RU2485180C2 - Способ трансфекции и трансдукции растительных клеток - Google Patents

Способ трансфекции и трансдукции растительных клеток Download PDF

Info

Publication number
RU2485180C2
RU2485180C2 RU2009148877/10A RU2009148877A RU2485180C2 RU 2485180 C2 RU2485180 C2 RU 2485180C2 RU 2009148877/10 A RU2009148877/10 A RU 2009148877/10A RU 2009148877 A RU2009148877 A RU 2009148877A RU 2485180 C2 RU2485180 C2 RU 2485180C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
dna
complex
carrier
cells
embryos
Prior art date
Application number
RU2009148877/10A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2009148877A (ru
Inventor
Франсуа ЮДЕ
Арчана ЧУГ
Original Assignee
Эгрикалча Энд Эгри-Фуд Кэнэда
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Эгрикалча Энд Эгри-Фуд Кэнэда filed Critical Эгрикалча Энд Эгри-Фуд Кэнэда
Publication of RU2009148877A publication Critical patent/RU2009148877A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2485180C2 publication Critical patent/RU2485180C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
    • C12N15/8263—Ablation; Apoptosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к способу получения генно-инженерного растения. Способ включает обработку растительных клеток с интактными клеточными барьерами комплексом носитель - переносимый материал, состоящим по крайней мере из одного переносимого полипептидного и/или полинуклеотидного компонента, связанного с носителем - положительно заряженным интернализуемым пептидом (ИНП), и предназначенным для получения трансдуцированных клеток и размножения растительных клеток для выращивания растения. При этом растительные клетки представляют собой соматические клетки, предварительно обработанные пермеабилизирующим клетки агентом, или гаметофиты. Изобретение позволяет эффективным образом получать генно-инженерные растения в условиях интенсивного поглощения клетками комплекса носитель-переносимый материал. 12 з.п. ф-лы, 11 ил., 5 табл., 12 пр.

Description

Настоящее изобретение относится к новым способам и композициям трансформации растений с использованием интернализуемых пептидов.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Традиционные стратегии культивирования растений для получения новых линий, обладающих определенными свойствами, трудоемки и иногда дают непредсказуемые результаты. Недавно разработки методов генетической трансформации растений, а также идентификация все большего числа и доступность полезных генов и их продуктов открыли путь к быстрому выведению растений, обладающих желаемыми свойствами. Однако сохраняется потребность в совершенствовании способов. Существующие стратегии, такие как трансформация, опосредованная Agrobacterum, и бомбардировка частицами сильно зависят от типа ткани и генотипа. Интернализуемые пептиды (ИНП) - новый и быстро растущий класс коротких пептидов, которые, как известно, играют важную роль в транслокации обширного ряда переносимых комплексов, включая белки и ДНК, через биомембраны клеточных линий млекопитающих и человека (Schwartz, Zhang, 2000; Lange), 2002; Vives, 2002).
Домен белковой трансдукции (ДБТ) ТАТ ВИЧ-1 представляет собой самые изученные транслоцирующие пептиды. В недавних публикациях описан потенциал ТАТ-ДБТ и его олигомеров в переносе плазмид за счет образования комплекса с отрицательно заряженной ДНК в клетках млекопитающих (Ignatovich с соавт., 2003;
Rudolph с соавт., 2003; Siprashvili с соавт., 2003; Hellgren с соавт., 2004). Другие пептиды, которые, как показано, имеют транслоцирующие свойства, включают pVEC, транспортан, пенетратин, рер-1-пептиды и фрагменты вышеуказанных соединений.
Некоторые данные из предыдущего уровня техники, относящиеся к транслокации, опосредованной ИНП, обсуждаются ниже. В заявке на патент США 20040121325 описан способ получения рекомбинантных растений или клеток растений, где экспрессируется последовательность, кодирующая белок, который обладает ксилосилтрансферазной активностью или усиливает ее.
В заявке на патент РСТ W02005117992 описана композиция, предназначенная для контролируемого переноса какого-либо соединения в клетку-мишень. Данная композиция включает интернализуемый пептид, ингибитор интернализуемого пептида, соединение и сайт расщепления, в котором ингибитор интернализуемого пептида тормозит транслокационную активность интернализуемого пептида. Расщепление в сайте расщепляющим веществом нейтрализует торможение интернализуемого пептида, и расторможенный интернализуемый пептид приобретает способность транслоцировать какое-либо соединение в клетку-мишень. Однако в этой заявке не описана трансформация растительных клеток.
В заявке на патент США №2005/0260756 описан проникающий через мембрану комплекс, предназначенный для облегчения переноса молекулы двухцепочечной РНК в клетку. Этот комплекс включает молекулу двухцепочечной РНК и интернализуемый пептид с ковалентной связью между двухцепочечной РНК и интернализуемым пептидом. Это изложение сущности изобретения относится только в трансформации нейронов.
Unnamalai с соавт. (FEBS Letters 566 (2004) 307) описывают применение катионного олигопептида полиаргинина для переноса двухцепочечной РНК для посттранскрипционного выключения генов.
Если, как показано, ИНП облегчают доставку переносимого материала в клетки млекопитающих, применение ИНП в клетках растений при исследованиях трансфекции затруднено рядом факторов. Главное препятствие применению этой технологии у растений заключается в том, что в отличие от животных клеток, клетки растений имеют систему двойного барьера (клеточную стенку и плазматическую мембрану) на пути интернализации ИНП и переносимых ими соединений. Таким образом, для того, чтобы транслокация была эффективной, ИНП должны преодолеть эти два барьера.
С учетом постоянно накапливающейся информации из проектов секвенирования геномов растений имеется насущная необходимость в разработке быстрого, универсального (независимого от типа ткани или генотипа) способа, применимого у растений, для функциональных исследований генома различных генов и для выведения трансгенных растений, проявляющих желаемые свойства.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение отвечает потребности в новых методиках переноса генов и (или) белков в клетки растений. Интернализуемые пептиды применяются для переноса нужного переносимого материала внутрь растительной клетки.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу доставки переносимого материала в клетку растения. Этот способ включает воздействие на клетку растения комплексом, состоящим по крайней мере из одного переносимого соединения, связанного с носителем. Растительная клетка предпочтительно представляет собой соматическую клетку или гаметофит.
В одном предпочтительном варианте компонент-носитель является полипептидом, обладающим способностью проникать в клетку и связывать нуклеиновые кислоты. В другом предпочтительном варианте этот носитель включает сигнал ядерной локализации.
Компонент-носитель может быть выбран из группы, состоящей из tat ВИЧ-1, pVEC, транспортина, пенетратина, пептидов Рер-1 и их фрагментов. Другие носители, способные проникать в клетку, также можно использовать в способе изобретения. В предпочтительном варианте носитель состоит из домена белковой трансдукции (ДБТ) tat или его фрагмента, предпочтительно из аминокислот от 49-й до 57-й tat ВИЧ.
В одном аспекте настоящего изобретения переносимый материал является нуклеиновой кислотой. Нуклеиновая кислота может представлять собой мРНК, tmPHK, тРНК, рРНК, siPHK, shPHK, ПНК, ssPHK, dsPHK, ssДНК, dsДНК, гибриды ДНК:РНК; плазмиды, искусственные хромосомы, конструктивные элементы для генной терапии, кДНК, продукты ПЦР, рестрикционные фрагменты, рибосомы, антисмысловые последовательности или комбинации всех вышеуказанных соединений. В одном предпочтительном варианте нуклеиновой кислотой является ДНК. В другом предпочтительном варианте нуклеиновой кислотой является РНК.
В другом аспекте настоящего изобретения переносимым компонентом является полипептид. В одном предпочтительном варианте полипептид кодирует белок, который меняет метаболизм клетки. Этот белок может быть белком, связанным с эмбриогенезом, или активным доменом вышеуказанного белка. Этот белок может быть полипептидом, связанным с гомологичной рекомбинацией, или активным доменом вышеуказанного полипептида.
В другом аспекте настоящего изобретения переносимый материал также включает комбинацию дополнительного полипептида и (или) нуклеиновой кислоты.
В предпочтительном варианте настоящего изобретения соматическую растительную клетку подвергают предварительной обработке агентом, пермеабилизирующим клетку, для облегчения интернализации комплекса. Предпочтительным пермеабилизирующим агентом является толуол.
Помимо способов, являющихся предметом настоящего изобретения, изобретение также включает комплекс, обеспечивающий транспорт активного вещества в растительную клетку. Этот комплекс включает переносимый материал, связанный с компонентом-носителем, где компонент-носитель может переносить комплекс в растительную клетку.
В предпочтительных вариантах переносимый компонент является нуклеиновой кислотой, а компонент-носитель включает сигнал ядерной локализации. В другом варианте этот комплекс включает гибридный белок, состоящий из переносимого материала и компонента-носителя. Может быть включен маркерный белок для отслеживания интернализации данного комплекса. В данный комплекс могут быть включены различные другие типы белков, такие как белок, ассоциированный с интеграцией, направляемой сайтом, или эмбриогенный белок или активный домен вышеуказанных соединений.
В другом предпочтительном варианте данный способ включает добавление трансфицируюшего агента, такого как липофектамин.
Настоящее изобретение также включает семена трансгенных растений и изолированные растительные клетки, полученные с помощью способов и конструктивных элементов, являющих предметом настоящего изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Эти и другие детали настоящего изобретения будут более понятными из следующего описания, где приведены ссылки на приложенные фигуры:
ФИГ.1 иллюстрирует эффект пермеабилизации в отношении транслокации комплекса, меченого флуоресцеином, согласно одному из вариантов настоящего изобретения;
ФИГ.2 демонстрирует поглощение Tat микроспорами;
ФИГ.3 демонстрирует эффективность различных ИНП в пермеабилизованных зародышах;
ФИГ.4 иллюстрирует поглощение комплекса Tat-GUS в пермеабилизованных зародышах;
ФИГ.5 иллюстрирует поглощение комплекса Tat2-GUS в пермеабилизованных зародышах;
ФИГ.6 иллюстрирует поглощение комплекса Pep-1-GUS в пермеабилизованных зародышах;
ФИГ.7 иллюстрирует поглощение комплекса Pep-1-GUS микроспорами;
ФИГ.8 демонстрирует экспрессию гена gus в пермеабилизованных зародышах;
ФИГ.9 демонстрирует растения, полученные из микроспор, обработанных комплексом Tat-ДНК; и
ФИГ.10 иллюстрирует влияние липофектамина на экспрессию гена gus;
ФИГ.11А демонстрирует влияние обработки ИНП и ДНК различными соединениями;
ФИГ.11В демонстрирует эффект различных комбинаций ДНК и RecA.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Перенос инородных нуклеиновых кислот или полипептидов через клеточные входные барьеры растительной клетки является трудной задачей. Шансы на успех можно повысить благодаря обработке растительных тканей клеточными пермеабилизирующими агентами, такими как толуол (Mahalakshmi с соавт., 2000); однако частота трансформации остается низкой.
Настоящее изобретение относится к новому способу доставки переносимого материала в растительные клетки. Этот переносимый материал может быть молекулой нуклеиновой кислоты, которая должна экспрессироваться в клетке-мишени, или он может быть полипептидом. Этот переносимый материал может включать маркер для отслеживания переноса в растительные клетки.
В способах настоящего изобретения переносимый материал связан с интернализуемым пептидом (ИНП), также именуемым в данном тексте как «носитель» или «компонент-носитель». Этот носитель связан с переносимым материалом в единый комплекс, и он переносит переносимый материал в клетку.
Вкратце, получают комплекс, включающий компонент-носитель и переносимый материал. Компонент-носитель представляет собой агент, способный проникать через мембрану растительной клетки и (или) клеточную стенку.
Предпочтительными носителями для применения в настоящем изобретении являются интернализуемые пептиды (ИНП). ИНП, используемые в способах и комплексах настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются tat ВИЧ, pVEC, транспортан, пенетратин, Рер-1 и фрагментами всех вышеуказанных соединений.
Переносимый материал может быть нуклеиновой кислотой или полипептидом. Примеры нуклеиновых кислот, которые могут быть связаны с носителем, включают мРНК, tmPHK, тРНК, рРНК, siPHK, shPHK, ПНК, ssPHK, dsPHK, ssДНК, dsДНК, гибриды ДНК:РНК; плазмиды, искусственные хромосомы, конструктивные элементы для генной терапии, кДНК, продукты ПЦР, рестрикционные фрагменты, рибосомы, антисмысловые последовательности или комбинации всех вышеуказанных соединений. В одном предпочтительном варианте нуклеиновой кислотой является ДНК. В другом предпочтительном варианте нуклеиновой кислотой является РНК. Примеры полипептидов, которые могут быть связаны с носителем, включают любой белок или его полипептидный фрагмент. Например, белок может быть агентом, который изменяет фенотип растения или растительной клетки. Это может быть белок, который обеспечивает устойчивость к некоторым вредителям или гербицидам. Полипептид также может нести информацию о белке, который меняет метаболизм клетки, такой как белок, связанный с эмбриогенезом, или белок, участвующий в интеграции, направляемой сайтом.
Комплекс носитель - переносимый материал, являющийся предметом настоящего изобретения, может быть образован различными путями за счет ковалентной связи и (или) электростатического взаимодействия. Также этот комплекс может быть получен из комбинации ИНП и переносимых материалов, например, ДНК, покрытой RecA, связанного в комплекс с Рер-1.
В предпочтительном варианте настоящего изобретения клетки сначала обрабатывают пермеабилизирующим агентом. Переноса с поразительно высокой частотой можно добиться с помощью комбинированных методик с использованием ИНП. Пермеабилизация приводит к образованию временных пор в плазматической мембране, облегчающих транслокацию ИНП в отдельности или в виде комплекса носитель - переносимый материал за счет устранения ограничения размеров, обусловленных клеточной стенкой и мембраной. Однако следует четко понимать, что предварительная обработка пермеабилизирующим агентом требуется не у всех типов растительных клеток. Например, микроспоры можно успешно трансформировать с помощью комплексов носитель - переносимый материал без этапа предварительной пермеабилизации.
Для облегчения транслокации комплекса носитель - переносимый материал можно использовать различные типы пермеабилизирующих агентов. Показано, что особенно эффективен пермеабилизирующий раствор, включающий толуол и этанол.
Результаты нескольких типовых экспериментов представлены на приложенных фигурах, где демонстрируется эффективность способов и композиций настоящего изобретения.
Что касается Фиг.1, то на ней представлена серия микрофотографий, демонстрирующих эффект пермеабилизации. Транслокация ТАТ-ИНП, меченого флуоресцеином, в незрелые зародыши Triticale cv AC Alta визуализирована с помощью флуоресцентной микроскопии. Результаты демонстрируют, что в контрольных зародышах, инкубированных только в пермеабилизирующем буфере А, и зародышах, обработанных пермеабилизирующим буфером с толуолом (В), флуоресценция отсутствует. Зародыши, обработанные только декстран-сульфатом с меченым изотиоцианатом флуоресцеина (ИТЦФ) (С) не проявляют сколько-либо значимого поглощения меченого декстран-сульфата. С другой стороны, в зародышах, обработанных декстран-сульфатом с меченым ИТЦФ в присутствии клеточного пермеабилизирующего агента (D), выявлена некоторая флуоресценция, как и в зародышах, обработанных только ТАТ-ИНП, меченых флуоресцеином (Е). Однако самое значимое поглощение выявлено в зародышах, обработанных ТАТ-ИНП, меченых флуоресцеином, в присутствии клеточного пермеабилизирующего агента. Это демонстрирует высокую эффективность транспорта в условиях, когда пермеабилизацию клетки сочетают с интернализуемым пептидом, таким как ТАТ-ИНП. Результаты, показанные на Фиг.1, демонстрируют, что пермеабилизация незрелых зародышей способствует эффективной транслокации интернализуемых пептидов.
Однако пермеабилизация не является необходимой во всех типах клеток. Фиг.2 иллюстрирует поглощение Tat, меченого флуоресцеином, изолированными микроспорами. Эти результаты указывают, что Tat ИНП способны проникать в клетки.
В способах настоящего изобретения применяются различные типы интернализуемых пептидов. В Таблице 1 приведены некоторые из изученных ИНП.
ТАБЛИЦА 1
Пептид Последовательность Длина пептида Ссылка
Транспортан*1 FI-GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL-амид 27 Pooga с соавт., 2001
pVEC*2 FI-LLIILRRRIRKQAHAHSK-амид 18 Elmquist с соавт., 2003
ТАТ-ДТБ*3 FI-RKKRRQRRR-амид 9 Futaki с соавт., 2001
У каждого из этих пептидов N-концевая группа мечена флуоресцеином, на что указывает «FI». Пептид транспортан представляет собой химерный пептид, включающий 12 аминокислот из нейропептида галанина на N-конце, связанных в положении Lys13 с 14 аминокислотами из осиного яда мастопарана на С-конце. Пептид pVEC получен из кадгерина мышиного эндотелия сосудов (аминокислоты 615-632). Пептид ТАТ-ДБТ включает домен белковой трансдукции ТАТ ВИЧ-1.
Таблица 2
  Обработка Видимая флуоресценция, наблюдаемая в зародышах-зиготах
1. Контроль (-толуол/этанол, -декстран, - Tat) - незрелые - зрелые
2. Контроль (только толуол/этанол) - -
3. Контроль (только декстран-сульфат) + -
4. Только pVEC + +
5. M-Tat + -
6. Только транспортан ++ +
7. Только ТАТ-ДБТ ++ +
8. Толуол с декстран-сульфатом ++ +
9. Толуол с Pvec +++ ++
10. Толуол+M-Tat ++ +
11. Толуол с транспортаном ++++ +++
12. Толуол с ТАТ-ДБТ +++++ ++++
В Таблице 2 представлена относительная интенсивность флуоресценции после обработки незрелых и зрелых зародышей различными интернализуемыми пептидами.
Аналогичные результаты представлены графически на Фиг.3. Результаты указывают, что транслокация различных пептидов произошла и у незрелых, и у зрелых зародышей. Эффективность транслокации повышается, когда клетки обрабатывают пермеабилизирующим агентом, таким как толуол. В то время, как толуол использован как типичный агент для иллюстрации эффекта пермеабилизации, само собой разумеется, что для достижения такого же эффекта можно применять другие пермеабилизирующие агенты. Результаты в Таблице и на Фиг.3 после применения трех различных ИНП означают, что в способах настоящего изобретения с высокой вероятностью будут применимы и другие ИНП.
Результаты указывают, что клеточные барьеры, существующие в зародышах-зиготах, можно преодолеть за счет пермеабилизации ткани с помощью толуола, что ведет к заметному увеличению транслокации всех трех исследованных пептидов.
Декстран-сульфат, меченый ИТЦФ, служил отрицательным контролем, так как он не обладает способностью проникать в клетку. Другой отрицательный контроль, M-tat, также дал гораздо меньшую флуоресценцию, и это указывает, что проникновение ИНП сильно зависит от последовательности аминокислотных остатков.
Репортерная система GUS (GUS:бета-глюкуронидаза) - это репортерная система, хорошо известная специалистам в области молекулярной биологии растений. Эта репортерная система использована для того, чтобы продемонстрировать эффекты пермеабилизации клетки и применение ИНП для повышения эффективности белковой трансдукции и трансфекции генов.
Фиг.4 иллюстрирует поглощение ферментного комплекса Tat-GUS в пермеабилизованных зародышах. На микрофотографии четко продемонстрирован высокоэффективный способ белковой трансдукции. Для еще большего усиления поглощения был специально синтезирован Tat2 ИНП, где Tat 2-димер ДБТ Tat ВИЧ, состоящий из 18 аминокислот. Результаты применения Tat2 в качестве ИНП представлены на Фиг.5. Чтобы вновь продемонстрировать, что в способах настоящего изобретения можно использовать другие ИНП, получен ферментный комплекс Рер-1-GUS. Микрофотографии, представленные на Фиг.6, иллюстрируют, что с помощью этого комплекса осуществлена эффективная трансдукция белка в пермеабилизованные незрелые зародыши. Фиг.6А отображает контрольный зародыш, Фиг.6 В демонстрирует доставку фермента глюкуронидазы (GUS), опосредованную Рер-1. Чтобы дополнительно продемонстрировать эффективность Рер-1 в качестве ИНП для доставки переносимого белка, микроспоры обработали таким же комплексом; результаты показаны на Фиг.7.
Как обсуждалось выше, транслокация изученных ИНП была больше в пермеабилизованных зрелых и незрелых зародышах. ТАТ-ДБТ продемонстрировал четкое накопление в герминативной зоне незрелых зародышей, и поглощение ТАТ-ДБТ увеличилось до максимального уровня (4,7 раз) после пермеабилизации незрелых зародышей. Кроме того, ТАТ-ДБТ богат аргинином и способен связываться с ДНК, что делает его подходящим носителем для переноса генов в растительные клетки и (или) ткани.
При дальнейших исследованиях изучен комплекс ТАТ-ДБТ-плазмидная ДНК в отношении способности индуцировать экспрессию гена gus, кодируемого в плазмиде пермеабилизованных зародышей. Результаты представлены на Фиг.8, и они четко свидетельствуют, что комплекс ИНП-плазмидная ДНК можно использовать для переноса гена для экспрессии в растительной клетке. Трансгенная экспрессия GUS в пермеабилизованных зародышах была статистически значимо выше, чем экспрессия в непермеабилизованных зародышах. Это убедительно свидетельствует в пользу того, что клеточная пермеабилизация играет важную роль в опосредованной ИНП транслокации комплекса, включающего переносимый материал. Результаты также указывают, что образование комплекса и пермеабилизация не нарушают биологическую активность транслоцированных переносимых компонентов.
Эффективность способов настоящего изобретения в отношении трансфекции гена доказана дополнительно с использованием комплекса Tat/Tat2-ДНК. ДНК является носителем гена устойчивости к гербицидам. Микроспоры трансфицированы, и выращены растения. Фиг.9 иллюстрирует, что трансгенные растения можно получить, используя способы настоящего изобретения.
Эффективность трансфекции гена растения можно еще больше повысить путем включения других известных агентов, способствующих трансфекции, таких как липофектамин. Когда липофектамин добавили к пермеабилизованным клеткам, обработанным комплексом ИНП-ДНК, эффективность возросла еще больше. Результаты, представленные на Фиг.10, иллюстрируют, что при образовании комплекса частота трансфекции выше, чем при использовании липофектамина в качестве трансфицирующего агента. Однако комбинация липофектамина с комплексом ИНП-ДНК оказалась самой эффективной.
В то время как для демонстрации эффективности системы были использованы ген gus и белковая репортерная система, совершенно очевидно, что если способами настоящего изобретения можно переносить такую крупную молекулу, как GUS, и экспрессировать комплексный продукт гена, тогда можно трансдуцировать и другие белки, и трансфицировать другие гены.
Способы настоящего изобретения также использованы для трансдукции белков, связанных с эмбриогенезом, в растительные клетки. Это запускает эмбриогенез и может действовать как маркер. Также это обеспечивает новый и универсальный способ доставки белка в растительные клетки. Одновременная доставка белков, связанных с эмбриогенезом, и нужного гена представляет собой новый способ в генной инженерии растений.
Также включены подробно описанные различия способов. Например, в комплексы ИНП-переносимый материал можно встраивать пептид с ядерным доменом локализации или доменом локализации другой органеллы.
Один или несколько вариантов, предпочтительных в настоящее время, описаны с помощью примеров. Специалистам в данной области техники будет понятно, что можно внести ряд изменений и модификаций, не выходя за область настоящего изобретения, как описано в формуле изобретения.
Приведенное выше изложение сущности изобретения описывает настоящее изобретение в целом. Считается, что специалист в данной области техники может с помощью предшествующего описания получать и использовать композиции и применять способы настоящего изобретения. Более глубокого понимания можно добиться с помощью ссылок на следующие конкретные примеры. Эти примеры описаны только для того, чтобы иллюстрировать предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения и не предназначены для ограничения объема изобретения. Ожидаются изменения формы и замены эквивалентов, так как обстоятельства могут предполагать или диктовать их целесообразность. Другие конфигурации будут очевидны для специалиста в данной области техники. Документы, такие как патенты или заявки на патенты, на которые ссылается настоящий документ, включены в него в виде ссылок.
ПРИМЕРЫ
Хотя в примерах использованы специальные термины, такие термины намеренно употреблены в описательном смысле, но они не налагают никаких ограничений. Способы из микробиологии и физики, на которые имеются ссылки, но отсутствует их точное описание в данном изложении и этих примерах, имеются в научной литературе и хорошо известны специалисту в данной области техники.
Пример 1. Подготовка растительных клеток
Зрелые зародыши
Зрелые зародыши (Т. aestivum cv AC Superb) выделены и подвергнуты поверхностной стерилизации согласно описанию Mahalakshmi с соавт.(2000). Стерилизованные зародыши высушены в потоке воздуха в ламинарном вытяжном шкафу за 1 час до использования.
Незрелые зародыши
Зародыши выделены из колосьев через две недели после цветения (щиток зародыша диаметром 1-2 мм). Незрелые семена подвергнуты поверхностной стерилизации 70% этанолом в течение 30 с, после чего обработаны 10% гипохлоритом (Хлорекс) и каплей Tween 20, 3 мин. Проведено четыре отмывания стерильной водой по 1 мин каждое. Зародыши препарированы вручную в стерильных условиях. Изолированные зародыши помещены на среду GEM (Eudes с соавт., 2003) на 24 ч в темном помещении при комнатной температуре до исследования транслокации с ИНП.
Изолированные микроспоры приготовлены, как описано Amundsen и Eudes, 2005.
Пример 2. Транслокация интернализуемых пептидов, меченых флуоресцеином, в зародыши-зиготы с использованием пермеабилизирующих агентов.
Пептиды синтезированы в лаборатории и помечены флуоресцеином в N-концевой аминокислоте (Alberta Peptide institute, Канада) (Таблица 1). В качестве отрицательного контроля использованы ИТЦФ-декстран-сульфат и мутировавший Tat.
Изолированные и стерилизованные зародыши (20-25) погружены в пермеабилизирующий буфер общим объемом 420 мкл (15 мМоль хлорида натрия, 1,5 мМоль цитрата натрия, рН 7,1), содержащий клеточный пермеабилизирующий агент толуол/этанол (1:4) в соотношении 1:20 с пермеабилизирующим буфером. К этой смеси добавлено 2,1 мкл 1-мМоль ИНП, меченого флуоресцеином, до конечной концентрации 5 мкМоль. В отрицательном контроле зародыши обрабатывали ИТЦФ-декстран-сульфатом или M-Tat. Зародыши инкубировали с пермеабилизирующей смеси в течение 1 ч в темноте при комнатной температуре, после чего дважды отмывали пермеабилизирующим буфером. Затем зародыши обрабатывали трипсином: ЭДТК (0,25% раствор, Sigma-Aldrich) в соотношении 1:2 с пермеабилизирующим буфером в течение 5 мин при комнатной температуре для удаления свободных пептидных молекул. После двукратной отмывки пермеабилизирующим буфером зародыши изучали под флуоресцентным микроскопом или подвергали спектрофотометрическому анализу.
Флуоресцентая микроскопия
После обработки интернализуемыми пептидами и ферментативного разрушения свободных внеклеточных пептидов зародыши изучали под флуоресцентным микроскопом для визуализации флуоресценции (фильтр GFP, возбуждение - 470 нм, эмиссия - 525 нм, Leica Inc., Германия).
Транслокация пептидов, меченых флуоресцеином, заметно усилилась в присутствии пермеабилизирующего агента (толуол) в зрелых и незрелых зародышах, что наблюдали под флуоресцентным микроскопом (Фиг.1 и Таблица 2). Отрицательный контроль, включая обработанный ИТЦФ-декстран-сульфатом и M-Tat, дал очень слабую флуоресценцию или не дал ее вовсе (Фиг.1 A-D). В целом флуоресценция в незрелых зародышах была больше, чем в незрелых зародышах как в условиях пермеабилизации, так и без пермеабилизации (Таблица 2; Фиг.3). Среди трех исследованных пептидов pVEC проявил наименьшее поглощение даже в зародышах, обработанных клеточным пермеабилизирующим агентом. Любопытно, что в пермеабилизованных незрелых зародышах, обработанных ТАТ-ДБТ, выявлен четкий слой накопления щитка зародыша и ограниченное накопление в герминативной области зародыша (Фиг.1F), в то время как после обработки пермеабилизованных зародышей двумя другими пептидами выявлено равномерное распределение флуоресценции.
Флуориметрический анализ
Для флуориметрического анализа зародыши обрабатывали 500 мкл 1% Triton X-100 (приготовленного в пермеабилизирующем буфере), 30 мин при 4°С. Надосадочную жидкость собирали в чистую пробирку и с помощью флуориметра измеряли относительное поглощение флуоресценции зародышами с различными ИНП (Biorad, Versafluor, США, возбуждение - 490, эмиссия - 520).
Флуориметрический анализ также выявил заметное увеличение транслокации интернализуемого пептида в зародыши, обработанные клеточным пермеабилизирующим агентом - толуолом (Фиг.3А, В). В незрелых зародышах выявлены более высокие уровни относительного поглощения флуоресценции в отношении всех пептидов в пермеабилизованных и непермеабилизованных незрелых зародышах. В частности, ТАТ-ДБТ в незрелых зародышах проявил относительное поглощение флуоресценции в пермеабилизованных зародышах в 4,7 раза выше, чем в непермеабилизованных зародышах. Транслокация транспортана и pVEC тоже увеличилась в 1,8 и 1,7 раза соответственно в пермеабилизованных незрелых зародышах (Фиг.3В). Однако флуориметрический анализ выявил относительно большую транслокацию транспортана при сравнении визуальному наблюдению ТАТ-ДБТ в пермеабилизованных и непермеабилизованных зародышах.
Пример 3. Поглощение комплекса ИНП-плазмидная ДНК пермеабилизованными незрелыми зародышами
Для изучения комплекса ИНП-ДНК для образования комплекса с ДНК ((pAct-1GUS) использован ТАТ-ДБТ без флуоресцеиновой метки. Плазмидную ДНК и ТАТ-ДБТ смешали в соотношении 1:10 (5 мкг ДНК : 50 мкг ТАТ-ДБТ, маточные растворы обоих приготовили в потребном количестве воды, доведя общий объем до 100 мкг пермеабилизирующим буфером. Эту смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч до добавления к зародышам, пропитанным пермеабилизирующим буфером. Пермеабилизирующий агент (толуол) с буфером в соотношении 1:20 добавляли тотчас перед добавлением комплекса к зародышам. Зародыши инкубировали с комплексом ТАТ-ДБТ и ДНК в присутствии пермеабилизирующего агента в течение 1 ч, после чего дважды отмывали пермеабилизирующим буфером. Зародыши культивировали на плашке со средой GEM, содержащей цефотаксим, 250 мкг/мл, при 25°С в течение трех суток.
Гистохимический анализ GUS
Незрелые зародыши инкубировали в гистохимическом буфере GUS (Jefferson, 1987) при 37°С на протяжении ночи с добавлением 20% метанола для предотвращения какой-либо экспрессии эндогенного GUS. Процент экспрессии GUS рассчитывали как число обработанных зародышей, экспрессирующих GUS/общее число обработанных зародышей × 100.
В незрелых зародышах, инкубированных с комплексом ТАТ-ДБТ-плазмидная ДНК в присутствии клеточного пермеабилизирующего агента, выявлена преходящая экспрессия GUS (12%, Фиг.8), в то время как в необработанном отрицательном контроле какая-либо экспрессия GUS отсутствовала. В зародышах, обработанных только комплексом ТАТ-ДБТ-ДНК без добавления пермеабилизирующего агента, тоже не выявлено никакой экспрессии GUS, что указывает на роль пермеабилизирующего агента, облегчающего поглощение комплекса ТАТ-ДБТ-ДНК в незрелых зародышах.
Пример 4. Поглощение ИНП различными растительными тканями
Семена тритикале промывали детергентом и проращивали на влажной хлопчатобумажной ткани в течение недели. Кончик корня, кончик листа, основание листа и колеоптиль отрезали и инкубировали с 5 мкМоль pVEC, меченого флуоресцеином, pVEC с измененной аминокислотной последовательностью и транспортаном. Поглощение оказалось максимальным в кончиках корней и основании листа и менее выраженным в колеоптиле и кончике листа. Максимальная флуоресценция выявлена для транспортана, а затем в порядке убывания для pVEC, pVEC с измененной аминокислотной последовательностью и в контроле, куда ИНП не добавляли.
Пример 5. Опосредованный ИНП перенос фермента GUS в незрелые зародыши
Незрелые зародыши тритикале, пермеабилизированные толуолом, обрабатывали комплексом ИНП-(Tat или Tat2 или R9)-фермент GUS (4:1 вес./вес.) в течение одного часа в пермеабилизирующем буфере. В отношении Рер-1 следовали инструкциям, как описано в разделе об активном мотиве в наборе Chariot для белковой трансдукции в клеточных линиях млекопитающих. Комплекс ИНП-фермент GUS готовили в соотношении 4:1 соответственно и инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа. Обработанные зародыши обрабатывали трипсином (1:1 трипсин:пермеабилизирующий буфер) в течение пяти минут при комнатной температуре, что приводило к разрушению избыточного и неинтернализованного комплекса ИНП-фермент GUS. После трех отмываний пермеабилизирующим буфером зародыши инкубировали в буфере для гистохимического определения GUS с 20% метанолом (Kosugi с соавт., 1990) при 37°С с 15:00 и до утра до появления синей окраски у обработанных незрелых зародышей.
Пример 6. Опосредованный ИНП перенос фермента GUS в микроспоры
Микроспоры тритикале обрабатывали комплексом ИНП (Рер-1, Tat, Tat2, R9) с ферментом GUS (4:1) в течение одного часа в среде NPB-99. Комплекс ИНП-фермент GUS готовили, как описано в примерах выше. После двукратного отмывания проводили обработку трипсином (1:1 со средой NPB-99) в течение пяти минут при комнатной температуре. Микроспоры инкубировали в буфере для гистохимического определения GUS с 20% метанолом (Kosugi et al., 1990) при 37°С с 15:00 до утра до появления синей окраски микроспор. В положительных микроспорах выявляли накопление GUS преимущественно в вакуолях.
Пример 7. Опосредованный ИНП перенос фермента GUS в эпидеомальные клетки лука
Способность переносить функционально активный фермент GUS с помощью ИНП R9 также изучена на эпидермальных клетках лука. Комплекс R9-GUS готовили, как описано в примерах выше, в соотношении 1-4:1. Эпидермальные клетки лука инкубировали с этим комплексом в течение одного часа и трижды с фосфатным солевым буфером с рН 7,2. Клетки, обработанные комплексом, окрашивались в синий цвет после инкубации с буфером для гистохимического определения GUS в течение трех часов при 37°С. Максимальная интенсивность окраски наблюдалась при соотношении 4:1.
Пример 8. Опосредованный ИНП перенос гена bar в микроспоры зародышей
Микроспоры тритикале обрабатывали комплексом ИНП (Tat/Tat2) и фрагментом, кодирующим ген устойчивости к гербицидам (bar) и включающим промотор «tap» и терминирующий кодон nos, в течение одного-двух часов при комнатной температуре. Комплекс готовили в соотношении 4:1 из tat/tat2 и ДНК (вес./вес.), инкубировали в течение одного часа и добавляли 5-10 мкг реагента липофектамина 2000. Клетки дважды отмывали NPB-99 и снова культивировали для эмбриогенеза в среде NPB-99 с 10% Фиколлом в присутствии завязей (Eudes, Amundsen, 2005).
ПЦР-положительные каллюсы, обработанные комплексом tat/tat2-ДНК+Липофектамин, получала, как показано ниже в Таблице 3.
ТАБЛИЦА 3
  Растение-альбинос Зеленое Растение Каллюсы
Обработка Общее число ПЦР-полож. Общее число ПЦР-полож. Общее число ПЦР-полож.
Контроль 6 0 0 0 8 0
Только ДНК 2 0 0 0 3 0
ЛФ+ДНК 0 0 0 0 4 0
Tat/Tat2+ДНК 2 0 2 0 0 0
Tat/Tat2+ЛФ+ДНК 6 0 13 0 13 3
Пример 9. Гены РНВ у тритикале
Ростки тритикале, предназначенные для выделения микроспор, хранили в холодильнике (4°С) в течение 3 недель с корнями в дистиллированной воде и головками, обернутыми алюминиевой фольгой. Через 3 недели ±3 суток подтверждали стадию одноядерной микроспоры от средней до поздней по срединному цветку с помощью окраски ацетокармином, предшествующей экстракции. Выделенную микроспору переносили в тритикале, как описано у Eudes и Amundsen (2005) в отношении получения очищенной взвеси микроспор, доведенной средой NPB-99 до концентрации 2,5 × 105 клеток на миллилитр.
Два транзитных пептида хлоропласта или митохондрий клонировали в рамке с тремя генами, кодирующими ферменты, участвующие в метаболизме PNB. Для котрансфекции использовали одинаковые молярные количества трех генетических кассет с одинаковым транзитным пептидом. 1 мкг ДНК, растворенной в 100 мкл стерильной воды, добавляли к 4 мкг Tat2, растворенного в 100 мкл, и аккуратно перемешивали, что давало в смеси соотношение ДНК и интернализуемого пептида (ИНП) 1:4. После инкубации с комплексом в течение 30 минут при комнатной температуре добавляли 5 мкл Липофектамина на 5 минут при комнатной температуре. Эту смесь добавляли к микроспорам без надосадочной жидкости в центрифужной пробирке емкостью 2 мл. Микроспоры инкубировали с комплексом носитель-переносимый материал в течение 15 минут и добавляли 100 мкл NPB-99, а затем инкубировали в течение 45 мин при комнатной температуре. Трансфицированные микроспоры отмывали NPB-99, затем центрифугировали и удаляли надосадочную жидкость. В центрифужную пробирку емкостью 2 мл добавляли 1000 мкг NPB-99, осторожно перемешивали, а затем пипеткой переносили 500 мл на чашку Петри диаметром 35 мм, содержащую 3 мл NPB-99+10% Фиколл (Sigma F4375) (NPB-99-10F), содержащий цефотаксим.
Четыре из пяти завязей из одинаковых стерилизованных колосьев, взятых прямо из растения, добавляли на каждую чашку, содержащую микроспоры. Чашки герметично покрывали пленкой Parafilm и помещали на чашку Петри диаметром 150 мм вокруг открытой чашки Петри диаметром 50 мм, содержащей стерильную дистиллированную воду. Затем чашки диаметром 150 мм тоже покрывали пленкой Parafilm и инкубировали в темноте при 28°С в течение 20-30 суток. Никакой селекции при культивировании микроспор, зародышей и ростков не проводили.
Перерожденные растения исследовали с помощью ПЦР на наличие трех трансгенов. Из растений извлекали РНК, положительную на эти три изучаемых гена. По отобранным растениям получали кДНК, и проводили ПЦР, чтобы подтвердить экспрессию этих трех трансгенов. Результаты представлены в Таблице 4.
Таблица 4.
Котрансфекция и одновременная экспрессия трех генов РНВ
Органелла с транзитным сигналом Число экспериментов по трансфекции Число зеленых растений Число ПЦР-положительных на три гена Число ПЦР-положительных на три кДНК
Хлоропласт 2 325 38 7
Митохондрии 1 21 9 1
Пример 10. Одновременный переноси ДНК-белка в микроспоры тритикале
Ростки тритикале, предназначенные для выделения микроспор, хранили в холодильнике (4°С) в течение 3 недель с корнями в дистиллированной воде и головками, обернутыми алюминиевой фольгой. Через 3 недели ±3 суток подтверждали стадию одноядерной микроспоры от средней до поздней по срединному цветку с помощью окраски ацетокармином, предшествующей экстракции. Выделенную микроспору переносили в тритикале, как описано у Eudes и Amundsen (2005) в отношении получения очищенной взвеси микроспор, доведенной средой NPB99 до концентрации 2,5×105 клеток на миллилитр.
Плазмиду (pAct-1 GUS, ~7,2 kb) линеаризировали с помощью рестрикционного фермента Pstд и ДНК очищали с использованием набора для очистки ПЦР-продукта (QlAquick, Qiagen, США). ДНК GUS переносили после 7 различных обработок (Т). Эти эксперименты повторяли пять раз.
Т1) Контроль. Обработка контроля - 200 мкл стерильной воды.
Т2) Только ДНК GUS: 1 мкг ДНК GUS (Sigma Aldrich), разведенный в 200 мкл стерильной воды.
Т3) ДНК GUS-RecA: 1 мкг ДНК, разведенной в 100 мкл стерильной воды, добавляли к 4 мкг RecA, разведенного в 100 мкл, и осторожно перемешивала, что давало смесь белка и ДНК в соотношении 1:4.
Т4) ДНК-Tat2: 1 мкг ДНК, разведенные в 100 мкп стерильной воды, добавляли к 4 мкг Tat2, разведенного в 100 мкл, и осторожно перемешивали, что давало смесь ДНК и интернализуемого пептида (ИНП) в соотношении 1:4.
Т5) Набор ДНК-Chariot: ДНК GUS с набором для белковой трансдукции Chariot трансформирована согласно протоколу производителя (Active Motif, США). 1 мкг ДНК GUS растворяли в 100 мкл стерильной воды и 6 мкл Chariot растворяли в 100 мкл стерильной воды. Раствор ДНК GUS добавляли к раствору Chariot в микроцентрифужной пробирке емкостью 2 мл до конечного объема 200 мкл.
Т6) Набор ДНК-RecA-Chariot: ДНК-RecA переносили в микроспоры с помощью набора для белковой трансдукции Chariot, следуя протоколу производителя. 4 мкг RecA растворяли в 50 мкл стерильной воды и 1 мкг ДНК GUS растворяли в 50 мкл стерильной воды. Раствор RecA добавляли к раствору ДНК и инкубировали в течение 15 мин. 6 мкг раствора Chariot растворяли в 100 мкл стерильной воды. Раствор Chariot пипеткой переносили в раствор ДНК-RecA до конечного объема 200 мкл в микроцентрифужной пробирке емкостью 2 мл.
Т7) ДНК-RecA-Tat2: Перенос ДНК-RecA с микроспоры за счет Tat2. 4 мкг RecA растворяли в 50 мкл стерильной воды и 1 мкг ДНК GUS растворяли в 50 мкл стерильной воды. Раствор RecA добавляли к раствору ДНК и инкубировали в течение 15 мин. 4 мкг Tat2 растворяли в 100 мкг стерильной воды. Раствор Tat2 пипеткой переносили в раствор ДНК-RecA до конечного объема 200 мкл в микроцентрифужной пробирке емкостью 2 мл.
После инкубации комплекса в течение 15 мин при комнатной температуре добавляли 5 мкг липофектамина в течение 5 мин при комнатной температуре. Смесь добавляли только к микроспорам без надосадочной жидкости в микроцентрифужной пробирке емкостью 2 мл. Микроспоры инкубировали с комплексом носитель - переносимый материал в течение 15 мин и добавляли 100 мкл NPB-99 и затем инкубировали в течение еще 45 мин при комнатной температуре. Трансфицированные макроспоры отмывали NPB-99, центрифугировали и сливали надосадочную жидкость. 1000 мкг NPB-99 добавляли в микроцентрифужную пробирку емкостью 2 мл. 500 мл пипеткой переносили на чашки Петри диаметром 35 мм, содержащие 3 мл NPB-99+10% Фиколл ((Sigma F4375) (NPB-99-10F), содержащий цефотаксим.
Четыре из пяти завязей из аналогичных стерилизованных колосьев, взятых прямо из растения, добавляли на все чашки Петри, содержащие микроспоры. Затем чашки Петри покрывали пленкой Parafilm и помещали на чашки Петри диаметром 150 мм вокруг открытой чашки Петри диаметром 50 мм, содержащей стерильную дистиллированную воду. Чашку Петри диаметром 150 мм тоже покрывали пленкой Parafilm и инкубировали в темноте при 28°С в течение 20-3 суток.
Зародыши размером больше 0,5 мм брали с чашек Петри и сеяли на среду GEM (20 мл в чашках Петри диаметром 10 см; Eudes et al. 2003). Чашки Петри покрывали пленкой Parafilm и помещали на 30 см ниже ламп широкого спектра Sylvania Gro-lux (40 Вт), освещающих 80 мкМоль м-2 с-1 (период освещения 16 ч) при комнатной температуре при 16°С. Как только зародыши становились зелеными, их переносили на 50 мл среды на укоренения в асептических условиях в емкости с фуксином при тех же условиях. Как только растения достигало стадии 2-3 листьев и имело достаточный рост корней, его переносили на Spencer-Lemaire roottrainer 4×8 (Spencer-Lemaire Industries Lte., Эдмонтон) и помещали в ростовую камеру при тех условиях, как и материнские растения. Через две недели после цветения оценивали плоидию по набору в семенах.
К 4-5 неделям зародыши подвергали гистохимическому анализу на GUS. Анализ проводили, добавляя 200 мл буфера для гистохимического определения GUS (500 мМоль NaH2PO4, 100 мМоль ЭДТК, 0,3 Моль маннитола, 2 мМоль X-gluc, pH 7.0) к микропорам и затем инкубировали при 37°С в темноте на протяжении ночи. Раствор с красителем сливали и отмывали зародыши фосфатным солевым буфером. Микроспоры синего цвета указывали на активность экзогенного фермента GUS, перенесенного ИНП. Процент синих зародышей при каждой обработке рассчитывали с помощью стереомикроскопа.
Четкую транслокацию Tat2 и Chariot в зародышах наблюдали через 2 месяца после трансфекции (Таблица 5). В отрицательном контроле - необработанных микроспорах - GUS не выявлялась. Максимальная доля зародышей, в которых выявлена GUS после обработки Tat2 и Chariot, составила 25,8 и 26,4% соответственно (Таблица 5). Вторая по значению частота синих зародышей наблюдалась после обработки ДНК-RecA-Chariot и ДНК-RecA-Tat2. В присутствии липофектамина обработка ДНК и ДНК-RecA давала трансфекцию в микропоры с меньшей частотой. Эти исследования демонстрируют, что различные комплексы ДНК и белков интернализировались в микроспорах тритикале.
Таблица 5.
Общее число зародышей с экспрессией GUS, полученных после 7 различных видов обработки для генной трансформации через 2 месяца после трансфекции. Т1) Контроль, необработанные зародыши; Т2) ДНК; Т3) ДНК-RecA; Т4) ДНК-Tat2; Т5) ДНК-Chariot; Т6) ДНК-RecA-Chariot; Т7) ДНК-RecA-Tat2.
  Эксп.1 Эксп.2 Эксп.3 Эксп.4 Эксп.5 Среднее ±SD
Т1 0 1 1 0 1 0,6±0,5
Т2 16 16 17 9 17 15±3,4
ТЗ 21 11 15 17 6 14±5,7
Т4 31 23 29 26 20 25,8±4,4
Т5 32 25 26 27 22 26,4±3,6
Т6 14 16 15 17 23 17±3,5
Т7 18 15 18 12 22 17±3,7
Пример 11. Тест с защитой от ДНКазы I и анализ с задержкой в геле
Комплексы ИНП-ДНК GUS готовили, как описано в отношении переноса в примере 10 комплекса ДНК и ИНП в микроспоры тритикале при обработке ДНК (Т2) и ДНК-RecA (Т3). Тест с защитой от ДНКазы) проведен, как описано в отношении переноса комплекса ДНК и ИНП в микроспоры тритикале при обработке ДНК (Т2) и ДНК-RecA (Т3), но без липофектамина. Сразу после инкубации пептида-ДНК в течение 20 мин 4 мкл ДНКазы) (набор с ДНКазой, не содержащий РНКазы; Qiagen, США) добавляли к смеси (200 мкл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут, после чего инкубировали в течение 5 мин на льду. Диссоциацию пептида и плазмиды и очистку плазмиды проводили с помощью набора для очистки ДНК (набор для ПЦР-очистки QtAquick).
Тест с защитой от ДНКазы I показал, что ДНК, ДНК-RecA, ДНК-Tat2, ДНК-Chahot, ДНК-RecA-Chahot и ДНК-RecA-Tat2 с липофектамином были достаточно защищены, так как четко визуализировалась полоса (7,2 kb), соответствующая ДНК, в то время как в случае ДНК и комплексом ДНК-RecA без липофектамина происходило разрушение ДНК под воздействием нуклеазы (Фиг.11А).
Комплексы RecA-ДНК GUS готовили, как описано в отношении переноса комплекса ДНК и ИНП в микроспоры тритикале. 1 мкл ДНК GUS перемешивали с различными концентрациями белка RecA для получения соотношений 1:0, 1:4, 1:8, 1:12, 1:16, 1:20 и 1:24. После инкубации в течение 20 мин без липофектамина 20 мкл комплекса переносили на 1% гель с агарозой.
Анализ с задержкой в геле на комплекс ДНК-RecA показывает, что размазанная флуоресценция наблюдалась при соотношениях RecA и ДНК GUS 1:8 и выше, что указывает на влияние более высоких концентраций RecA на сниженную мобильность линейной плазмидной ДНК (Фиг.11 В). RecA связывался с dsДНК при соотношениях 1:8 и выше.
На Фиг.11А изображено образование комплекса ИНП-ДНК (А). В тесте с защитой от ДНКазы I исследованы различные комбинации ИНП и ДНК. Т1) контроль, Т2) ДНК, и Т3) ДНК-RecA без липофектамина; Т4) ДНК, Т5) ДНК-RecA, Т6) ДНК-Tat2, Т7) ДНК-Chariot, Т8) ДНК-RecA-Chariot, и Т9) ДНК-RecA-Tat2 с липофектамином. На Фиг.11В отображен эффект различных концентраций ДНК и RecA.
Пример 12. Генетический конструктивный элемент «шпилечная петля» трансфицированный в микроспоры
Ген TaAOS (AY196004) выбран для выключения обмена жасмоновой кислоты (JA) в пшенице с помощью технологии «шпилечной петли». В качестве смысловой последовательности выбран фрагмент 27 mer ggccatccgcgaccgcctcgacttcta. Полная последовательность гена, клонированная между промотором актина и терминирующим кодоном NOS, была
TCTCGGCCATCCGCGACCGCCTCGACTTCTACTTCCTGTCATAGAAGT CGAGGCGGTCGCGGATGGCCCT.
1 мкг ДНК, растворенной в 100 мкл стерильной воды, добавляли к 4 мкг Tat2, растворенного в 100 мкл, и осторожно перемешивали, что давало смесь ДНК и интернализуемого пептида (ИНП) в соотношении 1:4. После инкубации этого комплекса в течение 30 мин при комнатной температуре добавляли 5 мкл липофектамина в течение 5 мин при комнатной температуре. Эту смесь добавляли только к микроспорам без надосадочной жидкости в микроцентрифужной пробирке емкостью 2 мл.
Микроспоры из культуры пшеницы Fielder брали, как описано в предыдущих примерах, и инкубировали с комплексом носитель-переносимый материал в течение 15 мин. Добавляли 100 мкл NPB-99 и инкубировали смесь в течение 45 мин при комнатной температуре. Трансфицированные микроспоры отмывали NPB-99, центрифугировали и сливали надосадочную жидкость. 1000 мкл NPB-99 добавляли в микроцентрифужную пробирку емкостью 2 мл и осторожно перемешивали. 500 мл пипеткой переносили на чашки Петри диаметром 35 мм, содержащие 3 мл NPB-99+10% Фиколл ((Sigma F4375) (NPB-99-10F), содержащий цефотаксим. Микроспоры и зародыши культивировали, как описано в предыдущих примерах.
Из культуры после двух экстракций микроспор получено всего 90 всходов. За первые дни привыкания к почве 55 всходов погибли. Такая необычно высокая частота гибели после контакта с почвой и воздушными контаминантами объяснялась выключением JA. Регенерирующие растения (35) проанализированы на трансген с помощью ПЦР. Три из этих растений оказались ПЦР-положительными на трансген.

Claims (13)

1. Способ получения генно-инженерного растения, включающий обработку растительных клеток с интактными клеточными барьерами комплексом носитель - переносимый материал, состоящим по крайней мере из одного переносимого полипептидного и/или полинуклеотидного компонента, связанного с носителем - положительно заряженным интернализуемым пептидом (ИНП), и предназначенным для получения трансдуцированных клеток и размножения растительных клеток для выращивания растения, причем растительные клетки представляют собой соматические клетки, предварительно обработанные пермеабилизирующим клетки агентом, или гаметофиты.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что гаметофит представляет собой микроспору.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что микроспора является одноядерной или имеет открытую микропору или является одноядерной с открытой микропорой.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что носитель представляет собой положительно заряженный полипептид, способный проникать в клетку и обладающий свойствами сигнала ядерной локализации.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что носитель выбирают из группы, состоящей из tat ВИЧ, pVEC, транспортана, пенетратина и Рер-1.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что носитель представляет собой димер последовательности аминокислот 49-57 tat ВИЧ.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что переносимый компонент представляет собой нуклеиновую кислоту.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что нуклеиновую кислоту выбирают из группы, состоящей из ssPHK, dsPHK, ssДНК, dsДНК и гибридов ДНК: РНК.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что переносимый компонент представляет собой по крайней мере один полипептид.
10. Способ по п.1, отличающийся тем, что переносимый компонент представляет собой полипептид и нуклеиновую кислоту.
11. Способ по п.9, отличающийся тем, что один полипептид представляет собой белок, связанный с эмбриогенезом, или его активный фрагмент.
12. Способ по п.1, отличающийся тем, что пермеабилизирующий агент представляет собой толуол.
13. Способ по п.1, отличающийся тем, что клетки обрабатывают комплексом носитель - переносимый компонент и липофектамином.
RU2009148877/10A 2007-06-07 2008-06-09 Способ трансфекции и трансдукции растительных клеток RU2485180C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US92900607P 2007-06-07 2007-06-07
US60/929,006 2007-06-07
PCT/CA2008/001112 WO2008148223A1 (en) 2007-06-07 2008-06-09 Nanocarrier based plant transfection and transduction

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2009148877A RU2009148877A (ru) 2011-07-20
RU2485180C2 true RU2485180C2 (ru) 2013-06-20

Family

ID=40093127

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2009148877/10A RU2485180C2 (ru) 2007-06-07 2008-06-09 Способ трансфекции и трансдукции растительных клеток

Country Status (11)

Country Link
US (2) US8680366B2 (ru)
EP (1) EP2181193B1 (ru)
JP (1) JP2010532159A (ru)
CN (1) CN101889091B (ru)
AU (1) AU2008258254B2 (ru)
BR (1) BRPI0814244B1 (ru)
CA (1) CA2693525C (ru)
MX (1) MX2009013325A (ru)
RU (1) RU2485180C2 (ru)
WO (1) WO2008148223A1 (ru)
ZA (1) ZA200908635B (ru)

Families Citing this family (101)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8097712B2 (en) 2007-11-07 2012-01-17 Beelogics Inc. Compositions for conferring tolerance to viral disease in social insects, and the use thereof
EP2220238A2 (en) * 2007-11-13 2010-08-25 Yissum Research Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. Methods of modulating production of phenylpropanoid compounds in plants
US8923125B2 (en) * 2008-10-24 2014-12-30 Qualcomm Incorporated Wireless network resource adaptation
JP2011067192A (ja) * 2009-08-25 2011-04-07 Sumitomo Chemical Co Ltd 植物の開花時期を制御する遺伝子、タンパク質およびその利用
US8962584B2 (en) 2009-10-14 2015-02-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. Compositions for controlling Varroa mites in bees
RU2571928C2 (ru) * 2009-10-16 2015-12-27 ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи Применение дендримерной нанотехнологии для доставки биомолекул в растительные клетки
EP2545182B1 (en) 2010-03-08 2017-05-03 Monsanto Technology LLC Polynucleotide molecules for gene regulation in plants
EP2643459B1 (en) 2010-11-24 2017-09-27 Takara Bio USA, Inc. Inducible expression system transcription modulators comprising a distributed protein transduction domain and methods for using the same
CA2820739A1 (en) * 2010-12-08 2012-06-14 National Research Council Of Canada Microspore transformation methodology by macroinjection
EP2668276A4 (en) * 2011-01-26 2014-04-23 Clontech Lab Inc IMPROVED PROTEIN TRANSDUCTION
CN103562397A (zh) 2011-03-23 2014-02-05 陶氏益农公司 适合于在植物中成像和投递应用的量子点载体肽缀合物
CA2842722C (en) * 2011-08-04 2020-06-09 Francois Eudes Organelle targeting nanocarriers
MX350775B (es) * 2011-09-13 2017-09-15 Monsanto Technology Llc Métodos y composiciones para el control de malezas.
US10760086B2 (en) 2011-09-13 2020-09-01 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
CN104160028A (zh) * 2011-09-13 2014-11-19 孟山都技术公司 用于杂草控制的方法和组合物
EP2756083B1 (en) * 2011-09-13 2020-08-19 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control
US10806146B2 (en) 2011-09-13 2020-10-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
UA116092C2 (uk) * 2011-09-13 2018-02-12 Монсанто Текнолоджи Ллс Спосіб та композиція для боротьби з бур'янами (варіанти)
MX362812B (es) * 2011-09-13 2019-02-13 Monsanto Technology Llc Metodos y composiciones para el control de malezas.
US10829828B2 (en) 2011-09-13 2020-11-10 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US9840715B1 (en) 2011-09-13 2017-12-12 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for delaying senescence and improving disease tolerance and yield in plants
MX342856B (es) 2011-09-13 2016-10-13 Monsanto Technology Llc Metodos y composiciones para el control de malezas.
AU2012308694B2 (en) 2011-09-13 2018-06-14 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
WO2013040005A1 (en) * 2011-09-13 2013-03-21 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US9920326B1 (en) 2011-09-14 2018-03-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for increasing invertase activity in plants
CN102441177A (zh) * 2011-12-05 2012-05-09 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 用于siRNA传递的纳米泡载体
RU2478711C1 (ru) * 2011-12-19 2013-04-10 Открытое акционерное общество "Институт стволовых клеток человека" Способ повышения эффективности вирусной трансдукции
EP2813142B1 (en) 2012-02-08 2018-05-23 National University Corporation Nara Institute of Science and Technology Method for introducing florigen
US10723806B2 (en) 2012-02-27 2020-07-28 Riken Method of introducing nucleic acid into plant cells
BR112014027813A2 (pt) 2012-05-07 2017-08-08 Dow Agrosciences Llc métodos e composições para integração de transgenes direcionada mediada por nuclease
US10240161B2 (en) 2012-05-24 2019-03-26 A.B. Seeds Ltd. Compositions and methods for silencing gene expression
BR112014031891A2 (pt) 2012-06-19 2017-08-01 Univ Minnesota direcionamento genético nas plantas utilizando vírus de dna
EP2903413A4 (en) 2012-10-05 2016-07-20 Dow Agrosciences Llc USE OF CRY1EA IN COMBINATIONS FOR MANAGING FALLING AUTUMN LEGION INSECTS
CA2888264A1 (en) 2012-10-18 2014-04-24 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for plant pest control
UY35251A (es) * 2013-01-01 2014-07-31 Seeds Ltd Ab MOLÉCULAS DE dsRNA AISLADAS Y MÉTODOS PARA USARLAS PARA SILENCIAR MOLÉCULAS DIANA DE INTERÉS
US10683505B2 (en) 2013-01-01 2020-06-16 Monsanto Technology Llc Methods of introducing dsRNA to plant seeds for modulating gene expression
US10000767B2 (en) 2013-01-28 2018-06-19 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for plant pest control
MX364458B (es) 2013-03-13 2019-04-26 Monsanto Technology Llc Métodos y composiciones para el control de malezas.
AR095233A1 (es) 2013-03-13 2015-09-30 Monsanto Technology Llc Métodos y composiciones para el control de malezas
US20140283211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Monsanto Technology Llc Methods and Compositions for Plant Pest Control
US10287594B2 (en) 2013-03-15 2019-05-14 Cibus Us Llc Methods and compositions for increasing efficiency of targeted gene modification using oligonucleotide-mediated gene repair
US10568328B2 (en) 2013-03-15 2020-02-25 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US9957515B2 (en) 2013-03-15 2018-05-01 Cibus Us Llc Methods and compositions for targeted gene modification
CN104073519A (zh) * 2013-03-27 2014-10-01 北京市农林科学院 细胞穿透肽介导外源基因转化芸薹属植物小孢子的方法
EP3679785A3 (en) 2013-04-05 2020-09-16 Dow AgroSciences LLC Methods and compositions for integration of an exogenous sequence within the genome of plants
EP3008186B1 (en) 2013-06-14 2018-11-28 Cellectis Methods for non-transgenic genome editing in plants
US9850496B2 (en) 2013-07-19 2017-12-26 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling Leptinotarsa
WO2015010026A2 (en) 2013-07-19 2015-01-22 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling leptinotarsa
ES2729635T3 (es) 2013-08-22 2019-11-05 Pioneer Hi Bred Int Modificación genómica usando sistemas de polinucleótido guía/endonucleasa Cas y métodos de uso
GB201315321D0 (en) 2013-08-28 2013-10-09 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Transduction Buffer
NZ719544A (en) 2013-11-04 2022-09-30 Beeologics Inc Compositions and methods for controlling arthropod parasite and pest infestations
UY35812A (es) 2013-11-04 2015-05-29 Dow Agrosciences Llc ?loci de maíz óptimos?.
CN106232821A (zh) 2013-11-04 2016-12-14 美国陶氏益农公司 最优大豆座位
CA2928855A1 (en) 2013-11-04 2015-05-07 Dow Agrosciences Llc Optimal maize loci
UA119253C2 (uk) 2013-12-10 2019-05-27 Біолоджикс, Інк. Спосіб боротьби із вірусом у кліща varroa та у бджіл
BR112016016337A2 (pt) 2014-01-15 2017-10-03 Monsanto Technology Llc Composição e métodos para controlar crescimento, desenvolvimento ou a capacidade de reprodução de uma planta, e para sensibilizar uma planta para um herbicida inibidor de epsps
JPWO2015133652A1 (ja) * 2014-03-06 2017-04-06 国立研究開発法人理化学研究所 植物の形質転換法
RS65213B1 (sr) 2014-03-14 2024-03-29 Cibus Us Llc Postupci i kompozicije za povećanje efikasnosti ciljane modifikacije gena korišćenjem reparacije gena posredovane oligonukleotidima
CN106413390B (zh) 2014-04-01 2019-09-27 孟山都技术公司 用于控制虫害的组合物和方法
AU2015280252A1 (en) 2014-06-23 2017-01-12 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for regulating gene expression via RNA interference
WO2015200539A1 (en) 2014-06-25 2015-12-30 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for delivering nucleic acids to plant cells and regulating gene expression
MX2017000422A (es) 2014-07-11 2017-05-01 Du Pont Composiciones y metodos para producir plantas resistentes al herbicida glifosato.
US10378012B2 (en) 2014-07-29 2019-08-13 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling insect pests
EP3191595B1 (en) 2014-09-12 2019-12-25 E. I. du Pont de Nemours and Company Generation of site-specific-integration sites for complex trait loci in corn and soybean, and methods of use
JP6942632B2 (ja) 2015-01-22 2021-09-29 モンサント テクノロジー エルエルシー Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ防除用組成物及びその方法
US10450576B2 (en) 2015-03-27 2019-10-22 E I Du Pont De Nemours And Company Soybean U6 small nuclear RNA gene promoters and their use in constitutive expression of small RNA genes in plants
AU2016270870A1 (en) 2015-06-02 2018-01-04 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for delivery of a polynucleotide into a plant
EP3302030A4 (en) 2015-06-03 2019-04-24 Monsanto Technology LLC METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE INTRODUCTION OF NUCLEIC ACIDS IN PLANTS
US20180273979A1 (en) 2015-10-12 2018-09-27 E I Du Pont De Nemours And Company Protected dna templates for gene modification and increased homologous recombination in cells and methods of use
AU2016341044B2 (en) 2015-10-20 2023-03-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Restoring function to a non-functional gene product via guided Cas systems and methods of use
WO2017100158A1 (en) 2015-12-11 2017-06-15 Danisco Us Inc. Methods and compositions for enhanced nuclease-mediated genome modification and reduced off-target site effects
EP3390631B1 (en) 2015-12-18 2020-04-08 Danisco US Inc. Methods and compositions for t-rna based guide rna expression
US11542515B2 (en) 2016-02-09 2023-01-03 Cibus Us Llc Methods and compositions for increasing efficiency of targeted gene modification using oligonucleotide-mediated gene repair
EP3699281A1 (en) 2016-03-11 2020-08-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas9 systems and methods of use
CA3022854A1 (en) 2016-06-14 2017-12-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Use of cpf1 endonuclease for plant genome modifications
CA3018430A1 (en) 2016-06-20 2017-12-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas systems and methods of use
US11661624B2 (en) 2017-03-30 2023-05-30 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of identifying and characterizing gene editing variations in nucleic acids
US11732251B2 (en) 2017-04-24 2023-08-22 Dupont Nutrition Biosciences Aps Anti-CRISPR polynucleotides and polypeptides and methods of use
GB201708665D0 (en) 2017-05-31 2017-07-12 Tropic Biosciences Uk Ltd Compositions and methods for increasing extractability of solids from coffee beans
US20200109408A1 (en) 2017-05-31 2020-04-09 Tropic Biosciences UK Limited Methods of selecting cells comprising genome editing events
GB201708662D0 (en) 2017-05-31 2017-07-12 Tropic Biosciences Uk Ltd Compositions and methods for increasing shelf-life of banana
US20200270604A1 (en) 2017-09-19 2020-08-27 Tropic Biosciences UK Limited Modifying the specificity of non-coding rna molecules for silencing gene expression in eukaryotic cells
EP3694561A4 (en) * 2017-10-12 2021-08-04 Mayo Foundation for Medical Education and Research METHODS AND MATERIALS FOR GENEDITATION
KR20200098578A (ko) 2017-12-15 2020-08-20 다니스코 유에스 인크. Cas9 변이체 및 사용 방법
US11359208B2 (en) 2018-01-09 2022-06-14 Cibus Us Llc Shatterproof genes and mutations
CA3089033A1 (en) * 2018-01-22 2019-07-25 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food Biological nitrogen fixation in crops
GB201807192D0 (en) 2018-05-01 2018-06-13 Tropic Biosciences Uk Ltd Compositions and methods for reducing caffeine content in coffee beans
WO2019234750A1 (en) 2018-06-07 2019-12-12 The State Of Israel, Ministry Of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization (Aro) (Volcani Center) Methods of regenerating and transforming cannabis
CN112424365A (zh) 2018-06-07 2021-02-26 以色列国家农业部、农村发展农业研究组织·沃尔卡尼中心 核酸构建体及其使用方法
AU2019398351A1 (en) 2018-12-14 2021-06-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel CRISPR-Cas systems for genome editing
GB201903521D0 (en) 2019-03-14 2019-05-01 Tropic Biosciences Uk Ltd No title
GB201903519D0 (en) 2019-03-14 2019-05-01 Tropic Biosciences Uk Ltd Introducing silencing activity to dysfunctional rna molecules and modifying their specificity against a gene of interest
GB201903520D0 (en) 2019-03-14 2019-05-01 Tropic Biosciences Uk Ltd Modifying the specificity of non-coding rna molecules for silencing genes in eukaryotic cells
GB202103256D0 (en) 2021-03-09 2021-04-21 Tropic Biosciences Uk Ltd Method for silencing genes
GB202109586D0 (en) 2021-07-02 2021-08-18 Tropic Biosciences Uk Ltd Method for editing banana genes
KR20240031315A (ko) 2021-07-02 2024-03-07 트로픽 바이오사이언시즈 유케이 리미티드 바나나 과실의 갈변 지연 또는 예방
GB202112865D0 (en) 2021-09-09 2021-10-27 Tropic Biosciences Uk Ltd Resistance to black sigatoka disease in banana
GB202112866D0 (en) 2021-09-09 2021-10-27 Tropic Biosciences Uk Ltd Resistance to fusarium wilt in a banana
WO2023102393A1 (en) 2021-11-30 2023-06-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. High efficiency large scale chromosomal genome manipulation
WO2024036190A2 (en) 2022-08-09 2024-02-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Guide polynucleotide multiplexing
GB202305021D0 (en) 2023-04-04 2023-05-17 Tropic Biosciences Uk Ltd Methods for generating breaks in a genome

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0001609B1 (de) 1977-10-20 1982-08-04 Skf Kugellagerfabriken Gmbh Verfahren zur Herstellung eines Wälzlagers mit einem in einer Aussenhülse angeordnetem Käfig und Käfig zur Durchführung des Verfahrens
DE19618797C2 (de) 1996-05-10 2000-03-23 Bertling Wolf Vehikel zum Transport molekularer Substanz
AT409381B (de) 2000-03-03 2002-07-25 Gloessl Josef Dr Xylosyltransferase-gen
KR20040053645A (ko) 2002-12-17 2004-06-24 학교법인 성균관대학 양이온성 올리고펩타이드를 이용한 식물 형질전환법
US20040147027A1 (en) * 2003-01-28 2004-07-29 Troy Carol M. Complex for facilitating delivery of dsRNA into a cell and uses thereof
KR100568457B1 (ko) 2003-07-22 2006-04-07 학교법인 성균관대학 양이온성 올리고펩타이드를 이용한 식물체로의 ｒｎａ전달 기법
US8507277B2 (en) * 2003-10-24 2013-08-13 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides
WO2005117928A1 (en) 2004-05-30 2005-12-15 Cemines, Inc. Compositions and methods for the treatment of skin cancer

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHANE СР et al. Transfection and expression ofplasmid DNA in plant cells by an arginine-rich intracellular delivery peptide without protoplast preparation // FEBS Lett. - 2007 May 1; 581(9):1891-7. Epub 2007 Apr 9. *
CHANE СР et al. Transfection and expression ofplasmid DNA in plant cells by an arginine-rich intracellular delivery peptide without protoplast preparation // FEBS Lett. - 2007 May 1; 581(9):1891-7. Epub 2007 Apr 9. CRANE С et al. Transgenic Medicago truncatula plants obtained from Agrobacterium tumefaciens-transformed roots and Agrobacterium rhizogenes-transformed hairy roots. Planta. 2006 May; 223(6): 1344-54. Epub 2006 Mar 31. *
CRANE С et al. Transgenic Medicago truncatula plants obtained from Agrobacterium tumefaciens-transformed roots and Agrobacterium rhizogenes-transformed hairy roots. Planta. 2006 May; 223(6): 1344-54. Epub 2006 Mar 31. *

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0814244B1 (pt) 2018-10-09
RU2009148877A (ru) 2011-07-20
WO2008148223A1 (en) 2008-12-11
US20110035836A1 (en) 2011-02-10
CA2693525C (en) 2020-09-29
US20140182012A1 (en) 2014-06-26
BRPI0814244A2 (pt) 2014-10-21
CN101889091A (zh) 2010-11-17
AU2008258254B2 (en) 2014-07-03
ZA200908635B (en) 2010-08-25
AU2008258254A1 (en) 2008-12-11
JP2010532159A (ja) 2010-10-07
CN101889091B (zh) 2014-02-19
CA2693525A1 (en) 2008-12-11
EP2181193A4 (en) 2010-08-04
MX2009013325A (es) 2010-05-20
EP2181193A1 (en) 2010-05-05
US9382548B2 (en) 2016-07-05
EP2181193B1 (en) 2017-10-25
US8680366B2 (en) 2014-03-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2485180C2 (ru) Способ трансфекции и трансдукции растительных клеток
US20230242927A1 (en) Novel plant cells, plants, and seeds
AU2017355507B2 (en) Novel plant cells, plants, and seeds
US11220694B1 (en) Rice cells and rice plants
EP3728577A1 (en) Plant gene editing systems, methods, and compositions
EP3392339A1 (en) Improved genome editing in plant cells
JP2014522662A (ja) オルガネラターゲッティングナノキャリア
CN112384063A (zh) 再生及转殖大麻的方法
US11603536B2 (en) Methods for efficient maize genome editing
US11976291B2 (en) Genetically enhanced maize plants
WO2022058388A1 (en) Methods for the production of genome edited plants
US11788098B2 (en) Plant transformation
US11926835B1 (en) Methods for efficient tomato genome editing
US11802288B1 (en) Methods for efficient soybean genome editing
US20160340683A1 (en) Nanocarrier based plant transfection and transduction
WO2020203806A1 (ja) 単離された植物細胞の凝集を抑制する方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20180610