチド鎖切断活性の決定は、例えば参照により本明細書に組み込まれる、例えば米国特許第８６９７３５９号明細書に開示されるような、当技術分野において公知の任意の好適なアッセイによって評価することができる。例えば、非従来型酵母中でＣａｓタンパク質および好適なＲＮＡ成分を発現させ、その後にインデルの存在について予測ＤＮＡ標的部位を試験することによって決定することができる（この特定のアッセイにおけるＣａｓタンパク質は、完全なエンドヌクレオチド鎖切断活性［二本鎖切断活性］を有するであろう）。予測標的部位でのインデルの存在についての試験は、例えば、ＤＮＡシークエンシング法を介して、または標的配列の機能の消失についてアッセイすることによるインデル形成を推測することによって実施することができよう。また別の例では、Ｃａｓタンパク質活性は、標的部位もしくは標的部位の近くにある配列に相同である配列を含むドナーＤＮＡが提供されている非従来型酵母においてＣａｓタンパク質および好適なＲＮＡ成分を発現させることによって決定することができる。標的部位でのドナーＤＮＡ配列（例えば、ドナーと標的配列との上首尾のＨＲによって予測されるであろう配列）の存在は、ターゲティングが発生したことを示すであろう。
例えばＣａｓ９などの本明細書のＣａｓタンパク質は、典型的には、異種核局在化配列（ＮＬＳ）をさらに含む。本明細書の異種ＮＬＳアミノ酸配列は、例えば、本明細書の酵母細胞の核内で検出可能な量のＣａｓタンパク質の蓄積を駆動するために十分な強度の配列であってよい。ＮＬＳは、塩基性の正荷電残基（例えば、リシンおよび／またはアルギニン）の１つ（一方向性）もしくは複数（例えば、両方向性）の短鎖配列（例えば、２～２０残基）を含んでいてよく、Ｃａｓアミノ酸配列中のどこであってもよいが、タンパク質表面上で曝露させられるように位置していてよい。ＮＬＳは、例えば、本明細書のＣａｓタンパク質のＮ末端もしくはＣ末端に機能的に結合させられてよい。２つ以上のＮＬＳ配列は、例えばＣａｓタンパク質のＮ末端およびＣ末端の両方などで、Ｃａｓタンパク質に結合させることができる。本明細書の好適なＮＬＳ配列の非限定的な例としては、参照によりどちらも本明細書に組み込まれる米国特許第６６６０８３０号明細書および同第７３０９５７６号明細書（例えば、その中の表１）に開示されたＮＬＳ配列が挙げられる。
Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ポリペプチドの修飾形を含むことができる。Ｃａｓ９ポリペプチドの修飾形は、Ｃａｓ９タンパク質の天然型ヌクレアーゼ活性を減少させるアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入もしくは置換）を含むことができる。例えば、一部の態様では、Ｃａｓ９タンパク質の修飾形は、対応する野生型Ｃａｓ９ポリペプチドの５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満もしくは１％未満のヌクレアーゼ活性を有する（２０１４年３月６日に公開された米国特許出願公開第２０１４００６８７９７Ａ１号明細書）。一部の場合には、Ｃａｓ９ポリペプチドの修飾形は、実質的なヌクレアーゼ活性を有しておらず、触媒的「不活性化Ｃａｓ９」もしくは「非活性化ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）」と呼ばれる。触媒的不活性化Ｃａｓ９変異体には、ＨＮＨおよびＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン内で突然変異を含有するＣａｓ９変異体が含まれる。これらの触媒的不活性化Ｃａｓ９変異体は、ｓｇＲＮＡと相互作用してｉｎ ｖｉｖｏの標的部位に結合することができるが、標的ＤＮＡのいずれかの鎖を切断することはできない。
触媒的不活性Ｃａｓ９は、異種配列に融合することができる（２０１４年３月６日に公開された米国特許出願公開第２０１４００６８７９７Ａ１号明細書）。好適な融合パートナーには、標的ＤＮＡと関連する標的ＤＮＡもしくはポリペプチド（例えば、ヒストンもしくは他のＤＮＡ結合タンパク質）に直接的に作用することによって転写を間接的に増加させる活性を提供するポリペプチドが含まれるがそれには限定されない。追加の好適な融合パートナーには、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性もしくは脱ミリストイル化活性を提供するポリペプチドが含まれるがそれらに限定されない。また別の好適な融合パートナーには、標的核酸の転写の増加（例えば、転写活性化因子もしくはその断片、転写活性化因子、小分子／薬物応答転写調節因子などを動員するタンパク質もしくはその断片）を直接的に提供するポリペプチドが含まれるがそれには限定されない。触媒的不活性Ｃａｓ９は、さらに二本鎖切断を生成するためにＦｏｋＩヌクレアーゼに融合させることもできる（Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ ３２，ｎｕｍｂｅｒ ６，Ｊｕｎｅ ２０１４）。
本明細書に開示の方法では、任意の誘導型エンドヌクレアーゼを使用することができる。そのようなエンドヌクレアーゼには、限定はされないが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼおよびＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが含まれるがそれらに限定されない。現在まで、特異的ＰＡＭ配列を認識できる（例えば、２０１４年３月１２日に出願された米国特許出願第１４／７７２７１１号明細書およびＺｅｔｓｃｈｅ Ｂ ｅｔ ａｌ．２０１５．Ｃｅｌｌ １６３，１０１３を参照されたい）および特定の位置で標的ＤＮＡを切断できる、多数のエンドヌクレアーゼが記載されてきた。誘導型Ｃａｓ系を利用する本明細書に記載の方法および実施形態に基づくと、現在では、これらの方法が任意の誘導型エンドヌクレアーゼ系を利用できるようにこれらの方法を必要に合わせて調整することができると理解されている。
Ｃａｓエンドヌクレアーゼの用語「機能的断片」、「機能的に同等である断片」および「機能的同等の断片」は、本明細書では互換的に使用され、標的部位を認識する、結合する、および任意選択的にニッキングもしくは切断する能力が保持されている（標的部位内に一本鎖もしくは二本鎖切断を導入する）本開示のＣａｓエンドヌクレアーゼ配列の一部分もしくは部分配列を意味する。
Ｃａｓエンドヌクレアーゼの用語「機能的変異体」、「機能的に同等である変異体」および「機能的同等の変異体」は、本明細書では互換的に使用され、標的部位を認識する、結合する、および任意選択的にニッキングもしくは切断する能力が保持されている（標的部位内に一本鎖もしくは二本鎖切断を導入する）本開示のＣａｓエンドヌクレアーゼ配列の変異体を意味する。断片および変異体は、例えば部位特異的突然変異誘発法および合成構築法などの方法によって入手できる。
Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子には、原理上は標的とすることができるＮ（１２－３０）ＮＧＧ形の任意のゲノム配列を認識できるヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）コドン最適化ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９遺伝子またはブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）Ｍｌｃ３、ラクトバチルス・ロシエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓｉａｅ）ＤＳＭ１５８１４、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）ＳＬ４、ラクトバチルス・ノデンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｎｏｄｅｎｓｉｓ）ＪＣＭ１４９３２、スルフロスピリルム種（Ｓｕｌｆｕｒｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ．）ＳＣＡＤＣ、ビフィドバクテリウム・サーモフィルム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）ＤＳＭ２０２１０、ロクタネラ・ベストフォルデンシス（Ｌｏｋｔａｎｅｌｌａ ｖｅｓｔｆｏｌｄｅｎｓｉｓ）、スフィンゴモナス・サンキサニゲネンス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓａｎｘａｎｉｇｅｎｅｎｓ）ＮＸ０２、エピリソニモナス・テナックス（Ｅｐｉｌｉｔｈｏｎｉｍｏｎａｓ ｔｅｎａｘ）ＤＳＭ１６８１１、スポロシトファガ・ミキソコッコイデス（Ｓｐｏｒｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｍｙｘｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ）およびサイクロフレクス・トルキス（Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ ｔｏｒｑｕｉｓ）ＡＴＣＣ７００７５５からなる群から選択される生物を起源とするＣａｓ９エンドヌクレアーゼであってよいが、ここで前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ標的配列の全部もしくは一部を認識する、結合する、および任意選択的にニッキングもしくは切断することのできるガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を形成することができる。（米国仮特許出願第ＢＢ２４７５号明細書
Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、例えば、一過性導入法、トランスフェクションおよび／または局所適用法を含むがそれらに限定されない当技術分野において公知の任意の方法または組換え構築物によって間接的に細胞に提供することができる。
エンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する酵素であり、塩基を損傷させずに特定部位でＤＮＡを切断する制限エンドヌクレアーゼを含む。制限エンドヌクレアーゼには、さらにサブタイプを含む、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型エンドヌクレアーゼが含まれる。Ｉ型およびＩＩＩ型形では、メチラーゼ活性および制限活性はどちらも単一複合体内に含有される。エンドヌクレアーゼにはさらに、制限エンドヌクレアーゼと同様に、特定認識部位で結合および切断するが、メガヌクレアーゼのための認識部位は典型的には長く、約１８ｂｐ以上であるホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥａｓｅ）としても公知であるメガヌクレアーゼが含まれる（２０１２年３月２２日に出願された特許出願ＷＯ－ＰＣＴ ＰＣＴ／ＵＳ１２／３００６１号明細書）。メガヌクレアーゼは、保存配列モチーフに基づいて４つのファミリーに分類されており、それらのファミリーはＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ－ＹＩＧ、Ｈ－Ｎ－ＨおよびＨｉｓ－Ｃｙｓボックスファミリーである。これらのモチーフは、金属イオンの配位およびホスホジエステル結合の加水分解に関与する。ＨＥａｓｅは、それらの長い認識部位およびそれらのＤＮＡ基質内の一部の配列多型を許容するために注目に値する。メガヌクレアーゼの命名規則は、他の制限エンドヌクレアーゼの命名規則と類似である。メガヌクレアーゼは、さらに独立ＯＲＦ、イントロンおよびインテインそれぞれによってコードされた酵素に対して接頭辞Ｆ－、Ｉ－もしくはＰＩ－によって特徴付けることができる。組換えプロセスにおける１つの工程は、認識部位もしくは認識部位の近くでポリヌクレオチド切断を含んでいる。この切断活性は、二本鎖切断を生成するために使用できる。部位特異的リコンビナーゼおよびそれらの認識部位の概説については、Ｓａｕｅｒ（１９９４）Ｃｕｒｒ Ｏｐ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５：５２１－７；およびＳａｄｏｗｓｋｉ（１９９３）ＦＡＳＥＢ ７：７６０－７を参照されたい。一部の例では、リコンビナーゼは、インテグラーゼもしくはリソルベースファミリー由来である。
ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、非従来型酵母もしくは他の生物のゲノム内の特定標的配列で二本鎖切断を作成するために使用できる新規なクラスの配列特異的ヌクレアーゼである。（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：１４３-１４８）。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよび二本鎖切断誘導物質ドメインを含む工学的二本鎖切断誘導物質である。認識部位特異性は、典型的には、例えばＣ２Ｈ２構造を有する２つ、３つもしくは４つのジンクフィンガーを含むジンクフィンガードメインによって与えられるが、他のジンクフィンガー構造は公知であり、工学的に作り出されている。ジンクフィンガードメインは、選択されたポリヌクレオチド認識配列に特異的に結合するポリペプチドを設計するために適用できる。ＺＦＮには、非特異的エンドヌクレアーゼドメイン、例えばＦｏｋＩなどのＩＩｓ型エンドヌクレアーゼ由来のヌクレアーゼドメインに結合した工学的ＤＮＡ－結合ジンクフィンガードメインが含まれる。追加の機能性は、転写活性化因子ドメイン、転写抑制因子ドメインおよびメチラーゼを含むジンクフィンガー結合ドメインに融合させることができる。一部の例では、切断活性のためにはヌクレアーゼドメインの二量化が必要とされる。各ジンクフィンガーは、標的ＤＮＡ内で３つの連続塩基対を認識する。例えば、３フィンガードメインは、ヌクレアーゼの二量化要件とともに９隣接ヌクレオチドの配列を認識し、１８ヌクレオチド認識配列に結合するために２セットのジンクフィンガートリプレットが使用される。
本明細書で使用する用語「ガイドポリヌクレオチド」は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができ、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識し、任意選択的に切断することを可能にするポリヌクレオチド配列を意味する。このガイドポリヌクレオチドは、単分子または二重分子であってよい。ガイドポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列もしくはそれらの組合せ（ＲＮＡ－ＤＮＡ組合せ配列）であってよい。任意選択的に、ガイドポリヌクレオチドは、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）、５－メチルｄＣ、２，６－ジアミノプリン、２’－フルオロＡ、２’－フルオロＵ、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、ホスホロチオエート結合、コレステロール分子との結合、ポリエチレングリコール分子との結合、スペーサー１８（ヘキサエチレングリコール鎖）分子との結合、または結果として環化をもたらす５’から３’への共有結合などであるがこれらに限定されない少なくとも１つのヌクレオチド、ホスホジエステル結合もしくは結合修飾を含む可能性がある。リボ核酸だけを含むガイドポリヌクレオチドは、「ガイドＲＮＡ」もしくは「ｇＲＮＡ」とも呼ばれる（さらに、どちらも参照により全体として本明細書に組み込まれる２０１５年３月１９日に公開された米国特許出願公開第２０１５－００８２４７８Ａ１号明細書および２０１５年２月２６日に公開された米国特許出願公開第２０１５－００５９０１０Ａ１号明細書を参照されたい）。
ガイドポリヌクレオチドは、ｃｒヌクレオチド配列およびｔｒａｃｒヌクレオチド配列を含む二本鎖分子（二本鎖ガイドポリヌクレオチドとも呼ばれる）であってよい。ｃｒヌクレオチドには、標的ＤＮＡ内のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる第１ヌクレオチド配列ドメイン（可変ターゲティングドメインもしくはＶＴドメインと呼ばれる）およびＣａｓエンドヌクレアーゼ認識（ＣＥＲ）ドメインの一部である第２ヌクレオチド配列（さらにｔｒａｃｒメイト配列とも呼ばれる）が含まれる。ｔｒａｃｒメイト配列は、相補性領域に沿ってｔｒａｃｒヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメインもしくはＣＥＲドメインを一緒に形成することができる。ＣＥＲドメインは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用することができる。二本鎖ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドおよびｔｒａｃｒヌクレオチド配列は、ＲＮＡ、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ－ＤＮＡ組合せ配列であってよい。一部の実施形態では、二本鎖ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチド分子は（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成される場合は）「ｃｒＤＮＡ」または（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成される場合は）「ｃｒＮＮＡ」または（ＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドとの組合せで構成される場合は）「ｃｒＤＮＡ－ＲＮＡ」と呼ばれる。ｃｒヌクレオチドは、細菌および古細菌中で天然に存在するｃＲＮＡの断片を含む可能性がある。本明細書で開示するｃｒヌクレオチド中に存在する可能性がある細菌および古細菌中で天然に存在するｃＲＮＡの断片のサイズは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ヌクレオチド以上から変動する可能性があるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒヌクレオチド配列は（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチから構成される場合は）「ｔｒａｃｒＲＮＡ」または（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチから構成される場合は）「ｔｒａｃｒＤＮＡ」または（ＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドとの組合せから構成される場合は）「ｔｒａｃｒＤＮＡ－ＲＮＡ」と呼ばれる。１つの実施形態では、ＲＮＡ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体を誘導するＲＮＡは、二本鎖ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡを含む二本鎖ＲＮＡである。
ｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）は、５’－から－３’方向において（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ ＩＩ型ｃｒＲＮＡの反復領域とアニーリングする配列、および（ｉｉ）ステムループ含有部分を含有する（Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４７１：６０２－６０７）。二本鎖ガイドポリヌクレオチドは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができるが、ここで前記ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体（ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系とも呼ばれる）は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをゲノム標的部位に方向付けることができ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが標的部位を認識する、結合する、および任意選択的にニッキングもしくは切断する（一本鎖もしくは二本鎖切断を導入する）ことを可能にする。（さらに、どちらも参照により全体として本明細書に組み込まれる２０１５年３月１９日に公開された米国特許出願公開第２０１５－００８２４７８Ａ１号明細書および２０１５年２月２６日に公開された米国特許出願公開第２０１５－００５９０１０Ａ１号明細書を参照されたい）。
ガイドポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒヌクレオチド配列に結合したｃｒヌクレオチド配列を含む単一分子（単一ガイドポリヌクレオチドとも呼ばれる）であってよい。単一ガイドポリヌクレオチドは、標的ＤＮＡ内のヌクレオチド配列にハイブリダイズできる第１ヌクレオチド配列ドメイン（可変ターゲティングドメインもしくはＶＴドメインと呼ばれる）およびＣａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用するＣａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン（ＣＥＲドメイン）を含む。「ドメイン」は、ＲＮＡ、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ－ＤＮＡ組合せ配列であってよいヌクレオチドの連続ストレッチを意味する。単一ガイドポリヌクレオチドのＶＴドメインおよび／またはＣＥＲドメインは、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ－ＤＮＡ組合せ配列を含むことができる。ｃｒヌクレオチドおよびｔｒａｃｒヌクレオチド由来の配列で構成されている単一ガイドポリヌクレオチドは、（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成される場合は）「単一ガイドＲＮＡ」または（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成される場合は）「単一ガイドＤＮＡ」または（ＲＮＡおよびＤＮＡヌクレオチドの組合せで構成される場合は）「単一ガイドＲＮＡ－ＤＮＡ」と称することができる。単一ガイドポリヌクレオチドは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができるが、ここで前記ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体（ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系とも呼ばれる）は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをゲノム標的部位に方向付けることができ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが標的部位を認識する、結合する、および任意選択的にニッキングもしくは切断する（一本鎖もしくは二本鎖切断を導入する）ことを可能にする。（さらに、どちらも参照により全体として本明細書に組み込まれる２０１５年３月１９日に公開された米国特許出願公開第２０１５－００８２４７８Ａ１号明細書および２０１５年２月２６日に公開された米国特許出願公開第２０１５－００５９０１０Ａ１号明細書を参照されたい）。
用語「可変ターゲティングドメイン」もしくは「ＶＴドメイン」は、本明細書では互換的に使用され、二本鎖ＤＮＡ標的部位の１本の鎖（ヌクレオチド配列）にハイブリダイズできる（相補的である）ヌクレオチド配列を含む。第１ヌクレオチド配列ドメイン（ＶＴドメイン）と標的配列との間の相補性率（％）は、少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６３％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％であってよい。可変ターゲティングドメインは、長さが少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０ヌクレオチドであってよい。一部の実施形態では、可変ターゲティングドメインは、１２～３０ヌクレオチドの連続ストレッチを含む。可変ターゲティングドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、修飾ＤＮＡ配列、修飾ＲＮＡ配列またはこれらの任意の組合せから構成されてよい。
用語（ガイドポリヌクレオチドの）「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン」もしくは「ＣＥＲドメイン」は、本明細書では互換的に使用され、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用するヌクレオチド配列を含む。ＣＥＲドメインは、ｔｒａｃｒヌクレオチドメイト配列を含み、その後にはｔｒａｃｒヌクレオチド配列が続く。ＣＥＲドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、修飾ＤＮＡ配列、修飾ＲＮＡ配列（例えば、参照により本明細書に組み込まれる２０１５年２月２６日に公開された米国特許出願公開第２０１５－００５９０１０Ａ１号明細書を参照されたい）またはそれらの任意の組合せから構成されてよい。
単一ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドおよびｔｒａｃｒヌクレオチドを結合するヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ－ＤＮＡ組合せ配列を含むことができる。１つの実施形態では、単一ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドおよびｔｒａｃｒヌクレオチドを結合するヌクレオチド配列は、長さが少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００ヌクレオチドであってよい。また別の実施形態では、単一ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドおよびｔｒａｃｒヌクレオチドを結合するヌクレオチド配列は、限定されないがＧＡＡＡテトラループ配列などのテトラループ配列を含む可能性がある。
ガイドポリヌクレオチド、ＶＴドメインおよび／またはＣＥＲドメインのヌクレオチド配列修飾は、５’キャップ、３’ポリアデニル化テイル、リボスイッチ配列、安定性制御配列、ｄｓＲＮＡ二本鎖を形成する配列、ガイドポリヌクレオチドを細胞内位置にターゲティングする修飾もしくは配列、トラッキングを提供する修飾もしくは配列、タンパク質のための結合部位を提供する修飾もしくは配列、ロックド核酸（ＬＮＡ）、５－メチルｄＣヌクレオチド、２，６－ジアミノプリンヌクレオチド、２’－フルオロＡヌクレオチド、２’－フルオロＵヌクレオチド；２’－Ｏ－メチルＲＮＡヌクレオチド、ホスホロチオエート結合、コレステロール分子への結合、ポリエチレングリコール分子への結合、スペーサー１８分子への結合、５’から３’への共有結合またはこれらの任意の組合せからなる群から選択することができるがこれらに限定されない。これらの修飾は、少なくとも１種の追加の有益な特徴をもたらすことができるが、ここでこの追加の有益な特徴は、修飾もしくは調節された安定性、細胞内ターゲティング、トラッキング、蛍光標識、タンパク質もしくはタンパク質複合体のための結合部位、相補的標的配列に対する修飾結合親和性、細胞分解に対する修飾耐性および増加した細胞透過性の群から選択される。
ガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡもしくはｔｒａｃｒＲＮＡの用語「機能的断片」、「機能的に同等である断片」および「機能的同等断片」は、本明細書では互換的に使用され、ガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡもしくはｔｒａｃｒＲＮＡとしてそれぞれ機能する能力が保持されている、本開示のガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡもしくはｔｒａｃｒＲＮＡの一部分もしくは部分配列を意味する。
ガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡもしくはｔｒａｃｒＲＮＡ（それぞれ）の用語「機能的変異体」、「機能的に同等である変異体」および「機能的同等変異体」は、本明細書では互換的に使用され、ガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡもしくはｔｒａｃｒＲＮＡとしてそれぞれ機能する能力が保持されている、本開示のガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡもしくはｔｒａｃｒＲＮＡの変異体を意味する。
用語「単一ガイドＲＮＡ」および「ｓｇＲＮＡ」は、本明細書では互換的に使用され、ｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）に融合した（ｔｒａｃｒＲＮＡにハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に結合した）可変ターゲティングドメインを含むｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）である、２つのＲＮＡ分子の合成融合に関する。単一ガイドＲＮＡは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼとの複合体を形成できるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のｃｒＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡ断片およびｔｒａｃｒＲＮＡもしくはｔｒａｃｒＲＮＡ断片を含むことができるが、ここで前記ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体はＣａｓエンドヌクレアーゼをＤＮＡ標的配列に方向付けることができ、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識する、結合する、および任意選択的にニッキングもしくは切断する（一本鎖もしくは二本鎖切断を導入する）ことを可能にする。
用語「ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体」、「ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系」、「ガイドＲＮＡ／Ｃａｓ複合体」、「ガイドＲＮＡ／Ｃａｓ系」、「ｇＲＮＡ／Ｃａｓ複合体」、「ｇＲＮＡ／Ｃａｓ系」、「ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ」、「ＲＧＥＮ」は、本明細書では互換的に使用され、複合体を形成することができる少なくとも１つのＲＮＡ成分および少なくとも１つのＣａｓエンドヌクレアーゼを意味しており、ここで前記ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ＣａｓエンドヌクレアーゼをＤＮＡ標的部位へ方向付けることができ、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識する、結合する、および任意選択的にニッキングもしくは切断する（一本鎖もしくは二本鎖切断を導入する）ことを可能にする。ＲＧＥＮのＲＮＡ成分は、ＤＮＡ標的配列の１本の鎖に相補的であるリボヌクレオチド配列を含有する。この相補的ＲＮＡ配列は、本明細書では「可変ターゲティングドメイン」配列とも呼ばれる。本明細書のガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、例えばＩ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系などの４種の既知のＣＲＩＳＰＲ系（Ｈｏｒｖａｔｈ ａｎｄ Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７：１６７－１７０）のいずれかのＣａｓタンパク質および好適なＲＮＡ成分を含むことができる。ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ＩＩ型Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼおよび少なくとも１つのＲＮＡ成分（例えば、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡ）を含むことができる。（さらに、どちらも参照により全体として本明細書に組み込まれる２０１５年３月１９日に公開された米国特許出願公開第２０１５－００８２４７８Ａ１号明細書および２０１５年２月２６日に公開された米国特許出願公開第２０１５－００５９０１０Ａ１号明細書を参照されたい）。
ガイドポリヌクレオチドは、粒子衝突法、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｕ）形質転換法もしくは局所適用法などであるがそれらに限定されない当技術分野において公知の任意の方法を使用して、一本鎖ポリヌクレオチドもしくは二本鎖ポリヌクレオチドとして一過性で細胞内に導入することができる。ガイドポリヌクレオチドは、さらに（粒子衝突法もしくはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）形質転換法などであるがそれらに限定されない方法によって）前記細胞内のガイドＲＮＡを転写させることのできる特異的プロモーターに機能的に結合された、ガイドポリヌクレオチドをコードする異種核酸断片を含む組換えＤＮＡ分子を導入することによって細胞内に間接的に導入することもできる。特異的プロモーターは、精密に規定された未修飾の５’－および３’－末端を備えるＲＮＡの転写を許容するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターであってよいがそれには限定されない（ＤｉＣａｒｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４１：４３３６－４３４３；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３：ｅ１６１）。
用語「標的部位」、「標的配列」、「標的部位配列」、「標的ＤＮＡ」、「標的遺伝子座」、「ゲノム標的部位」、「ゲノム標的配列」、「ゲノム標的遺伝子座」および「プロトスペーサー」は、本明細書では互換的に使用され、例えば、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体が認識する、結合する、および任意選択的にニッキングもしくは切断することができる、細胞のゲノム内の染色体、エピソームもしくは任意の他のＤＮＡ分子（染色体、葉緑体（ｃｈｏｌｏｒｏｐｌａｓｔｉｃ）、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡを含む）上のヌクレオチド配列などであるがそれらに限定されないポリヌクレオチド配列を意味する。標的部位は、細胞のゲノム内の内在性部位であってよい、または、標的部位は、その細胞に対して異種であってよく、それによりその細胞のゲノム内では天然型ではない、または標的部位は、それが天然で発生する場所に比較して異種ゲノム位置内で見いだすことができる。本明細書で使用する用語「内在性標的配列」および「天然標的配列」は、内在性もしくは細胞のゲノムにとって自然である、および細胞のゲノム内のその標的配列の内在性もしくは天然位置にある標的配列を意味するために本明細書では互換的に使用される。細胞には、ヒト、非ヒト、動物、細菌、古細菌、真菌、昆虫、酵母、非従来型酵母、植物細胞、植物、種子ならびに本明細書に記載した方法によって生成された微生物が含まれるがそれらに限定されない。「人工標的部位」もしくは「人工標的配列」は、本明細書では互換的に使用され、細胞のゲノム内に導入されている標的配列を意味する。そのような人工標的配列は、細胞のゲノム内に、しかし細胞のゲノム内の異なる位置（すなわち、非内在性もしくは非天然位置）に位置している内在性もしくは天然標的配列と配列が同一であってよい。
「改変標的部位」、「改変標的配列」、「修飾標的部位」、「修飾標的配列」は、本明細書では互換的に使用され、改変されていない標的配列と比較した場合に少なくとも１つの改変を含む本明細書に開示した標的配列を意味する。そのような「改変」には、例えば：（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換え、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入または（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの組合せが含まれる。
標的ＤＮＡ配列（標的部位）の長さは変動する可能性があり、例えば、長さが少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド以上である標的部位が含まれる。さらに、標的部位は回文構造であってよいことも考えられ、すなわち、一方の鎖上の配列は相補鎖上で反対方向に同一配列を読み取れる。ニック／切断部位は標的配列内に存在する可能性がある、またはニック／切断部位は標的配列の外側に存在する可能性があろう。また別の変形形態では、平滑末端を生成するために相互に直接対抗するヌクレオチド位置で発生する可能性がある、または、他の場合、切り込みが５’オーバーハングもしくは３’オーバーハングのいずれかであってよい、「付着末端」とも呼ばれる一本鎖オーバーハングを生成するためにギザギザ状であってよい。ゲノム標的部位の活性変異体もまた使用することができる。そのような活性変異体は、所定の標的部位に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を含むことができ、ここで活性変異体は生物学的活性を保持しており、したがってＣａｓエンドヌクレアーゼが認識および切断することができる。エンドヌクレアーゼによる標的部位の一本鎖もしくは二本鎖切断を測定するためのアッセイは当技術分野で公知であり、一般には、認識部位を含有するＤＮＡ基質への作用物質の全体的活性および特異性を測定する。
本明細書の「エピソーム」は、酵母細胞の染色体は別として、酵母細胞内に自律的に存在できる（複製して娘細胞に進むことができる）ＤＮＡ分子を意味する。エピソームＤＮＡは、酵母細胞に対して天然であっても異種であってもよい。本明細書の天然エピソームの例には、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）が含まれる。本明細書の異種エピソームの例としては、プラスミドおよび酵母人工染色体（ＹＡＣ）が挙げられる。
本明細書の「プロトスペーサー隣接モチーフ」（ＰＡＭ）は、本明細書に記載したガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系によって認識（標的化）される標的配列（プロトスペーサー）に隣接する短鎖ヌクレオチド配列を意味する。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、標的ＤＮＡ配列の後にＰＡＭ配列が続かない場合は、標的ＤＮＡ配列を上首尾で認識することができない。本明細書のＰＡＭの配列および長さは、使用されるＣａｓタンパク質もしくはＣａｓタンパク質複合体に依存して異なる可能性がある。ＰＡＭ配列は、任意の長さの配列であってよいが、典型的には１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０ヌクレオチド長である。
用語「５’－キャップ」および「７－メチルグアニル酸（ｍ７Ｇ）キャップ」は、本明細書では互換的に使用される。７－メチルグアニル酸残基は、真核細胞内のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の５’末端上に位置する。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）は、真核細胞内でｍＲＮＡを転写する。メッセンジャーＲＮＡキャッピングは、一般には次のように発生する：ｍＲＮＡ転写産物の最末端５’リン酸基は、ＲＮＡ末端ホスファターゼによって除去され、２つの末端リン酸基が残る。グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）は、グアニリルトランスフェラーゼによって転写物の末端リン酸基に加えられ、転写物末端に５’－５’三リン酸結合グアニンが残る。最後に、この末端グアニンの７－窒素が、メチルトランスフェラーゼによってメチル化される。
本明細書の専門用語「５’－キャップを有していない」は、５’－キャップの代わりに、例えば５’－ヒドロキシル基を有するＲＮＡを意味するために使用される。そのようなＲＮＡは、例えば、「脱キャップＲＮＡ」と呼ぶことができる。５’－キャップドＲＮＡは核外輸送を受けるので、脱キャップＲＮＡは、転写後には核内でより十分に蓄積することができる。本明細書の１つ以上のＲＮＡ成分は、脱キャップされている。
用語「リボザイム」および「リボ核酸酵素」は、本明細書では互換的に使用される。リボザイムは、特定部位でＲＮＡを切断できる二次、三次および／または四次構造を形成する１つ以上のＲＮＡ配列を意味する。本明細書のリボザイムは、例えば、ハンマーヘッド（ＨＨ）リボザイム、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイム、グループＩイントロンリボザイム、ＲｎａｓｅＰリボザイムもしくはヘアピンリボザイムであってよい。リボザイムには、リボザイム配列に比較してシス部位でＲＮＡを切断する（すなわち、自己触媒性もしくは自己切断型）ことができる「自己切断型リボザイム」が含まれる。リボザイムヌクレオチド分解活性の一般的性質は、記載されている（例えば、Ｌｉｌｌｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３９：６４１－６４６）。本明細書の「ハンマーヘッドリボザイム」（ＨＨＲ）は、３本の塩基対ステムおよび触媒反応に関係する高度に保存された非相補的ヌクレオチドのコアから作り上げられた小さな触媒的ＲＮＡモチーフを含むことができる。参照により本明細書に組み込まれるＰｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３７２：６８－７４）およびＨａｍｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（ＲＮＡ １８：８７１－８８５）は、ハンマーヘッドリボザイムの構造および活性について開示している。本明細書のリボザイムの他の非限定的な例としては、Ｖａｒｋｕｄサテライト（ＶＳ）リボザイム、グルコサミン－６－リン酸活性化リボザイム（ｇｌｍＳ）およびＣＰＥＢ３リボザイムが挙げられる。Ｌｉｌｌｅｙ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３９：６４１－６４６）は、リボザイム構造および活性に関する情報を開示している。本明細書で使用するために好適なはずであるリボザイムの例としては、参照により本明細書に組み込まれる欧州特許第０７０７６３８号明細書ならびに米国特許第６０６３５６６号明細書、同第５５８０９６７号明細書、同第５６１６４５９号明細書および同第５６８８６７０号明細書に開示されたリボザイムが挙げられる。
本明細書のハンマーヘッドリボザイムは、例えば、Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ ８１：９９１－１００２、参照によって本明細書に組み込まれる）によって開示された「最小ハンマーヘッド」配列を含むことができる。ハンマーヘッドリボザイムは、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＨａｍｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（ＲＮＡ １８：８７１－８８５）に開示されたＩ型、ＩＩ型もしくはＩＩＩ型ハンマーヘッドリボザイムであってよい。本明細書にしたがって利用できるハンマーヘッドリボザイムをコードするＤＮＡを同定するための複数の手段は、Ｈａｍｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．に開示されている。本明細書のハンマーヘッドリボザイムは、例えば、ウイルス、ウイロイド、植物ウイルスサテライトＲＮＡ、原核生物（例えば、古細菌、シアノバクテリア、アシドバクテリア）または例えば植物（例えば、アラビドプシス・タリアーナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、カーネーション）、原生生物（例えば、アメーバ、ユーグレナ）、真菌（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））、両生類（例えば、イモリ、カエル）、住血吸虫、昆虫（例えば、コオロギ）、軟体動物、哺乳類（例えば、マウス、ヒト）または線虫由来であってよい。
本明細書のハンマーヘッドリボザイムは、典型的には、それぞれが保存配列の短鎖リンカーによって分離されたヘリックスＩ、ＩＩおよびＩＩＩと呼ばれる３本の塩基対ヘリックスを含んでいる。３つのタイプのハンマーヘッドリボザイム（Ｉ～ＩＩＩ）は、一般にどのヘリックスがリボザイムの５’および３’末端に含まれているかに基づく。例えば、ハンマーヘッドリボザイム配列の５’および３’末端がステムＩに寄与する場合、それはＩ型ハンマーヘッドリボザイムと呼ぶことができる。３つのこれらの可能性のあるトポロジー的タイプのうちでＩ型は原核生物、真核生物およびＲＮＡ植物病原体のゲノム内で見いだすことができるが、他方ＩＩ型ハンマーヘッドリボザイムは、原核生物中でのみ記載されており、ＩＩＩ型ハンマーヘッドリボザイムはほとんどが植物、植物病原体および原核生物中で見いだされる。所定の実施形態におけるハンマーヘッドリボザイムは、Ｉ型ハンマーヘッドリボザイムである。
ハンマーヘッドリボザイムをコードする配列は、少なくとも約４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０もしくは１５０（または４０～１５０の間の任意の整数）ヌクレオチド、４０～１００ヌクレオチドもしくは４０～６０ヌクレオチドを含むことができる。
本開示の１つの実施形態では、本方法は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を非従来型酵母内の染色体もしくはエピソーム上の標的部位配列にターゲティングする方法であって、前記酵母にＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第１組換えＤＮＡ構築物、保護ポリヌクレオチド修飾鋳型およびＲＮＡ成分の上流でリボザイムをコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも１つの第２組換えＤＮＡ構築物を提供する工程を含み、ここで前記第２組換えＤＮＡ構築物から転写されたＲＮＡは前記ＲＮＡ成分を生成するためにリボザイムを自己触媒性で除去し、ここでＲＮＡ成分およびＣａｓ９エンドヌクレアーゼは標的部位配列の全部もしくは一部に結合できるＲＧＥＮを形成できる方法を含む。
所定の実施形態では、リボザイム－ガイドＲＮＡカセットを含むＤＮＡポリヌクレオチドは、ガイドＲＮＡ成分配列の下流にある好適な転写終結配列を含むことができよう。本明細書で有用な転写終結配列の例は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開２０１４／０１８６９０６号明細書に開示されている。例えば、Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓｕｐ４遺伝子転写ターミネーター配列を使用できる。そのような実施形態は、典型的には、リボザイム－ＲＮＡ成分カセットから下流に位置するリボザイム配列を含んでいない。さらに、そのような実施形態は、典型的には、ターミネーター配列の選択に依存して、ＲＮＡ成分配列の末端に続いて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個以上の残基を含む。これらの追加の残基は、例えば、ターミネーター配列の選択に依存して、全てがＵ残基であってもよい、または少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％のＵ残基であってもよい。または、リボザイム配列（例えば、ハンマーヘッドもしくはＨＤＶリボザイム）は、ＲＮＡ成分配列（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のヌクレオチド）の３’であってよい；そのような実施形態におけるＲＮＡ成分配列は、上流および下流リボザイムに隣接されている。３’リボザイム配列は、それ自体をＲＮＡ成分配列から切断するように適宜にポジショニングできる；そのような切断は、転写物が、例えば、ＲＮＡ成分配列の末端で正確に終結するか、または、ＲＮＡ成分配列の末端に続いて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個以上の残基を備えるようにさせるであろう。
用語「ターゲティング」、「遺伝子ターゲティング」および「ＤＮＡターゲティング」は、本明細書で互換的に使用される。本明細書のＤＮＡターゲティングは、例えば細胞の染色体もしくはエピソーム中などの、特定のＤＮＡ配列でのノックアウト、編集もしくはノックインの特異的な導入であってよい。一般に、ＤＮＡターゲティングは、本明細書では、好適なポリヌクレオチド成分と関連するＣａｓタンパク質を含む細胞内の特定のＤＮＡ配列で一方もしくは両方の鎖を切断することによって実施することができる。そのようなＤＮＡ切断は、二本鎖切断（ＤＳＢ）である場合は、標的部位での修飾をもたらすことができるＮＨＥＪもしくはＨＤＲプロセスを刺激することができる。
用語「ノックアウト」、「遺伝子ノックアウト」および「遺伝的ノックアウト」は、本明細書では互換的に使用される。ノックアウトは、本明細書では、Ｃａｓタンパク質によるターゲティングによって部分的もしくは完全に無効化されている細胞のＤＮＡ配列を表す；ノックアウト前のそのようなＤＮＡ配列は、アミノ酸配列をコードしていた可能性がある、または例えば調節機能（例えばプロモーター）を有していた可能性がある。ノックアウトは、インデル（ＮＨＥＪを通しての標的ＤＮＡ配列内のヌクレオチド塩基の挿入もしくは欠失）または標的化部位もしくは標的化部位の近くで配列の機能を減少させる、または完全に破壊する配列の特異的除去によって生成することができる。インデルは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の塩基であってよい。所定の実施形態におけるインデルは、いっそう大きく、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００塩基であってよい。インデルが遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に導入される場合は、インデルは多くの場合、フレームシフト突然変異を生じさせることによって、ＯＲＦによってコードされたタンパク質の野生型発現を崩壊させる。
ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系は、関心対象のゲノムヌクレオチド配列の編集（修飾）を可能にするために共送達ポリヌクレオチド修飾鋳型と組み合わせて使用することができる。（さらに、どちらも参照により全体として本明細書に組み込まれる２０１５年３月１９日に公開された米国特許出願公開第２０１５－００８２４７８Ａ１号明細書および２０１５年２月２６日に公開された国際公開第２０１５／０２６８８６Ａ１号パンフレットを参照されたい）。
「修飾ヌクレオチド」もしくは「編集ヌクレオチド」は、それの非修飾ヌクレオチド配列と比較した場合に少なくとも１つの改変を含む関心対象のヌクレオチド配列を意味する。そのような「改変」には、例えば：（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換え、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入または（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの組合せが含まれる。
用語「ポリヌクレオチド修飾鋳型」には、編集対象のヌクレオチド配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含むポリヌクレオチドが含まれる。ヌクレオチド修飾は、少なくとも１つのヌクレオチド置換（少なくとも１つのヌクレオチドの置換え）、１つのヌクレオチド付加（少なくとも１つのヌクレオチドの挿入）、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失またはそれらの任意の組合せであってよい。任意選択的に、ポリヌクレオチド修飾鋳型は、さらに少なくとも１つのヌクレオチド修飾に隣接する同種ヌクレオチド配列を含むことができ、ここで隣接する同種ヌクレオチド配列は編集対象の所望のヌクレオチド配列に対して十分な相同性を提供する。その５’もしくは３’末端での保護を含まないポリヌクレオチド修飾鋳型は、「非保護ポリヌクレオチド修飾鋳型」と呼ばれる。
用語「保護ポリヌクレオチド修飾鋳型」もしくは「保護ポリヌクレオチド編集鋳型」は、本明細書では互換的に使用され、少なくとも１つの末端（その５’末端もしくはその３’末端またはその５’および３’末端）で少なくとも１つの修飾（保護もしくは保護分子と呼ばれる）を有するポリヌクレオチド修飾鋳型分子を含む。５’もしくは３’末端での保護には、増加したＨＤＲ、減少したＮＨＥＪもしくは減少したオフサイト組込みまたはそれらの任意の組合せによって証明されるように鋳型をより安定性（保護された）にさせるポリヌクレオチド修飾鋳型への任意の修飾が含まれる。保護分子（修飾）は、細胞内のエキソヌクレアーゼから鋳型を保護することによって鋳型安定性を改変する、および／または鋳型が非相同末端結合（ＮＨＥＪ）のための基質として作用する能力を改変することができる。代替法として、保護ポリヌクレオチド修飾鋳型は、非保護ポリヌクレオチド供与体と比較して、相同組換え修復のタンパク質とは良好に相互作用することができる、または非相同末端結合のタンパク質とはより不良にしか相互作用することができない。保護ポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖線状もしくは環状分子であってよい。環状鋳型は、さらに典型的な５’リン酸基としての保護（修飾）末端も含有しており、線状ＤＮＡ分子の３’水酸基は、環状分子内の隣の５’もしくは３’塩基へのホスホジエステル結合で置き換えられている。
一部の細胞では、ポリヌクレオチド修飾鋳型は、ＤＮＡ損傷の他の自然位置内に（例えば、ＮＨＥＪによって）組み込むことができる。ＮＨＥＪによるＤＮＡの断片の組込みは、ＤＮＡ末端の５’リン酸基および３’水酸基が結合させられる最終ＤＮＡライゲーション工程を有する。保護ポリヌクレオチド修飾鋳型の場合は、好適な５’リン酸基を利用できない、または修飾によって遮断され、それにより鋳型のオフサイト組込みが防止される。
本明細書で使用する用語「増加した」は、増加した量もしくは活性がそれに対して比較される量もしくは活性よりも少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％もしくは２５０％以上である量もしくは活性を意味することができる。用語「増加（した）」、「上昇（した）」、「強化（された）」、「超」、および「改善（した）」は、本明細書では互換的に使用される。用語「増加（した）」は、例えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現を特徴付けるために使用することができ、このとき「増加した発現」は、「過剰発現」を意味することもできる。
保護ポリヌクレオチド修飾鋳型の非限定的例は、環状ＤＮＡポリヌクレオチド修飾鋳型（利用可能な二本鎖末端を伴わない）、各鎖の５’末端上で３炭素アルカンスペーサーからなる少なくとも１つの保護分子を含む線状二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド修飾鋳型および各鎖上でホスホロチオエート結合と置き換えられた少なくとも１、２、３、４もしくは５つの５’最末端ホスホジエステル結合からなる少なくとも１つの保護分子を含む線状ポリヌクレオチド修飾鋳型である。保護ポリヌクレオチド修飾鋳型の他の非限定的例には、アルカンスペーサー、蛍光体、ＮＨＳエステル、ジゴキシゲン、コレステリル－ＴＥＧ、Ｃ６、Ｃ１２、ヘキシニル、Ｏｘｔａｄｉｙｎｙｌ ｄＵＴＰ、ビオチン、ジチオール、逆ジデオキシ－Ｔ修飾またはそれらの任意の１つの組合せなどであるがそれらに限定されない保護分子を含む鋳型が含まれる。
１つの実施形態では、本開示は、そのゲノム内に修飾ヌクレオチド配列を含む細胞を選択するための方法であって：ａ）ガイドポリヌクレオチド、保護ポリヌクレオチド修飾鋳型およびＣａｓエンドヌクレアーゼを細胞に提供する工程であって、ここで前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドポリヌクレオチドは前記細胞のゲノム内の標的部位で一本鎖もしくは二本鎖切断を導入することができる複合体を形成することができ、前記保護ポリヌクレオチド修飾鋳型は、前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含む工程；およびｂ）工程（ａ）から前記修飾ヌクレオチド配列を含む細胞を選択する工程を含む方法について記載する。本方法は、前記細胞内の相同組換え修復（ＨＤＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の頻度を決定する工程をさらに含む。
本明細書に記載した方法を使用すると、ＨＤＲの頻度は、非保護（コントロール）ポリヌクレオチド修飾鋳型を使用すること以外は、本明細書に記載した方法と同一の成分および工程全部を有するコントロール法に由来するＨＤＲの頻度と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％もしくは２５０％増加させることができる。
本明細書に記載した方法を使用すると、ＮＨＥＪの頻度は、非保護（コントロール）ポリヌクレオチド修飾鋳型を使用すること以外は、本明細書に記載した方法と同一の成分および工程全部を有するコントロール法に由来するＮＨＥＪの頻度と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％減少させることができる。
１つの実施形態では、本開示は、細胞のゲノム内のヌクレオチド配列を編集するための方法であって、ガイドポリヌクレオチド、保護ポリヌクレオチド修飾鋳型および少なくとも１つのＣａｓエンドヌクレアーゼを細胞に提供する工程であって、ここでＣａｓエンドヌクレアーゼは前記細胞のゲノム内の標的部位で一本鎖もしくは二本鎖切断を導入することができ、前記ポリヌクレオチド修飾鋳型は前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含む方法について記載する。編集対象のヌクレオチドは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼによって認識および切断される標的部位内もしくは標的部位外に位置する可能性がある。１つの実施形態では、少なくとも１つのヌクレオチド修飾は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼによって認識および切断される標的部位での修飾ではない。また別の実施形態では、編集対象の少なくとも１つのヌクレオチドとゲノム標的部位との間には少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、９００もしくは１，０００ヌクレオチドが存在する。
細胞には、ヒト、非ヒト、動物、細菌、古細菌、真菌、微生物、昆虫、酵母、および植物細胞、植物、種子ならびに本明細書に記載した方法によって生成された微生物が含まれるがそれらに限定されない。本明細書の酵母の例としては、従来型酵母および非従来型酵母が挙げられる。所定の実施形態における従来型酵母は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって媒介される修復プロセスよりも相同組換え（ＨＲ）ＤＮＡ修復プロセスを好む酵母である。本明細書の従来型酵母の例としては、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、出芽酵母、パン酵母および／または醸造酵母としても知られるＳ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；Ｓ．バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）；Ｓ．ボウラルディ（Ｓ．ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）；Ｓ．ブルデリ（Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ）；Ｓ．カリオカヌス（Ｓ．ｃａｒｉｏｃａｎｕｓ）；Ｓ．カリオクス（Ｓ．ｃａｒｉｏｃｕｓ）；Ｓ．ケバリエリ（Ｓ．ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ）；Ｓ．ダイレネンシス（Ｓ．ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）；Ｓ．エリプソイデウス（Ｓ．ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｕｓ）；Ｓ．オイバヤヌス（Ｓ．ｅｕｂａｙａｎｕｓ）；Ｓ．エクシグウス（Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ）；Ｓ．フロレンティヌス（Ｓ．ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ）；Ｓ．クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）；Ｓ．マルチニアエ（Ｓ．ｍａｒｔｉｎｉａｅ）；Ｓ．モナセンシス（Ｓ．ｍｏｎａｃｅｎｓｉｓ）；Ｓ．ノルベンシス（Ｓ．ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）；Ｓ．パラドクスス（Ｓ．ｐａｒａｄｏｘｕｓ）；Ｓ．パストリアヌス（Ｓ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）；Ｓ．スペンセロルム（Ｓ．ｓｐｅｎｃｅｒｏｒｕｍ）；Ｓ．ツリセンシス（Ｓ．ｔｕｒｉｃｅｎｓｉｓ）；Ｓ．ユニスポルス（Ｓ．ｕｎｉｓｐｏｒｕｓ）；Ｓ．ウバルム（Ｓ．ｕｖａｒｕｍ）；Ｓ．ゾナツス（Ｓ．ｚｏｎａｔｕｓ）およびシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、分裂酵母としても知られるＳ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）；Ｓ．クリオフィルス（Ｓ．ｃｒｙｏｐｈｉｌｕｓ）；Ｓ．ヤポニクス（Ｓ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）；Ｓ．オクトスポルス（Ｓ．ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ））の種が挙げられる。植物細胞には、トウモロコシ、コメ、ソルガム、ライムギ、オオムギ、コムギ、アワ、カラスムギ、サトウキビ、芝草、もしくはスイッチグラス、ダイズ、カノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、綿、タバコ、ピーナッツ、ジャガイモ、タバコ、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）およびベニバナ細胞からなる群から選択される細胞が含まれる。
本明細書の非従来型酵母は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））またはシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ））の種などの従来型酵母ではない。所定の実施形態における非従来型酵母は、ＨＲによって媒介される修復プロセスよりもＮＨＥＪ ＤＮＡ修復プロセスを好む酵母である可能性がある。例えばＳ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびＳ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）などの従来型酵母は、典型的には、ルーチン的に７０％を超える効率を備える短鎖隣接相同性アーム（３０～５０ｂｐ）を備えるドナーＤＮＡの特異的組込みを示すが、他方ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）およびクルベイロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）などの非従来型酵母は通常は１％未満の効率で類似の構造のドナーＤＮＡを備える特異的組込みを示す（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８：ｅ５７９５２）。したがって、ＨＲプロセスの優先度は、例えば、酵母を適切なドナーＤＮＡで形質転換し、ドナーＤＮＡによって標的とされると予測されるゲノム部位と特異的に組み換えられる程度を決定することによって、測定することができる。ＮＨＥＪに対する優先度（もしくはＨＲに対する低い優先度）は、例えば、そのようなアッセイが酵母ゲノム内へのドナーＤＮＡの高度の無作為組込みを生成すると明らかになるであろう。酵母内のＤＮＡの特異的（ＨＲ媒介性）および／または無作為（ＮＨＥＪ媒介性）組込みの比率を決定するためのアッセイは当技術分野において公知である（例えば、Ｆｅｒｒｅｉｒａ ａｎｄ Ｃｏｏｐｅｒ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１８：２２４９－２２５４；Ｃｏｒｒｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８：ｅ６９６２８；Ｗｅａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：６３５４－６３５８；Ｋｅｅｎｅｙ ａｎｄ Ｂｏｅｋｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３６：８４９－８５６）。
それらの低レベルのＨＲ活性を前提にすると、本明細書の非従来型酵母は、（ｉ）３０～５０ｂｐの隣接相同性アームを有する適切なドナーＤＮＡによる、例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％もしくは８％未満の特異的なターゲティング率をすることができる、および／または（ｉｉ）前述のドナーＤＮＡの、例えば、約６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％もしくは７５％超の無作為組込み率を示すことができる。これらの好適なドナーＤＮＡの（ｉ）特異的ターゲティング率および／または（ｉｉ）無作為組込み率は、本明細書に開示したＲＧＥＮが提供される前から存在するために、非従来型酵母を特徴付けることができる。所定の実施形態において非従来型酵母にＲＧＥＮを提供することの目的は、特定部位で酵母をＨＲに偏らせるための部位特異的ＤＮＡ一本鎖切断（ＳＳＢ）もしくは二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせることである。したがって、非従来型酵母における好適なＲＧＥＮを提供する工程は、典型的には、酵母が特定のドナーＤＮＡを備えるＨＲの増加率を示すことを許容するはずである。そのような増加した率は、好適なコントロール（例えば、好適なＲＧＥＮが欠如すること以外は、同一ドナーＤＮＡを用いて形質転換された同一の非従来型酵母）内のＨＲ率よりも少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍もしくは１０倍高い可能性がある。
本明細書に記載した方法および組成物は、ヌクレオチド配列を修飾するため、および／または相同組換え修復の頻度を増加させるために、ガイドポリヌクレオチド、保護ポリヌクレオチド修飾鋳型およびＣａｓエンドヌクレアーゼを使用する。保護ポリヌクレオチド鋳型は、少なくとも１つの異種遺伝子発現カセットにより分離された２つの相同性アームを含む可能性がある。本方法は、さらに任意の修飾鋳型のオフサイト組込みの頻度を減少させるために使用できる。
１つの実施形態では、本開示は、そのゲノム内に修飾ヌクレオチド配列を含む微生物細胞を選択するための方法であって：ａ）ガイドポリヌクレオチド、少なくとも１つの保護ポリヌクレオチド修飾鋳型およびＣａｓエンドヌクレアーゼを細胞に提供する工程であって、ここで前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドポリヌクレオチドは前記細胞のゲノム内の標的部位で一本鎖もしくは二本鎖切断を導入することができる複合体を形成することができ、前記保護ポリヌクレオチド修飾鋳型は、前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含む工程；ｂ）工程（ａ）から前記修飾ヌクレオチド配列を含む細胞を選択する工程、および（ｃ）前記細胞内の保護ポリヌクレオチド修飾鋳型のオフサイト組込みの頻度をさらに決定する工程を含む方法について記載する。
前記細胞内の保護ポリヌクレオチド修飾鋳型のオフサイト組込みの頻度は、非保護（コントロール）ポリヌクレオチド修飾鋳型を使用すること以外は、本明細書に記載した方法と同一の成分全部を有するコントロール法に由来するオフサイト組込みの頻度と比較して、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％減少させることができる。
用語「ノックイン」、「遺伝子ノックイン」、「遺伝子挿入」および「遺伝的ノックイン」は、本明細書では互換的に使用される。ノックインは、Ｃａｓタンパク質を用いたターゲティングによって（好適なドナーＤＮＡポリヌクレオチドもまた使用される場合はＨＲによって）細胞内の特定のＤＮＡ配列でのＤＮＡ配列の置換えもしくは挿入を表す。ノックインの例は、遺伝子のコーディング領域内の異種アミノ酸コーディング配列の特異的挿入、または遺伝子座内の転写調節要素の特異的挿入である。
Ｃａｓエンドヌクレアーゼに対する標的部位に挿入される関心対象のポリヌクレオチドを有する細胞もしくは生物を得るためには、様々な方法および組成物を使用することができる。そのような方法は、標的部位で関心対象のポリヌクレオチドの組込みを提供するために相同組換えを使用することができる。提供される１つの方法では、関心対象のポリヌクレオチドがドナーＤＮＡ構築物内の生物細胞に提供される。本明細書で使用する「ドナーＤＮＡ」もしくは「ドナーポリヌクレオチド」は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの標的部位内に挿入される関心対象のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ構築物である。ドナーＤＮＡ構築物は、さらに関心対象のポリヌクレオチドに隣接する第１および第２相同性領域を含むことができる。ドナーＤＮＡの第１および第２相同性領域は、それぞれが細胞もしくは生物ゲノムの標的部位内に存在する、またはこの標的部位に隣接する第１および第２ゲノム領域に対する相同性を共有する。「相同性」は、類似するＤＮＡ配列を意味する。例えば、ドナーＤＮＡ上で見出される「ゲノム領域に対する相同性領域」とは、細胞もしくは生物ゲノム内の所定の「ゲノム領域」と類似する配列を有するＤＮＡの領域である。相同性領域は、切断標的部位での相同組換えを促進するために十分な任意の長さであってよい。例えば、相同性領域は、相同性領域が、対応するゲノム領域との相同組換えを受けるのに十分な相同性を有するように、長さが少なくとも５～１０、５～１５、５～２０、５～２５、５～３０、５～３５、５～４０、５～４５、５～５０、５～５５、５～６０、５～６５、５～７０、５～７５、５～８０、５～８５、５～９０、５～９５、５～１００、５～２００、５～３００、５～４００、５～５００、５～６００、５～７００、５～８００、５～９００、５～１，０００、５～１，１００、５～１，２００、５～１，３００、５～１，４００、５～１，５００、５～１，６００、５～１，７００、５～１，８００、５～１，９００、５～２，０００、５～２，１００、５～２，２００、５～２，３００、５～２，４００、５～２，５００、５～２，６００、５～２，７００、５～２，８００、５～２，９００、５～３，０００、５～３，１００以上の塩基を含むことができる。「十分な相同性」は、２つのポリヌクレオチド配列が相同組換え反応のための基質として作用するために十分な構造的類似性を有することを示す。この構造的類似性は、各ポリヌクレオチド断片の全長とポリヌクレオチドの配列類似性とを含む。配列類似性は、配列の全長にわたる配列同一性率（％）および／または１００％配列同一性を有する連続ヌクレオチドなどの局在化類似性を含む保存領域および配列の長さの一部分にわたる配列同一性率（％）によって記載することができる。
標的およびドナーポリヌクレオチドによって共有される相同性もしくは配列同一性の量は変動する可能性があり、約１～２０ｂｐ、２０～５０ｂｐ、５０～１００ｂｐ、７５～１５０ｂｐ、１００～２５０ｂｐ、１５０～３００ｂｐ、２００～４００ｂｐ、２５０～５００ｂｐ、３００～６００ｂｐ、３５０～７５０ｂｐ、４００～８００ｂｐ、４５０～９００ｂｐ、５００～１，０００ｂｐ、６００～１，２５０ｂｐ、７００～１，５００ｂｐ、８００～１，７５０ｂｐ、９００～２，０００ｂｐ、１～２．５ｋｂ、１．５～３ｋｂ、２～４ｋｂ、２．５～５ｋｂ、３～６ｋｂ、３．５～７ｋｂ、４～８ｋｂ、５～１０ｋｂの範囲内で単位整数値を有する全長および／または全領域を含む、または最大で標的部位の全長を含む。これらの範囲には、この範囲内の全ての整数が含まれ、例えば１～２０ｂｐの範囲には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０ｂｐが含まれる。相同性の量は、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性率（％）を含む２種のポリヌクレオチドの完全にアラインメントされた長さ全体にわたる配列同一性率（％）によって記載することもできる。十分な相同性は、ポリヌクレオチドの長さと、全体的な配列同一性率（％）および任意選択的に連続ヌクレオチドの保存領域もしくは局所的配列同一性率（％）との任意の組合せを含み、例えば、十分な相同性は、標的遺伝子座の領域に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する７５～１５０ｂｐの領域であると記載することができる。十分な相同性は、さらにストリンジェンシー条件下で２つのポリヌクレオチドが特異的にハイブリダイズする予測された能力によっても説明することができ、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）；およびＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
ドナーＤＮＡポリヌクレオチドは、標的部位で配列と非相同である配列によって分離された２つの相同配列を有する可能性がある。そのようなドナーポリヌクレオチドのこれら２つの相同配列は、非相同配列に隣接する「相同性アーム」と呼ぶことができる。標的部位と２つの相同性アームを備えるドナーポリヌクレオチドとの間のＨＲは、典型的には標的部位での配列とドナーポリヌクレオチドの非相同配列との置換えを生じさせる（ドナーポリヌクレオチドの相同性アームと相同であるＤＮＡ配列間に位置する標的部位配列は、ドナーポリヌクレオチドの非相同配列によって置き換えられる）。２つの相同性アームを備えるドナーポリヌクレオチドでは、アームは１つ以上のヌクレオチドによって分離されてよい（すなわち、ドナーポリヌクレオチド内の非相同配列は、長さが少なくとも１ヌクレオチドであってよい）。本明細書の非従来型酵母内で実施できる様々なＨＲ手法は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＤＮＡ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｈ．Ｔｓｕｂｏｕｃｈｉ，Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１１）に開示されている。
本明細書で使用する「ゲノム領域」は、標的部位のいずれかの側に存在する、または、標的部位の一部分もさらに含む細胞のゲノム中の染色体のセグメントである。ゲノム領域は、そのゲノム領域が対応する相同性領域との相同組換えを受けるのに十分な相同性を有するように、少なくとも５～１０、５～１５、５～２０、５～２５、５～３０、５～３５、５～４０、５～４５、５～５０、５～５５、５～６０、５～６５、５～７０、５～７５、５～８０、５～８５、５～９０、５～９５、５～１００、５～２００、５～３００、５～４００、５～５００、５～６００、５～７００、５～８００、５～９００、５～１，０００、５～１，１００、５～１，２００、５～１，３００、５～１，４００、５～１，５００、５～１，６００、５～１，７００、５～１，８００、５～１，９００、５～２，０００、５～２，１００、５～２，２００、５～２，３００、５～２，４００、５～２，５００、５～２，６００、５～２，７００、５～２，８００．５～２，９００、５～３，０００、５～３，１００個以上の塩基を含むことができる。
関心対象のポリヌクレオチドおよび／または形質は、どちらの出願も参照により本明細書に組み込まれる２０１３年１０月３日に公開された米国特許出願公開第２０１３－０２６３３２４Ａ１号明細書および２０１３年１月２４日に公開されたＰＣＴ／ＵＳ１３／２２８９１号明細書に記載されたように、複合形質遺伝子座内で一緒に積み重ねることができる。本明細書に記載したガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ系は、二本鎖切断を生成するための効率的な系を提供し、形質が複合形質遺伝子座内で積み重ねられることを可能にする。
ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系は、１つ以上のガイドポリヌクレオチド、１つ以上のＣａｓエンドヌクレアーゼおよび任意選択的に１つ以上のドナーＤＮＡを細胞に提供する工程によって、１つ以上の関心対象のポリヌクレオチドもしくは１つ以上の関心対象の形質を１つ以上の標的部位内に導入するために使用できる。（（参照により本明細書に組み込まれる２０１４年８月２０日に出願された米国特許出願第１４／４６３，６８７号明細書に記載されたように
所定のゲノム領域とドナーＤＮＡ上で見出される対応する相同性領域との間の構造的類似性は、相同組換えが発生することを可能にする任意の程度の配列同一性であってよい。例えば、ドナーＤＮＡの「相同性領域」および生物ゲノムの「ゲノム領域」によって共有される相同性もしくは配列同一性の量は、それらの配列が相同組換えを受けるように、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性であってよい。
ドナーＤＮＡ上の相同性領域は、標的部位に隣接する任意の配列に対する相同性を有する可能性がある。一部の実施形態では、相同性領域は、標的部位に直接隣接するゲノム配列に対して有意な配列相同性を共有するが、相同領域は、標的部位に対してさらに５’もしくは３’であってよい領域に対して十分な相同性を有するように設計できることは認識されている。さらに他の実施形態では、相同性領域は、下流ゲノム領域に沿って標的部位の断片との相同性も有する可能性がある。１つの実施形態では、第１相同性領域は、標的部位の第１断片をさらに含み、第２相同性領域は標的部位の第２断片を含むが、ここで第１および第２断片は異なる。
本明細書で使用する「相同組換え」には、相同性部位で２つのＤＮＡ分子間のＤＮＡ断片の交換が含まれる。相同組換えの頻度は、多数の因子によって影響を受ける。様々な生物は相同組換えの量および相同組換え対非相同組換えの相対比率に関して変動する。一般に、相同性の領域の長さは、相同組換え事象の頻度に影響を及ぼす：相同性領域が長いほど頻度は高くなる。相同組換えを観察するために必要とされる相同性領域の長さは、さらに種変動性でもある。多くの場合に、少なくとも５ｋｂの相同性が利用されてきたが、２５～５０ｂｐと小さい相同性を用いた相同組換えが観察されている。例えば、Ｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８２）Ｃｅｌｌ ３１：２５－３３；Ｓｈｅｎ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，（１９８６）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１２：４４１－５７；Ｗａｔｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４７６８－７２、Ｓｕｇａｗａｒａ ａｎｄ Ｈａｂｅｒ，（１９９２）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２：５６３－７５、Ｒｕｂｎｉｔｚ ａｎｄ Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，（１９８４）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ４：２２５３－８；Ａｙａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：５１９９－２０３；Ｌｉｓｋａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１５：１６１－７を参照されたい。
相同組換え修復（ＨＤＲ）は、細胞内の二本鎖および一本鎖ＤＮＡ切断を修復する機構である。相同組換え修復には、相同組換え（ＨＲ）および一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）が含まれる（Ｌｉｅｂｅｒ．２０１０ Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７９：１８１－２１１）。ＨＤＲの最も一般的な形態は、ドナーとアクセプターＤＮＡとの間の最長配列相同性要件を有する相同組換え（ＨＲ）と呼ばれる。ＨＤＲの他の形態には、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）および切断誘導性複製が含まれ、これらはＨＲに比較してより短い配列相同性を必要とする。ニックでの相同組換え修復（一本鎖切断）は、二本鎖切断でＨＤＲとは異なる機序によって発生する可能性がある（Ｄａｖｉｓ ａｎｄ Ｍａｉｚｅｌｓ．ＰＮＡＳ（００２７－８４２４），１１１（１０），ｐ．Ｅ９２４－Ｅ９３２）。
例えば、相同組換え（ＨＲ）を介しての細胞のゲノムの改変は、遺伝子組換えのための強力なツールである。植物における相同組換えのためのパラメーターは、導入され、短縮された選択可能マーカー遺伝子をレスキューすることによって主として調査されてきた。これらの実験では、相同性ＤＮＡ断片は、典型的には０．３ｋｂ～２ｋｂであった。相同組換えの観察された頻度は、約１０－４～１０－５であった。例えば、Ｈａｌｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２３１：１８６－９３；Ｏｆｆｒｉｎｇａ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）ＥＭＢＯ Ｊ ９：３０７７－８４；Ｏｆｆｒｉｎｇａ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：７３４６－５０；Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）ＥＭＢＯ Ｊ ７：４０２１－６；Ｈｏｕｒｄａ ａｎｄ Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ，（１９９４）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２４３：１０６－１１；およびＲｉｓｓｅｅｕｗ ｅｔ
ａｌ．，（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｊ ７：１０９－１９を参照されたい。
相同組換えは、昆虫において証明されている。ショウジョウバエでは、Ｄｒａｙ ａｎｄ Ｇｌｏｏｒは、３ｋｂという小さな全鋳型を見いだした：標的相同性は、合理的な効率で標的内にＤＮＡの大きな非相同セグメントをコピーするために十分であった（Ｄｒａｙ ａｎｄ Ｇｌｏｏｒ，（１９９７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４７：６８９－９９）。ショウジョウバエにおける標的ＦＲＴでのＦＬＰ媒介性ＤＮＡ組込みを使用して、Ｇｏｌｉｃらは、ドナーおよび標的が１．１ｋｂの相同性と比較して４．１ｋｂの相同性を共有した場合には組込みがおよそ１０倍効率的であることを証明した（Ｇｏｌｉｃ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５：３６６５）。ショウジョウバエからのデータは、２～４ｋｂの相同性が効率的ターゲティングのために十分であることを示しているが、約３０ｂｐ～約１００ｂｐでははるかに低い相同性で十分であるという幾つかの証拠が存在する（Ｎａｓｓｉｆ ａｎｄ Ｅｎｇｅｌｓ，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１２６２－６；Ｋｅｅｌｅｒ ａｎｄ Ｇｌｏｏｒ，（１９９７）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １７：６２７－３４）。
相同組換えは、さらに他の生物においても実施されてきた。例えば、寄生原虫であるリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）属における相同組換えのためには、少なくとも１５０～２００ｂｐの相同性が必要とされた（Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｕ ａｎｄ Ｄｕｍａｓ，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５：４２７８－８６）。糸状菌のアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）では、遺伝子置換えは５０ｂｐと少ない隣接相同性を用いて達成されている（Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２８：ｅ９７）。標的化遺伝子置換えは、さらに繊毛虫類であるテトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）においても証明されている（Ｇａｅｒｔｉｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２：５３９１－８）。哺乳類では、相同組換えは、培養中で増殖させ、形質転換させ、選択し、マウス胚中に導入することのできる多能性幹細胞系（ＥＳ）を使用して、マウスにおいて最も上首尾が得られた。挿入されたトランスジェニックＥＳ細胞を有する胚は、遺伝的子孫として発達する。同胞種を異種交配することによって、選択された遺伝子を有するホモ接合型マウスを得ることができる。このプロセスについての概説は、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，２ｎｄ Ｅｄ．，（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｂｙ ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．）；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，（１９８９）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ ５：７０－６；およびＢｒｏｎｓｏｎ，（１９９４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９：２７１５５－８に提供されている。マウス以外の哺乳類における相同組換えは、卵母細胞に移植できる、または胚を発生させることのできる幹細胞の欠如によって限定されている。しかし、ＭｃＣｒｅａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０５：１０６６－９（２０００）は、一次胚線維芽細胞内での形質転換および選択によるヒツジにおける上首尾の相同組換えについて報告した。
エラープローンＤＮＡ修復機構は、二本鎖切断部位で突然変異を作り出すことができる。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路は、切断された末端を１つに接合する最も一般的な修復機構である（Ｂｌｅｕｙａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（２００６）ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ ５：１－１２）。染色体の構造的完全性は、典型的には修復によって維持されるが、欠失、挿入または他の再配列が可能である。１つの二本鎖切断の２つの末端は、ＮＨＥＪの最も優勢な基質であるが（Ｋｉｒｉｋ ｅｔ ａｌ．，（２０００）ＥＭＢＯ Ｊ １９：５５６２－６）、しかし２つの異なる二本鎖切断が発生すると、異なる切断からの自由端はライゲーションすることができ、染色体欠失（Ｓｉｅｂｅｒｔ ａｎｄ Ｐｕｃｈｔａ，（２００２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １４：１１２１－３１）または異なる染色体間の染色体転座（Ｐａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １７５：２１－９）を生じさせる可能性がある。
エピソームＤＮＡ分子は、さらに二本鎖切断内にライゲーションする、例えば、染色体二本鎖切断内へＴ－ＤＮＡを組み込むことができる（Ｃｈｉｌｔｏｎ ａｎｄ Ｑｕｅ，（２００３）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １３３：９５６－６５；Ｓａｌｏｍｏｎ ａｎｄ Ｐｕｃｈｔａ，（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ １７：６０８６－９５）。二本鎖切断の周囲の配列が、例えば、二本鎖切断の成熟に関係するエキソヌクレアーゼ活性によって改変されると、遺伝子変換経路は、例えば非分割性体細胞もしくはＤＮＡ複製後の姉妹染色分体などの相同配列を利用できる場合は原初の構造を取り戻すことができる（Ｍｏｌｉｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １６：３４２－５２）。異所性および／または後成的ＤＮＡ配列もまた相同組換えのためのＤＮＡ修復鋳型として機能することができる（Ｐｕｃｈｔａ，（１９９９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５２：１１７３－８１）。
二本鎖切断がＤＮＡ内に導入されると、細胞のＤＮＡ修復機構は、切断を修復するように活性化される。エラープローンＤＮＡ修復機構は、二本鎖切断部位で突然変異を作り出すことができる。破損した末端を１つに結合させるための最も一般的な修復機構は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路である（Ｂｌｅｕｙａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（２００６）ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ ５：１－１２）。染色体の構造的完全性は、典型的には、修復により維持されるが、欠失、挿入またはその他の再配列も考えられる（Ｓｉｅｂｅｒｔ ａｎｄ Ｐｕｃｈｔａ，（２００２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １４：１１２１－３１；Ｐａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １７５：２１－９）。
または、二本鎖切断は、相同ＤＮＡ配列間の相同組換えによって修復することができる。二本鎖切断の周囲の配列が、例えば、二本鎖切断の成熟に関係しているエキソヌクレアーゼ活性によって改変されると、遺伝子変換経路は、例えば非分割性体細胞もしくはＤＮＡ複製後の姉妹染色分体などの相同配列を利用できる場合は原初の構造を取り戻すことができる（Ｍｏｌｉｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １６：３４２－５２）。異所性および／または後成的ＤＮＡ配列もまた相同組換えのためのＤＮＡ修復鋳型として機能することができる（Ｐｕｃｈｔａ，（１９９９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５２：１１７３－８１）。
ＤＮＡ二本鎖切断は、相同組換え経路を刺激するための効果的因子であると思われる（Ｐｕｃｈｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２８：２８１－９２；Ｔｚｆｉｒａ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，（２００５）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３：５６７－９；Ｐｕｃｈｔａ，（２００５）Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔ ５６：１－１４）。ＤＮＡ切断剤を使用すると、植物において人工的に構築された相同ＤＮＡ反復配列間で相同組換えの２～９倍の増加が観察された（Ｐｕｃｈｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２８：２８１－９２）。トウモロコシプロトプラスト内において、線状ＤＮＡ分子を用いた実験は、プラスミド間の強化された相同組換えを証明した（Ｌｙｚｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２３０：２０９－１８）。
ドナーＤＮＡは、当技術分野において公知の任意の手段によって導入することができる。ドナーＤＮＡは、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換もしくはバイオリスティック粒子衝突法を含む当技術分野において公知の任意の形質転換法によって提供することができる。ドナーＤＮＡは、細胞内で一過性で存在する可能性がある、またはウイルスレプリコンを介して導入することができよう。
ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系についてのさらなる使用は記載されており（例えば、それらの全部が参照により本明細書に組み込まれる２０１５年３月１９日に公開された米国特許出願公開第２０１５－００８２４７８Ａ１号明細書、２０１５年２月２６日に公開された国際公開第２０１５／０２６８８６Ａ１号パンフレット、２０１５年２月２６日に公開された米国特許出願公開第２０１５－００５９０１０Ａ１号明細書、２０１４年７月７日に出願された米国特許出願第６２／０２３２４６号明細書および２０１４年８月１３日に出願された米国特許出願第６２／０３６，６５２号明細書を参照されたい）、関心対象のヌクレオチド配列（例えば調節要素）を修飾もしくは置き換える方法、関心対象のポリヌクレオチドの挿入、遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックイン、スプライシング部位の修飾および／またはまた別のスプライシング部位の導入、関心対象のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の修飾、アミノ酸および／またはタンパク質融合ならびに関心対象の遺伝子内へ逆反復配列を発現することによる遺伝子サイレンシングが含まれる。
本開示の１つの実施形態では、本方法は、そのゲノム内に修飾ヌクレオチド配列を含む細胞を選択するための方法であって：ａ）ガイドポリヌクレオチド、保護ポリヌクレオチド修飾鋳型およびＣａｓエンドヌクレアーゼを細胞に提供する工程であって、ここで前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドポリヌクレオチドは前記細胞のゲノム内の標的部位で一本鎖もしくは二本鎖切断を導入することができる複合体を形成することができ、前記保護ポリヌクレオチド修飾鋳型は、前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含む工程；およびｂ）工程（ａ）から前記修飾ヌクレオチド配列を含む細胞を選択する工程を含む方法を含む。保護ポリヌクレオチド修飾鋳型は、その５’末端、３’末端ならびに５’末端および３’末端の両方で少なくとも１つの保護分子を含む線状ポリヌクレオチドであってよい、または環状分子であってよい。保護分子は、アルカンスペーサー、蛍光体、ＮＨＳエステル、ジゴキシゲン、コレステリル－ＴＥＧ、Ｃ６、Ｃ１２、ヘキシニル、Ｏｘｔａｄｉｙｎｙｌ ｄＵＴＰ、ビオチン、ジチオール、逆ジデオキシ－Ｔ修飾またはそれらの任意の１つの組合せからなる群から選択できる。保護ポリヌクレオチド修飾鋳型は、少なくとも１本の鎖の５’末端で少なくとも１つのホスホロチエート結合を含む二本鎖線状分子であってよい。保護ポリヌクレオチド修飾鋳型は、各鎖の５’末端上で３炭素アルカリスペーサーを含む二本鎖線状分子であってよい。保護ポリヌクレオチド鋳型の少なくとも１つのヌクレオチド修飾は、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換え、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入および（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組合せからなる群から選択することができる。
本明細書に記載した方法および組成物は、ガイドポリヌクレオチド、保護ポリヌクレオチド修飾鋳型およびＣａｓエンドヌクレアーゼを使用し、遺伝子組換え（例えば関心対象のポリヌクレオチドを導入する、遺伝子を編集する、もしくは代謝経路の一部である遺伝子を修飾する）のために使用できる。
本明細書に記載した方法は、代謝経路工学（代謝工学）および／または遺伝子組換えされてきた組換え微生物細胞を生成するために使用できる。所定の実施形態における組換え微生物細胞は、本明細書に記載した方法を使用する代謝工学のために遺伝子を欠失させることによって遺伝子組み換えされてきた微生物細胞であってよい。所定の実施形態における組換え微生物細胞は、例えばＰＵＦＡなどの増加した量の全脂質および／または脂肪酸を生成するために遺伝子組換えされてきた微生物細胞であってよい。例えば、脂肪酸もしくはＰＵＦＡ生合成経路またはその一部は、例えば脂肪酸デサチュラーゼおよびエロンガーゼなどの所定の経路酵素のためにコーディング配列を挿入することによって生物に導入することができる。下記の酵素：δ－４デサチュラーゼ、δ－５デサチュラーゼ、δ－６デサチュラーゼ、δ－１２デサチュラーゼ、δ－１５デサチュラーゼ、δ－１７デサチュラーゼ、δ－９デサチュラーゼ、δ－８デサチュラーゼ、δ－９エロンガーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、Ｃ２０／２２エロンガーゼの１つもしくは組合せは、その中にＰＵＦＡ生合成経路を提供するために油脂性酵母細胞に遺伝的に導入することができる。これらの酵素の１つ以上は、異種起源由来であってよい。典型的なＰＵＦＡ生合成経路は、δ－９エロンガーゼおよびδ－８デサチュラーゼの両方（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１－００５５９７３号明細書を参照されたい）またはδ－６デサチュラーゼおよびδ－６エロンガーゼの両方を含有する可能性がある。または、組換え微生物細胞は、脂肪酸生合成を調節する、デサチュラーゼもしくはエロンガーゼをコードする遺伝子以外の遺伝子を導入もしくは欠失させることによって、増加した全脂質および／またはＰＵＦＡレベルを有するように修飾することができる。
所定の実施形態における組換え微生物細胞は、乾燥細胞重量の重量％として測定して少なくとも２８％のＥＰＡを含む油を生成する、およびＳｏｕ２ソルビトール利用タンパク質をコードする内在性ポリヌクレオチド配列および膜結合型Ｏ－アシルトランスフェラーゼモチーフ内に少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む活性ＬＰＣＡＴ酵素をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列のダウンレギュレーションを含むヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属細胞であってよい（参照により本明細書に組み込まれる２０１３年１２月１８日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７８９５号明細書）。
組換え微生物細胞は、酵母、カビ、真菌、卵母細胞、細菌、藻類、ストラメノパイルもしくは原生生物（例えば、ユーグレナ）の細胞であってよい。所定の実施形態では、組換え微生物細胞は、例えば油脂性酵母細胞などの油脂性微生物細胞である。油脂性酵母の例としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属およびリポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属の種が挙げられる。油脂性酵母のより特定の例としては、例えば、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポミセス・スターケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェルス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プルケリマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユティリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン・プランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ・グルティヌス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｕｓ）およびＲ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）が挙げられる。所定の実施形態における真菌細胞の例としては、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属（例えば、フザリウム・ラテリティウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｌａｔｅｒｉｔｉｕｍ））、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属（例えば、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ））およびムコール（Ｍｕｃｏｒ）属（例えば、ムコール・ロキシイ（Ｍｕｃｏｒ ｒｏｕｘｉｉ）およびムコール・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ））が挙げられる。本明細書に開示した他の実施形態では、微生物細胞は、エントモフトラ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ）属、ピチウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）属およびポルフィリジウム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）属の微生物細胞であってよい。
本明細書では関心対象のポリヌクレオチドについて詳細に記載するが、商業市場および作物の開発に関係する商業市場の関心を反映するポリヌクレオチドが含まれる。関心対象の作物および市場は変化し、開発途上国が世界市場を広げるにつれて、さらに新規な作物およびテクノロジーもまた出現するであろう。さらに、農業形質ならびに産出量および雑種強勢などの特徴に関する我々の理解が高まるにつれて、遺伝子組換えのための遺伝子の選択はこれに応じて変化するであろう。
さらに提供されるのは、そのゲノム内に標的部位でターゲティングされる関心対象のポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を同定するための方法である。標的部位もしくは標的部位の近くでゲノム内への挿入を含むそれらの細胞をスクリーニング可能マーカー表現型を使用せずに同定するためには、様々な方法を利用することができる。そのような方法は、ＰＣＲ法、シークエンシング法、ヌクレアーゼ消化法、サザンブロット法およびそれらの任意の組合せを含むがそれらに限定されない標的配列内の何らかの変化を検出するために標的配列を直接的に分析する工程であると見なすことができる。例えば、本明細書に記載した方法のために必要な程度まで参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２／１４７，８３４号明細書を参照されたい。
関心対象のポリヌクレオチド／ポリペプチドには、微生物代謝経路遺伝子、除草剤耐性コーディング配列、殺虫剤耐性コーディング配列、殺線虫性コーディング配列、抗菌コーディング配列、抗真菌コーディング配列、抗ウイルスコーディング配列、非生物および非生物的ストレス耐性コーディング配列もしくは例えば産出量、穀粒品質、栄養素量、デンプンの品質および量、窒素の固定および／または利用、脂肪酸および油分および／または油成分などの植物形質を修飾する配列が含まれるがそれらに限定されない。関心対象の遺伝子の一般的カテゴリーには、例えば、ジンクフィンガーなどの情報に関係する遺伝子、キナーゼなどのコミュニケーションに包含される遺伝子および熱ショックタンパク質などのハウスキーピングに関係する遺伝子が含まれる。トランス遺伝子のより特異的カテゴリーには、例えば、農業、昆虫耐性、疾患耐性、除草剤耐性、妊孕性もしく不稔性、穀粒の特徴および商業的製品にとって重要な形質をコードする遺伝子が含まれる。関心対象の遺伝子には、一般に、油、デンプン、炭水化物もしくは栄養素代謝に関係する遺伝子、ならびに殻のサイズ、スクロース負荷に影響を及ぼす遺伝子および本明細書に記載した除草剤耐性などであるがそれらに限定されない他の形質と組み合わせて積み重ねる、または使用できる遺伝子が含まれる。
例えば油、デンプンおよびタンパク質含量などの農業的に重要な形質は、伝統的な育種法を使用することに加えて遺伝的に改変することができる。修飾には、オレイン酸、飽和酸および不飽和酸の含量を増加させる工程、リシンおよび硫黄のレベルを増加させる工程、必須アミノ酸を提供する工程およびさらにデンプンの修飾が含まれる。ホルドチオニンタンパク質修飾は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７０３，０４９号明細書、同第５，８８５，８０１号明細書、同第５，８８５，８０２号明細書および同第５，９９０，３８９号明細書に記載されている。
さらに、関心対象のポリヌクレオチドは、さらに関心対象の標的化遺伝子配列のためのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の少なくとも一部分に対して相補的であるアンチセンス配列も含むことができる。アンチセンスヌクレオチドは、対応するｍＲＮＡとハイブリダイズするために構築される。アンチセンス配列の修飾は、その配列が対応するｍＲＮＡとハイブリダイズして対応するｍＲＮＡの発現を妨害する限り作成することができる。この方法で、対応するアンチセンス配列に対する７０％、８０％もしくは８５％の配列同一性を有するアンチセンス構築物を使用することができる。さらに、標的遺伝子の発現を崩壊させるためにアンチセンスヌクレオチドの部分が使用されてもよい。一般に、少なくとも５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチドまたはそれ以上の配列を使用できる。
さらに、関心対象のポリヌクレオチドは、さらに関心対象の生物内の内在性遺伝子の発現を抑制するためにセンス方向で使用することもできる。センス方向にあるポリヌクレオチドを使用して微生物および植物中の遺伝子発現を抑制するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，２８３，１８４号明細書および同第５，０３４，３２３号明細書を参照されたい。
関心対象のポリヌクレオチドは、さらに表現型マーカーであってよい。表現型マーカーは、陽性選択可能マーカーであるか陰性選択可能マーカーであるかにかかわらず、視覚マーカーおよび選択可能マーカーを含むスクリーニング可能または選択可能マーカーである。任意の表現型マーカーを使用することができる。詳細には、選択可能もしくはスクリーニング可能マーカーは、多くの場合は特定の条件下で、１つの分子もしくはこの分子を含有する細胞を同定する、またはこの分子もしくは細胞に有利もしくは不利に選択することを可能にするＤＮＡセグメントを含む。これらのマーカーは、ＲＮＡ、ペプチドもしくはタンパク質の産生などであるがそれらに限定されない活性をコードすることができる、またはＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、無機化合物および有機化合物または組成物などのための結合部位を提供することができる。
選択可能マーカーの例としては、それらに限定されないが、制限酵素部位を含むＤＮＡセグメント；例えばスペクチノマイシン、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、Ｂａｓｔａ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）などの抗生物質を含む、他の点では毒性の化合物に対する耐性を提供する産物をコードするＤＮＡセグメント；レシピエント細胞において他の点では欠失している産物をコードするＤＮＡセグメント（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）；容易に同定できる産物をコードするＤＮＡセグメント（例えば、β－ガラクトシダーゼ、ＧＵＳ；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン（ＣＦＰ）、黄色（ＹＦＰ）、赤色（ＲＦＰ）および細胞表面タンパク質などの表現型マーカー）；ＰＣＲにとっての新規のプライマー部位（例えば、以前には並置されていなかった２つのＤＮＡ配列の並列）の生成、制限エンドヌクレアーゼもしくは他のＤＮＡ修飾酵素、化学物質などの作用を受けていない、または受けたＤＮＡ配列の含有ならびにその同定を可能にする特異的修飾（例えば、メチル化）のために必要とされたＤＮＡ配列の包含が挙げられる。
追加の選択可能マーカーには、例えばグルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノンおよび２，４－ジクロロフェノキシアセテート（２，４－Ｄ）などの除草性化合物に対する耐性を付与する遺伝子が含まれる。例えば、Ｙａｒｒａｎｔｏｎ，（１９９２）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３：５０６－１１；Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６３１４－８；Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｃｅｌｌ ７１：６３－７２；Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，（１９９２）Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６：２４１９－２２；Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｃｅｌｌ ４８：５５５－６６；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｃｅｌｌ ４９：６０３－１２；Ｆｉｇｇｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｃｅｌｌ ５２：７１３－２２；Ｄｅｕｓｃｈｌｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４００－４；Ｆｕｅｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２５４９－５３；Ｄｅｕｓｃｈｌｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：４８０－３；Ｇｏｓｓｅｎ，（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｒｅｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１９１７－２１；Ｌａｂｏｗ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０：３３４３－５６；Ｚａｍｂｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：３９５２－６；Ｂａｉｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：５０７２－６；Ｗｙｂｏｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９：４６４７－５３；Ｈｉｌｌｅｎ ａｎｄ Ｗｉｓｓｍａｎ，（１９８９）Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｏｌ Ｓｔｒｕｃ Ｂｉｏｌ １０：１４３－６２；Ｄｅｇｅｎｋｏｌｂ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ３５：１５９１－５；Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：１０９４－１０４；Ｂｏｎｉｎ，（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７－５１；Ｏｌｉｖａ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ３６：９１３－９；Ｈｌａｖｋａ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７８ （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）；Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：７２１－４を参照されたい。商業的形質は、さらに例えばエタノール産生のためにデンプンを増加させられる、またはタンパク質の発現を提供できる１つ以上の遺伝子上でコードすることもできる。形質転換微生物もしくは植物のまた別の重要な商業的使用は、例えば米国特許第５，６０２，３２１号明細書に記載されているポリマーおよびバイオプラスチックの生成である。例えばβ－ケトチオラーゼ、ＰＨＢａｓｅ（ポリヒドロキシブチレートシンターゼ（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙｂｕｒｙｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ））およびアセトアセチル－ＣｏＡレダクターゼ（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：５８３７－５８４７を参照されたい）などの遺伝子は、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の発現を促進する。
本明細書で使用するための選択方法は、カナマイシン、ハイグロマイシンおよびアミノグリコシドＧ４１８に対する耐性ならびにウラシル、ロイシン、リシン、トリプトファンもしくはヒスチジンが欠如する培地上で増殖する能力である。また別の実施形態では、５－フルオロオロチン酸（５－フルオロウラシル－６－カルボン酸一水和物［５－ＦＯＡ］）が酵母Ｕｒａ－突然変異体（米国特許出願公開第２００９－００９３５４３号明細書）の選択のために使用される、またはスルホニルウレア系除草剤耐性（国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット）を付与する天然アセトヒドロキシ酸シンターゼ（もしくはアセト乳酸シンターゼ；Ｅ．Ｃ．４．１．３．１８）が形質転換体を選択するために利用される。部位特異的リコンビナーゼ系を使用することによって、好ましい選択マーカー対を複数の連続的形質転換において使用するために「リサイクリング」するための固有の方法は、さらに米国特許出願公開第２００９－００９３５４３号明細書に教示されている。
転写、ＲＮＡ安定性、翻訳、タンパク質安定性ならびにタンパク質位置決め、酸素制限および宿主細胞からの分泌の態様を制御する本明細書に開示された実施形態では多数の様々な遺伝要素を操作するのが望ましい場合がある。より詳細には、遺伝子発現は、下記の：関連プロモーターおよびターミネーター配列の性質；クローン化遺伝子のコピー数；遺伝子がプラスミド由来であるか、宿主細胞のゲノム内に組み込まれているのかどうか；合成異種タンパク質の最終細胞部位；宿主生物内の翻訳効率；宿主細胞内のクローン化遺伝子タンパク質の内在性安定性；およびその頻度が例えば宿主細胞の好ましいコドン使用の頻度に近付くようなクローン化遺伝子内のコドン使用を改変することによって制御することができる。
微生物宿主細胞内の異種遺伝子の発現を駆動するために有用なプロモーターは数多くあり、当業者には公知である。発現は、誘導法もしくは構成的方法で実施することができる。誘導発現は、関心対象の遺伝子に機能的に結合した調節可能なプロモーターの活性を誘導することによって実施できるが、構成的発現は、関心対象の遺伝子に機能的に結合した構成的プロモーターの使用によって達成できる。遺伝子の発現を指令できる実質的に任意のプロモーター（すなわち、天然、合成もしくはキメラ）は好適であるが、宿主種からの転写および翻訳調節領域は、特別に有用な可能性がある。
一般に、ターミネーターは、それからプロモーターが得られた遺伝子の３’領域または異なる遺伝子由来であってよい。極めて多数のターミネーターが公知であり、それらが由来した同一もしくは異なる属および種の両方において利用されると、様々な宿主において満足できるように機能する。ターミネーターは、通常は任意の特別な特性のためではなくもむしろより便宜的な物質として選択される。好ましくは、ターミネーターは、酵母遺伝子に由来する。ターミネーターはさらに、当業者であればターミネーターを設計および合成するために利用可能な情報を利用できるので、合成であってもよい。ターミネーターは、不可欠ではないが、存在するのが好ましい。
制限されることを意図していないが、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属の組換え微生物宿主細胞において使用するための好ましいプロモーターおよびターミネーターは、それらの全部が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９－００９３５４３号明細書、同第２０１０－００６８７８９号明細書、同第２０１１－００５９４９６号明細書、同第２０１２－０２５２０７９号明細書、同第２０１２－０２５２０９３号明細書、同第２０１３－００８９９１０号明細書および同第２０１３－００８９９１１号明細書の中で教示されたものである。
トランス遺伝子、組換えＤＮＡ分子、関心対象のＤＮＡ配列および関心対象のポリヌクレオチドは、遺伝子サイレンシングのための１つ以上のＤＮＡ配列を含むことができる。細胞および生物におけるＤＮＡ配列の発現を包含する遺伝子サイレンシングのための方法は、当技術分野において公知であり、共抑制、アンチセンス抑制、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）干渉、ヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）干渉、イントロン含有ヘアピンＲＮＡ（ｉｈｐＲＮＡ）干渉、転写遺伝子サイレンシングおよびミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）干渉が含まれるがそれらに限定されない。
本明細書で使用する「核酸」は、ポリヌクレオチドを意味しており、デオキシリボヌクレオチド塩基もしくはリボヌクレオチド塩基の一本鎖もしくは二本鎖ポリマーを含む。核酸は、さらに断片および修飾ヌクレオチドを含むこともできる。
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」および「核酸断片」は、任意選択的に合成、非天然もしくは改変ヌクレオチド塩基を含有する一本鎖または二本鎖であるＲＮＡおよび／またはＤＮＡのポリマーを示すために互換的に使用される。ヌクレオチド（通常は５’－一リン酸塩形で見いだされる）は、次の一文字名称で呼ばれる：アデノシンもしくはデオキシアデノシン（それぞれＲＮＡもしくはＤＮＡに対して）に対して「Ａ」、シトシンもしくはデオキシシトシンに対しては「Ｃ」、グアノシンもしくはデオキシグアノシンに対しては「Ｇ」、ウリジンに対しては「Ｕ」、デオキシチミジンに対しては「Ｔ」、プリン（ＡもしくはＧ）に対しては「Ｒ」、ピリミジン（ＣまたはＴ）に対しては「Ｙ」、ＧもしくはＴに対しては「Ｋ」、ＡもしくはＣもしくはＴに対しては「Ｈ」、イノシンに対しては「Ｉ」および任意のヌクレオチドに対しては「Ｎ」（例えば、ＤＮＡ配列について言及する場合は、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＴもしくはＧであってよく；ＲＮＡ配列について言及する場合は、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＵもしくはＧであってよい）。本明細書に開示した任意のＲＮＡ配列（例えば、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ）は、好適なＤＮＡ配列によってコードされてよい。
「オープンリーディングフレーム」は、ＯＲＦと略記する。
「機能的に同等である小断片」および「機能的に同等の小断片」は、本明細書では互換的に使用される。これらの用語は、遺伝子発現を改変する、または所定の表現型を生成する能力が、断片もしくは小断片が活性酵素をコードするか否かにかかわらず維持されている単離核酸断片の一部分もしくは小断片を意味する。例えば、断片もしくは小断片は、微生物もしくは植物において所望の表現型を生成するために遺伝子の設計において使用できる。遺伝子は、プロモーター配列に対してセンスもしくはアンチセンス方向で、活性酵素をコードするか否かにかかわらず、それらの核酸断片もしくは小断片を結合することによって抑制において使用するために設計できる。
用語「保存ドメイン」もしくは「モチーフ」は、進化的に関連するタンパク質のアラインメントされた配列に沿って特定位置で保存された１セットのアミノ酸を意味する。他の位置でのアミノ酸は相同タンパク質間で変動する可能性があるが、特定位置で高度に保存されているアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性もしくは活性にとって必須であるアミノ酸を指示する。それらは１ファミリーのタンパク質ホモログのアラインメントされた配列内のそれらの高度の保存度によって同定されるために、それらは、新規に決定された配列を備えるタンパク質が以前に同定されたタンパク質ファミリーに属するかどうかを決定するために、識別子もしくは「シグネチャー」として使用できる。
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列、それらの変異体およびこれらの配列の構造的関係は、本明細書では互換的に使用される用語「相同性」、「相同」、「実質的に同一」、「実質的に類似」および「実質的に対応する」によって記載することができる。これらは、ポリペプチドもしくは核酸断片に関するが、ここで１つ以上のアミノ酸もしくはヌクレオチド塩基における変化は例えば遺伝子発現を媒介する、または所定の表現型を生成する能力などの分子の機能には影響を及ぼさない。これらの用語はさらに、初期の未修飾断片に対して結果として生じた核酸断片の機能的特性を実質的には改変しない核酸断片の修飾も意味する。これらの修飾には、核酸断片内の１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換および／または挿入が含まれる。
包含された実質的に類似の核酸配列は、それらが（例えば、０．５×のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、６０℃の中ストリンジェンシー条件下で）本明細書に例示した配列または本明細書に開示した核酸配列のいずれかと機能的に同等であり、本明細書に開示した、または本明細書に開示した核酸配列のいずれかと機能的同等であるヌクレオチド配列のいずれかの部分とハイブリダイズする能力によって規定できる。ストリンジェンシー条件は、例えば遠縁の生物由来の相同配列などの中等度に類似の断片から、例えば近縁の生物由来の機能的酵素を複製する遺伝子などの高度に類似の断片までをスクリーニングするために調整することができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄がストリンジェンシー条件を決定する。
用語「選択的にハイブリダイズする」には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、核酸配列の、非標的核酸配列および非標的核酸の実質的排除へのハイブリダイゼーションに比較して特定の核酸標的配列への検出可能に大きな程度（例えば、バックグラウンドに比較して少なくとも２倍）のハイブリダイゼーションについての言及が含まれる。選択的にハイブリダイズする配列は、典型的には相互に少なくとも８０％の配列同一性もしくは９０％の配列同一性および１００％までの配列同一性（すなわち、完全相補的）を有する。
用語「ストリンジェントな条件」もしくは「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」には、プローブがｉｎ ｖｉｔｒｏハイブリダイゼーションアッセイにおいてその標的配列に選択的にハイブリダイズするであろう条件についての言及が含まれる。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、様々な状況において異なるであろう。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することによって、プローブと１００％相補的である標的配列を同定することができる（相同プロービング）。または、ストリンジェンシー条件は、低い程度の類似性が検出されるように配列内での一部のミスマッチを許容するように調整することができる（非相同プロービング）。一般に、プローブは、長さが約１，０００ヌクレオチド未満、任意選択的に長さが５００ヌクレオチド未満である。
典型的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０～８．３、および短鎖プローブ（例えば、１０～５０ヌクレオチド）に対しては少なくとも約３０℃および長鎖プローブ（例えば、５０ヌクレオチド超）に対しては少なくとも約６０℃で、塩濃度が約１．５ＭのＮａイオン、典型的には約０．０１～１．０ＭのＮａイオン濃度（もしくは他の塩）である条件であろう。ストリンジェントな条件は、さらにまた例えばホルムアミドなどの脱安定化剤の添加により達成することができる。典型的な低ストリンジェンシー条件には、３７℃での３０～３５％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（硫酸ドデシルナトリウム）のバッファー溶液を用いたハイブリダイゼーションおよび５０～５５℃での１×～２×のＳＳＣ（２０×のＳＳＣ＝３．０ＭのＮａＣｌ／０．３Ｍのクエン酸三ナトリウム）中での洗浄が含まれる。典型的な中ストリンジェンシー条件には、３７℃での４０～４５％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ中でのハイブリダイゼーションおよび５５～６０℃での０．５×～１×のＳＳＣ中での洗浄が含まれる。典型的な高ストリンジェンシー条件には、３７℃での５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ中でのハイブリダイゼーションおよび６０～６５℃での０．１×のＳＳＣ中での洗浄が含まれる。
核酸配列もしくはポリペプチド配列の状況における「配列同一性」もしくは「同一性」は、特定の比較窓全体にわたり最大の一致に対してアラインメントされた場合に同一である２つの配列における核酸塩基もしくはアミノ酸残基を意味する。
用語「配列同一性のパーセンテージ」は、比較窓全体にわたり２つの適切にアラインメントされた配列を比較することにより決定される数値を意味しており、比較窓中のポリヌクレオチド配列もしくはポリペプチド配列の部分は、これら２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加もしくは欠失（すなわち、ギャップ）を含む場合がある。パーセンテージは、配列同一性のパーセンテージを得るために、マッチした位置数を生じさせるために両方の配列内で同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が発生する位置の数を決定し、マッチした位置数を比較窓内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けることによって計算される。配列同一性率（％）の有用な例としては、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％または５０％～１００％の任意の整数パーセンテージが挙げられるがこれらに限定されない。これらの同一性は、本明細書に記載したプログラムのいずれかを使用して決定することができる。
配列アラインメントおよび同一性率（％）もしくは類似性の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムが挙げられるがこれに限定されない相同配列を検出するために設計された様々な比較方法を使用して決定することができる。本出願の状況内では、配列分析ソフトウェアが分析に使用される場合は、他に規定されない限り、分析結果は、言及したプログラムの「デフォルト値」をベースとすることは理解されるだろう。本明細書で使用する「デフォルト値」は、最初に初期化されるとソフトウェアで最初にロードされる数値もしくはパラメーターの任意のセットを意味するであろう。
「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法」は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１－１５３、Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｃｏｍｐｕｔ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ ８：１８９－１９１により説明されている）と表示されており、およびＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム中で見出されるアラインメント法に対応する。多重アラインメントの場合、デフォルト値は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に対応する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用するタンパク質配列のペアワイズアラインメントおよび同一性率（％）の算出用のデフォルトパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸の場合、これらのパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖプログラムを使用した配列のアラインメントの後、同一プログラム中の「配列距離」表を調べることにより、「同一性率（％）」を得ることができる。
「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法」は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１－１５３、Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｃｏｍｐｕｔ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ ８：１８９－１９１により説明されている）と表示されているおよびＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム中で見出されるアラインメント法に対応する。多重アラインメント用のデフォルトパラメーター（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ Ｄｉｖｅｒｇｅｎ Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを使用した配列のアラインメントの後、同一プログラム中の「配列距離」表を調べることにより、「同一性率（％）」を得ることができる。
他に言及しない場合は、本明細書で提供する配列同一性／類似性値は、下記のパラメーター：ＧＡＰ生成ペナルティ重量５０およびＧＡＰ長伸長ペナルティ重量３およびｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐ ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘを使用したヌクレオチド配列に対する同一性率（％）および類似性率（％）；ＧＡＰ生成ペナルティ重量８およびＧＡＰ長伸長ペナルティ２およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する、ＧＡＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０（ＧＣＧ，Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して得られた数値を意味する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５）。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４８：４４３－５３のアルゴリズムを使用してマッチの数を最大化してギャップの数を最小限に抑える２つの完全配列のアラインメントを見出す。ＧＡＰは、全ての可能なアラインメントおよびギャップ位置を考慮し、一致した塩基の単位でギャップ生成ペナルティおよびギャップ伸長ペナルティを使用して、マッチした塩基の最大数および最小のギャップを有するアラインメントを作成する。
「ＢＬＡＳＴ」は、生物学的配列間の類似性領域を見いだすために使用される、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）によって提供される探索アルゴリズムである。このプログラムは、ヌクレオチドもしくはタンパク質配列を配列データベースと比較し、類似性が無作為に発生したとは予測されないクエリー配列との十分な類似性を有する配列を同定するためにマッチの統計的有意性を計算する。ＢＬＡＳＴは、同定された配列およびクエリー配列に対するそれらの局所的アラインメントを報告する。
多数のレベルの配列同一性は、他の種由来のポリペプチドまたはそのようなポリペプチドが同一もしくは類似の機能もしくは活性を有する場合に自然もしくは合成的に修飾されているポリペプチドを同定する際に有用であることは当業者によって明確に理解されるだろう。同一性率（％）の有用な例としては、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％または５０％～１００％の任意の整数パーセンテージが挙げられるがこれらに限定されない。実際に、５０％～１００％の、例えば５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の任意の整数のアミノ酸同一性は、本開示を記載する際に有用である可能性がある。
「遺伝子」には、例えば、コーディング配列に先行する（５’非コーディング配列）および後続する（３’非コーディング配列）調節配列を含む、特異的タンパク質などであるがそれには限定されない機能的分子を発現する核酸断片が含まれる。「天然遺伝子」は、自己の調節配列を備えて自然で見出される遺伝子を意味する。
「突然変異遺伝子」は、ヒトが介入して改変されている遺伝子である。そのような「突然変異遺伝子」は、少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失もしくは置換によって、対応する非突然変異遺伝子の配列とは異なる配列を有する。本開示の所定の実施形態では、突然変異遺伝子は、本明細書に開示したガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系から結果として生じる改変を含む。突然変異細胞は、突然変異遺伝子を含む細胞である。
本明細書で使用する「標的化突然変異」は、本明細書で開示した、または当技術分野で公知である標的配列のＤＮＡ内に二本鎖切断を導入することができる二本鎖切断誘導剤を包含する方法を使用して、天然遺伝子内の標的配列を改変することによって作成された天然遺伝子内での突然変異である。
ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ誘導性標的化突然変異は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼによって認識および切断されるゲノム標的部位内もしくは外に位置するヌクレオチド配列内で発生する可能性がある。
細胞に適用される場合の用語「ゲノム」は、核内で見出される染色体ＤＮＡだけでなく、細胞の細胞内成分（例えば、ミトコンドリアもしくはプラスミド）内で見出されるオルガネラＤＮＡも包含する。
「コドン修飾遺伝子」もしくは「コドン優先遺伝子」もしくは「コドン最適化遺伝子」は、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度を模倣するように設計されているコドン使用頻度を有する遺伝子である。
「対立遺伝子」は、染色体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子の数種の代替形の１つである。染色体上の所定の遺伝子座に存在する対立遺伝子全部が同一である場合は、その生物はその遺伝子座ではホモ接合性である。染色体上の所定の遺伝子座に存在する対立遺伝子が異なる場合は、その生物はその遺伝子座ではヘテロ接合性である。
「コーディング配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を意味する。「調節配列」は、コーディング配列の上流（５’非コーディング配列）、コーディング配列内またはコーディング配列の下流（３’非コーディング配列）に位置しており、関連するコーディング配列の転写、ＲＮＡのプロセシングもしくは安定性または翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を意味する。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、５’非翻訳配列、３’非翻訳配列、イントロン、ポリアデニル化標的配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステム－ループ構造が含まれる可能性があるがこれらに限定されない。
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写を開始する他のタンパク質の認識および結合に関係するＤＮＡの領域である。プロモーター配列は、近位およびより遠位の上流要素からなり、後者の要素はエンハンサーと称されることが多い。「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激できるＤＮＡ配列であり、プロモーターの固有の要素であってもよい、またはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を増強するために挿入された異種要素であってもよい。プロモーターは、それらの全体が天然遺伝子に由来してよい、または自然界で見出される様々なプロモーターに由来する様々な要素から構成されてよい、および／または合成ＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。様々なプロモーターが、様々な組織型もしくは細胞型で、または様々な発達段階で、または様々な環境条件に応じて、遺伝子の発現を指令できることは当業者に理解されている。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界が完全には定義されていないので、一部の変動を備えるＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有する可能性があることもさらに認識されている。ほとんどの場合の大多数の細胞型で遺伝子が発現することを引き起こすプロモーターは、一般には「構成的プロモーター」と呼ばれる。
本明細書で使用する「強力プロモーター」は、単位時間当たり相当に多数の生成開始を指令できるプロモーター、および／または細胞内の遺伝子の平均転写レベルよりも高いレベルの遺伝子転写を駆動するプロモーターである。
植物プロモーターは、植物細胞において転写を開始できるプロモーターであり、植物プロモーターの概説については、Ｐｏｔｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ４０：１－２２を参照されたい。構成的プロモーターには、例えば、国際公開第９９／４３８３８号パンフレットおよび米国特許第６，０７２，０５０号明細書に開示されたＲｓｙｎ７プロモーターのコアプロモーターおよび他の構成的プロモーター、コアＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０－２）；ライスアクチン（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１６３－７１）；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １２：６１９－３２；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １８：６７５－８９）；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ ８１：５８１－８）；ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ ３：２７２３－３０）；ＡＬＳプロモーター（米国特許第５，６５９，０２６号明細書）などが含まれる。他の構成プロモーターは、例えば、米国特許第５，６０８，１４９号明細書、同第５，６０８，１４４号明細書、同第５，６０４，１２１号明細書、同第５，５６９，５９７号明細書、同第５，４６６，７８５号明細書、同第５，３９９，６８０号明細書、同第５，２６８，４６３号明細書、同第５，６０８，１４２号明細書および同第６，１７７，６１１号明細書に記載されている。一部の例では、誘導性プロモーターを使用することができる。病原体による感染後に誘導される病原体誘導性プロモーターには、限定はされないが、ＰＲタンパク質、ＳＡタンパク質、β－１，３－グルカナーゼ、キチナーゼなどの発現を調節するプロモーターが含まれる。
化学調節プロモーターは、外在性化学調節因子の適用によって植物内の遺伝子の発現を調節するために使用することができる。プロモーターは、化学物質の適用が遺伝子発現を誘導する化学誘導性プロモーターであっても、化学物質の適用が遺伝子発現を抑制する化学抑制性プロモーターであってもよい。化学誘導性プロモーターには、限定はされないが、ベンゼンスルホンアミド除草剤解毒剤によって活性化されるトウモロコシＩｎ２－２プロモーター（Ｄｅ Ｖｅｙｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３８：５６８－７７）、発芽前除草剤として使用される疎水性求電子性化合物によって活性化されるトウモロコシＧＳＴプロモーター（ＧＳＴ－ＩＩ－２７、国際公開第９３／０１２９４号パンフレット）およびサリチル酸によって活性化されるタバコＰＲ－１ａプロモーター（Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６８：８０３－７）が含まれる。その他の化学調節プロモーターには、ステロイド応答性プロモーター（例えば、グルココルチコイド誘導性プロモーター（Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０４２１－５；ＭｃＮｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｊ １４：２４７－２５７を参照されたい）；テトラサイクリン誘導性およびテトラサイクリン抑制性プロモーター（Ｇａｔｚ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２２７：２２９－３７；米国特許第５，８１４，６１８号明細書および同第５，７８９，１５６号明細書を参照されたい）が含まれる。
組織優先プロモーターは、特定の植物組織内での強化された発現をターゲティングするために使用することができる。組織優先プロモーターには、例えば、Ｋａｗａｍａｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３８：７９２－８０３；およびＧｕｅｖａｒａ－Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｊ ４：４９５－５０５が含まれる。種子優先プロモーターには、種子の発生中に活性な種子特異的プロモーターおよび種子の発芽中に活性な種子発芽プロモーターの両方が含まれる。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）ＢｉｏＥｓｓａｙｓ １０：１０８を参照されたい。
用語「誘導性プロモーター」は、例えば化学的化合物（化学的誘導因子）によって内在性もしくは外在性刺激の存在に応答して、または環境、ホルモン、化学的および／または発育シグナルに応答してコーディング配列もしくは機能的ＲＮＡを選択的に発現するプロモーターを意味する。誘導性もしくは調節プロモーターには、例えば、光、熱、ストレス、洪水もしくは渇水、塩分ストレス、浸透圧ストレス、植物ホルモン、外傷または例えばエタノール、アブシジン酸（ＡＢＡ）、ジャスモン酸塩、サリチル酸もしくは毒性緩和剤などの化学物質により誘導もしくは調節されるプロモーターが含まれる。ストレス誘導性の例は、ＲＤ２９Ａプロモーター（Ｋａｓｕｇａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：２８７－９１）である。植物細胞において有用な様々なタイプの新規なプロモーターは、常に発見され続けている；数多くの例は、Ｏｋａｍｕｒｏ ａｎｄ Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，（１９８９）Ｉｎ Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，Ｖｏｌ．１１５，Ｓｔｕｍｐｆ ａｎｄ Ｃｏｎｎ，ｅｄｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ），ｐｐ．１－８２による編纂物において見いだすことができる。
「翻訳リーダー配列」は、遺伝子のプロモーター配列とコーディング配列との間に位置するポリヌクレオチド配列を意味する。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列の上流にあるｍＲＮＡ内に存在する。翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ安定性もしくは翻訳効率への一次転写物のプロセシングに影響を及ぼす可能性がある。翻訳リーダー配列の例は、記載されている（例えば、Ｔｕｒｎｅｒ ａｎｄ Ｆｏｓｔｅｒ，（１９９５）Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３：２２５－２３６を参照されたい）。
「３’非コーディング配列」、「転写ターミネーター」もしくは「終結配列」は、コーディング配列の下流に位置するＤＮＡ配列を意味しており、ポリアデニル化認識配列およびｍＲＮＡプロセシングもしくは遺伝子配列に影響を及ぼすことのできる調節シグナルをコードする他の配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは、通常は、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸区域の付加に影響を及ぼすことによって特徴付けられる。様々な３’非コーディング配列の使用は、Ｉｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：６７１－６８０によって例示されている。
「ＲＮＡ転写物」は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒性転写により生じる産物を意味する。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全相補性コピーである場合は、ＲＮＡ転写物は、一次転写物もしくはプレ－ｍＲＮＡと呼ばれる。ＲＮＡ転写物は、それが一次転写物であるプレｍＲＮＡｔの翻訳後プロセシングに由来するＲＮＡ配列である場合に成熟ＲＮＡもしくはｍＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャーＲＮＡ」もしくは「ｍＲＮＡ」は、イントロンを有しておらず、細胞によってタンパク質に翻訳することのできるＲＮＡを意味する。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡ鋳型に相補的である、および酵素の逆転写酵素を使用してｍＲＮＡ鋳型から合成されるＤＮＡを意味する。ｃＤＮＡは、一本鎖形であってよい、またはＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片を使用して二本鎖形に転換させることができる。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含み、細胞内もしくはｉｎ ｖｉｔｒｏでタンパク質内に翻訳できるＲＮＡ転写物を意味する。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的一次転写物もしくはｍＲＮＡの全部または一部に対して相補的である、および標的遺伝子の発現を遮断するＲＮＡ転写物を意味する（例えば、米国特許第５，１０７，０６５号明細書を参照されたい）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物の任意の部分、すなわち、５’非コーディング配列、３’非コーディング配列、イントロンもしくはコーディング配列との相補性であってよい。「機能的ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡもしくは翻訳されることはないがそれでも細胞内プロセスに影響を及ぼす他のＲＮＡを意味する。用語「相補体」および「逆相補体」は、ｍＲＮＡ転写物に関して本明細書では互換的に使用され、メッセージのアンチセンスＲＮＡを定義することが意図されている。
用語「コントロール細胞」および「好適なコントロール細胞」は、本明細書では互換的に使用され、特定の修飾（例えば、ポリヌクレオチドの過剰発現、ポリヌクレオチドのダウンレギュレーション）が加えられた細胞（すなわち、「実験細胞」）をことができる。コントロール細胞は、実験細胞の特定の修飾を有していない、または発現しない任意の細胞であってよい。したがって、コントロール細胞は、非形質転換野生型細胞であってよい、または遺伝的に形質転換される可能性はあるが遺伝的形質転換を発現することはない。例えば、コントロール細胞は、実験細胞の直接の親であってよく、その直接の親細胞は、実験細胞内に存在する特定の修飾を有していない。または、コントロール細胞は、一世代または複数世代によって除去される実験細胞の親であってよい。さらになお、コントロール細胞は、実験細胞の同胞であってよく、この同胞は、実験細胞内に存在する特定の修飾を含まない。
用語「機能的に結合した」は、一方の機能が他方によって調節されるような単一核酸断片上での核酸配列の会合を意味する。例えば、プロモーターは、そのコーディング配列の発現を調節することができる場合には、コーディング配列と機能的に結合している（すなわち、コーディング配列はプロモーターの転写制御下にある）。コーディング配列は、センスもしくはアンチセンス方向で調節配列に機能的に結合させることができる。また別の例では、相補性ＲＮＡ領域は、直接的もしくは間接的のいずれかで、５’を標的ｍＲＮＡに、もしくは３’を標的ｍＲＮＡに、または標的ｍＲＮＡ内で機能的に結合させることができる、または第１相補性領域は５’であり、その相補体は３’から標的ｍＲＮＡまでである。
本明細書で使用する標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）により詳細に記載されている。形質転換法は、当業者であれば周知であり、下記で説明する。
「ＰＣＲ」もしくは「ポリメラーゼ連鎖反応」は、特定のＤＮＡセグメントを合成するための技術であり、一連の反復的な変性、アニーリングおよび伸長サイクルからなる。典型的には、二本鎖ＤＮＡは熱変成され、標的セグメントの３’境界に対して相補的である２本のプライマーは低温でＤＮＡにアニーリングされ、その後に中間温度で伸長させられる。１セットのこれらの３つの連続工程は、「サイクル」と呼ばれる。
用語「組換え」は、例えば、化学合成によって、または遺伝子工学技術による核酸の単離セグメントの操作によって、２つのさもなければ分離している配列セグメントの人工的組合せを意味する。
用語「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」は、細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子を運ぶことが多く、通常は二本鎖ＤＮＡの形態にある染色体外要素を意味する。そのような要素は、その中で多数のヌクレオチド配列が、細胞内へ関心対象のポリヌクレオチドを導入できる固有構造に結合もしくは再結合されている任意の起源に由来する一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡの線状もしくは環状の形態にある自律的複製配列、ゲノム組込み配列、ファージもしくはヌクレオチド配列であってよい。「形質転換カセット」は、遺伝子を含有する、および遺伝子に加えて特定宿主細胞の形質転換を促進する要素を有する特定ベクターを意味する。「発現カセット」は、遺伝子を含有する、および遺伝子に加えて宿主内でのその遺伝子の発現を可能にする要素を有する特定ベクターを意味する。
本明細書で使用する用語「形質転換」は、核酸分子の宿主生物内への移動を意味する。核酸分子は、自律的に複製するプラスミドであってよい、または生成宿主のゲノム内に組み込まれてよい。用語「組換えＤＮＡ分子」、「組換え構築物」、「発現構築物」、「構築物」、「構築物」および「組換えＤＮＡ構築物」は、本明細書では互換的に使用される。組換え構築物は、核酸断片、例えば自然には全部が一緒に見いだされることのない調節配列およびコーディング配列の人工的組合せを含む。例えば、構築物は、異なる起源に由来する調節配列およびコーディング配列、または同一起源に由来するが、自然に見いだされるのとは異なる方法で配列された調節配列およびコーディング配列を含む可能性がある。そのような構築物は、単独で使用されてよい、またはベクターと結び付けて使用されてよい。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者であれば周知であるように、宿主細胞を形質転換させるために使用される方法に左右される。例えば、プラスミドベクターを使用できる。当業者であれば、宿主細胞を上首尾で形質転換する、選択する、および繁殖させるためにベクター上に存在しなければならない遺伝要素について熟知している。当業者であればさらに、様々な独立形質転換事象が様々なレベルおよびパターンの発現を生じさせる可能性があること（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ４：２４１１－２４１８；ＤｅＡｌｍｅｄｉａ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１８：７８－８６）、およびそこで複数の事象は、典型的には所望の発現レベルおよびパターンを提示するラインを入手するためにスクリーニングされることも認識するであろう。そのようなスクリーニングは、標準分子生物学、生物化学アッセイならびにＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、ＰＣＲ、リアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、タンパク質発現の免疫ブロッティング分析、酵素もしくは活性アッセイおよび／または表現型分析を含む他のアッセイによって遂行することができる。
本明細書において使用する用語「発現」は、前駆体もしくは成熟形のいずれかでの機能的最終産物（例えば、ｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡもしくはタンパク質）の生成を意味する。
用語「提供する工程」には、核酸（例えば、発現構築物）もしくはペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質を細胞に提供する工程を含む。「提供する工程」には、核酸もしくはポリペプチドの真核細胞もしくは原核細胞内への組込みであって、核酸を細胞のゲノム内に組み込むことができる組込みについての言及および核酸もしくはタンパク質の細胞への一過性提供についての言及が含まれる。「提供する工程」には、安定性もしくは一過性形質転換法、トランスフェクション、形質導入、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ウイルス法、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換、弾道粒子加速ならびに有性交配についての言及が含まれる。したがって、核酸断片（例えば、組換えＤＮＡ構築物／発現構築物、ガイドＲＮＡ、ガイドＤＮＡ、鋳型ＤＮＡ、ドナーＤＮＡ）を細胞内に導入する状況における「提供する工程」には、「トランスフェクション」もしくは「形質転換」もしくは「形質導入」が含まれ、さらに核酸断片の真核細胞もしくは原核細胞内への組込みについての言及が含まれるが、ここで核酸断片は細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチドもしくはミトコンドリアＤＮＡ）内に組み込む、自律複製内に転換する、または一過性発現する（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ）ことができる。
安定性形質転換法、一過性形質転換法、ウイルス媒介性方法、有性交配および有性育種法を含む、組成物（例えば、ヌクレオチド配列、ペプチドもしくはポリペプチド）を生物に接触させる、提供する、および／または導入するための多数の方法が公知である。安定性形質転換は、導入されたポリヌクレオチドが生物のゲノム内に組み込まれ、それらの子孫によって遺伝で受け継がれる可能性があることを表す。一過性形質転換は、導入された組成物が一時的にのみ発現する、または生物内に存在することを表す。
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを細胞もしくは生物に接触させる、提供する、導入するためのプロトコールは公知であり、マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：３２０－３４および米国特許第６，３００，５４３号明細書）、分裂組織形質転換（米国特許第５，７３６，３６９号明細書）、エレクトロポレーション（Ｒｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：５６０２－６）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換（米国特許第５，５６３，０５５号明細書および同第５，９８１，８４０号明細書）、直接遺伝子導入（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ ３：２７１７－２２）および弾道粒子加速（米国特許第４，９４５，０５０号明細書；同第５，８７９，９１８号明細書；同第５，８８６，２４４号明細書；同第５，９３２，７８２号明細書；Ｔｏｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）“Ｄｉｒｅｃｔ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｉｎｔａｃｔ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌｓ ｖｉａ Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ”，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｅｄ．Ｇａｍｂｏｒｇ ＆ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）；ＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９２３－６；Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ２２：４２１－７７；Ｓａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：２７－３７（タマネギ）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ８７：６７１－４（ダイズ）；Ｆｉｎｅｒ ａｎｄ ＭｃＭｕｌｌｅｎ，（１９９１）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２７Ｐ：１７５－８２（ダイズ）；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ ９６：３１９－２４（ダイズ）；Ｄａｔｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：７３６－４０（コメ）；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：４３０５－９（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：５５９－６３（トウモロコシ）；米国特許第５，２４０，８５５号明細書；同第５，３２２，７８３号明細書および同第５，３２４，６４６号明細書；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ９１：４４０－４（トウモロコシ）；Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：８３３－９（トウモロコシ）；Ｈｏｏｙｋａａｓ－Ｖａｎ Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１１：７６３－４；米国特許第５，７３６，３６９号明細書（穀類）；Ｂｙｔｅｂｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：５３４５－９（ユリ科）；Ｄｅ Ｗｅｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８５），Ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｖｕｌｅ Ｔｉｓｓｕｅｓ，ｅｄ．Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（Ｌｏｎｇｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．１９７－２０９（花粉）；Ｋａｅｐｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ９：４１５－８）およびＫａｅｐｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ ８４：５６０－６（ウィスカー媒介性形質転換）；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４：１４９５－５０５（エレクトロポレーション）；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ １２：２５０－５；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ａｎｄ Ｆｏｒｄ（１９９５）Ａｎｎａｌｓ Ｂｏｔａｎｙ ７５：４０７－１３（コメ）およびＯｓｊｏｄａ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：７４５－５０（アグロバクテリウム・ツメファキエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を介してトウモロコシ）、化学的形質転換（酢酸リチウム形質転換［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：１８６－１８７（１９９１））が含まれる。１つの例として、米国特許第４，８８０，７４１号明細書および同第５，０７１，７６４号明細書ならびにＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８：２３２－２３５）は、ＤＮＡの線状化断片に基づくＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）についての組込み技術を記載している。
または、ポリヌクレオチドは、細胞もしくは生物をウイルスもしくはウイルス核酸と接触させることにより細胞もしくは生物内に導入することができる。一般に、そのような方法は、ウイルスＤＮＡもしくはＲＮＡ分子内にポリヌクレオチドを組み込む工程を包含している。一部の例では、関心対象のポリペプチドは、所望の組換えタンパク質を生成するためにｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏでのタンパク質分解によって後にプロセシングされる、ウイルスポリタンパク質の一部として最初に合成することができる。ポリヌクレオチドを植物中に導入してその中でコードされた、ウイルスＤＮＡもしくはＲＮＡ分子を包含するタンパク質を発現させるための方法は公知であり、例えば、米国特許第５，８８９，１９１号明細書、同第５，８８９，１９０号明細書、同第５，８６６，７８５号明細書、同第５，５８９，３６７号明細書および同第５，３１６，９３１号明細書を参照されたい。一過性形質転換法には、例えば二本鎖切断誘導物質などのポリペプチドの生物内への直接的導入、例えばＤＮＡおよび／またはＲＮＡポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドの導入ならびに例えば二本鎖切断誘導物質をコードするｍＲＮＡなどのＲＮＡ転写物の生物内への導入が含まれるがそれらに限定されない。そのような方法には、例えば、マイクロインジェクションもしくは粒子衝突法が含まれる。例えば、Ｃｒｏｓｓｗａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２０２：１７９－８５；Ｎｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ ４４：５３－８；Ｈｅｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：２１７６－８０；およびＨｕｓｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １０７：７７５－８４を参照されたい。
核酸およびタンパク質は、例えば細胞浸透性ペプチド、ナノキャリアなどの誘導型Ｃａｓ系（タンパク質および／または核酸）いずれか１つもしくは全成分の取込みを促進するための分子を使用する方法などであるがそれらに限定されない当技術分野において公知の任意の方法によって細胞に提供することができる。例えばさらに参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１００３５８３６号明細書、Ｎａｎｏｃａｒｉｅｒ ｂａｓｅｄ ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎおよび欧州特許出願公開第２８２１４８６Ａ１号明細書、Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｉｎｔｏ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓを参照されたい。
ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を細胞に提供する工程には、前記複合体の個別成分を細胞に直接的もしくは組換え構築物によってのいずれかで提供する工程が含まれ、同様に複合体全体を細胞に提供する工程が含まれる。
「成熟」タンパク質は、翻訳後にプロセシングされたポリペプチド（すなわち、一次翻訳産物中に存在する任意のプレペプチドもしくはプロペプチドがそれから除去されているポリペプチド）を意味する。「前駆体」タンパク質は、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物を意味する（すなわち、プレペプチドおよびプロペプチドが依然として存在する）。プレペプチドおよびプロペプチドは、細胞内局在化シグナルであってよいがこれには限定されない。
「安定性形質転換」は、結果として遺伝的に安定性の遺伝形質を生じさせる、核およびオルガネラゲノムの両方を含む宿主生物のゲノム内への核酸断片の移動を意味する。対照的に、「一過性形質転換」は、結果として組込みもしくは安定性遺伝形質を伴わない遺伝子発現を生じさせる、宿主生物の核もしくは他のＤＮＡ含有オルガネラ内への核酸断片の移動を意味する。形質転換核酸断片を含有する宿主生物は、「トランスジェニック」生物と呼ばれる。
用語「植物」は、植物全体、植物器官、植物組織、種子、植物細胞、種子および同一物の子孫を意味する。植物細胞には、制限なく、種子、懸濁培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、新芽、配偶体、胞子体、花粉および小胞子由来の細胞が含まれる。植物部位には、根、茎、新芽、葉、花粉、種子、腫瘍組織、および様々な形態の細胞および培養物（例えば、単細胞、プロトプラスト、胚およびカルス組織）を含むがそれらに限定されない分化組織および未分化組織が含まれる。植物組織は、植物中または植物の器官、組織もしくは細胞培養物中に含まれてよい。用語「植物器官」は、植物組織、または植物の形態的および機能的に独立した部分を構成する一群の組織を意味する。用語「ゲノム」は、生物の各細胞またはウイルスもしくはオルガネラ中に存在する遺伝物質（遺伝子および非コーディング配列）の構成要素全体；および／または１つの親からの（ハプロイド）単位として受け継いだ完全セットの染色体を意味する。「子孫」は、植物のあらゆるその後の世代を含む。
トランスジェニック植物には、例えば、形質転換工程によって導入された異種ポリヌクレオチドをゲノム内に含む植物が含まれる。異種ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが後に続く世代に受け継がれるように、ゲノム内に安定性で組み込むことができる。異種ポリヌクレオチドは、ゲノム内に単独で、または組換えＤＮＡ構築体の一部として組み込まれる可能性がある。トランスジェニック植物はさらに、そのゲノム内に２つ以上の異種ポリヌクレオチドを含むこともできる。各異種ポリヌクレオチドは、トランスジェニック植物に異なる形質を付与することができる。異種ポリヌクレオチドとしては、例えば、外来種を起源とする配列を含むことができ、または異種ポリヌクレオチドが同種由来である場合は、その天然形態から実質的に修飾される可能性がある。トランスジェニックは、任意の細胞、細胞系、カルス、組織、植物部位もしくは植物を含むことができ、それらの遺伝子型はそのように改変されたそれらのトランスジェニックならびに初期のトランスジェニック由来の有性交配（ｓｅｘｕａｌ ｃｒｏｓｓ）または無性増殖によって作成されたものを含む異種核酸の存在によって改変させられている。従来型植物育種法、異種ポリヌクレオチドの挿入を生じさせない本明細書に記載のゲノム編集手順または例えば無作為他家受精、非組換えウイルス感染、非組換え細菌形質転換、非組換え転位もしくは自然突然変異などの自然に発生する事象による植物ゲノム（染色体もしくは染色体外）の改変をトランスジェニックと見なすことは意図されていない。
稔性植物は、生存可能な雄性配偶子および雌性配偶子を生成する植物であり、自家稔性である。そのような自家稔性植物は、任意の他の植物からの寄与を伴わずに配偶子およびその中に含有される遺伝物質の子孫植物を生成することができる。雄性不稔植物には、生育可能もしくはさもなければ受精可能である雄性配偶子を生成しない植物が含まれる。雌性不稔植物には、生育可能もしくはさもなければ受精可能な雌性配偶子を生成しない植物が含まれる。雄性不稔植物および雌性不稔植物は、それぞれ雌性稔性および雄性捻性であってよいと認識されている。さらに、雄性稔性（雌性捻性以外）植物は、雌性稔性植物と交配すると成長可能な子孫を生成することができ、雌性稔性（雄性捻性以外）植物は、雄性稔性植物と交配すると成長可能な子孫を生成することができると認識されている。
例えばサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）などの従来型酵母は、典型的には、ルーチン的に７０％を超える効率を備える短鎖隣接相同性アーム（３０～５０ｂｐ）を備えるドナーＤＮＡの特異的組込みを示すが、他方例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ピチア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）およびクルベイロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）などの非従来型酵母は、通常は１％未満の効率で類似の構造のドナーＤＮＡを備える特異的組込みを示す（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８：ｅ５７９５２）。したがって、ＨＲプロセスの優先度は、例えば、酵母を好適なドナーＤＮＡで形質転換させ、ドナーＤＮＡによってターゲティングされると予測されるゲノム部位と特異的に組み換えられる程度を決定することによって、測定することができる。ＮＨＥＪに対する優先度（もしくはＨＲに対する低い優先度）は、例えば、そのようなアッセイが酵母ゲノム内へのドナーＤＮＡの高度の無作為組込みを生成すれば明らかになるであろう。酵母内のＤＮＡの特異的（ＨＲ媒介性）および／または無作為（ＮＨＥＪ媒介性）組込みの比率を決定するためのアッセイは、当技術分野において公知である（例えば、Ｆｅｒｒｅｉｒａ ａｎｄ Ｃｏｏｐｅｒ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１８：２２４９－２２５４；Ｃｏｒｒｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８：ｅ６９６２８；Ｗｅａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：６３５４－６３５８；Ｋｅｅｎｅｙ ａｎｄ Ｂｏｅｋｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３６：８４９－８５６を参照されたい）。
それらの低レベルのＨＲ活性を前提にすると、本明細書の非従来型酵母は、（ｉ）３０～５０ｂｐの隣接相同性アームを有する好適な鋳型もしくはドナーＤＮＡによる、例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％もしくは８％未満の特異的なターゲティング率を示す可能性がある、および／または（ｉｉ）前述のドナーＤＮＡの、例えば、約６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％もしくは７５％超の無作為組込み率を示す可能性がある。これらの好適な鋳型もしくはドナーＤＮＡの（ｉ）特異的ターゲティング率および／または（ｉｉ）無作為組込み率は、本明細書に開示した誘導型Ｃａｓ系が提供される前から存在するために、非従来型酵母であると特徴付けることができる。
本明細書の非従来型酵母の非限定的例には、下記の：ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、アルクスラ（Ａｒｘｕｌａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ウスティラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリゴノプシス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）属、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属およびパチソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属の酵母が含まれる。ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属種の好適な例は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である。ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属種の好適な例としては、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｐ．メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、Ｐ．スティピティス（Ｐ．ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、Ｐ．アノマーラ（Ｐ．ａｎｏｍａｌａ）およびＰ．アングスタ（Ｐ．ａｎｇｕｓｔａ）が挙げられる。シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属種の好適な例には、Ｓ．カステリイ（Ｓ．ｃａｓｔｅｌｌｉｉ）、Ｓ．アルビウス（Ｓ．ａｌｌｕｖｉｕｓ）、Ｓ．ホミニス（Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｓ．オキシデンタリス（Ｓ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、Ｓ．カプリオッティ（Ｓ．ｃａｐｒｉｏｔｔｉｉ）、Ｓ．エチェルシィ（Ｓ．ｅｔｃｈｅｌｌｓｉｉ）、Ｓ．ポリモルファス（Ｓ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ）、Ｓ．シュードポリモルファス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ）、Ｓ．バンリジアエ（Ｓ．ｖａｎｒｉｊｉａｅ）およびＳ．ヤマダエ（Ｓ．ｙａｍａｄａｅ）が挙げられる。クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属種の好適な例としては、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、Ｋ．フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、Ｋ．ファゼオロスポラス（Ｋ．ｐｈａｓｅｏｌｏｓｐｏｒｕｓ）、Ｋ．バヌデニイ（Ｋ．ｖａｎｕｄｅｎｉｉ）、Ｋ．ワルティ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）、Ｋ．アフリカヌス（Ｋ．ａｆｒｉｃａｎｕｓ）およびＫ．ポリスポラス（Ｋ．ｐｏｌｙｓｐｏｒｕｓ）が挙げられる。アルクスラ（Ａｒｘｕｌａ）属種の好適な例としては、Ａ．アデニニボランス（Ａ．ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）およびＡ．テレストレ（Ａ．ｔｅｒｒｅｓｔｒｅ）が挙げられる。トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属種の好適な例としては、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、Ｔ．カピタタム（Ｔ．ｃａｐｉｔａｔｕｍ）、Ｔ．インキン（Ｔ．ｉｎｋｉｎ）およびＴ．ビーメリ（Ｔ．ｂｅｅｍｅｒｉ）が挙げられる。カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属種の好適な例としては、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｃ．アスカラフィダルム（Ｃ．ａｓｃａｌａｐｈｉｄａｒｕｍ）、Ｃ．アンフィクシアエ（Ｃ．ａｍｐｈｉｘｉａｅ）、Ｃ．アンタークティカ（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、Ｃ．アルゲンティア（Ｃ．ａｒｇｅｎｔｅａ）、Ｃ．アトランティカ（Ｃ．ａｔｌａｎｔｉｃａ）、Ｃ．アトモスファェリカ（Ｃ．ａｔｍｏｓｐｈａｅｒｉｃａ）、Ｃ．ブラッテ（Ｃ．ｂｌａｔｔａｅ）、Ｃ．ブロメリアセアルム（Ｃ．ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｒｕｍ）、Ｃ．カルポフィラ（Ｃ．ｃａｒｐｏｐｈｉｌａ）、Ｃ．カルバジャリス（Ｃ．ｃａｒｖａｊａｌｉｓ）、Ｃ．セラムビシダルム（Ｃ．ｃｅｒａｍｂｙｃｉｄａｒｕｍ）、Ｃ．チャウリオデス（Ｃ．ｃｈａｕｌｉｏｄｅｓ）、Ｃ．コリダリ（Ｃ．ｃｏｒｙｄａｌｉ）、Ｃ．ドッセイ（Ｃ．ｄｏｓｓｅｙｉ）、Ｃ．デュブリニエンシス（Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）、Ｃ．エルガテンシス（Ｃ．ｅｒｇａｔｅｎｓｉｓ）、Ｃ．フルクツス（Ｃ．ｆｒｕｃｔｕｓ）、Ｃ．グラブラータ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）、Ｃ．フェルメンタティ（Ｃ．ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｃ．ギリエルモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、Ｃ．ハエムロニィ（Ｃ．ｈａｅｍｕｌｏｎｉｉ）、Ｃ．インセクタメンス（Ｃ．ｉｎｓｅｃｔａｍｅｎｓ）、Ｃ．インセクトルム（Ｃ．ｉｎｓｅｃｔｏｒｕｍ）、Ｃ．インテルメディア（Ｃ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、Ｃ．イェフレシィ（Ｃ．ｊｅｆｆｒｅｓｉｉ）、Ｃ．ケフィア（Ｃ．ｋｅｆｙｒ）、Ｃ．ケロセニエ（Ｃ．ｋｅｒｏｓｅｎｅａｅ）、Ｃ．クルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）、Ｃ．ルシタニエ（Ｃ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、Ｃ．リキソソフィラ（Ｃ．ｌｙｘｏｓｏｐｈｉｌａ）、Ｃ．マルトーサ（Ｃ．ｍａｌｔｏｓａ）、Ｃ．マリーナ（Ｃ．ｍａｒｉｎａ）、Ｃ．メンブラニファシエンス（Ｃ．ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、Ｃ．ミレリ（Ｃ．ｍｉｌｌｅｒｉ）、Ｃ．モギイ（Ｃ．ｍｏｇｉｉ）、Ｃ．オレオフィラ（Ｃ．ｏｌｅｏｐｈｉｌａ）、Ｃ．オレゴネンシス（Ｃ．ｏｒｅｇｏｎｅｎｓｉｓ）、Ｃ．パラプシローシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、Ｃ．クエルシトルーサ（Ｃ．ｑｕｅｒｃｉｔｒｕｓａ）、Ｃ．ルゴサ（Ｃ．ｒｕｇｏｓａ）、Ｃ．サケ（Ｃ．ｓａｋｅ）、Ｃ．シャハテア（Ｃ．ｓｈｅｈａｔｅａ）、Ｃ．テムノキラエ（Ｃ．ｔｅｍｎｏｃｈｉｌａｅ）、Ｃ．テヌイス（Ｃ．ｔｅｎｕｉｓ）、Ｃ．テアエ（Ｃ．ｔｈｅａｅ）、Ｃ．トレランス（Ｃ．ｔｏｌｅｒａｎｓ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ツチヤエ（Ｃ．ｔｓｕｃｈｉｙａｅ）、Ｃ．シノラボランティウム（Ｃ．ｓｉｎｏｌａｂｏｒａｎｔｉｕｍ）、Ｃ．ソーヤ（Ｃ．ｓｏｊａｅ）、Ｃ．サブハシィ（Ｃ．ｓｕｂｈａｓｈｉｉ）、Ｃ．ビスワナチイ（Ｃ．ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ）、Ｃ．ユティリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、Ｃ．ウバツベンシス（Ｃ．ｕｂａｔｕｂｅｎｓｉｓ）およびＣ．ゼンプリニナ（Ｃ．ｚｅｍｐｌｉｎｉｎａ）が挙げられる。ウスティラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属種の好適な例としては、Ｕ．アベナエ（Ｕ．ａｖｅｎａｅ）、Ｕ．エスクレンタ（Ｕ．ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、Ｕ．ホルデイ（Ｕ．ｈｏｒｄｅｉ）、Ｕ．マイジス（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）、Ｕ．ヌーダ（Ｕ．ｎｕｄａ）およびＵ．トリチシ（Ｕ．ｔｒｉｔｉｃｉ）が挙げられる。トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属種の好適な例としては、Ｔ．ゲオチャレス（Ｔ．ｇｅｏｃｈａｒｅｓ）、Ｔ．アジマ（Ｔ．ａｚｙｍａ）、Ｔ．グラブラータ（Ｔ．ｇｌａｂｒａｔａ）およびＴ．カンジダ（Ｔ．ｃａｎｄｉｄａ）が挙げられる。
チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属種の好適な例としては、Ｚ．バイリイ（Ｚ．ｂａｉｌｉｉ）、Ｚ．ビスポラス（Ｚ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ）、Ｚ．シドリ（Ｚ．ｃｉｄｒｉ）、Ｚ．フェルメンタティ（Ｚ．ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｚ．フロレンティヌス（Ｚ．ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ）、Ｚ．コンブチャエンシス（Ｚ．ｋｏｍｂｕｃｈａｅｎｓｉｓ）、Ｚ．レンツス（Ｚ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｚ．メリス（Ｚ．ｍｅｌｌｉｓ）、Ｚ．ミクロエリプソイデス（Ｚ．ｍｉｃｒｏｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｓ）、Ｚ．ムラキイ（Ｚ．ｍｒａｋｉｉ）、Ｚ．シュードロウキシイ（Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ）、およびＺ．ロウキシィ（Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）が挙げられる。トリゴノプシス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）属種の好適な例としては、Ｔ．バリアビリス（Ｔ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）が挙げられる。クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種の好適な例としては、Ｃ．ローレンティ（Ｃ．ｌａｕｒｅｎｔｉｉ）、Ｃ．アルビダス（Ｃ．ａｌｂｉｄｕｓ）、Ｃ．ネオフォルマンス（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、Ｃ．ガッティ（Ｃ．ｇａｔｔｉｉ）、Ｃ．ユニグトゥラツス（Ｃ．ｕｎｉｇｕｔｔｕｌａｔｕｓ）、Ｃ．アデリエンシス（Ｃ．ａｄｅｌｉｅｎｓｉｓ）、Ｃ．アエリウス（Ｃ．ａｅｒｉｕｓ）、Ｃ．アルビドシミリス（Ｃ．ａｌｂｉｄｏｓｉｍｉｌｉｓ）、Ｃ．アンタルクティカス（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ）、Ｃ．アクアティカス（Ｃ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、Ｃ．アーテル（Ｃ．ａｔｅｒ）、Ｃ．ブータネンシス（Ｃ．ｂｈｕｔａｎｅｎｓｉｓ）、Ｃ．コンソルティオニス（Ｃ．ｃｏｎｓｏｒｔｉｏｎｉｓ）、Ｃ．カルバツス（Ｃ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）、Ｃ．フェノリカス（Ｃ．ｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ）、Ｃ．スキンネリ（Ｃ．ｓｋｉｎｎｅｒｉ）、Ｃ．テレウス（Ｃ．ｔｅｒｒｅｕｓ）およびＣ．ビシュニアッシ（Ｃ．ｖｉｓｈｎｉａｃｃｉ）が挙げられる。ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属種の好適な例としては、Ｒ．アケニオルム（Ｒ．ａｃｈｅｎｉｏｒｕｍ）、Ｒ．トゥラ（Ｒ．ｔｕｌａ）、Ｒ．アクタ（Ｒ．ａｃｕｔａ）、Ｒ．アメリカーナ（Ｒ．ａｍｅｒｉｃａｎａ）、Ｒ．アラウカリアエ（Ｒ．ａｒａｕｃａｒｉａｅ）、Ｒ．アークティカ（Ｒ．ａｒｃｔｉｃａ）、Ｒ．アルメニアカ（Ｒ．ａｒｍｅｎｉａｃａ）、Ｒ．アウランティアカ（Ｒ．ａｕｒａｎｔｉａｃａ）、Ｒ．アウリクラリエ（Ｒ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａｅ）、Ｒ．バカルム（Ｒ．ｂａｃａｒｕｍ）、Ｒ．ベンチカ（Ｒ．ｂｅｎｔｈｉｃａ）、Ｒ．ビオウルゲイ（Ｒ．ｂｉｏｕｒｇｅｉ）、Ｒ．ボゴリエンシス（Ｒ．ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）、Ｒ．ブロンキアリス（Ｒ．ｂｒｏｎｃｈｉａｌｉｓ）、Ｒ．ブフォニィ（Ｒ．ｂｕｆｆｏｎｉｉ）、Ｒ．カリプトゲナエ（Ｒ．ｃａｌｙｐｔｏｇｅｎａｅ）、Ｒ．チュングナメンシス（Ｒ．ｃｈｕｎｇｎａｍｅｎｓｉｓ）、Ｒ．クラディエンシス（Ｒ．ｃｌａｄｉｅｎｓｉｓ）、Ｒ．コラリナ（Ｒ．ｃｏｒａｌｌｉｎａ）、Ｒ．クレゾリカ（Ｒ．ｃｒｅｓｏｌｉｃａ）、Ｒ．クロセア（Ｒ．ｃｒｏｃｅａ）、Ｒ．シクロクラスティカ（Ｒ．ｃｙｃｌｏｃｌａｓｔｉｃａ）、Ｒ．ダイレネンシス（Ｒ．ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）、Ｒ．ディフルエンス（Ｒ．ｄｉｆｆｌｕｅｎｓ）、Ｒ．エバーグラディエンシス（Ｒ．ｅｖｅｒｇｌａｄｉｅｎｓｉｓ）、Ｒ．フェルリカ（Ｒ．ｆｅｒｕｌｉｃａ）、Ｒ．フォリオルム（Ｒ．ｆｏｌｉｏｒｕｍ）、Ｒ．フラガリア（Ｒ．ｆｒａｇａｒｉａ）、Ｒ．フジサネンシス（Ｒ．ｆｕｊｉｓａｎｅｎｓｉｓ）、Ｒ．フトロネンシス（Ｒ．ｆｕｔｒｏｎｅｎｓｉｓ）、Ｒ．ゲラティノーサ（Ｒ．ｇｅｌａｔｉｎｏｓａ）、Ｒ．グラシアリス（Ｒ．ｇｌａｃｉａｌｉｓ）、Ｒ．グルティニス（Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、Ｒ．グラシリス（Ｒ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、Ｒ．グリンベルグシィ（Ｒ．ｇｒｉｎｂｅｒｇｓｉｉ）、Ｒ．ヒマライエンシス（Ｒ．ｈｉｍａｌａｙｅｎｓｉｓ）、Ｒ．ヒヌレア（Ｒ．ｈｉｎｎｕｌｅａ）、Ｒ．ヒストリティカ（Ｒ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、Ｒ．ヒロフィラ（Ｒ．ｈｙｌｏｐｈｉｌａ）、Ｒ．インカルナタ（Ｒ．ｉｎｃａｒｎａｔａ）、Ｒ．インゲニオサ（Ｒ．ｉｎｇｅｎｉｏｓａ）、Ｒ．ジャバニカ（Ｒ．ｊａｖａｎｉｃａ）、Ｒ．コイシカウェンシス（Ｒ．ｋｏｉｓｈｉｋａｗｅｎｓｉｓ）、Ｒ．ラクトーサ（Ｒ．ｌａｃｔｏｓａ）、Ｒ．ラメリブラキエ（Ｒ．ｌａｍｅｌｌｉｂｒａｃｈｉａｅ）、Ｒ．ラリンギス（Ｒ．ｌａｒｙｎｇｉｓ）、Ｒ．リグノフィラ（Ｒ．ｌｉｇｎｏｐｈｉｌａ）、Ｒ．リニ（Ｒ．ｌｉｎｉ）、Ｒ．ロンギッシマ（Ｒ．ｌｏｎｇｉｓｓｉｍａ）、Ｒ．ルドウィギィ（Ｒ．ｌｕｄｗｉｇｉｉ）、Ｒ．リシノフィラ（Ｒ．ｌｙｓｉｎｏｐｈｉｌａ）、Ｒ．マリーナ（Ｒ．ｍａｒｉｎａ）、Ｒ．マルチニエ－フラガンティス（Ｒ．ｍａｒｔｙｎｉａｅ－ｆｒａｇａｎｔｉｓ）、Ｒ．マトリテンシス（Ｒ．ｍａｔｒｉｔｅｎｓｉｓ）、Ｒ．メリ（Ｒ．ｍｅｌｉ）、Ｒ．ミヌータ（Ｒ．ｍｉｎｕｔａ）、Ｒ．ムシラギノーサ（Ｒ．ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）、Ｒ．ニテンス（Ｒ．ｎｉｔｅｎｓ）、Ｒ．ノトファギ（Ｒ．ｎｏｔｈｏｆａｇｉ）、Ｒ．オリザエ（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ）、Ｒ．パシフィカ（Ｒ．ｐａｃｉｆｉｃａ）、Ｒ．パリダ（Ｒ．ｐａｌｌｉｄａ）、Ｒ．ペネアウス（Ｒ．ｐｅｎｅａｕｓ）、Ｒ．フィリラ（Ｒ．ｐｈｉｌｙｌａ）、Ｒ．フィロプラナ（Ｒ．ｐｈｙｌｌｏｐｌａｎａ）、Ｒ．ピラティ（Ｒ．ｐｉｌａｔｉｉ）、Ｒ．ピリマナエ（Ｒ．ｐｉｌｉｍａｎａｅ）、Ｒ．ピニコラ（Ｒ．ｐｉｎｉｃｏｌａ）、Ｒ．ピリカータ（Ｒ．ｐｌｉｃａｔａ）、Ｒ．ポリモルファ（Ｒ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、Ｒ．サイクロフェノリカ（Ｒ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃａ）、Ｒ．サイクロフィラ（Ｒ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ）、Ｒ．パストゥラ（Ｒ．ｐｕｓｔｕｌａ）、Ｒ．レティノフィラ（Ｒ．ｒｅｔｉｎｏｐｈｉｌａ）、Ｒ．ロザケア（Ｒ．ｒｏｓａｃｅａ）、Ｒ．ロスラータ（Ｒ．ｒｏｓｕｌａｔａ）、Ｒ．ルベファシエンス（Ｒ．ｒｕｂｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｒ．ルベラ（Ｒ．ｒｕｂｅｌｌａ）、Ｒ．ルベスセンス（Ｒ．ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）、Ｒ．ルブラ（Ｒ．ｒｕｂｒａ）、Ｒ．ルブロルゴサ（Ｒ．ｒｕｂｒｏｒｕｇｏｓａ）、Ｒ．ルフラ（Ｒ．ｒｕｆｕｌａ）、Ｒ．ルティラ（Ｒ．ｒｕｔｉｌａ）、Ｒ．サングイネア（Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅａ）、Ｒ．サニエイ（Ｒ．ｓａｎｎｉｅｉ）、Ｒ．サルトリィ（Ｒ．ｓａｒｔｏｒｙｉ）、Ｒ．シルベストリス（Ｒ．ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ）、Ｒ．シンプレックス（Ｒ．ｓｉｍｐｌｅｘ）、Ｒ．シネンシス（Ｒ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、Ｒ．スルーフィアエ（Ｒ．ｓｌｏｏｆｆｉａｅ）、Ｒ．ソンクキィ（Ｒ．ｓｏｎｃｋｉｉ）、Ｒ．ストラミネア（Ｒ．ｓｔｒａｍｉｎｅａ）、Ｒ．スベリコラ（Ｒ．ｓｕｂｅｒｉｃｏｌａ）、Ｒ．スガニィ（Ｒ．ｓｕｇａｎｉｉ）、Ｒ．タイワネンシス（Ｒ．ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ）、Ｒ．タイワニアナ（Ｒ．ｔａｉｗａｎｉａｎａ）、Ｒ．テルペノイダリス（Ｒ．ｔｅｒｐｅｎｏｉｄａｌｉｓ）、Ｒ．テッレア（Ｒ．ｔｅｒｒｅａ）、Ｒ．テキセンシス（Ｒ．ｔｅｘｅｎｓｉｓ）、Ｒ．トキョエンシス（Ｒ．ｔｏｋｙｏｅｎｓｉｓ）、Ｒ．ウルザマエ（Ｒ．ｕｌｚａｍａｅ）、Ｒ．バニリカ（Ｒ．ｖａｎｉｌｌｉｃａ）、Ｒ．ブイレミニィ（Ｒ．ｖｕｉｌｌｅｍｉｎｉｉ）、Ｒ．ヤロウィ（Ｒ．ｙａｒｒｏｗｉｉ）、Ｒ．ユナネンシス（Ｒ．ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ）およびＲ．ゾルティ（Ｒ．ｚｓｏｌｔｉｉ）が挙げられる。ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）属種の好適な例としては、Ｐ．ロドジマ（Ｐ．ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）が挙げられる。
スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属種の好適な例としては、Ｓ．アルボルベスセンス（Ｓ．ａｌｂｏｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）、Ｓ．バナエンシス（Ｓ．ｂａｎｎａｅｎｓｉｓ）、Ｓ．ベイジンゲンシス（Ｓ．ｂｅｉｊｉｎｇｅｎｓｉｓ）、Ｓ．ビスコフィエ（Ｓ．ｂｉｓｃｈｏｆｉａｅ）、Ｓ．クラバツス（Ｓ．ｃｌａｖａｔｕｓ）、Ｓ．コプロスマエ（Ｓ．ｃｏｐｒｏｓｍａｅ）、Ｓ．コプロスミコーラ（Ｓ．ｃｏｐｒｏｓｍｉｃｏｌａ）、Ｓ．コラリヌス（Ｓ．ｃｏｒａｌｌｉｎｕｓ）、Ｓ．ディメナエ（Ｓ．ｄｉｍｍｅｎａｅ）、Ｓ．ドラコフィリィ（Ｓ．ｄｒａｃｏｐｈｙｌｌｉ）、Ｓ．エロンガツス（Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）、Ｓ．グラシリス（Ｓ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）、Ｓ．イノシトフィルス（Ｓ．ｉｎｏｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ジョンソニィ（Ｓ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、Ｓ．コアラエ（Ｓ．ｋｏａｌａｅ）、Ｓ．マグニスポラス（Ｓ．ｍａｇｎｉｓｐｏｒｕｓ）、Ｓ．ノボゼアランディカス（Ｓ．ｎｏｖｏｚｅａｌａｎｄｉｃｕｓ）、Ｓ．オドラス（Ｓ．ｏｄｏｒｕｓ）、Ｓ．パタゴニカス（Ｓ．ｐａｔａｇｏｎｉｃｕｓ）、Ｓ．プロダクツス（Ｓ．ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ）、Ｓ．ロセウス（Ｓ．ｒｏｓｅｕｓ）、Ｓ．サシコーラ（Ｓ．ｓａｓｉｃｏｌａ）、Ｓ．シバタヌス（Ｓ．ｓｈｉｂａｔａｎｕｓ）、Ｓ．シンギュラリス（Ｓ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）、Ｓ．スブルンネウス（Ｓ．ｓｕｂｂｒｕｎｎｅｕｓ）、Ｓ．シンメトリカス（Ｓ．ｓｙｍｍｅｔｒｉｃｕｓ）、Ｓ．シジギィ（Ｓ．ｓｙｚｙｇｉｉ）、Ｓ．タウポエンシス（Ｓ．ｔａｕｐｏｅｎｓｉｓ）、Ｓ．ツガエ（Ｓ．ｔｓｕｇａｅ）、Ｓ．キサンツス（Ｓ．ｘａｎｔｈｕｓ）、およびＳ．ユナネンシス（Ｓ．ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ）が挙げられる。パチソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属種の好適な例としては、Ｐ．タノフィルス（Ｐ．ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ）が挙げられる。
好適なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））の例としては、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手できる次の単離菌：菌株名称ＡＴＣＣ＃２０３６２、＃８８６２、＃８６６１、＃８６６２、＃９７７３、＃１５５８６、＃１６６１７、＃１６６１８、＃１８９４２、＃１８９４３、＃１８９４４、＃１８９４５、＃２０１１４、＃２０１７７、＃２０１８２、＃２０２２５、＃２０２２６、＃２０２２８、＃２０３２７、＃２０２５５、＃２０２８７、＃２０２９７、＃２０３１５、＃２０３２０、＃２０３２４、＃２０３３６、＃２０３４１、＃２０３４６、＃２０３４８、＃２０３６３、＃２０３６４、＃２０３７２、＃２０３７３、＃２０３８３、＃２０３９０、＃２０４００、＃２０４６０、＃２０４６１、＃２０４６２、＃２０４９６、＃２０５１０、＃２０６２８、＃２０６８８、＃２０７７４、＃２０７７５、＃２０７７６、＃２０７７７、＃２０７７８、＃２０７７９、＃２０７８０、＃２０７８１、＃２０７９４、＃２０７９５、＃２０８７５、＃２０２４１、＃２０４２２、＃２０４２３、＃３２３３８、＃３２３３９、＃３２３４０、＃３２３４１、＃３４３４２、＃３２３４３、＃３２９３５、＃３４０１７、＃３４０１８、＃３４０８８、＃３４９２２、＃３４９２２、＃３８２９５、＃４２２８１、＃４４６０１、＃４６０２５、＃４６０２６、＃４６０２７、＃４６０２８、＃４６０６７、＃４６０６８、＃４６０６９、＃４６０７０、＃４６３３０、＃４６４８２、＃４６４８３、＃４６４８４、＃４６４３６、＃６０５９４、＃６２３８５、＃６４０４２、＃７４２３４、＃７６５９８、＃７６８６１、＃７６８６２、＃７６９８２、＃９０７１６、＃９０８１１、＃９０８１２、＃９０８１３、＃９０８１４、＃９０９０３、＃９０９０４、＃９０９０５、＃９６０２８、＃２０１２４１、＃２０１２４２、＃２０１２４３、＃２０１２４４、＃２０１２４５、＃２０１２４６、＃２０１２４７、＃２０１２４９および／または＃２０１８４７が挙げられる。
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ならびに本明細書の任意の他の非従来型酵母は、油脂性（例えば、油としての乾燥細胞重量の少なくとも２５％を生成する）および／または１種以上のポリ不飽和脂肪酸（例えば、ω－６もしくはω－３）であってよい。そのような油脂性は、その野生型形に比較して増加した量の脂質を生成するように遺伝子組み換えされている酵母の結果である可能性がある。油脂性Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株の例は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９／００９３５４３号明細書および同第２０１０／０３１７０７２号明細書、同第２０１２／００５２５３７号明細書および同第２０１４／０１８６９０６号明細書に開示されている。
非従来型酵母について本明細書で開示した実施形態は、さらに例えば真菌などの他の微生物にも提供することができる。所定の実施形態における従来型真菌は、ＨＲによって媒介される修復プロセスよりもＮＨＥＪ ＤＮＡ修復プロセスを好む真菌である可能性がある。本明細書の真菌は、担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、接合菌類（Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ツボカビ類（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）もしくは子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）の真菌であってよい。本明細書の糸状菌の例としては、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属（例えば、Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）、Ｎ．シトフィラ（Ｎ．ｓｉｔｏｐｈｉｌａ））、クリオネクトリア（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ）属（例えば、Ｃ．パラシチカ（Ｃ．ｐａｒａｓｉｔｉｃａ））、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属（例えば、Ａ．プルランス（Ａ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ））、フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）属、ピロミケス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリプトコックス（Ｃｒｙｐｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、アクレモモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）属、スキタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）属、スキゾフィルム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）属、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属（例えば、Ｐ．ビライアエ（Ｐ．ｂｉｌａｉａｅ）、Ｐ．カメムベルチ（Ｐ．ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ）、Ｐ．カンディヅム（Ｐ．ｃａｎｄｉｄｕｍ）、Ｐ．クリソゲヌム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、Ｐ．エクスパンスム（Ｐ．ｅｘｐａｎｓｕｍ）、Ｐ．フニクロスム（Ｐ．ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、Ｐ．グラウクム（Ｐ．ｇｌａｕｃｕｍ）、Ｐ．マルネフェイ（Ｐ．ｍａｒｎｅｆｆｅｉ）、Ｐ．ロケフォルチ（Ｐ．ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、Ｐ．ベルコスム（Ｐ．ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ）、Ｐ．ヴリジカタム（Ｐ．ｖｉｒｉｄｉｃａｔｕｍ））、ギベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）属（例えば、Ｇ．アクミナタ（Ｇ．ａｃｕｍｉｎａｔａ）、Ｇ．アベナケア（Ｇ．ａｖｅｎａｃｅａ）、Ｇ．バカタ（Ｇ．ｂａｃｃａｔａ）、Ｇ．キルキナタ（Ｇ．ｃｉｒｃｉｎａｔａ）、Ｇ．キアノゲナ（Ｇ．ｃｙａｎｏｇｅｎａ）、Ｇ．フジクロイ（Ｇ．ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、Ｇ．イントリカンス（Ｇ．ｉｎｔｒｉｃａｎｓ）、Ｇ．プリカリス（Ｇ．ｐｕｌｉｃａｒｉｓ）、Ｇ．スティボイデス（Ｇ．ｓｔｉｌｂｏｉｄｅｓ）、Ｇ．トリキンクタ（Ｇ．ｔｒｉｃｉｎｃｔａ）、Ｇ．ゼアエ（Ｇ．ｚｅａｅ））、ミケリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属（例えば、Ｍ．ロウキシイ（Ｍ．ｒｏｕｘｉｉ）、Ｍ．キルキネロイデス（Ｍ．ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ））、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属（例えば、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、Ａ．フラヴス（Ａ．ｆｌａｖｕｓ）、Ａ．レンツルス（Ａ．ｌｅｎｔｕｌｕｓ）、Ａ．テレウス（Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ）、Ａ．クラバツス（Ａ．ｃｌａｖａｔｕｓ）、Ａ．フミガツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ））、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属（例えば、Ｆ．グラミネアルム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、Ｆ．オキシスポルム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、Ｆ．ブディゲヌム（Ｆ．ｂｕｂｉｇｅｎｕｍ）、Ｆ．ソラニ（Ｆ．ｓｏｌａｎｉ）、Ｆ．オキシスポルム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、Ｆ．ベルチキルリオイデス（Ｆ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）、Ｆ．プロリフェラタム（Ｆ．ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ）、Ｆ．ベネナタム（Ｆ．ｖｅｎｅｎａｔｕｍ））およびフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ならびにそれらのアナモルフおよびテレモルフが挙げられる。本明細書の真菌の属および種は、所望であれば、Ｂａｒｎｅｔｔ ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ（Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ Ｇｅｎｅｒａ ｏｆ Ｉｍｐｅｒｆｅｃｔ Ｆｕｎｇｉ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｕｒｇｅｓｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９７２）に開示された形態学によって定義することができる。真菌は、任意選択的に、例えば動物（例えば、ヒト）の害虫／病原体などの害虫／病原体であると特徴付けることができる。
本明細書の所定の態様におけるトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属種としては、Ｔ．アグレッシバム（Ｔ．ａｇｇｒｅｓｓｉｖｕｍ）、Ｔ．アマゾニクム（Ｔ．ａｍａｚｏｎｉｃｕｍ）、Ｔ．アスペレルム（Ｔ．ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ）、Ｔ．アトロビリデ（Ｔ．ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）、Ｔ．アウレオビリデ（Ｔ．ａｕｒｅｏｖｉｒｉｄｅ）、Ｔ．アウストロコニンギィ（Ｔ．ａｕｓｔｒｏｋｏｎｉｎｇｉｉ）、Ｔ．ブレビコンパクトゥム（Ｔ．ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ）、Ｔ．カンディドゥム（Ｔ．ｃａｎｄｉｄｕｍ）、Ｔ．カリッベウム（Ｔ．ｃａｒｉｂｂａｅｕｍ）、Ｔ．カトプトロン（Ｔ．ｃａｔｏｐｔｒｏｎ）、Ｔ．クレメウム（Ｔ．ｃｒｅｍｅｕｍ）、Ｔ．セラミクム（Ｔ．ｃｅｒａｍｉｃｕｍ）、Ｔ．セリヌム（Ｔ．ｃｅｒｉｎｕｍ）、Ｔ．クロロスポルム（Ｔ．ｃｈｌｏｒｏｓｐｏｒｕｍ）、Ｔ．クロロスペルマム（Ｔ．ｃｈｒｏｍｏｓｐｅｒｍｕｍ）、Ｔ．シナモメウム（Ｔ．ｃｉｎｎａｍｏｍｅｕｍ）、Ｔ．シトリノビリデ（Ｔ．ｃｉｔｒｉｎｏｖｉｒｉｄｅ）、Ｔ．クラッスム（Ｔ．ｃｒａｓｓｕｍ）、Ｔ．クレメウム（Ｔ．ｃｒｅｍｅｕｍ）、Ｔ．ジングレエアエ（Ｔ．ｄｉｎｇｌｅｙｅａｅ）、Ｔ．ドロテアエ（Ｔ．ｄｏｒｏｔｈｅａｅ）、Ｔ．エフスム（Ｔ．ｅｆｆｕｓｕｍ）、Ｔ．エリナセウム（Ｔ．ｅｒｉｎａｃｅｕｍ）、Ｔ．エストニクム（Ｔ．ｅｓｔｏｎｉｃｕｍ）、Ｔ．フェルティル（Ｔ．ｆｅｒｔｉｌｅ）、Ｔ．ゲラティノサス（Ｔ．ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓ）、Ｔ．グハネンセ（Ｔ．ｇｈａｎｅｎｓｅ）、Ｔ．ハマタム（Ｔ．ｈａｍａｔｕｍ）、Ｔ．ハルジアヌム（Ｔ．ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、Ｔ．ヘリクム（Ｔ．ｈｅｌｉｃｕｍ）、Ｔ．イントリカタム（Ｔ．ｉｎｔｒｉｃａｔｕｍ）、Ｔ．コニラングブラ（Ｔ．ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）、Ｔ．コニンギィ（Ｔ．ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、Ｔ．コニンギオプシス（Ｔ．ｋｏｎｉｎｇｉｏｐｓｉｓ）、Ｔ．ロンギブラキアタム（Ｔ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、Ｔ．ロンギピレ（Ｔ．ｌｏｎｇｉｐｉｌｅ）、Ｔ．ミヌティスポルム（Ｔ．ｍｉｎｕｔｉｓｐｏｒｕｍ）、Ｔ．オブロギスポルム（Ｔ．ｏｂｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｍ）、Ｔ．オバリスポルム（Ｔ．ｏｖａｌｉｓｐｏｒｕｍ）、Ｔ．ペテルセニィ（Ｔ．ｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ）、Ｔ．フィロスタヒディス（Ｔ．ｐｈｙｌｌｏｓｔａｈｙｄｉｓ）、Ｔ．ピルリフェルム（Ｔ．ｐｉｌｕｌｉｆｅｒｕｍ）、Ｔ．プレウロティコラ（Ｔ．ｐｌｅｕｒｏｔｉｃｏｌａ）、Ｔ．プレウロトゥム（Ｔ．ｐｌｅｕｒｏｔｕｍ）、Ｔ．ポリスポルム（Ｔ．ｐｏｌｙｓｐｏｒｕｍ）、Ｔ．プセウドコニンギィ（Ｔ．ｐｓｅｕｄｏｋｏｎｉｎｇｉｉ）、Ｔ．プベスセンス（Ｔ．ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）、Ｔ．ロゲルソニィ（Ｔ．ｒｏｇｅｒｓｏｎｉｉ）、Ｔ．ロシクム（Ｔ．ｒｏｓｓｉｃｕｍ）、Ｔ．サツルニスポルム（Ｔ．ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒｕｍ）、Ｔ．シネンシス（Ｔ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、Ｔ．シヌオスム（Ｔ．ｓｉｎｕｏｓｕｍ）、Ｔ．スピラレ（Ｔ．ｓｐｉｒａｌｅ）、Ｔ．ストラミネウム（Ｔ．ｓｔｒａｍｉｎｅｕｍ）、Ｔ．ストリゴスム（Ｔ．ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ）、Ｔ．ストロマティクム（Ｔ．ｓｔｒｏｍａｔｉｃｕｍ）、Ｔ．スロトゥンドゥム（Ｔ．ｓｕｒｒｏｔｕｎｄｕｍ）、Ｔ．タイワネンセ（Ｔ．ｔａｉｗａｎｅｎｓｅ）、Ｔ．タイランディクム（Ｔ．ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｍ）、Ｔ．テレフォリコルム（Ｔ．ｔｈｅｌｅｐｈｏｒｉｃｏｌｕｍ）、Ｔ．セオブロミコラ（Ｔ．ｔｈｅｏｂｒｏｍｉｃｏｌａ）、Ｔ．トメントスム（Ｔ．ｔｏｍｅｎｔｏｓｕｍ）、Ｔ．ベルティヌム（Ｔ．ｖｅｌｕｔｉｎｕｍ）、Ｔ．ビレンス（Ｔ．ｖｉｒｅｎｓ）、Ｔ．ビリデ（Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ）およびＴ．ビリデスセンス（Ｔ．ｖｉｒｉｄｅｓｃｅｎｓ）が挙げられる。本明細書のトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属種は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ： Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐ．Ｋ．Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，ＣＡＢＩ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ，２０１３）に記載されたように培養／操作することができる。
所定の実施形態における微生物細胞は、藻類細胞である。例えば、藻類細胞は、下記の：緑色植物（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）（緑藻類）、紅色植物（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）（紅藻類）、褐色植物（Ｐｈａｅｏｐｈｙｃｅａｅ）（褐藻類）、珪藻綱（Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃａｅａｅ）（珪藻類）および双鞭毛虫類（Ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔａ）（渦鞭毛藻（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ））のいずれか由来の藻類細胞であってよい。藻類細胞は、他の態様において、微細藻類（例えば、植物プランクトン、微細植物もしくはプランクトン藻類）または大型藻類（ケルプ、海草）の細胞であってよい。また別の例として、本明細書の藻類細胞は、ポルフィラ（Ｐｏｒｐｈｙｒａ）属（紫色の海苔）、パルマリア（Ｐａｌｍａｒｉａ）属（例えば、Ｐ．パルマータ（Ｐ．ｐａｌｍａｔａ）（ダルス））、アルスロスピラ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ）属種（例えば、Ａ．プラテンシス（Ａ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）（スピルリナ））、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属（例えば、Ｃ．プロトテコイデス（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ））、コンドラス（Ｃｈｏｎｄｒｕｓ）属（例えば、Ｃ．クリスプス（Ｃ．ｃｒｉｓｐｕｓ）（アイリッシュ・モス））、アファニゾメノン（Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ）属、サルガスム（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ）属、コチャユヨ（Ｃｏｃｈａｙｕｙｏ）属、ボトリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えば、Ｂ．ブラウニイ（Ｂ．ｂｒａｕｎｉｉ））、デュナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）属（例えば、Ｄ．テルティオレクタ（Ｄ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ））、グラシラリア（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ）属、プロイロクリシス（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ）属（例えば、Ｐ．カルテラエ（Ｐ．ｃａｒｔｅｒａｅ））、アンキストロデスムス（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ）属、シクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）属、ハンチア（Ｈａｎｔｚｓｃｈｉａ）属、ナノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ナノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属、ニッスチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）属、ファエオダクチラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）属（例えば、Ｐ．トリコルヌタム（Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ））、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属、スティコノコッカス（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）属（例えば、Ｔ．スエシカ（Ｔ．ｓｕｅｃｉｃａ））、タラシオシリア（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）属（例えば、Ｔ．シュードナナ（Ｔ．ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ））、クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属（例えば、Ｃ．コーニイ（Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ））、ネオクロリス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）属（例えば、Ｎ．オレオアバンダンス（Ｎ．ｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓ））またはシオキトリウム（Ｓｃｈｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の種であってよい。本明細書の藻類種は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＴｈｏｍｐｓｏｎ（Ａｌｇａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｓｙｓｔｅｍ（ＥＯＬＳＳ），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ １、ｅｏｌｓｓ．ｎｅｔ／ｓａｍｐｌｅ－ｃｈａｐｔｅｒｓのインターネットサイトから入手可能）に記載されたように培養および／または操作することができる。
本明細書の原生生物細胞は、例えば、繊毛虫（Ｃｉｌｉａｔａ）綱（例えば、テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）属、ゾウリムシ（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ）属、コルピディウム（Ｃｏｌｐｉｄｉｕｍ）属、コルポダ（Ｃｏｌｐｏｄａ）属、グラウコマ（Ｇｌａｕｃｏｍａ）属、プラティオフリア（Ｐｌａｔｙｏｐｈｒｙａ）属、ボルチセラ（Ｖｏｒｔｉｃｅｌｌａ）属、ポトマカス（Ｐｏｔｏｍａｃｕｓ）属、シュードコニレンブス（Ｐｓｅｕｄｏｃｏｈｎｉｌｅｍｂｕｓ）属、ユープロテス（Ｅｕｐｌｏｔｅｓ）属、エンゲルマニエラ（Ｅｎｇｅｌｍａｎｉｅｌｌａ）属およびスチロニキア（Ｓｔｙｌｏｎｉｃｈｉａ）属）、マスチゴフォラ（Ｍａｓｔｉｇｏｐｈｏｒａ）亜門（フラゲラーテ（ｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ））、フィトマスチゴフォラ（Ｐｈｙｔｏｍａｓｔｉｇｏｐｈｏｒｅａ）綱（例えば、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ）属、アスタシア（Ａｓｔａｓｉａ）属、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）属およびクリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ））、鞭毛虫（Ｚｏｏｍａｓｔｉｇｏｐｈｏｒｅａ）綱、リゾポーザ（Ｒｈｉｚｏｐｏｄａ）上綱、ロボセア（Ｌｏｂｏｓｅａ）綱（例えば、アメーバ（Ａｍｏｅｂａ）属）ならびに真菌虫亜綱（Ｅｕｍｙｃｅｔｏｚｏｅａ）（例えば、ディクティオステリウム（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）属およびフィサルム（Ｐｈｙｓａｒｕｍ）属）から選択することができる。本明細書の所定の原生生物種は、例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）Ｐｒｏｔｉｓｔｏｌｏｇｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｇｕｉｄｅ：ｔｉｐｓ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｏｚｏａ ａｎｄ ａｌｇａｅ（２０１３、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｎｅｔ ｓｉｔｅで入手可能）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されたように培養および／または操作することができる。所定の実施形態では、原生生物は、任意選択的に、植物または動物（例えば、ヒト）の害虫／病原体と特徴付けることができる。
所定の実施形態における細菌細胞は、球菌、桿菌、スピロヘータ菌、スフェロプラスト菌、プロトプラスト菌などの形態の細菌細胞であってよい。細菌の他の非限定的例としては、グラム陰性およびグラム陽性である細菌が挙げられる。細菌のさらに他の非限定的例としては、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属（例えばＳ．チフス（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）、Ｓ．エンテリティディス（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ））、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属（例えばＳ．ディセンテリアエ（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ））、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属（例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エドワードシエラ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属、ユーインゲラ（Ｅｗｉｎｇｅｌｌａ）属、クルイベラ（Ｋｌｕｙｖｅｒａ）属、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、プラノコッカス（Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストマトコッカス（Ｓｔｏｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えばＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｓ．エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ））、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属（例えばＶ．コレラエ（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）、エーロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、プレシオモナス（Ｐｌｅｓｓｉｏｍｏｎａｓ）属、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属（例えば、Ｈ．インフルエンザエ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ））、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属（例えば、Ｍ．ニューモニア（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ））、ウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）属、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）属、コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）属、ロカリマエア（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ）属、エーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えばＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｓ．ニューモニアエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えばＥ．フェーカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ））、エーロコッカス（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ゲメラ（Ｇｅｍｅｌｌａ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えばＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属（例えばＬ．メセンテロイデス（Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ））、ペディコッカス（Ｐｅｄｉｃｏｃｃｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属（例えばＢ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ））、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（例えばＣ．ジフテリアエ（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ））、アルカノバクテリウム（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属、ロードコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属（例えばＬ．モノシトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ））、エリシペロトリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）属、ガルドネレラ（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ）属、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属（例えば、Ｎ．メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、Ｎ．ゴノルホエアエ（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ））、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、アクロバクター（Ａｒｃｏｂａｃｔｅｒ）属、ウォリネラ（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）属、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）属（例えば、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ））、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（例えばＡ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、クリセモナス（Ｃｈｒｙｓｅｏｍｏｎａｓ）属、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）属、エイケネラ（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ）属、フラビモナス（Ｆｌａｖｉｍｏｎａｓ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）属、オリゲラ（Ｏｌｉｇｅｌｌａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属（例えばＰ．アエルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））、シェバネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属、ウィークセラ（Ｗｅｅｋｓｅｌｌａ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属、フランシエセラ（Ｆｒａｎｃｉｅｓｅｌｌａ）属、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属、アフィピア（Ａｆｉｐｉａ）属、バルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）属、カリマトバクテリウム（Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、カルジオバクテリウム（Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトバチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、スピリルム（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ペプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、サルシニア（Ｓａｒｃｉｎｉａ）属、コプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、モビルンクス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ）属、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、オイバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属（例えばＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｌ．アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ））、ロチア（Ｒｏｔｈｉａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属（例えばＣ．ボツリナム（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、Ｃ．パーフィリンゲンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ））、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属、プレボテーラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ビロフィラ（Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ）属、レプトリキア（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ）属、ウォリネラ（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）属、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、メガスファエラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）属、ベイロネラ（Ｖｅｉｌｏｎｅｌｌａ）属、ノルカルディア（Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）属、アクチノマデュラ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ）属、ノルカルディオプシス（Ｎｏｒｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ミクロポリスポラス（Ｍｉｃｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｓ）属、サーモアクチノミセス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）属、ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（例えば、Ｍ．ツベルクロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、Ｍ．レプラエ（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ））、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）属、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）属（例えば、Ｂ．ブルドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ））、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属およびクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ）属の細菌が挙げられる。細菌は、任意選択的に、所定の実施形態では植物もしくは動物（例えば、ヒト）の害虫／病原体であると特徴付けることができる。細菌は、所定の実施形態では、混合微生物集団（例えば、他の細菌を含有する、または酵母および／もしくは他の細菌を含有する）に含まれる可能性がある。
所定の実施形態における古細菌細胞は、例えばユーリ古細菌門、クレン古細菌門、ナノ古細菌門、コル古細菌門、アイガー古細菌門、タウム古細菌門などの任意の古細菌門に由来してよい。本明細書の古細菌細胞は、例えば、好極限性（例えば、ほんどの生命にとって有害となる、物理的もしくは地球化学的に過酷な条件で成長および／または増殖することができる）であってよい。好極限性古細菌の一部の例としては、好熱性（例えば、４５～１２２℃の温度で成長できる）、超好熱性（例えば、８０～１２２℃の温度で成長できる）、好酸性（例えば、３以下のｐＨレベルで成長できる）、好アルカリ性（例えば、９以下のｐＨレベルで成長できる）および／または好塩性（例えば、高塩濃度［２０～３０％のＮａＣｌ］で成長できる）のものが挙げられる。古細菌種の例としては、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種（例えば、Ｈ．ボルカニイ（Ｈ．ｖｏｌｃａｎｉｉ））、スルフォロブス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）属種（例えば、Ｓ．ソルファタリカス（Ｓ．ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）、Ｓ．アシドカルダリウス（Ｓ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ））、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属種（例えば、Ｔ．アルカリフィルス（Ｔ．ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｓ）、Ｔ．セレール（Ｔ．ｃｅｌｅｒ）、Ｔ．キトノファグス（Ｔ．ｃｈｉｔｏｎｏｐｈａｇｕｓ）、Ｔ．ガンマトレランス（Ｔ．ｇａｍｍａｔｏｌｅｒａｎｓ）、Ｔ．ヒドロテルマリス（Ｔ．ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ）、Ｔ．コダカレンシス（Ｔ．ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）、Ｔ．リトラリス（Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、Ｔ．ペプトノフィルス（Ｔ．ｐｅｐｔｏｎｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｔ．プロフンドゥス（Ｔ．ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ）、Ｔ．ステッテリ（Ｔ．ｓｔｅｔｔｅｒｉ））、メタノカルドコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ）属種（例えば、Ｍ．サーモリトトロフィクス（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、Ｍ．ヤナシイ（Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ））、メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）属種（例えば、Ｍ．マリパルディス（Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）、メタノサーモバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ）属種（例えば、Ｍ．マルブルゲンシス（Ｍ．ｍａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓ）、Ｍ．テルマウトトロフィクス（Ｍ．ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ））、アーケオグロブス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）属種（例えば、Ａ．フルギドゥス（Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ））、ニトロソプミルス（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌｕｓ）属種（例えば、Ｎ．マリティムス（Ｎ．ｍａｒｉｔｉｍｕｓ））、メタロスファエラ（Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ）属種（例えば、Ｍ．セドゥラ（Ｍ．ｓｅｄｕｌａ））、フェロプラズマ（Ｆｅｒｒｏｐｌａｓｍａ）属種、サーモプラズマ（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）属種、メタノブレビバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）属種（例えば、Ｍ．スミチイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ））およびメタノスフェラ（Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ）属種（例えば、Ｍ．スタットマナエ（Ｍ．ｓｔａｄｔｍａｎａｅ））が挙げられる。
所定の実施形態における哺乳類細胞は、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル、類人猿）、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット）、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギもしくはヒツジの細胞であってよい。本明細書の哺乳類細胞の他の例としては、初代上皮細胞（例えば、角化細胞、子宮頸部上皮細胞、気管支上皮細胞、気管上皮細胞、腎臓上皮細胞、網膜上皮細胞）；樹立細胞系（例えば、２９３胎仔腎臓細胞、ＨｅＬａ子宮頸部上皮細胞、ＰＥＲ－Ｃ６網膜細胞、ＭＤＢＫ、ＣＲＦＫ、ＭＤＣＫ、ＣＨＯ、ＢｅＷｏ、チャン細胞、デトロイト５６２、Ｈｅｐ－２、ＫＢ、ＬＳ１８０、ＬＳ１７４Ｔ、ＮＣＩ－Ｈ－５４８、ＲＰＭＩ２６５０、ＳＷ－１３、Ｔ２４、ＷＩ－２８ ＶＡ１３、２ＲＡ、ＷＩＳＨ、ＢＳ－Ｃ－Ｉ、ＬＬＣ－ＭＫ２、クローンＭ－３、ＲＡＧ、ＴＣＭＫ－１、ＬＬＣ－ＰＫ１、ＰＫ－１５、ＧＨ１、ＧＨ３、Ｌ２、ＬＬＣ－ＲＣ２５６、ＭＨ１Ｃ１、ＸＣ、ＭＤＯＫ、ＶＳＷ、ＴＨ－Ｉ、Ｂ１細胞）；任意の組織または器官からの任意の上皮、間葉（例えば、線維芽細胞）、神経もしくは筋肉細胞（例えば、皮膚、心臓；肝臓；腎臓；結腸；腸；食道；胃；例えば脳または脊髄などの神経組織；肺；維管束組織；例えばリンパ腺、アデノイド、扁桃腺、骨髄または血液などのリンパ系組織；脾臓）；ならびに線維芽細胞または線維芽細胞様細胞株（例えば、ＴＲＧ－２、ＩＭＲ－３３、ドン細胞、ＧＨＫ－２１、シトルリン細胞、デンプシー細胞、デトロイト５５１、デトロイト５１０、デトロイト５２５、デトロイト５２９、デトロイト５３２、デトロイト５３９、デトロイト５４８、デトロイト５７３、ＨＥＬ２９９、ＩＭＲ－９０、ＭＲＣ－５、ＷＩ－３８、ＷＩ－２６、ＭｉＣｌ１、ＣＶ－１、ＣＯＳ－１、ＣＯＳ－３、ＣＯＳ－７、ベロ、ＤＢＳ－ＦｒｈＬ－２、ＢＡＬＢ／３Ｔ３、Ｆ９、ＳＶ－Ｔ２、Ｍ－ＭＳＶ－ＢＡＬＢ／３Ｔ３、Ｋ－ＢＡＬＢ、ＢＬＯ－１１、ＮＯＲ－１０、Ｃ３Ｈ／ＩＯＴＩ／２、ＨＳＤＭ１Ｃ３、ＫＬＮ２０５、ＭｃＣｏｙ細胞、マウスＬ細胞、ＳＣＣ－ＰＳＡ１、スイス／３Ｔ３細胞、インドホエジカ細胞、ＳＩＲ、イェンセン細胞が挙げられる。哺乳類細胞系を培養および操作する方法は、当技術分野において知られている。
所定の実施形態では、細胞は、動物もしくは植物の任意の病原体および／または害虫の細胞であってよい。そのような病原体および／または害虫の例としては、様々なタイプの細菌、真菌、酵母、原生生物、線虫および昆虫が挙げられる。当業者であれば、上記に開示したそのような病原体／害虫の例を認識するであろう。
「センチモルガン」（ｃＭ）もしくは「図単位」は、２つの結合遺伝子、マーカー、標的部位、遺伝子座もしくはそれらの任意の対間の距離であり、ここで減数分裂の積の１％は組換えである。したがって、１センチモルガンは２つの結合遺伝子、マーカー、標的部位、遺伝子座もしくはそれらの任意の対間の１％の平均組換え頻度と同等の距離と同等である。
本明細書に記載したガイドＲＮＡ／Ｃａｓ系は、標的からずれた切断が標的細胞にとって有害である可能性がある状況では、ヌクレアーゼゲノム遺伝子工学、特に微生物および植物ゲノム遺伝子工学のために特に有用である。本明細書に記載したガイドＲＮＡ／Ｃａｓ系の１つの実施形態では、発現最適化Ｃａｓ９遺伝子は、標的ゲノム内、例えば、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属ゲノム内に安定性で組み込まれる。Ｃａｓ９遺伝子の発現は、例えばヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属プロモーターなどのプロモーターの制御下にある。ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡの非存在下では、Ｃａｓ９タンパク質はＤＮＡを切断することができないので、このため細胞内でのその存在はほとんどもしくは全く結果をもたらさないはずである。そこで、本明細書に記載したガイドＲＮＡ／Ｃａｓ系の重要な利点は、細胞生育性にほとんどもしくは全く結果を伴わないＣａｓ９タンパク質を効率的に発現させることのできる細胞系もしくは生物を作成して維持する能力である。
遺伝子ターゲティングを媒介するガイドＲＮＡ／Ｃａｓ系は、国際公開第２０１３／０１９８８８８号パンフレット（２０１３年８月１日に公開）に開示された方法に類似する方法でトランス遺伝子挿入を指令するため、および／または複数のトランス遺伝子を含む複合トランスジェニック形質遺伝子座を生成するための方法であって、関心対象の遺伝子を導入するために二本鎖切断誘導物質の代わりに本明細書に開示したガイドＲＮＡ／Ｃａｓ系が使用される方法において使用することができる。複合トランスジェニック形質遺伝子座には、相互に遺伝的に結合された複数のトランス遺伝子を有するゲノム遺伝子座が含まれる。相互から０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１．０、２もしくは実に５センチモルガン（ｃＭ）以内に独立トランス遺伝子を挿入することによって、トランス遺伝子は、単一遺伝子座として増殖されることができる（例えば、米国特許出願公開第１３／４２７，１３８号明細書もしくは国際公開第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０３００６１号明細書を参照されたい）。
関心対象の表現型もしくは形質と相関する染色体間隔は、同定することができる。染色体間隔を同定するためには、当技術分野において周知の様々な方法を利用できる。そのような染色体間隔の境界は、関心対象の形質を制御する遺伝子に結合されるであろうマーカーを包含すると描出される。言い換えると、染色体間隔は、その間隔（その間隔の境界を規定する末端マーカーを含む）内に存在する任意のマーカーをトウモロコシ煤斑耐性についてのマーカーとして使用できるように描出される。１つの実施形態では、染色体間隔は、少なくとも１つのＱＴＬを含み、さらに、２つ以上のＱＴＬを実際に含む可能性がある。同一間隔内の複数のＱＴＬの近接近は、１つのマーカーが２つ以上のＱＴＬへの結合を証明する可能性があるので、特定のマーカーと特定のＱＴＬとの相関を不明瞭にする可能性がある。これとは逆に、例えば、近接近にある２つのマーカーが所望の表現型形質と共分離を示す場合は、それらのマーカーのそれぞれが同一ＱＴＬもしくは２つの異なるＱＴＬを同定するかどうかが不明の場合がある。用語「定量的形質遺伝子座」もしくは「ＱＴＬ」は、少なくとも１つの遺伝的背景において、例えば、少なくとも１つの育種集団において定量的表現型形質の示差的発現と関連しているＤＮＡの１つの領域を意味する。ＱＴＬの領域は、問題の形質に影響を及ぼす１つ以上の遺伝子を包含する、または密接に結合している。「ＱＴＬの対立遺伝子」は、例えばハロタイプなどの隣接ゲノム領域もしくは結合群内の複数の遺伝子もしくは他の遺伝因子を含むことができる。ＱＴＬの１つの対立遺伝子は、特定窓内のハロタイプを意味することができ、ここで前記窓は、１セットの１つ以上の多型マーカーを用いて定義できる、および追跡できる隣接ゲノム領域である。ハロタイプは、特定窓内の各マーカーで対立遺伝子の固有のフィンガープリントによって定義することができる。
スクリーニング可能マーカー表現型を使用せずに標的部位もしくは標的部位の近くで改変ゲノムを有するそれらの細胞を同定するためには、様々な方法を利用することができる。そのような方法は、ＰＣＲ法、シークエンシング法、ヌクレアーゼ消化法、サザンブロット法およびそれらの任意の組合せを含むがそれらに限定されない、標的配列内の何らかの変化を検出するために標的配列を直接的に分析する工程であると見なすことができる。
タンパク質は、アミノ酸の置換、欠失、切断および挿入を含む様々な方法で改変することができる。そのような操作のための方法は、一般に公知である。例えば、タンパク質のアミノ酸配列変異体は、ＤＮＡ内の突然変異によって調製することができる。突然変異生成およびヌクレオチド配列改変の方法には、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８－９２；Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５４：３６７－８２；米国特許第４，８７３，１９２号明細書；Ｗａｌｋｅｒ ａｎｄ Ｇａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびその中で言及された参考文献が含まれる。タンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない可能性が高いアミノ酸置換に関するガイダンスは、例えば、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｆｏｕｎｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデル内で見いだされる。例えば１つのアミノ酸と類似の特性を有するまた別のアミノ酸との保存的置換が好ましい可能性がある。保存的置換、挿入およびアミノ酸置換は、タンパク質の特性における急激な変化を生成するとは予測されず、任意の置換、欠失、挿入もしくはそれらの組合せの影響はルーチンのスクリーニングアッセイによって評価することができる。二本鎖切断誘導活性についてのアッセイは、当技術分野で公知であり、一般には、標的部位を含有するＤＮＡ基質上の作用物質の全活性および特異性を測定する。
ヌクレオチド配列およびポリペプチドを生物中に導入するためには、例えば、形質転換、有性交配およびポリペプチド、ＤＮＡもしくはｍＲＮＡの細胞内への導入を含む様々な方法が公知である。
組成物を様々な生物と接触させる、様々な生物に提供する、および／または様々な生物中に導入するための方法は公知であり、安定性形質転換、一過性形質転換法、ウイルス媒介性方法および有性育種法が含まれるがそれらに限定されない。安定性形質転換は、導入されたポリヌクレオチドが生物のゲノム内に組み込まれ、それらの子孫によって遺伝で受け継がれる可能性があることを表す。一過性形質転換は、導入された組成物が一時的にのみ発現する、または生物内に存在することを表す。
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを植物内に導入するためのプロトコールは、例えば単子葉植物もしくは双子葉植物などの形質転換の標的とされる植物もしくは植物細胞のタイプに依存して変動する可能性がある。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを植物細胞内に導入し、その後の植物ゲノム内へ挿入するための好適な方法には、マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：３２０－３４および米国特許第６，３００，５４３号明細書）、分裂組織形質転換（米国特許第５，７３６，３６９号明細書）、エレクトロポレーション（Ｒｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：５６０２－６）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換（米国特許第５，５６３，０５５号明細書および同第５，９８１，８４０号明細書）、直接遺伝子導入（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ ３：２７１７－２２）および弾道粒子加速（米国特許第４，９４５，０５０号明細書；同第５，８７９，９１８号明細書；同第５，８８６，２４４号明細書；同第５，９３２，７８２号明細書；Ｔｏｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）“Ｄｉｒｅｃｔ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｉｎｔａｃｔ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌｓ ｖｉａ Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ”，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｅｄ．Ｇａｍｂｏｒｇ ＆ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）；ＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９２３－６；Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ２２：４２１－７７；Ｓａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：２７－３７（タマネギ）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ８７：６７１－４（ダイズ）；Ｆｉｎｅｒ ａｎｄ ＭｃＭｕｌｌｅｎ，（１９９１）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２７Ｐ：１７５－８２（ダイズ）；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ ９６：３１９－２４（ダイズ）；Ｄａｔｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：７３６－４０（コメ）；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：４３０５－９（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：５５９－６３（トウモロコシ）；米国特許第５，２４０，８５５号明細書；同第５，３２２，７８３号明細書および同第５，３２４，６４６号明細書；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ９１：４４０－４（トウモロコシ）；Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：８３３－９（トウモロコシ）；Ｈｏｏｙｋａａｓ－Ｖａｎ Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１１：７６３－４；米国特許第５，７３６，３６９号明細書（穀類）；Ｂｙｔｅｂｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：５３４５－９（ユリ科）；Ｄｅ Ｗｅｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８５），Ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｖｕｌｅ Ｔｉｓｓｕｅｓ，ｅｄ．Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（Ｌｏｎｇｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．１９７－２０９（花粉）；Ｋａｅｐｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ９：４１５－８）およびＫａｅｐｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ ８４：５６０－６（ウィスカー媒介性形質転換）；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４：１４９５－５０５（エレクトロポレーション）；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｃｆｅｌｌ Ｒｅｐ １２：２５０－５；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ａｎｄ Ｆｏｒｄ（１９９５）Ａｎｎａｌｓ Ｂｏｔａｎｙ ７５：４０７－１３（コメ）およびＯｓｊｏｄａ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：７４５－５０（アグロバクテリウム・ツメファキエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を介するトウモロコシ）が含まれる。
または、ポリヌクレオチドは、植物をウイルスもしくはウイルス核酸と接触させることにより植物内に導入することができる。一般に、そのような方法は、ウイルスＤＮＡもしくはＲＮＡ分子内にポリヌクレオチドを組み込む工程を包含している。一部の例では、関心対象のポリペプチドは、最初にウイルスポリタンパク質の一部として合成することができ、その後に所望の組換えタンパク質を生成するためにｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏでのタンパク質分解によってプロセシングされる。ポリヌクレオチドを植物中に導入してその中でコードされた、ウイルスＤＮＡもしくはＲＮＡ分子を包含するタンパク質を発現させるための方法は公知であり、例えば、米国特許第５，８８９，１９１号明細書、同第５，８８９，１９０号明細書、同第５，８６６，７８５号明細書、同第５，５８９，３６７号明細書および同第５，３１６，９３１号明細書を参照されたい。一過性形質転換法には、例えば二本鎖切断誘導物質などのポリペプチドの生物内への直接的導入、例えばＤＮＡおよび／またはＲＮＡポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドの導入ならびに例えば二本鎖切断誘導物質をコードするｍＲＮＡなどのＲＮＡ転写物の生物内への導入が含まれるがそれらに限定されない。そのような方法には、例えば、マイクロインジェクションもしくは粒子衝突法が含まれる。例えば、Ｃｒｏｓｓｗａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２０２：１７９－８５；Ｎｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ ４４：５３－８；Ｈｅｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：２１７６－８０；およびＨｕｓｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １０７：７７５－８４を参照されたい。
用語「双子葉植物」は、「双子葉植物網」としても公知である被子植物の亜綱を意味するが、植物全体、植物器官（例えば、葉、幹、根など）、種子、植物細胞および同一物の子孫についての言及が含まれる。本明細書で使用する植物細胞には、制限なく、種子、懸濁培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、新芽、配偶体、胞子体、花粉および小胞子が含まれる。
本開示の状況における用語「交配した」もしくは「交配（ｃｒｏｓｓ）」もしくは「交配（ｃｒｏｓｓｉｎｇ）」は、子孫（すなわち、細胞、種子もしくは植物）を生成するための授粉による配偶子の融合を意味する。この用語は、有性交配（１種の植物と他の植物との授粉）および自植（自家受粉、すなわち、花粉および胚珠（もしくは小胞子および大胞子）は同一植物もしくは遺伝的に同一の植物に由来する）の両方を包含する。
用語「遺伝子移入」は、１つの遺伝的背景から別の遺伝的背景への遺伝子座の所望の対立遺伝子の伝達を意味する。例えば、特定遺伝子座での所望の対立遺伝子の遺伝子移入は、２種の親植物間の有性交配により少なくとも１つの子孫植物へ伝達することができるが、ここで親植物の少なくとも１つはそのゲノム内に所望の対立遺伝子を有する。または、例えば、対立遺伝子の伝達は、例えば融合プロトプラスト内の２つのドナーゲノム間の組換えによって発生する可能性があり、ここでドナープロトプラストの少なくとも１つは、そのゲノム内に所望の対立遺伝子を有する。所望の対立遺伝子は、例えば、トランス遺伝子、修飾（突然変異もしくは編集）天然対立遺伝子またはマーカーもしくはＱＴＬの選択された対立遺伝子であってよい。
標準のＤＮＡ単離、精製、分子クローニング、ベクター構築および検証／特性解析法は明確に確立されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）を参照されたい。ベクターおよび構築物には、環状プラスミドおよび関心対象のポリヌクレオチドおよび任意選択的にリンカー、アダプター、調節もしくは分析を含む他の成分を含む線状ポリヌクレオチドが含まれる。一部の例では、認識部位および／または標的部位は、イントロン、コーディング配列、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲおよび／または調節領域内に含有される可能性がある。
単子葉植物および双子葉植物を含む任意の植物を使用できる。使用できる単子葉植物の例としては、トウモロコシ（ゼア・マイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ））、コメ（オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ））、ライムギ（セカレ・セレアレ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ））、ソルガム（ソルガム・ビカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、ソルガム・ブルガレ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ））、キビ（例えばトウジンビエ（ペニセタム・グラウクム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ）、キビ（パニクム・ミリアセウム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、アワ（セタリア・イタリカ（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ）、シコクビエ（エレウシネ・コラカナ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｃｏｒａｃａｎａ））、コムギ（トリティクム・アエスティバム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ））、サトウキビ（サッカルム種（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．））、カラスムギ（アヴィーナ（Ａｖｅｎａ属））、オオムギ（ホルデウム属（Ｈｏｒｄｅｕｍ））、スイッチグラス（パニクム・ヴィルガタム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ））、パイナップル（アナナス・コモスス（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ））、バナナ（ムサ種（Ｍｕｓａ ｓｐｐ．））、ヤシ、観賞植物、芝草および他の草が挙げられる。使用できる双子葉植物の例としては、ダイズ（グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ））、カノーラ（ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）およびＢ．カンペストリス（Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ））、アルファルファ（メディカゴ・サティバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ））、タバコ（ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ））、シロイヌナズナ（アラビドプシス・タリアーナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ））、ヒマワリ（ヘリアンサス・アナス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ））、綿（ゴシピウム・アルボレウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ａｒｂｏｒｅｕｍ））および落花生（アラキス・ハイポガエア（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ））、トマト（ソラナム・リコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ））、ジャガイモ（ソラナム・ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ））などが含まれるがそれらに限定されない。
略語の意味は以下の通りである：「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」は「マイクロモルの」を意味し、「ｍＭ」は「ミリモルの」を意味し、「Ｍ」は「モルの」を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、および「ｋｂ」はキロベースを意味味する。
本明細書に開示した組成物および方法の非限定的例は、以下の通りである：
１．そのゲノム内に修飾ヌクレオチド配列を含む細胞を選択するための方法であって：
ａ）ガイドポリヌクレオチド、少なくとも１つの保護ポリヌクレオチド修飾鋳型およびＣａｓエンドヌクレアーゼを細胞に提供する工程であって、ここで前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドポリヌクレオチドは前記細胞のゲノム内の標的部位で一本鎖もしくは二本鎖切断を導入することができる複合体を形成することができ、前記保護ポリヌクレオチド修飾鋳型は、前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含む工程；および
ｂ）工程（ａ）から前記修飾ヌクレオチド配列を含む細胞を選択する工程を含む方法。
２．保護ポリヌクレオチド修飾鋳型は、その５’末端、３’末端ならびに５’末端および３’末端の両方で少なくとも１つの保護分子を含む線状ポリヌクレオチドである、実施形態１の方法。
３．保護分子は、アルカンスペーサー、蛍光体、ＮＨＳエステル、ジゴキシゲン、コレステリル－ＴＥＧ、Ｃ６、Ｃ１２、ヘキシニル、Ｏｘｔａｄｉｙｎｙｌ ｄＵＴＰ、ビオチン、ジチオール、逆ジデオキシ－Ｔ修飾もしくはそれらのいずれか１つの組合せからなる群から選択される、実施形態２の方法。
４．保護ポリヌクレオチド修飾鋳型は、環状ポリヌクレオチドである、実施形態１の方法。
５．前記保護ポリヌクレオチド修飾鋳型は、少なくとも１本の鎖の５’末端で少なくとも１つのホスホロチエート結合を含む一本鎖もしくは二本鎖線状分子である、実施形態１の方法。
６．前記保護ポリヌクレオチド修飾鋳型は、各鎖の５’末端上で３炭素アルカリスペーサーを含む一本鎖もしくは二本鎖線状分子である、実施形態１の方法。
７．保護ポリヌクレオチド鋳型の少なくとも１つのヌクレオチド修飾は、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換え、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入および（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組合せからなる群から選択される、実施形態１～６のいずれか１つの方法。
８．前記細胞内の相同組換え修復（ＨＤＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の頻度をさらに決定する、実施形態１の方法。
９．ＨＤＲの頻度は、非保護（コントロール）ポリヌクレオチド修飾鋳型を使用すること以外は、実施形態１の方法と同一の成分および工程全部を有するコントロール法に由来するＨＤＲの頻度と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％もしくは２５０％増加させられる、実施形態８の方法。
１０．ＮＨＥＪの頻度は、非保護（コントロール）ポリヌクレオチド修飾鋳型を使用すること以外は、実施形態１の方法と同一の成分および工程全部を有するコントロール法に由来するＮＨＥＪの頻度と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％減少させられる、実施形態８の方法。
１１．前記細胞内の保護ポリヌクレオチド修飾鋳型のオフサイト組込みの頻度をさらに決定する、実施形態１の方法。
１２．前記細胞内の保護ポリヌクレオチド修飾鋳型のオフサイト組込みの頻度は、非保護（コントロール）ポリヌクレオチド修飾鋳型を使用すること以外は、実施形態１の方法と全て同一の成分および工程を有するコントロール法に由来するオフサイト組込みの頻度と比較して減少させられる、実施形態１１の方法。
１３．そのゲノム内の標的部位に挿入された関心対象のポリヌクレオチドを含む細胞を選択するための方法であって：
ａ）ガイドポリヌクレオチド、少なくとも１つの保護ポリヌクレオチドドナーＤＮＡおよびＣａｓエンドヌクレアーゼを細胞に提供する工程であって、ここで前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドポリヌクレオチドは前記細胞のゲノム内の標的部位での一本鎖もしくは二本鎖切断を導入することができる複合体を形成することができ、前記保護ポリヌクレオチドドナーＤＮＡは前記細胞のゲノム内に導入すべき関心対象のポリヌクレオチドを含む工程；および
ｂ）工程（ａ）からそのゲノム内の標的部位内へ挿入された関心対象のポリヌクレオチドを含む細胞を選択する工程を含む方法。
１４．そのゲノム内の標的部位に挿入された関心対象のポリヌクレオチドを含む微生物細胞を選択するための方法であって：
ａ）ガイドポリヌクレオチド、少なくとも１つの保護ポリヌクレオチドドナーＤＮＡおよびＣａｓエンドヌクレアーゼを細胞に提供する工程であって、ここで前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドポリヌクレオチドは前記細胞のゲノム内の標的部位での一本鎖もしくは二本鎖切断を導入することができる複合体を形成することができ、前記保護ポリヌクレオチドドナーＤＮＡは前記細胞のゲノム内に導入すべき関心対象のポリヌクレオチドを含む工程；および
ｂ）工程（ａ）からそのゲノム内の標的部位内へ挿入された関心対象のポリヌクレオチドを含む微生物細胞を選択する工程を含む方法。
１５．細胞は、ヒト、非ヒト、動物、細菌、古細菌、真菌、昆虫、酵母、非従来型酵母、植物および微生物細胞からなる群から選択される、実施形態１～１３の方法。
１６．微生物細胞は、酵母細胞または非従来型酵母由来の細胞である、実施形態１５の方法。
１７．前記酵母は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、アークスラ（Ａｒｘｕｌａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ウスティラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリゴノプシス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）属、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属およびパチソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属からなる群から選択される属の一員である、実施形態１６の非従来型酵母である。
１８．（ｂ）の細胞から植物を生成する工程をさらに含む、実施形態１３の方法。
下記の実施例では、他に特に明記しない限り、部およびパーセンテージは重量によるものであり、度は摂氏である。これらの実施例は、本開示の実施形態を示しているが、例示するためにのみ提供されていることを理解すべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者であれば様々な用法および条件に適合させるために本開示に様々な変更および修飾を加えることができる。そのような修飾もまた、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図されている。
実施例１
Ｃａｎ１をターゲティングするＣａｓ９ ＨＤＶ－ｇＲＮＡ発現プラスミド
本実施例では、肝炎δウイルス（ＨＤＶ）リボザイムによって５’末端上で隣接されている一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の使用について考察する。ＨＤＶリボザイムは、その固有の配列の５’を切断し、任意の先行するＲＮＡ配列を除去するが、ｇＲＮＡの５’末端に融合したＨＤＶ配列は残す。
ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属におけるｓｇＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系を試験するために、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｍ１ ＧＡＳ由来のＣａｓ９遺伝子（ＳＦ３７０（配列番号１））は、当技術分野において公知の標準技術によってヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）コドン最適化した（配列番号２）。細胞の核にＣａｓ９タンパク質を局在化するために、シミアン・ウイルス４０（ＳＶ４０）一方向性（ＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号３）核局在化シグナルは、Ｃａｓ９タンパク質のカルボキシ末端で組み込まれた。ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）コドン最適化Ｃａｓ９遺伝子は、標準分子生物学技術によってヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属構成的プロモーターであるＦＢＡ１（配列番号４）に融合させた。ＦＢＡ１プロモーターおよびヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）最適化Ｃａｓ９－ＮＬＳ融合を含有するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）コドン最適化Ｃａｓ９発現カセットの例は、配列番号５に示した。Ｃａｓ９発現カセットは、結果としてｐＺｕｆＣａｓ９（配列番号６）を生じさせるプラスミドｐＺｕｆ内にクローン化された。
プラスミドｐＺｕｆ－Ｃａｓ９ＣＳ（配列番号６）は、ｐＲＦ１０９（配列番号９）を生成するｐＺｕｆ－Ｃａｓ９ＣＳ（配列番号６）内に存在するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）コドン最適化Ｃａｓ９遺伝子（配列番号２）内に存在する内在性ＡａｒＩ部位を除去するために、Ａｇｉｌｅｎｔ ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅおよび次のプライマーＡａｒＩ－除去－１（ＡＧＡＡＧＴＡＴＣＣＴＡＣＣＡＴＣＴＡＣｃａｔｃｔｃｃＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＴＣＣ、配列番号７）およびＡａｒＩ－除去－２（ＧＧＡＡＴＣＧＡＣＧＡＧＴＴＴＣＴＴＴＣｇｇａｇａｔｇＧＴＡＧＡＴＧＧＴＡＧＧＡＴＡＣＴＴＣＴ、配列番号８）を使用して突然変異を起こさせた。修飾Ａａｒ１－Ｃａｓ９ＣＳ遺伝子（配列番号１０）は、存在するＣａｓ９遺伝子（配列番号２）をＡａｒ１－Ｃａｓ９遺伝子（配列番号１０）と置き換えてｐＲＦ１４１（配列番号１１）を生成することでｐＲＦ１０９（配列番号９）由来のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ断片としてｐＺｕｆＣａｓ９ＣＳ（配列番号６）のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ部位内にクローニングさせた。
高スループット可変性ターゲティングドメイン（ＶＴ）クローニングカセット（図１、配列番号１２）は、ｙｌ５２プロモーター（配列番号１３）、ＨＤＶリボザイムをコードするＤＮＡ配列（配列番号１４）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）逆選択カセットｒｐｓＬ（配列番号１５）、Ｃａｓ９ ＣＥＲドメインをコードするＤＮＡ（配列番号１６）およびＳ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＵＰ４ターミネーター（配列番号１７）から構成される。高スループットクローニングカセット（配列番号１２）の末端に隣接しているのは、ＰａｃＩおよびＣｌａＩ制限酵素認識部位である。高スループットクローニングカセット（配列番号１２）は、ｐＲＦ２９１（配列番号１４）を生成するためにｐＲＦ１４１（配列番号１１）のＰａｃＩ／ＣｌａＩ部位内にクローニングされた。ｒｐｓＬ逆選択カセット（配列番号１５）は、その天然プロモーターおよびターミネーターとともにＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｒｐｓＬ遺伝子のＷＴ（野生型）コピーを含有する。ｒｐｓＬはＳ１２リボソームタンパク質サブユニットを含有する（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）。Ｓ１２サブユニット内の一部の突然変異は、ｒｐｓＬ遺伝子の野生型コピーが存在する場合は、菌株がストレプトマイシンに対して表現型的に感受性であるように、抗生物質ストレプトマイシンに対する耐性（Ｏｚａｋｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９６９）．“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｌｏｃｕｓ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ．”Ｎａｔｕｒｅ ２２２（５１９１）：３３３－３３９）を劣性方法で誘導する（（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ，Ｊ．（１９５１）．“Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；ａ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ．”Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ６１（５）：５４９－５５０．）。（（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ，Ｊ．（１９５１）．“Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；ａ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ．”Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ６１（５）：５４９－５５０．）。例えばＴｏｐ１０（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの一般的クローニング菌株は、細胞がストレプトマイシンに対して耐性であるようにそれらの染色体上にｒｐｓＬの突然変異コピーを有する。
可変ターゲティングドメインをｐＲＦ２９１内にクローニングするには、高スループットクローニングカセット内に存在する２つのＡａｒＩ部位内にクローニングするために、アニーリングされるとそれらが所望の可変ターゲティングドメインならびに正確なオーバーハングを含有する２つの部分的相補性オリゴヌクレオチドを必要とする。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のＣＡＮ１遺伝子内のＣａｎ１－１標的部位（配列番号２２）を標的とする可変ターゲティングドメインＣａｎ１－１（配列番号２１）をコードするＤＮＡを含有する２つのオリゴヌクレオチドであるＣａｎ１－１Ｆ（ＡＡＴＧＧＧＡＣｔｃａａａｃｇａｔｔａｃｃｃａｃｃｃｔｃＧＴＴＴ、配列番号１９）およびＣａｎ１－１Ｒ（ＴＣＴＡＡＡＡＣｇａｇｇｇｔｇｇｇｔａａｔｃｇｔｔｔｇａＧＴＣＣ、配列番号２０）を１００μＭで二重バッファー（３０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭの酢酸ナトリウム）中に再懸濁させた。Ｃａｎ１－１Ｆ（配列番号１９）およびＣａｎ１－１Ｒ（配列番号２０）を単一試験管中でそれぞれ５０μＭの最終濃度で混合し、９５℃へ５分間加熱し、二本鎖ＤＮＡ小分子を形成するために２つのオリゴヌクレオチドをアニーリングするために０．１℃／分で２５℃へ冷却した（図２）。２０μＬの最終容量中に５０ｎｇのｐＲＦ２９１、Ｃａｎ１－１Ｆ（配列番号１９）およびＣａｎ１－１Ｒ（配列番号２０）から構成される２．５μＭの短鎖二本鎖ＤＮＡ、１×のＴ４リガーゼバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．５））、０．５μＭのＡａｒＩオリゴヌクレオチド、２単位のＡａｒＩ、４０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを含有する単一チューブ消化／ライゲーション反応を作成した。Ｃａｎ１－１Ｆ二本鎖およびＣａｎ１－１Ｒ二本鎖が欠如する第２コントロール反応もまた組み立てた。この反応を３７℃で３０分間インキュベートした。１０μＬの各反応は、以前に記載されたようにＴｏｐ１０ Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞内へ形質転換させた（Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｒ．＆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｅｄｎ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２０１２））。Ｃａｎ１－１Ｆ（配列番号１９）およびＣａｎ１－１Ｒ（配列番号２０）の二本鎖がＡａｒＩ制限部位によって隣接されたｒｐｓＬ逆染色マーカーに置き換えられたｐＲＦ２９１の存在を選択するために、細胞は、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有する１．５（重量／容積）％のＢａｃｔｏ寒天により凝固させた溶原性ブロス上でプレーティングした。高スループットクローニングカセットを含有するｐＲＦ２９１の存在は、抗生物質アンピシリンに対しては表現型的に耐性であるが、プラスミド上の逆選択カセットの存在に起因して抗生物質ストレプトマイシンには感受性であるコロニーを産生した。しかし、逆選択カセットがＡａｒＩ酵素により除去され、二本鎖ＤＮＡを含有するＣａｎ１－１可変ターゲティングドメインが（ＡａｒＩに対する認識配列を除去して）その部位内にライゲーションされた場合は、プラスミドを用いて形質転換された細胞はアンピシリン耐性、ストレプトマイシン耐性表現型を有していた（図１）。逆選択カセットを置き換えているＣａｎ１－１可変ターゲティングドメインを含有するｐＲＦ２９１は、ＳＵＰ４ターミネーター（配列番号１７）に融合したＣＥＲドメイン（配列番号１６）をコードするＤＮＡに融合したＣａｎ１－１可変ターゲティングドメイン（配列番号２１）をコードするＤＮＡに融合したＨＤＶリボザイム（配列番号１４）をコードするＤＮＡに融合したｙｌ５２プロモーター（配列番号１３）を含有する組換えＣａｎ１－１ ｇＲＮＡ発現カセット（配列番号１９）を作成した。この構築物を含有するプラスミドであるｐＲＦ３０３（配列番号２４）を使用して、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のＣＡＮ１遺伝子（配列番号２３）をＣａｓ９によりターゲティングした。
実施例２
保護ポリヌクレオチド修飾鋳型の生成
Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ生成ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）の修復中に、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を修復するために非相同末端結合経路を使用するための大多数の真核細胞タイプに対する優先は、典型的にはこの切断を修復するための相同組換え修復（ＨＤＲ）のタンパク質を使用してコロニーをほとんど備えないＮＨＥＪ由来突然変異（インデル）の大きな背景を作り出す。これは、ＤＳＢでの鋳型化変化を作成するために鋳型を使用および編集する遺伝子編集実験では、ＨＤＲを使用してＣａｓ９／ｇＲＮＡ生成ＤＳＢが修復された事象を見いだすために多数の事象についてスクリーニングしなければならないことを意味する。鋳型を編集する保護ポリヌクレオチドの使用は、所望の編集を用いて事象を見いだすためにスクリーニングしなければならない事象数を減少させることでＣａｓ９／ｇＲＮＡ生成ＤＳＢのＨＤＲ修復の頻度を増加させる方法を提供する。本実施例では、「保護ポリヌクレオチド修飾鋳型」と呼ばれる、それらが分解する傾向を低下させる修飾末端を有する３種の異なるタイプのポリヌクレオチド修飾鋳型の生成について記載する。これらの保護ポリヌクレオチド修飾鋳型は、細胞内のエキソヌクレアーゼから鋳型を保護することによって強力に鋳型安定性を改変する、および／または鋳型が非相同末端結合（ＮＨＥＪ）のための基質として作用する能力を改変することができる。所望の遺伝子編集事象が２つの異なる相同性アーム間の領域の欠失である場合は（図３Ａ）、編集鋳型は、介在配列を使用せずに結合している２つの相同性アームを含有するであろう（図３Ｂ）。３種のタイプの保護ポリヌクレオチド修飾鋳型は、１）利用可能な二本鎖末端を備えていない環状ＤＮＡ鋳型（図３Ｄ）、各鎖の５’末端上の３炭素アルカンスペーサーを用いて修飾された線状二本鎖ＤＮＡ鋳型（図３Ｃ）、および３）各鎖上でホスホロチオエート結合と取り換えられた５つの５’最末端ホスホジエステル結合を備える線状二本鎖ＤＮＡ鋳型（図３Ｃ）である。
非保護（未修飾）ポリヌクレオチド修飾鋳型は、１つが、標準技術（使用したプライマー、ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＣＴＡＣＧＴＴＡＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＣ（フォワード、配列番号２６）およびＧＧＡＧＡＧＡＧＣＧＴＣＧＧＧＡＧＴＧＧＴＣＧＧＡＴＧＧＡＴＧＧＡＧＡＣＧ（リバース、配列番号２７））を用いてヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ２０３６２ゲノムＤＮＡから増幅させたＣＡＮ１オープンリーディングフレーム（配列番号２５）の２ｂｐの５’で終了する６２９ｂｐである２つのＰＣＲ産物を作成することによって生成した。リバースプライマーはＣＡＮ１オープンリーディングフレームの３’の３７ｂｐの配列に相補的な１７ヌクレオチドを付加し、フォワードプライマーは、５’ＨｉｎＤＩＩＩ認識部位を付加する。第２ＰＣＲ産物は、ＣＡＮ１オープンリーディングフレームの３’の３７塩基対から出発する６３７ｂｐからなる（配列番号２８）。このＰＣＲ産物は、標準技術（使用したプライマー、ＣＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＡＴＣＣＧＡＣＣＡＣＴＣＣＣＧＡＣＧＣＴＣＴＣＴＣＣ（フォワード、配列番号２９）およびＣＣＡＴＡＣＡＴＣＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＴＧＣ（リバース、配列番号３０））を使用してヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ２０３６２ゲノムＤＮＡから増幅させた。フォワードプライマーは、ＣＡＮ１オープンリーディングフレームの５’の２ｂｐで終了する領域に相補的である２０ヌクレオチドを付加する。上流ＰＣＲ産物（配列番号２５）および下流ＰＣＲ産物（配列番号２８）はどちらも、Ｚｙｍｏクリーンおよび濃縮カラムを使用して精製した。１０ｎｇの各ＰＣＲ産物は新規のＰＣＲ反応中で混合した。上流産物の３’の３７ヌクレオチドは、下流産物の５’の３７ヌクレオチドと同一である。上流断片および下流断片を使用して、上流配列および下流配列の両方を含有する重複する末端からの合成により、相互が非保護ポリヌクレオチド修飾鋳型（配列番号３１）を表す単一産物を作成するようにプライミングした（Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ（２０１３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ５４（３）：１２９－１３３）（図３Ｂ）。完全非保護（コントロール）ポリヌクレオチド修飾鋳型は、ＨｉｎＤＩＩＩを用いて消化し、プラスミドｐＲＦ８０（配列番号３３）を使用してｐＵＣ１８（配列番号３２）のＨｉｎＤＩＩＩ部位内にクローニングした。プラスミドｐＲＦ８０は、相同組換え修復（ＨＤＲ）のための鋳型として使用されると全ＣＡＮ１オープンリーディングフレームの欠失をもたらすであろう１２１０ｂｐのＤＮＡ断片（配列番号３４）を含む二本鎖環状保護ポリヌクレオチド修飾鋳型（図３Ｄ）を表す。
線状保護ポリヌクレオチド修飾鋳型は、ｐＲＦ８０上に含有されたクローン化鋳型から生成された（配列番号３３）。ｐＲＦ８０上に含有された鋳型は、標準技術およびプライマーとして化学的に合成、修飾されたオリゴヌクレオチド（ＩＤＴ）を使用してＰＣＲ増幅させた。アルカンスペーサーを用いて修飾された５’末端を備える線状保護ポリヌクレオチド修飾鋳型を生成するために、ｐＲＦ８０からの鋳型は、各鎖の５’末端上で５’アルカンスペーサーを備えるＣＡＮ１ ＯＲＦ欠失鋳型（配列番号３４）を含有する１２１５ｂｐのＰＣＲを生成するために増幅させた（使用したプライマー、／５ＳｐＣ３／ＡＧＣＴＴＧＣＴＡＣＧＴＴＡＧＧＡＧＡＡ、フォワード（配列番号３５）および／５ＳｐＣ３／ＴＡＴＧＡＧＣＴＴＡＴＣＣＴＧＴＡＴＣＧ、リバース（配列番号３６））。第２線状保護ポリヌクレオチド修飾鋳型は、本質的にＰＣＲ鋳型としてｐＲＦ８０（配列番号３３）を用いる同一方法で生成した。線状鋳型は、５つの５’最末端ホスホジエステル結合がホスホロチオエート結合（＊）（使用したプライマー；Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｔ＊ＧＣＴＡＣＧＴＴＡＧＧＡＧＡＡ、フォワード（配列番号３７）およびＴ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊ＧＣＴＴＡＴＣＣＴＧＴＡＴＣＧ、リバース（配列番号３８））と置き換えられている化学合成プライマー（ＩＤＴ）を用いて増幅させた。結果として生じる産物は、各鎖の５’最末端に５つのホスホロチオエート結合を含有する１，２１５ｂｐのＣＡＮ１欠失保護ポリヌクレオチド修飾鋳型（配列番号３１）である。未修飾（非保護、コントロール）鋳型は、非保護１，２１５ｂｐの線状ＣＡＮ１欠失ポリヌクレオチド修飾鋳型（編集鋳型）（配列番号３１）を生成するために、修飾を備えない化学合成オリゴヌクレオチドプライマーおよび標準技術（使用したプライマー、ＡＧＣＴＴＧＣＴＡＣＧＴＴＡＧＧＡＧＡＡ、フォワード（配列番号４０）およびＴＡＴＧＡＧＣＴＴＡＴＣＣＴＧＴＡＴＣＧ、リバース（配列番号４１）を使用してｐＲＦ８０から増幅させた。線状鋳型のＰＣＲ反応は、Ｚｙｍｏクリーンおよび濃縮２５カラムを使用して精製し、２５μＬの１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中に溶出させた。
実施例３
Ｃａｓ９／ｇＲＮＡターゲティングと組み合わせて保護ポリヌクレオチド修飾鋳型を使用する精密な遺伝子編集
本実施例では、ＨＤＲおよびＮＨＥＪ頻度に（非保護（コントロール）鋳型の代わりに）保護鋳型を使用した場合の影響を決定するために、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞を保護および非保護（未修飾）ポリヌクレオチド修飾鋳型の存在下および非存在下でターゲティングプラスミドを用いて形質転換させた。ＨＤＲ頻度の増加およびＮＨＥＪ頻度の同時の減少は、典型的なＣａｓ９／ｇＲＮＡ遺伝子編集実験において存在するＮＨＥＪ由来背景を大きく減少させるであろう。全ターゲティング効率（ＮＨＥＪ頻度＋ＨＤＲ頻度を表す）を決定するために、細胞をカナバニン耐性について表現型的にスコアリングした。ＨＤＲおよびＮＨＥＪによるＣａｓ９／ｇＲＮＡ生成二本鎖切断の修復の頻度を決定するために、ＣＡＮ１遺伝子座（配列番号３９）のコロニーＰＣＲを実施した。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ２０３６２のウラシル栄養要求性株を３０℃のＹＰＤ培地プレート（Ｔｅｋｎｏｖａ）上で２４時間増殖させた。１ループの細胞を形質転換バッファー（３５％のポリエチレングリコール（平均分子量３５５０）、１００ｍＭの酢酸リチウム、１００ｍＭのジチオトレイトール、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．０））中に再懸濁させた。１００μＬの細胞懸濁液は、ポリヌクレオチド修飾鋳型なし、１μｇの非保護線状ポリヌクレオチド修飾鋳型（配列番号３１）、１μｇのＣ３Ｓ保護線状ポリヌクレオチド修飾鋳型（配列番号３１の５’末端で３炭素アルカリスペーサーを含む鋳型）、１μｇのＰＴ保護ポリヌクレオチド修飾鋳型（配列番号３１の最初の５つの５’ヌクレオチドでホスホロチエート結合を含む鋳型）もしくは５μｇの環状ポリヌクレオチド修飾鋳型、ｐＲＦ８０（配列番号３３）のいずれかとともに１００ｎｇのｐＲＦ２９１（配列番号１８）（Ｃａｓ９発現、ｇＲＮＡなし）もしくはｐＲＦ３０３（配列番号２４）（Ｃａｓ９発現、Ｃａｎ１－１ ｇＲＮＡ発現）のいずれかと混合した。形質転換混合物は、８００ＲＰＭで１時間にわたり３９℃でインキュベートした。形質転換混合物は、プラスミドＤＮＡを用いて形質転換された細胞を選択するためにウラシル（Ｔｅｋｎｏｖａ）が欠如する完全最小培地プレート上でプレーティングした。プレートは、３０℃で４８時間インキュベートした。各形質転換からの２４コロニーは、単一コロニーに対してウラシル（Ｔｅｋｎｏｖａ）が欠如する完全最小培地プレート上で画線精製した。６０μｇ／ｍＬのＬ－カナバニンを含有するアルギニンが欠如する完全最小培地プレートに各画線精製コロニー（各形質転換について９６）からの４つの単一コロニーをパッチした。Ｌ－カナバニンは、細胞へのアルギンおよびＬ－カナバニンのインポーターである機能的ＣＡＮ１遺伝子を備える細胞にとっては毒性である。ＣＡＮ１遺伝子内に機能的対立遺伝子の消失を含有する細胞は、培地中のＬ－カナバニンの存在に対して表現型的に耐性であり、Ｌ－カナバニンを含有するプレート上でコロニーを形成するであろう。ＣＡＮ１遺伝子の野生型コピーを含有する細胞は、Ｌ－カナバニンを含有する培地上では増殖できないであろう。Ｌ－カナバニンの作用様式は、周知である（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ Ｇ．Ａ．，Ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎｄ ｍｏｄｅ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌ－Ｃａｎａｖａｎｉｎｅ，ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎａｌｏｇ ｏｆ Ｌ－ａｒｇｉｎｉｎｅ，Ｔｈｅ ｑｕａｒｔｅｒｌｙ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ ５２，１９７７，１５５－１７８）。形質転換処理によるカナバニン耐性の発生頻度は、表２に示した。
Figure 0007011590000005
Ｃａｓ９発現カセットを有するがＣＡＮ１遺伝子をターゲティングする機能的ｇＲＮＡが欠如するｐＲＦ２９１（配列番号１８）を用いて形質転換された細胞は、Ｃ３Ｓポリヌクレオチド修飾鋳型を用いた単回実験におけるカナバニン耐性コロニーが生じた単一例を除いて、カナバニン耐性細胞を生じさせなかった（表２）。非保護もしくは保護ポリヌクレオチド修飾鋳型の存在下および非存在下でｐＲＦ３０３（配列番号２４）を用いて形質転換された細胞は、カナバニン耐性コロニーの類似の頻度を生じさせたが（表２）、これは形質転換ミックス中のポリヌクレオチド修飾鋳型の存在が標的化二本鎖切断を誘導するＣａｓ９／ｇＲＮＡの能力を改変させないことを示唆している。
非保護（コントロール）もしくは保護ポリヌクレオチド修飾保護修飾鋳型の存在下で、Ｃａｎ１－１標的部位でＣａｓ９／ｇＲＮＡにより生成された標的化二本鎖切断での相同組換え修復（ＨＤＲ）およびＮＨＥＪの頻度を決定するために、標準技術を使用してＣＡＮ１遺伝子座（配列番号４４）（使用したプライマー、ＧＧＡＡＧＧＣＡＣＡＴＡＴＧＧＣＡＡＧＧ、フォワード（配列番号４２）およびＧＴＡＡＧＡＧＴＧＧＴＴＴＧＣＴＣＣＡＧＧ、リバース（配列番号４３））のヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）コロニーＰＣＲを実施した。ＣＡＮ１遺伝子座が修飾されなかった、またはＮＨＥＪによって生成された小インデルを含有する場合は、コロニーＰＣＲは、見かけのサイズ２１２５ｂｐ（配列番号４４）でＷＴ ＣＡＮ１遺伝子座とサイズが類似するバンドを生じさせるであろう。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ生成二本鎖切断が非保護もしくは保護修飾鋳型を使用して修復されていた場合は、ＰＣＲはより小さなＣＡＮ１遺伝子座産物３９２ｂｐを生成することになり、これは全オープンリーディングフレーム（配列番号４５）の欠失を示すであろう。コロニーＰＣＲは、鋳型の存在下もしくは非存在下においてｐＲＦ３０３を用いて形質転換された細胞由来の全カナバニン耐性コロニー上で実施し、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ生成二本鎖切断がポリヌクレオチド修飾鋳型を用いてＨＤＲもしくはＮＨＥＪにより修復された細胞の分画が決定された（表３）。
Figure 0007011590000006
非保護ポリヌクレオチド修飾鋳型もしくはＣ３Ｓ保護線状鋳型を用いて処理された細胞は、ＨＤＲによるＣａｓ９／ｇＲＮＡ生成ＤＳＢの修復の類似の頻度を有していた（表３）。ＰＴ線状保護修飾ポリヌクレオチド鋳型もしくはｐＲＦ８０環状保護修飾ポリヌクレオチド修飾鋳型を用いて処理された細胞は、それぞれ、非保護（コントロール）線状ポリヌクレオチド修飾鋳型より２．１倍および１．４倍高いＣａｓ９／ｇＲＮＡ生成ＤＳＢのＨＤＲ頻度を有していた。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ生成二本鎖切断の修復では、５’ホスホロチオエート修飾を備える線状保護鋳型もしくは環状の非複製保護鋳型は、非保護線状ポリヌクレオチド修飾鋳型の頻度の２００％および１４０％を備えるＨＤＲによって修復された切断の分画における実質的な増加を提供する。ＮＨＥＪは、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を含む大多数の真核細胞における優勢なＤＮＡ ＤＳＢ修復経路である。保護ＤＮＡ修飾鋳型の使用は、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ生成ＤＳＢのＨＤＲ修復の頻度を２倍に大きく増加させ、ＤＳＢの正確な鋳型修復を見いだすためにより少ない事象数のスクリーニングを可能にする。
ポリヌクレオチド修飾鋳型を使用したＣａｓ９／ｇＲＮＡ生成二本鎖切断の修復の追加の厄介な問題は、ＤＮＡ損傷の他の領域でＮＨＥＪ経路によって鋳型が組み込まれてしまうことがあり、結果としてオフサイト組込みを生じさせる可能性が高いことである。このオフサイト組込みがポリヌクレオチド修飾鋳型を用いて処理された細胞において発生する頻度を決定するために、ポリヌクレオチド修飾鋳型（配列番号４６）の６２ｂｐ断片を探すための相対コピー数分析を実施した。相対コピー数分析は、ｐＲＦ３０３（配列番号２４）および線状コントロールポリヌクレオチド修飾鋳型（配列番号３４）、線状保護ポリヌクレオチド修飾鋳型、ＰＴ（配列番号３４）および環状保護ポリヌクレオチド修飾鋳型のｐＲＦ８０（配列番号３３）を用いて処理された細胞由来のコロニー上で実施した。ポリヌクレオチド修飾鋳型がＣＡＮ１遺伝子座（配列番号３９）でのＣａｓ９／ｇＲＮＡ二本鎖切断のＨＤＲ中にのみ組み込まれる場合は、細胞はコピー数分析断片（配列番号４６）の単一コピーしか有していないであろう。しかし、細胞がＮＨＥＪ経路の活性に起因してポリヌクレオチド修飾鋳型の追加のコピーをゲノム内のどこかで組み込む場合は、断片の追加のコピーが存在し、細胞はより高い相対コピー数に復帰するであろう。手短には、ゲノムＤＮＡは標準技術を使用してＣａｎ１－１ Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ標的化二本鎖切断のＨＤＲに対して正であるとスコアリングされたコロニーから単離された。各コロニー由来の１μＬのゲノムＤＮＡは、ＣＡＮ１遺伝子座（配列番号４６）、（使用したプライマー、ＡＧＣＧＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＡＧＣ、フォワード（配列番号４７）、ＣＴＴＧＣＣＡＴＡＴＧＴＧＣＣＴＴＣＣＡ、リバース（配列番号４８）および６ＦＡＭ－ＣＴＴＴＴＣＧＣＣＣＣＣＡＣＴＧＣＡＧＣＣ－ＴＡＭＲＡ、プローブ（配列番号４９））もしくはコントロールとしてのＴＥＦ１遺伝子座（配列番号５０）（使用したプライマー、ＣＧＡＣＴＧＴＧＣＣＡＴＣＣＴＣＡＴＣＡ、フォワード（配列番号５１）、ＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＴＧＧＡＧＡＴＡＣＣＡ、リバース（配列番号５２）および６ＦＡＭ－ＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＧＧＴＧＡＧＴＴ－ＴＡＭＲＡ、プローブ（配列番号５３））の両方について３つの複製ｑＰＣＲ反応に加えた。反応は、９５℃で１０分間、その後に９５℃で１５分間、６０℃で１分間の４０サイクルが続くサイクリング条件を使用して、ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＱｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ ７機器上でＴａｑＭＡＮ汎用ＰＣＲマスターミックス（ＡＢＩ ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内でランした。プローブからの６ＦＡＭ蛍光を４０サイクルのＰＣＲを通して監視し、Ｃｔ値を収集した。相対遺伝子コピー数は、ΔΔＣｔ法によって決定した（Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃２ ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｕｐｄａｔｅｄ ２００１））。手短には、ＴＥＦ１ Ｃｔ値を使用して、ゲノムＤＮＡサンプル間の細胞コピー数の相違についてデータを正規化した。野生型菌株由来のゲノムＤＮＡは、ＣＡＮ１コピー数断片（配列番号４６）についての相対定量のための参照物質として使用した。Ｑｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ ７上のソフトウェアは、野生型株に比較して各サンプルについての相対遺伝子コピー数および対応するエラーを計算した。コロニーは、２未満の相対コピー数および２以上の相対コピー数である２つのビンに分離された。第１のビンは、ポリヌクレオチド修飾鋳型がＣａｎ１－１標的部位でのＣａｓ９／ｇＲＮＡ生成二本鎖切断（配列番号２２）のＨＤＲ修復のためにのみ使用され、ＮＨＥＪによってゲノム内のどこかに組み込まれなかったことを示している。第２のビンは、ポリヌクレオチド修飾鋳型がＣａｎ１－１標的部位（配列番号２２）でのＣａｓ９／ｇＲＮＡ生成二本鎖切断を修復するために使用され、ＮＨＥＪ機構を介してゲノム内のどこかに少なくとも１回は組み込まれたことを示している。コピー数分析の結果は、表４に示した。
Figure 0007011590000007
コピー数分析は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のＣＡＮ１遺伝子座ならびに全ポリヌクレオチド修飾鋳型（保護および非保護）上の両方に存在したｑＰＣＲ標的を使用して実施した。細胞内のＣＡＮ１遺伝子座のＨＤＲのためにポリヌクレオチド修飾鋳型が使用された場合は、標的のコピー数は１のままであろう。ポリヌクレオチド編集鋳型がさらにヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属ゲノム内のどこかに挿入された場合は、コピー数はＣＡＮ１遺伝子座内に存在するコピーおよびゲノム内のどこかでＮＨＥＪによって挿入されたポリヌクレオチド編集鋳型のコピーを示す少なくとも２となるであろう。
非保護線状ポリヌクレオチド修飾鋳型およびＰＴ鋳型はどちらもＣＡＮ１ポリヌクレオチド修飾鋳型の単一コピーを備えるおよそ６０％のコロニーを産生したが、これはポリヌクレオチド修飾鋳型がＣａｓ９／ｇＲＮＡ生成ＤＳＢのＨＤＲのために使用されたが、ゲノム内には組み込まれなかったことを示している（表４）。環状保護ポリヌクレオチド修飾鋳型であるｐＲＦ８０は１００％のコロニーがＣＡＮ１遺伝子座の単一コピーだけを備えることを証明したが、これは環状鋳型がＣａｎ１－１でのＣａｓ９／ｇＲＮＡ生成切断のＨＤＲのためだけに使用され、染色体内のどこにも組み込まれなかったことを示している。
保護ポリヌクレオチド修飾鋳型は、非保護ポリヌクレオチド修飾鋳型と比較して驚くべき方法で優れた結果をもたらした。各鎖上の５つの５’ホスホジエステル結合がホスホロチオエート結合と置き換えられている線状保護鋳型は、染色体内のどこかで線状鋳型の取込みにおける変化を誘発することなく、ＨＤＲによって修復されたＣａｓ９／ｇＲＮＡ生成ＤＳＢを用いると非保護鋳型の２倍超という多数のコロニーを生じさせる。線状ではなく環状である保護ポリヌクレオチド修飾鋳型は、Ｃａｎ１－１でのＣａｓ９／ｇＲＮＡ生成二本鎖切断のＨＤＲの頻度における４０％の改善をもたらし（表３）、ポリヌクレオチド修飾鋳型のオフサイト組込みを伴わずにコロニー数の６０％の改善をもたらした（表４）。
実施例４
Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡプラスミド上に含有された保護ポリヌクレオチド修飾鋳型を使用する精密なゲノム編集
本実施例では、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のＵＲＡ３遺伝子を、Ｃａｓ９発現カセットおよびｓｇＲＮＡ発現カセットを含有する環状ＤＮＡ分子の一部である保護ポリヌクレオチド編集鋳型を使用して精密なゲノム編集の標的とした。
プラスミドｐＲＦ４３４（配列番号５４）は、ＰａｃＩおよびＰｍｅＩ制限部位間でｐＲＦ２９１（配列番号１８）に存在するＵＲＡ３選択可能マーカーをハイグロマイシン耐性発現カセット（配列番号５５）と置き換えることによって構築した。このプラスミドは、ｐＲＦ２９１と同一方法で可変ターゲティングドメインの高スループットクローニングを可能にする（図１）。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＵＲＡ３遺伝子剤（配列番号５６）内に、標的部位Ｕｒａ３－１（配列番号５７）が存在する。Ｕｒａ３－１標的部位（配列番号５７）に対応する可変ターゲティングドメインをコードするＤＮＡを含有する２つのオリゴＵｒａ３－１Ｆ（配列番号５８）およびＵＲＡ３－１Ｒ（配列番号５９）を１００μＭで二本鎖バッファー（３０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭの酢酸ナトリウム）中に再懸濁させた。Ｕｒａ３－１Ｆ（配列番号５８）およびＵｒａ３－１Ｒ（配列番号５９）を単一試験管中でそれぞれ５０μＭの最終濃度で混合し、９５℃へ５分間加熱し、二本鎖ＤＮＡ小分子を形成するために２つのヌクレオチドをアニーリングするために０．１℃／分で２５℃へ冷却した。２０μＬの最終容量中に５０ｎｇのｐＲＦ４３４、Ｕｒａ３－１Ｆ（配列番号５８）およびＵｒａ３－１Ｒ（配列番号５９）から構成される２．５μＭの小二本鎖ＤＮＡ、１×のＴ４リガーゼバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．５））、０．５μＭのＡａｒＩオリゴヌクレオチド、２単位のＡａｒＩ、４０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを含有する単一チューブ消化／ライゲーション反応を作成した。コントロール反応には、Ｕｒａ３－１Ｆ（配列番号５８）およびＵｒａ３－１Ｒ（配列番号５９）の小ＤＮＡ二本鎖が欠如していた。反応は、３７℃で１時間インキュベートし、その後に以前に記載されたようにＴｏｐ１０ Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞内へ形質転換させた（Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｒ．＆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｅｄｎ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２０１２））。Ｕｒａ３－１Ｆ（配列番号５８）およびＵｒａ３－１Ｒ（配列番号５９）の二本鎖がＡａｒＩ制限部位によって隣接されたｒｐｓＬ逆染色マーカーに置き換えられているｐＲＦ４３４の存在を選択するために（図１）、細胞は、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有する１．５（重量／容積）％のＢａｃｔｏ寒天により凝固させた溶原性ブロス上でプレーティングした。高スループットクローニングカセットを含有するｐＲＦ４３４（配列番号５４）の存在は、アンピシリンに対して表現型的に耐性であるが、逆選択カセットのためにストレプトマイシンに対しては感受性であるコロニーを産生したが、ストレプトマイシンの存在下ではコロニーを形成しない。しかし、逆選択カセットがＡａｒＩ酵素によって除去され、Ｕｒａ３－１二本鎖ＤＮＡがその部位内にライゲートされる（ＡａｒＩ認識部位を除去する）場合には、形質転換細胞は、アンピシリン耐性、ストレプトマイシン耐性表現型を有し、アンピシリンおよびストレプトマイシンの存在下でコロニーを形成する。ＡａｒＩ部位内でＵｒａ３－１可変ターゲティングドメインをコードするＤＮＡを含有するｐＲＦ４３４（配列番号５４）は、ＳＵＰ４ターミネーター（配列番号１７）に融合したＣＥＲドメイン（配列番号１６）をコードするＤＮＡに融合したＵｒａ３－１ ＶＴドメイン（配列番号６０）をコードするＤＮＡに融合したＨＤＶリボザイム（配列番号１４）をコードするＤＮＡに融合したｙｌ５２プロモーター（配列番号１３）を含有する組換えＨＤＶ－ｓｇＲＮＡ発現カセットを作成する。この構築物を含有するプラスミドであるｐＲＦ４２１（配列番号６１）を使用して、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のＵＲＡ３遺伝子座（配列番号５６）をターゲティングした。
ＵＲＡ３遺伝子座（配列番号５６）をターゲティングする保護ポリヌクレオチド編集鋳型を構築するために、ＵＲＡ３オープンリーディングフレーム（配列番号６２）の上流３７８ｂｐをＵＲＡ３停止コドンおよびこの停止コドン（配列番号６３）をコードするＤＮＡの下流２５５ｂｐに融合させた。このＤＮＡは、停止コドンだけを残してＵＲＡ３オープンリーディングフレームを欠失させることのできるポリヌクレオチド編集鋳型を表す。ポリヌクレオチド編集鋳型は、５’ＥｃｏＲＩおよび３’ＨｉｎＤＩＩＩ制限部位（配列番号６４）を用いて化学的に合成した。この構築物は、プラスミドｐＲＦ２６３（配列番号６５）を生成するｐＵＣ１８（配列番号３２）のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎＤＩＩＩ部位内にクローニングされた。ポリヌクレオチド編集鋳型は、５’および３’ＥｃｏＲＩ部位（配列番号６８）によって隣接されたＵＲＡ３欠失ポリヌクレオチド修飾鋳型を生成するために、プライマーＨＹ００７（配列番号６６）およびオリゴ２９７（配列番号６５）を使用してｐＲＦ２６３から増幅させた。ＥｃｏＲＩ隣接ＵＲＡ３欠失ポリヌクレオチド修飾鋳型は、ｐＲＦ４３７（配列番号６９）を生成するためにｐＲＦ４２１（配列番号６１）のＥｃｏＲ部位内にクローニングされた。
原栄養性ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ２０３６２細胞は、３０℃のＹＰＤ培地プレート（Ｔｅｋｎｏｖａ）上で２４時間増殖させた。１ループの細胞を形質転換バッファー（３５％のポリエチレングリコール（平均分子量３５５０）、１００ｍＭの酢酸リチウム、１００ｍＭのジチオトレイトール、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．０））中に再懸濁させた。１００μＬの細胞懸濁液は、１００ｎｇのｐＲＦ４２１（配列番号６１）、ｐＲＦ４３４（配列番号５４）、ｐＲＦ４３７（配列番号６９）のいずれかまたはＤＮＡなしと混合した。細胞に１時間にわたり３９℃、８００ＲＰＭで熱ショックを与えた。各形質転換に１ｍＬのＹＰＤ培地（Ｔｅｋｎｏｖａ）を加えた。細胞は、ハイグロマイシン耐性カセットの発現を可能にするために４時間にわたり３０℃、２２０ＲＰＭで増殖させた。細胞は、２５０ｍｇ／Ｌの硫酸ハイグロマイシン（ｃａｌｂｉｏｃｎｅｍ）を含有するＹＰＤ培地上でプレーティングした。コロニーは、３０℃で形成するに任せた。各形質転換からの４８コロニー（コロニーを全く有していなかったＤＮＡなしを除いて）は、ＹＰＤ培地プレート（Ｔｅｋｎｏｖａ）および４５０ｍｇ／Ｌの５－フルオロオロチン酸（５ＦＯＡ）を含有するＣＭプレートにパッチした。５ＦＯＡは、機能的ＵＲＡ３遺伝子を備える細胞に対して選択する。これらのパッチから、ｐＲＦ４３４（配列番号５４）、ｐＲＦ４２１（配列番号６１）およびｐＲＦ４３７（配列番号６９）によるＵＲＡ３不活性化の効率をスコアリングすることが可能であった（表５）。
Figure 0007011590000008
Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡプラスミドの状況内での保護ポリヌクレオチド修飾鋳型の存在は、Ｕｒａ３－１可変ターゲティングドメインを含有するｓｇＲＮＡを使用してＵＲＡ３遺伝子座をターゲティングする頻度に影響を及ぼさなかった（表５）。５ＦＯＡ耐性の頻度は全ターゲティング頻度を表し、ＮＨＥＪ経路およびＨＤＲ経路によるＣａｓ９／ｇＲＮＡ ＤＳＢの修復により生成された突然変異体を含む。ＨＤＲおよびＮＨＥＪ経路によるＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ生成ＤＳＢの修復の頻度を決定するために、５ＦＯＡ耐性コロニー内のＵＲＡ３遺伝子座のＰＣＲ増幅は、オリゴヌクレオチドプライマー３０８（配列番号７０）および３０９（配列番号７１）を使用して実施した。典型的には、ＮＨＥＪ経路によって修復されたＣａｓ／ｓｇＲＮＡ切断は、少数ヌクレオ値の欠失もしくは挿入を生じさせ、結果として小インデルを生じさせ、全遺伝子座が増幅される場合は、産物は（１７１４ｂｐ）のサイズのＷＴ（配列番号５６）であると思われる。Ｃａｓ／ｓｇＲＮＡ生成ＤＳＢがＨＤＲを介して保護ポリヌクレオチド編集鋳型を用いて修復されている場合には、増幅ＵＲＡ３遺伝子座は、ＵＲＡ３オープンリーディングフレームの欠失に起因してサイズが減少する（８５９ｂｐ）（配列番号７２）。ｐＲＦ４３７（配列番号６９）を用いて形質転換された細胞由来の５ＦＯＡ耐性コロニーのＰＣＲの例は、図４に示した。
５ＦＯＡ耐性コロニー間のＨＤＲの全頻度は、表６に示した。
Figure 0007011590000009
ポリヌクレオチド編集鋳型を複製環状ＤＮＡ内に配置することによって、末端は保護され、修飾鋳型は細胞内に残留し、ＨＤＲ経路を介してのＣａｓ／ｓｇＲＮＡ生成ＤＳＢの修復を有する８０％を超えるコロニーを産生するので、このためコロニーの１５％はＮＨＥＪによるＣａｓ／ｓｇＲＮＡ生成切断を修復した。

Claims (11)

  1. そのゲノム内に修飾ヌクレオチド配列を含む微生物細胞を選択するための方法であって：
    ａ．ガイドポリヌクレオチド、少なくとも１つの保護ポリヌクレオチド修飾鋳型およびＣａｓエンドヌクレアーゼを微生物細胞に提供する工程であって、
    ここで前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドポリヌクレオチドは前記細胞のゲノム内の標的部位で一本鎖もしくは二本鎖切断を導入することができる複合体を形成することができ、
    前記保護ポリヌクレオチド修飾鋳型は、前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含み、
    前記修飾ヌクレオチド配列は、相同組換え修復（ＨＤＲ）により標的部位に挿入される工程；および
    ｂ．工程（ａ）から前記修飾ヌクレオチド配列を含む細胞を選択する工程を含み、
    前記保護ポリヌクレオチド修飾鋳型は、その５’末端、３’末端または５’末端および３’末端の両方で少なくとも１つの保護分子を含む線状ポリヌクレオチドであって、５’末端でホスホロチエート結合を含む一本鎖または二本鎖線状分子であり、前記保護ポリヌクレオチド修飾鋳型は、標的部位の両端に隣接する配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、
    前記微生物細胞は、非従来型酵母または真菌細胞であって、前記非従来型酵母は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属種またはシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属種ではない酵母である、方法。
  2. 前記保護分子は、アルカンスペーサー、蛍光体、ＮＨＳエステル、ジゴキシゲン、コレステリル－ＴＥＧ、Ｃ６、Ｃ１２、ヘキシニル、Ｏｘｔａｄｉｙｎｙｌ ｄＵＴＰ、ビオチン、ジチオール、逆ジデオキシ－Ｔ修飾またはそれらの任意の１つの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記保護ポリヌクレオチド鋳型の前記少なくとも１つのヌクレオチド修飾は、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換え、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入および（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任
    意の組合せからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記細胞内の相同組換え修復（ＨＤＲ）および／または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の頻度をさらに決定する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. ＨＤＲの前記頻度は、非保護（コントロール）ポリヌクレオチド修飾鋳型を使用すること以外は、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法と全て同一の成分および工程を有するコントロール法に由来するＨＤＲの前記頻度と比較して増加する、請求項４に記載の方法。
  6. ＮＨＥＪの前記頻度は、非保護（コントロール）ポリヌクレオチド修飾鋳型を使用すること以外は、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法と全て同一の成分および工程を有するコントロール法に由来するＮＨＥＪの前記頻度と比較して減少する、請求項４に記載の方法。
  7. 前記細胞内の前記保護ポリヌクレオチド修飾鋳型のオフサイト組込みの前記頻度をさらに決定する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記細胞内の前記保護ポリヌクレオチド修飾鋳型のオフサイト組込みの前記頻度は、非保護（コントロール）ポリヌクレオチド修飾鋳型を使用すること以外は、請求項１に記載の方法と全て同一の成分および工程を有するコントロール法に由来するオフサイト組込みの前記頻度と比較して減少する、請求項７に記載の方法。
  9. そのゲノム内の標的部位に挿入された関心対象のポリヌクレオチドを含む微生物細胞を選択するための方法であって：
    ａ）ガイドポリヌクレオチド、少なくとも１つの保護ポリヌクレオチドドナーＤＮＡおよびＣａｓエンドヌクレアーゼを細胞に提供する工程であって、
    ここで前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドポリヌクレオチドは前記細胞のゲノム内の標的部位での一本鎖もしくは二本鎖切断を導入することができる複合体を形成することができ、
    前記保護ポリヌクレオチドドナーＤＮＡは前記細胞のゲノム内に導入すべき関心対象のポリヌクレオチドを含み、
    前記関心対象のポリヌクレオチドは、相同組換え修復（ＨＤＲ）により標的部位に挿入される工程；および
    ｂ）工程（ａ）からそのゲノム内の標的部位内へ挿入された関心対象のポリヌクレオチドを含む微生物細胞を選択する工程
    を含み、
    前記保護ポリヌクレオチドドナーＤＮＡは、その５’末端、３’末端または５’末端および３’末端の両方で少なくとも１つの保護分子を含む線状ポリヌクレオチドであって、５’末端でホスホロチエート結合を含む一本鎖または二本鎖線状分子であり、前記保護ポリヌクレオチドドナーＤＮＡは、標的部位の両端に隣接する配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、
    前記微生物細胞は、非従来型酵母または真菌細胞であって、前記非従来型酵母は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属種またはシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属種ではない酵母である、方法。
  10. 前記微生物細胞は、非従来型酵母であって、前記非従来型酵母は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属種またはシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属種ではない酵母である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記酵母は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、アークスラ（Ａｒｘｕｌａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ウスティラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリゴノプシス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）属、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属およびパチソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属からなる群から選択される属の一員である、請求項１０に記載の方法。
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