KR100568457B1

KR100568457B1 - 양이온성 올리고펩타이드를 이용한 식물체로의 ｒｎａ전달 기법

Info

Publication number: KR100568457B1
Application number: KR1020030050305A
Authority: KR
Inventors: 이우성
Original assignee: 학교법인 성균관대학
Priority date: 2003-07-22
Filing date: 2003-07-22
Publication date: 2006-04-07
Also published as: WO2005007860A1; KR20050011288A

Abstract

본 발명은 양이온성 올리고펩타이드를 이용한 식물체로의 RNA 전달 기법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 RNA 전달 기법은 양이온성 올리고펩타이드를 운반체로 이용하여 이 운반체에 도입시키고자 하는 음전하의 RNA를 정전기적 상호작용을 통하여 결합시킨 뒤 수용액 상태로 식물 조직에 투과시키는 것을 포함한다. 본 발명의 RNA 전달 기법은 세포 수준에서 뿐만 아니라 전체 식물 조직을 대상으로 가능한 RNA의 효율적인 전달 기법이다. 이와 같은 본 발명의 RNA 전달 기법에 따르면, 도입시키고자 하는 표적 RNA가 양이온을 띠는 올리고펩타이드 운반체에 정전기적 상호작용으로 결합한 상태에서 식물체로 쉽고 간편하게 투과될 수 있어, 이중가닥 RNA를 식물체에 도입시키는 경우, 전사후 유전자 사일런싱(PTGS)을 용이하게 수행할 수 있어 식물의 유전자 기능을 신속하게 규명할 수 있고, 상기의 기법으로 mRNA를 식물체에 도입시키는 경우, 식물 세포내 고유의 전사조절 기작에 구애받지 않고서도 원하는 단백질을 발현시킬 수 있게 된다.

양이온성 올리고펩타이드, 정전기적 상호작용, 알기닌 펩타이드, 라이신 펩타이드, 이중가닥 RNA, mRNA, 전사후 유전자 사일런싱(PTGS), RNA 간섭(RNA i)

Description

양이온성 올리고펩타이드를 이용한 식물체로의 ＲＮＡ 전달 기법{Cationic Oligopeptide-mediated RNA Delivery into Plants}

도 1(a)는 베타-글루쿠로니다제(GUS: β-glucuronidase) DNA를 주형으로 하여 in vitro에서 합성한 이중가닥 RNA와 12량체의 알기닌 펩타이드의 복합체를 GUS유전자 및 NPTⅡ유전자가 35S 프로모터의 조절하에 과다 발현하고 있는 담배현탁배양세포주(tobacco suspension cells)에 처리한 후, 이로부터 분리한 RNA를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, 이하 'RT-PCR'로 약칭함)을 수행한 결과를 나타낸 것이고,

도 1(b)는 상기 도 1(a)와 동일한 시료로부터 분리한 전체 RNA를 방사성 동위원소로 표지된 이중가닥 RNA를 탐침(probe)으로 하여 노던 블랏(northern blot)으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 2(a)는 녹색형광단백질(GFP: green fluorescent protein) 유전자가 35S 프로모터의 조절에 의해 과다 발현하고 있는 아라비돕시스(arabidopsis thaliana; 애기장대)의 잎에서 분리한 전체 RNA를 12량체의 알기닌 펩타이드에 결합시켜 양파 뿌리에 처리한 후 공초점 형광현미경(confocal microscopy)으로 관찰한 것이고,

도 2(b)는 GFP 유전자가 35S 프로모터의 조절에 의해 과다 발현하고 있는 애기장대의 잎에서 분리한 전체 RNA만을 단독으로 양파 뿌리에 처리한 후 공초점 형광현미경으로 관찰한 것이다.

도 3(a)는 GFP DNA를 주형으로 하여 시험관 내(in vitro)에서 전사시킨 mRNA의 5´말단에 메틸구아닌캡(methyl guanine cap)을 도입한 후 이를 12량체의 알기닌 펩타이드를 이용하여 양파 뿌리에 처리한 후 GFP mRNA의 발현정도를 공초점 형광현미경으로 관찰한 것이고,

도 3(b)는 GFP DNA를 주형으로 하여 in vitro에서 전사시킨 mRNA를 12량체의 알기닌 펩타이드를 이용하여 양파 뿌리에 처리한 후 GFP mRNA의 발현정도를 공초점 형광현미경으로 관찰한 것이며,

도 3(c)는 GFP DNA를 주형으로 하여 in vitro에서 전사시킨 mRNA만을 단독으로 양파 뿌리에 처리한 후 GFP mRNA의 발현정도를 공초점 형광현미경으로 관찰한 것이다.

본 발명은 양이온성 올리고펩타이드를 이용한 식물체로의 RNA 전달 기법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 양이온성 올리고펩타이드를 운반체로 이용하여 이 운반체에 도입시키고자 하는 음전하의 RNA를 정전기적 상호작용을 통하여 결합시킨 뒤 수용액 상태로 식물 조직에 투과시키는 것을 포함하는 새로운 방식의 RNA 전달 기법에 관한 것이다.

식물에서 형질전환이 가능하게 된 지난 수 십 년 동안 유용 외래 유전자의 도입을 통한 유용 형질전환 식물체의 획득과 더불어 특정 유전자의 염기서열을 안티센스(antisense) 방향으로 식물체로 도입시켜 특정유전자의 사일런싱(silencing)을 유도하는 방법이 개발되어 사용되었다. 특히 사일런싱 실험에서 전사 후 세포질내에서 mRNA가 분해되는 것이 관찰되었으며, 이는 전사후 유전자 사일런싱(Post Transcriptional Gene Silencing, 이하 'PTGS'로 약칭함)의 징후로 여겨져 왔다.

초기에 페튜니아 및 다른 몇몇 식물 종에만 한정되어 발생하는 기괴한 현상으로 간주되었던 PTGS는 현재 분자생물학에 있어 관심의 초점이 되고 있는 부분이다. 집합적으로 RNA 사일런싱(RNA silencing)으로 알려진 식물에서의 PTGS 기작 및 동물시스템이나 원생동물에서 발생하는 RNA 간섭(RNA interference, 이하 'RNA i'로 약칭함) 현상은 이중가닥 RNA(double stranded RNA)와 동일한 서열을 가지는 숙주 mRNA를 분해하는데 필요한 다수의 인자들을 공유하고 있다. 따라서, 식물에서의 PTGS는 동물에서의 RNA i 현상과 기능적으로 같다고 볼 수 있으며, PTGS의 유전학적 분석 및 생화학적 분석은 RNA i 현상이 본래의 PTGS 모델(Dougherty 등, 1994)과 매우 정확하다는 것을 증명한다.

식물은 바이러스 RNA(viral RNA)를 감지하면 이에 대한 방어 기작으로 외래 바이러스 RNA를 선택적으로 분해시키기 위해 PTGS를 시작한다. 따라서, 형질전환 시스템에서 PTGS가 처음 발견되긴 하였으나 PTGS의 생물학적 역할은 식물의 바이러스 방어 전략(plant virus-defense strategy)일 것으로 추측할 수 있다. 그러나, RNA 사일런싱은 바이러스 RNA에 대한 세포내 방어 기작으로서의 역할뿐만 아니라 세포의 정상적 발육 및 생리적 과정에도 연루되어 있는 것으로 본다. RNA 사일런싱은 선충(C. elegans)(Fraser 등, 2000; Gonczey 등, 2000)의 유전자 기능을 연구하는데 이용되었으며, 초파리(Kennerdell 및 Carthew, 1998; Misquitta 및 Paterson, 1999), 선충(nematode)(Fire 등, 1998; Montgomery 등, 1998), 트립파노좀(Ngo 등, 1998), 포유 동물(Wianny 및 Goetz, 2000) 및 식물(Chuang 및 Meyerowitz, 2000; Waterhouse 등, 1998)을 포함한 다수의 유기체에서 효과가 있음이 알려져 있다.

세포내에서 형성되거나 또는 세포외부로부터 전달된 이중가닥 RNA는 표적 mRNA의 분해를 유발하는데 중심적 역할을 한다. 해몬드 등(Hammond 등, 2000; Nykanen 등, 2001; Hutvagner 및 Zarmore, 2002)에 따르면 이중가닥 RNA는 21∼23개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 작은 간섭 RNA(small interference RNA, 이하 'siRNA'로 약칭함)로 절단되고, 이와 같이 형성된 siRNA들은 mRNA를 인식하여 분해시키는 RNA-유도된 사일런싱 복합체(RNA-induced silencing complex, 이하 'RISC'로 약칭함)에 붙는다. 그러면, siRNA는 RNA-의존성 RNA 폴리머라아제(RNA-dependent RNA polymerase, 이하 'RdRP'로 약칭함)에 의해 증폭되어 표적 mRNA의 양을 훨씬 초과하는 몰 비율을 유지하게 된다(Nishikura, 2001). 또한, 서로 다른 기원을 가지는 이중가닥 RNA일지라도 이러한 기작을 공유할 것으로 추측된다. 이와 같이 식물에서 이중가닥 RNA에 의해 유도되는 유전자 사일런싱을 보다 편리하게 조사하기 위한 방편으로, 본 발명자는 in vitro에서 합성한 이중가닥 RNA를 식물 세포에 효과적으로 전달할 수 있는 방법을 연구하게 되었다.

동물 시스템에서 이중가닥 RNA의 도입은 이를 주사(injection)하거나(Fire 등, 1998) 또는 이중가닥 RNA를 포함하는 배지에서 세포를 배양함으로써(Timmons 및 Fire, 1998; Timmons 등, 2001) 가능하다. 그러나, 식물에서 이중가닥 RNA의 직접 도입은 아직까지 광범위하게 시도된 바가 없다. 합동 억제(co-suppression) 또는 PTGS 기작은 아그로박테리움(Agrobacterium)을 매개로 한 형질전환에 의해 표적 유전자에 대한 이중가닥 RNA를 형성하는 벡터를 도입하거나(Chuang 및 Meyerowitz, 2000; Waterhouse 등, 1998; Robert 등, 1989; Liu 등, 2002; Dalmay 등, 2000), 침투법(infiltration)(Schiff 및 Kumar, 2002)을 이용하거나 또는 이중가닥 RNA를 생성하는 바이러스 벡터(viral vector)를 식물에 감염시키는 방법을 이용하여 연관된 유전자의 추가적인 복제물로 식물체를 형질전환시킴으로서 대부분 연구되었다. 바이러스 벡터로 TMV, PVX, CaMV, TRV 및 Gemini 바이러스들을 기초로 한 다양한 벡터가 있으며, 어떤 바이러스들은 식물의 유전자 사일런싱 기작(gene-silencing mechanism)을 방해하는 유전자들을 발현하기 때문에 사일런싱을 유도하는 다른 것보다 좀더 효율적일 수 있다. 이에 더불어, 요한센 및 캐링턴(2001)은 형질전환된 식물체를 발생시키지 않고도 손상되지 않은 조직에서 유전자 사일런싱을 신속히 연구할 수 있도록 한 아그로박테리움을 매개로 한 일시적 발현 시스템(transient expression system)을 개발했다.

그러나, 바이러스를 이용한 식물체로의 RNA전달법은 숙주로 사용되는 바이러스의 병원성에 의해 나타나게 되는 형질/병징과 특정 RNA의 사일런싱에 의한 형질이나 병징을 구분하기 어려울 뿐만 아니라 감염 후 원형질 연락사와의 상호작용을 통한 이동성으로 인해 형질이나 병징이 나타나는 부위를 조절하기 힘든 단점이 있다. 또한, 아그로박테리움을 이용한 방법도 적절한 벡터의 제조 및 형질전환에 엄청난 시간이 소요되는 단점이 있다. 따라서, 식물에서의 PTGS를 보다 용이하게 수행하고 또한 이에 의해 식물의 유전자 기능을 보다 신속하게 규명할 수 있도록 외래 이중가닥 RNA를 단시간에 효율적이고 간편하게 식물체에 도입시킬 수 있는 RNA 전달 기법의 개발이 절실하게 요구되고 있다.

최근 재조합 DNA법(recombinant DNA method)에 의하여 외래 유전자를 식물에 도입함으로써 관행 육종으로는 식물에 도입하기 불가능하였던 새로운 형질을 식물에 부여할 수 있게 되었다. 재조합 DNA법에 의한 식물 형질전환 방법으로 지금까지는 주로 아그로박테리움(Agrobacterium)의 Ti-플라스미드(Ti-plasmid)를 개조하여 만든 식물 발현벡터를 사용하여 숙주 DNA에 원하는 외래 유전자를 삽입하는 방법을 이용하여 왔으며(Hernalsteens et al., 1980, Nature 287, 654-656), 그밖에 T-DNA 부위를 포함하지 않는 벡터를 이용하는 경우에는, 전기천공법(electroporation), 입자 총법(microparticle bombardment), 폴리에틸렌 글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake) 등이 재조합 DNA를 식물체로 도입하는데 이용되고 있다. 그러나, 상기와 같은 플라스미드 벡터를 이용한 식물체에서의 표적 유전자의 발현 은 DNA의 핵 내부로의 진입이 필수적이며, 진입 후에도 안정적으로 숙주의 염색체에 안착하여 발현할 수 있어야만 한다. 이에 반해, 전체 RNA 또는 mRNA를 이용한 표적 유전자의 발현은 핵 내부로의 진입이 필요 없으며 세포질에서 직접 표적 단백질을 번역할 수 있으므로 더욱 효과적으로 발현된다. 따라서, 상기의 외래 mRNA를 단시간에 효과적으로 식물체에 도입할 수 있는 보다 쉽고 간편한 RNA 전달 기법의 개발이 요구되고 있다.

이에 본 발명자는, 양이온성 올리고펩타이드를 운반체로 이용하여 이 운반체에 도입시키고자 하는 음전하의 RNA를 정전기적 상호작용을 통하여 결합시킨 뒤 수용액 상태로 식물 조직에 투과시킴으로써 세포 수준에서 뿐만 아니라 전체 식물 조직을 대상으로 가능하며 조직 배양 단계를 거치지 않고도 RNA의 효율적이 전달이 가능한 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 상기한 종래의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 양이온성 올리고펩타이드를 운반체로 하여 음전하의 RNA와 정전기적 상호작용을 통해 결합시켜 식물체로 도입시킴으로써 기존의 RNA도입 기법들에 비해 훨씬 용이하고 간편하게 RNA를 식물체로 전달할 수 있는 새로운 방식의 식물체로의 RNA 전달 기법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 양이온성 올리고펩타이드를 이용한 식물체로의 RNA 전달 기법은 양이온성 올리고펩타이드를 운반체(carrier)로 이용하여 이 운반체에 도입시키고자 하는 음전하의 RNA를 정전기적 상호작용을 통하여 결합시킨 뒤 수용액 상태로 식물체에 처리하여 직접 도입시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 한다.

이때, 식물체로 도입할 수 있는 RNA는 이중가닥 RNA 또는 단일가닥 RNA 모두 가능하며, 이중가닥 RNA의 경우는 in vitro에서 합성한 것을 이용하고 단일가닥 RNA의 경우는 표적으로 하는 유전자의 mRNA를 in vitro에서 합성한 것 또는 in vivo에서 분리해 낸 mRNA를 이용함이 바람직하다.

이와 같은 방법에서 양이온성 올리고펩타이드는 양전하를 띠는 6∼30량체의 라이신 펩타이드 또는 알기닌 펩타이드이며, 특히 6량체, 9량체, 12량체 및 15량체의 길이를 갖는 올리고라이신 또는 올리고알기닌이 바람직하며, 세포막을 투과할 수 있다면 전술한 펩타이드 이외의 다른 펩타이드 또는 펩타이드 유사체도 사용가능하다.

양이온성 올리고펩타이드는 인간 면역 결핍 바이러스(HIV)-tat 전사 인자(ref)를 포함한 다양한 단백질들의 단백질 변환 도메인(protein transduction domain, 이하 'PTD'로 약칭함)의 수정된 형태로, 알기닌 또는 라이신과 같이 PTD는 양전하를 띠는 아미노기를 많이 함유하고 있어서, 세포막을 통과할 수 있다(Futaki 등, 2001).

양이온성 펩타이드를 구성하는 양이온성 아미노산의 배합과 길이는 본 발명의 RNA전달 기법의 효율에 크게 영향을 미치고 못하는 것으로 사료된다. 특히, 6∼30량체의 길이를 가진 펩타이드의 효율은 매우 일정하였으며, 전체 아미노산중 양전하를 띠는 알기닌과 라이신의 합이 약 90% 이상이 되면 효율적인 전달매체로서 작용하는 것으로 사료된다. 이와 같은 올리고 펩타이드를 이용한 동물세포의 형질전환법은 이미 잘 알려져 사용되고 있지만, 이를 식물 시스템에 적용하여 RNA와 같은 핵산을 식물 세포내로 투과시키는데 사용한 예나 사용이 가능함을 암시한 문헌은 아직까지는 알려져 있지 않다.

본 발명에 제시된 RNA/펩타이드 복합체는 아미노산의 양전하와 RNA의 음전하 사이의 정전기적 상호작용을 이용하여 결합시킨 것으로, 이와 같은 결합에 적합한 반응 용액으로는 일반적인 PBS(인산염 완충용액, pH 7.4)나, MS배지 등을 사용할 수 있으며, 심지어 정제수 또는 바닷물 농도의 식염수 등도 사용할 수 있다. 반응 용액의 pH는 다양한 pH 범위, 약 pH 4 내지 10의 범위에서도 결합이 확인되듯이 엄밀한 pH를 필요로 하지 않는다. 반응 온도는 약 4℃에서 실시하는 것이 적당하며, 약 15분 내지 약 1시간 동안 방치시킨 결과 RNA와 펩타이드 복합체가 형성되는 것으로 확인된다. 바람직하게는, 복합체의 안정성을 향상시키기 위해서 1시간 동안 반응시키는 것이 좋다.

이와 같이 형성된 RNA/펩타이드 복합체는 수용액 상태로 식물의 배양 세포는 물론이고 종자, 뿌리, 줄기, 구근 등의 조직으로 직접 도입시킬 수 있다. 이는 상기의 복합체를 포함하는 용액을 세포배양 배지, 발아 배지 또는 육종 배지 등에 첨 가하고 이 배지에서 세포를 배양하거나 종자를 발아시키거나 어린 식물을 육종함으로서 이루어지는 매우 간단한 방법이다. 즉, 본 발명의 RNA 전달 기법은 세포 수준에서 뿐만 아니라 전체 식물 조직을 대상으로 가능하며 조직 배양 단계를 거치지 않고도 RNA의 효율적이 전달이 가능한 기법이다. 어떤 이론적 근거를 통해 입증하지는 못하였으나, 이와 같은 도입은 식물 뿌리의 삼투작용과 같은 자연적인 흡수현상을 이용하여 식물체 자신이 RNA/펩타이드 복합체 함유 수용액을 흡수하도록 한 뒤, 흡수된 수용액중의 양이온성 올리고펩타이드의 핵지향성에 의하여 각 식물 세포의 세포벽과 원형질막을 통과하여 세포질, 더 나아가서는 핵까지도 유도되는 것으로 추정된다. 대안적으로, RNA/펩타이드 복합체를 함유한 수용액을 표적 RNA를 도입시키고자 하는 식물의 조직으로 직접 주사하여 주입하는 방법도 이용할 수 있다.

이와 같은 방법을 이용하면 장시간이 요구되는 벡터작업 없이도 보다 쉽고 간편하게 이중가닥 RNA를 식물체로 도입시킬 수 있어 인 플란타 유전자 사일런싱(in-planta gene silencing)의 일환인 PTGS를 용이하게 수행할 수 있다. 이에 의해, 식물의 유전자 기능을 신속하게 규명할 수 있으며, 특정 유전자의 간섭을 통해 새로운 형질의 농작물 개발에 도움이 되는 한편, 기능 유전체학(functional genetics)의 기반 기술을 제공할 수 있을 것으로 사료된다.

또한, 이와 같은 방법으로 mRNA를 식물체에 도입하면 세포내 핵 안으로의 진입 없이도 세포질에서 직접 표적 단백질로 번역할 수 있으므로 식물체로의 DNA 도입에 비해 더욱 효과적으로 발현된다. 이와 같은 세포질내 직접 발현은 세포분열 주기에 의존적이지 않을 뿐만 아니라 세포분열을 하고 있지 않는 세포들에서도 표적유전자를 발현시킬 수 있다는 것을 의미하는 것으로 보다 다양한 식물 조직에서의 표적 유전자 발현을 유도할 수 있을 것이다. 또한, 전체 RNA 중 특정 단백질의 전사에 관여하는 표적 mRNA를 in vitro에서 대량 합성하여 전달하는 것이 가능하기 때문에 식물체내에서의 표적 유전자의 기능연구에 사용될 수 있으며, 숙주의 유전자에 어떠한 변형을 주지 않고 표적유전자를 발현시킬 수 있기 때문에 현재 문제가 되고있는 유전자변형작물(GMO)의 문제를 해결 할 수 있을 것이다. 또한, in vivo로부터 분리한 전체 RNA를 무작위적으로 양이온성 펩타이드와 정전기적으로 결합시켜 전달하면 특정 발생 단계에서 과발현하거나 조직 특이적인 발현 양상을 보이는 표적 유전자들의 연구 등에 응용이 가능할 것이다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

＜실시예 1＞이중가닥 RNA/펩타이드의 전달

35S 프로모터의 조절하에 베타-글루쿠로니다제(GUS: β-glucuronidase) 유전자 및 네오마이신내성 유전자(NPTⅡ: neomycin phosphotransferase Ⅱ)를 함유하는 pBI121 플라스미드를 운반하는 아그로박테리움에 의해 형질전환되어 GUS 및 NPTⅡ가 과다 발현되고 있는 담배 식물체의 발아물(shoots)로부터 담배현탁배양세포주(tobacco suspension cells)를 수득하여 카나마이신(kanamycin) 50㎎/L 함유하는 MS배지에 25℃하에서 보관하였다. 이와는 별도로 GUS DNA를 주형으로 하여 그에 상응하는 이중가닥 RNA를 in vitro에서 합성하였다.

올리고펩타이드로는 12량체의 알기닌 펩타이드(펩트론사 제조, 한국) 분말을 PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4)에 용해시킨 후, 상기의 준비된 GUS 이중가닥 RNA 5㎍, 10㎍, 20㎍과 각각 혼합하여 얼음위에서 1시간 반응시켜 GUS 이중가닥 RNA/알기닌 펩타이드 복합체를 수득하였다. 이와 같이 수득한 복합체를 상기 준비된 담배현탁배양세포주에 25℃에서 1시간 동안 처리하여 전달하였다.

유전자 발현의 선택적인 발현 억제를 확인하기 위해, TRI 시약(Molecualr Probes Diagnostics사 제조, 미국)을 이용하여 상기 담배현탁배양세포주로부터 전체 RNA를 분리하였다. 분리된 전체 RNA에 대하여 GUS 및 NPTⅡ 유전자의 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 수행한 결과를 도 1(a)에 나타내었으며, 도시된 바와 같이 GUS mRNA 검출되지 않는 반면, NPTⅡ mRNA는 GUS 이중가닥 RNA의 도입 여부에 관계없이 발현이 정상적으로 이루어짐이 관찰되었다. 따라서, 담배현탁배양세포주내의 GUS mRNA는 세포내로 도입된 이중가닥 GUS RNA에 의해 인 플란타 유전자 사일런싱의 일환으로 PTGS가 발생했음을 알 수 있다. 이를 뒷받침하는 증거로, 도면에 도시하지는 않았으나 RNase 보호 아세이(RNase protection assay)의 수행 결과, GUS DNA의 이중가닥 RNA를 처리한 세포로부터 21∼23개의 염기쌍을 가지는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 발견할 수 있었다. 또 다른 방법으로, 상기와 동일한 시료로부터 전체 RNA를 분리하여 방사성 동위원소로 표지된 이중가닥 RNA를 탐침으로 하여 노던 블랏(northern blot)을 수행하였는데, 도 1(b)에 나타난 바와 같이 GUS mRNA는 검출되지 않는 반면, NPTⅡ mRNA는 정상적으로 발현이 이루어졌음을 확인할 수 있었다.

이러한 결과들을 종합해보면 12량체의 양이온성 알기닌 펩타이드가 이중가닥 RNA를 식물 세포로 효과적으로 전달하여 PTGS를 유도하는데 사용될 수 있음을 알 수 있다. 또한, 상기의 실험에서 담배현탁배양세포주내의 GUS 유전자는 적어도 3주 동안은 사일런싱이 유지되는 것으로 관찰되었다.

＜비교예 1＞이중가닥 RNA만의 전달

GUS 이중가닥 RNA/알기닌 펩타이드 복합체 대신에 GUS 이중가닥 RNA만을 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 조건하에서 실험한 것으로, 도면에 도시하지는 않았으나, RNase 보호 아세이(RNase protection assay)를 수행한 결과, siRNA를 발견할 수 없었다.

＜실시예 2＞in vivo 전체 RNA/펩타이드의 전달

녹색형광단백질(GFP: green fluorescent protein)이 35S 프로모터의 조절에 의해 과다 발현하고 있는 애기장대의 잎으로부터 전체 RNA만을 선택적으로 분리하였다. 분리된 전체 RNA에는 35S 프로모터의 조절 결과로 인해 과다 발현된 다량의 GFP 유전자의 mRNA가 포함되어 있는데, 이러한 전체 RNA 10㎍을 12량체의 알기닌 펩타이드와 정전기적으로 결합시킨 후 이 복합체를 포함하는 수용액에 양파 뿌리를 1시간 정도 침지 처리한 후에 복합체를 물로 씻어내고 2일 동안 인큐베이션을 실시 하였다. 이의 일부 뿌리 조직을 취하여 공초점 형광현미경(Zeiss, Germany, Axiovert2)으로 관찰한 결과를 도 2(a)에 나타내었으며, 도시된 바와 같이 녹색 형광성을 확인할 수 있었다. 즉, in vivo 전체 RNA중에 포함된 GFP mRNA가 알기닌 펩타이드에 의해 양파 뿌리 세포에 전달되어 세포질에서 직접 발현되었음을 알 수 있다.

＜비교예 2＞분리된 in vivo 전체 RNA만의 전달

GFP RNA/알기닌 펩타이드 복합체 대신에 전체 RNA만을 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 2와 동일한 조건하에서 실험한 것으로, 구체적으로는 애기장대의 잎에서 분리한 전체 RNA만을 단독으로 포함하는 수용액에 양파 뿌리를 1시간 정도 침지 처리 후, 일부 뿌리 조직을 취하여 공초점 형광현미경으로 관찰한 결과, 도 2(b)와 같이 녹색 형광성을 확인할 수 없었다.

＜실시예 3＞대량 합성된 GFP mRNA/캡핑/펩타이드 전달

GFP DNA를 주형으로 하여 in vitro에서 이에 상응하는 mRNA를 대량으로 합성한 후, 진핵 생물의 전사개시에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 메틸구아닌캡을 도입하였다. 합성된 mRNA 6㎍을 12량체의 알기닌 펩타이드 6㎍과 정전기적으로 결합시킨 후 이 복합체를 포함하는 수용액에 양파 뿌리를 1시간 정도 침지 처리한 후 물로 씻어내고 인큐베이션을 실시하였다. 2일 후에, 이의 일부 뿌리 조직을 취하여 공초점 형광현미경으로 관찰한 결과를 도 3(a)에 나타내었으며, 도시된 바와 같이 녹색 형광성을 확인할 수 있었다.

＜비교예 3＞대량 합성된 GFP mRNA/펩타이드 전달

GFP mRNA 5´말단의 캡핑 과정을 생략한 것을 제외하고는 상기 실시예 3과 동일한 조건하에서 실험한 것으로, 도 3(b)에 나타난 바와 같이 패널(a)에 비해 녹색 형광성이 낮게 발현되었음을 확인할 수 있었다.

＜비교예 4＞대량 합성된 GFP mRNA만의 전달

GFP mRNA/알기닌 펩타이드 복합체 대신에 전체 mRNA만을 사용하였고, 캡핑 과정도 생략한 것을 제외하고는 상기 실시예 3과 동일한 조건하에서 실험한 것으로, 도 3(c)에 나타난 바와 같이 녹색 형광성이 거의 관찰되지 않았다.

이상의 연구들은 담배현탁배양세포주, 애기장대의 잎 및 양파 뿌리 등에서 이루어졌으며 대부분의 식물 세포나 조직에서도 RNA가 투과될 것으로 예상한다.

이와 같은 본 발명에 따른 새로운 방식의 RNA 전달 기법에 따르면, 식물체로 외래 DNA를 도입시키는 식물 형질전환 기법이나 기존의 RNA 전달 기법들에 비해서도 훨씬 용이하고 간편하여, 식물체로의 RNA 전달에 따른 결과를 확인함에 있어서 상당히 효율적이다. 본 기법으로 이중가닥 RNA를 식물체에 도입시키면 PTGS 기작을 용이하게 수행할 수 있어 식물의 유전자 기능을 신속하게 규명할 수 있고, 특정 유전자의 간섭을 통해 새로운 형질의 농작물 개발에 도움이 되는 한편, 기능 유전체학(functional genetics)의 기반 기술을 제공할 것으로 사료된다. 또한, 본 기법으로 mRNA를 식물체에 도입시키면 식물 세포내 고유의 전사조절 기작에 구애받지 않고서도 원하는 단백질을 세포질에서 직접 발현시킬 수 있어 세포분열 주기에 의존적이지 않고 세포분열을 하고 있지 않는 세포들에서도 표적 유전자를 발현도 가능하게 되어 보다 다양한 식물 조직에서의 표적 유전자의 발현을 유도할 수 있을 것으로 사료된다.

Claims

양이온성 올리고펩타이드를 운반체로 이용하여 이 운반체에 도입시키고자 하는 RNA를 정전기적 상호작용을 통하여 결합시킨 뒤 수용액 상태로 식물 조직에 투과시키며,

상기 올리고펩타이드에 대한 표적 RNA의 부착이 4℃하에서 pH 4 내지 10범위의 인산염 완충용액(PBS), MS 배지, 물 또는 식염수용액에 15분 내지 1시간 동안 반응시킴으로써 이루어지는 것을 포함하는 양이온성 올리고펩타이드를 이용한 식물체로의 RNA 전달 기법.
제1항에 있어서,

식물체로 전달하고자 하는 RNA는 이중가닥 RNA 또는 단일가닥 RNA인 것을 특징으로 하는 양이온성 올리고펩타이드를 이용한 식물체로의 RNA 전달 기법.
제1항에 있어서,

올리고펩타이드는 6∼30량체의 라이신 펩타이드 또는 알기닌 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 양이온성 올리고펩타이드를 이용한 식물체로의 RNA 전달 기법.
제1항에 있어서,

올리고펩타이드는 6량체, 9량체, 12량체 및 15량체의 라이신 펩타이드 또는 알기닌 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 양이온성 올리고펩타이드를 이용한 식물체로의 RNA 전달 기법.
삭제
제1항에 있어서,

식물체가 식물의 배양 세포, 종자, 뿌리, 줄기 또는 구근 조직을 포함하는 것을 특징으로 하는 양이온성 올리고펩타이드를 이용한 식물체로의 RNA전달 기법.
제1항에 있어서,

식물 조직으로의 투과가 배양액을 통한 투과이거나 또는 주사를 통한 주입에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 양이온성 올리고펩타이드를 이용한 식물체로의 RNA 전달 기법.