CN103562397A - 适合于在植物中成像和投递应用的量子点载体肽缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于将感兴趣的分子导入具有细胞壁的植物细胞中的方法，其通过使用具有量子点(QD)与一种或多种细胞穿透肽(CPP)的QD-肽缀合物进行。提供了用于遗传或以其它方式修饰植物及用于治疗或预防包含细胞壁的植物细胞中的疾病的方法。

Description

适合于在植物中成像和投递应用的量子点载体肽缀合物
优先权要求
本申请要求2011年3月23日提交的美国临时专利申请流水号61/466,804的权益。
技术领域
本公开内容一般涉及用于将感兴趣的分子导入具有细胞壁的植物细胞中的方法，其通过使用具有量子点(QD)与一种或多种细胞穿透肽(CPP)的QD-肽缀合物进行。
发明背景
纳米颗粒具有的独特性质已经被利用于将DNA投递至细胞。金属纳米颗粒，诸如金(Au)纳米颗粒由于其低细胞毒性和容易用各种有生物学意义的配体官能化而已经用于DNA投递。在金属纳米颗粒外，还已经使用大小范围3-5nm内的半导体纳米颗粒(例如量子点)(“QD”)作为载体来将分子投递到细胞中。DNA和蛋白质可以连接到附接于QD表面的配体(见例如F.Patolsky等,J.Am.Chem.Soc.125,13918(2003))。
已经使用纳米颗粒来将质粒DNA投递到多种动物细胞。已经发现了，在将经DNA包被的纳米颗粒与没有细胞壁的细胞一起温育时，细胞吸收纳米颗粒，并开始表达DNA上编码的任何基因。然而，由于植物细胞壁的存在，当前的植物基因投递是挑战性的，这导致对用于植物遗传转化的侵入性投递手段的常见依赖。在期望对通常具有细胞壁的细胞进行纳米颗粒介导的投递的情况中，在将颗粒添加至植物原生质体前将细胞壁剥离(见F.Torney等,Nature Nanotechnol.2,(2007))。在植物细胞中，细胞壁作为投递外源施用的分子的障碍。已经采用许多侵入性方法，如基因枪(生物射弹)、显微注射、电穿孔、和土壤杆菌来实现向这些有壁的植物细胞中的基因和小分子投递，但是仅仅通过显微注射实现了蛋白质投递。在存在植物细胞壁的情况中投递小分子和蛋白质仍是未经探索的，并且为了开发要应用于完整的植物细胞/组织或器官以进行体外和体内操作的使能技术其会是有利的。
细胞穿透肽(CPP)是一类新的且快速增长的短肽，已知其在将一大批包含蛋白质和DNA的货物复合物易位穿过哺乳动物和人细胞系的生物膜时发挥重要的作用。J.Schwartz和S.Zhang(2000),Peptide Mediated CellularDelivery,Curr.Opin.Mol.Ther.2:162–167;
Figure BDA0000419939730000021
Langel(2002),Preface in:CellPenetrating Peptides;Processes and Applications,
Figure BDA0000419939730000022
Langel,Editor,CRC Press,Boca Raton;E.Vives和B.Lebleu(2002),The Tat Derived Cell PenetratingPeptide in:Cell Penetrating Peptides;Processes and Applications,U.Langel,Editor,CRC Press,Boca Raton:第3页–第22页。虽然已经显示了CPP有助于哺乳动物细胞中的货物投递，但是在植物细胞中使用CPP以进行转染的研究受限于许多因素。使此技术适合于植物的主要障碍在于，与动物细胞不同，植物细胞给CPP及其货物的内在化呈现出双重屏障系统(细胞壁和质膜)。因此，为了有效易位CPP必须克服这两种屏障。CPP已经在植物细胞中使用，但是通常依赖于与使用CPP一起的透化剂和技术的使用以实现对植物细胞投递货物投递。HIV1TAT蛋白质转导域(PTD)是得到最充分研究的易位肽之一。最近的报告已经显示了TAT PTD及其寡聚物用于质粒投递的潜力，其通过与哺乳动物细胞中带负电荷的DNA形成复合物来实现。I.Ignatovich,E.Dizhe,A.Pavlotskaya,B.Akifiev,S.Burov,S.Orlov和A.Perevozchikov(2003),Complexes of Plasmid DNA with Basic Domain 47-57 of the HIV 1 Tat ProteinAre Transferred to Mammalian Cells by Endocytosis mediated Pathways,J.Biol.Chem.278:42625-42636;C.Rudolph,C.Plank,J.Lausier,U.Schillinger,R.H.Müller,and J.Rosenecker(2003),Oligomers of the Arginine Rich Motif of theHIV 1 TAT Protein are Capable of Transferring Plasmid DNA into Cells,J.Biol.Chem.278:11411–11418;Z.Siprashvili,F.Scholl,S.Oliver,A.Adams,C.Contag,P.Wender,and P.Khavari(2003),Gene Transfer via Reversible PlasmidCondensation with Cysteine Flanked,Internally Spaced Arginine Rich Peptides,Hum.Gene.Ther.14(13):1225-33;I.Hellgren,J.Gorman,and C.Sylvén(2004),Factors Controlling the Efficiency of Tat mediated Plasmid DNA Transfer,J.Drug.Target.12(1):39-47。已经显示具有移位特征的其它肽包括pVEC、transportan、penetratin、pep-1肽及其片段。
用肽包被QD是一种在用于各种生物技术方法的纳米颗粒表面工程化中已经变得普遍的方法。例如，将细胞穿透肽，诸如聚精氨酸和TAT衍生的肽附着于QD表面已经容许将QD移位入动物细胞中。最近，CPP已经被广泛用作媒介物，用于基础和应用生物医学研究中的分子细胞投递。凭借其帮助，现在有可能将膜不透性物质如肽核酸(PNA)、蛋白质、寡核苷酸、或纳米颗粒引入哺乳动物细胞中。使用CPP来将生物分子投递到细胞中及其瞬时表达对植物生物学家具有不断增加的吸引力。如此，仍然需要经由使用基于纳米颗粒的投递来在植物中稳定掺入基因和其它感兴趣分子的方法。
发明概述
以下实施方案结合系统、工具和方法来描述，所述系统、工具和方法意为例示性和说明性，而非对范围的限制。
本发明的一个实施方案包括将感兴趣的分子导入具有细胞壁的植物细
胞中以实现植物和种子的稳定转化的方法。该方法包括提供所述具有细胞壁的植物细胞，并使量子点(QD)与一种或多种细胞穿透肽(CPP)相互作用以形成QD-肽缀合物，并将一种或多种感兴趣的分子附接于所述一种或多种CPP以形成活化的QD-肽缀合物。将细胞和所述活化的QD-肽缀合物在容许将其摄取到所述具有细胞壁的细胞中置于彼此接触中。
本发明的另一个实施方案包括稳定表达基因的方法。该方法包括提供具有细胞壁的植物细胞，使量子点(QD)与一种或多种细胞穿透肽(CPP)相互作用以形成QD-肽缀合物，并将一种或多种基因附接于所述一种或多种CPP以形成活化的QD-肽缀合物。将具有细胞壁的植物细胞和活化的QD-肽缀合物置于彼此接触中，并将QD-肽缀合物和一种或多种基因置于容许将其摄取到所述具有细胞壁的植物细胞中的条件下。然后，在具有植物细胞的植物后代中表达基因。
本发明的又一个实施方案包括用于将分子物质转移入植物细胞中的方法。该方法包括使量子点(QD)与一种或多种细胞穿透肽(CPP)相互作用以形成QD-肽缀合物，并使所述QD-肽缀合物与质粒DNA相互作用以形成活化的QD-肽缀合物结构。使所述活化的QD-肽缀合物结构与携带完整壁的植物细胞在允许所述一种或多种CPP和来自所述质粒DNA的所述一种或多种基因摄取入所述植物细胞中的条件下接触。
本发明的另一个具体的实施方案包括筛选并鉴定植物转化的方法。该方法包括提供具有细胞壁的植物细胞，使量子点(QD)与一种或多种细胞穿透肽(CPP)相互作用以形成QD-肽缀合物，并将一种或多种感兴趣的分子附接于所述一种或多种CPP以形成活化的QD-肽缀合物。将所述具有细胞壁的细胞和所述活化的QD-肽缀合物置于彼此接触中，并将QD-肽缀合物和感兴趣分子置于容许将其摄取到所述具有细胞壁的植物细胞中的条件下。然后，对具有细胞壁的植物细胞成像。
在上文所描述的例示性方面和实施方案外，其它方面和实施方案会因以下描述而变得显而易见。
附图简述
图1显示了量子点/肽缀合物的实施方案。
图2显示了pDAB3831的质粒图。
发明详述
在以下的描述和表中，使用了许多术语。为了提供对说明书和权利要求书(包括此类术语给予的范围)的清楚且一致的理解，提供了以下定义：
回交。回交可以是育种人员将杂种后代往回与亲本之一，例如第一代杂种F1与F1杂种的亲本基因型之一重复杂交的方法。
胚。胚可以是成熟的种子内含有的小植物。
对除草剂的抗性。对一定剂量的除草剂的抗性指植物幸免于(即植物可以不被杀死)所述剂量的除草剂的能力。在一些情况中，耐受性植物可以暂时变黄或者在其它方面展现出一些除草剂诱导的损伤(例如，过度分蘖和/或生长抑制)，但是能恢复。
稳定化的。稳定化的指从同一品种的近交植物的一个世代可再现地(reproducibly)传递给下一世代的植物特征。
摄取。摄取指颗粒，诸如量子点、载体肽、细胞穿透肽和归巢肽穿过细胞壁或细胞膜的易位，其中所述易位不仅仅由于除摄取颗粒的细胞外的某物对颗粒赋予的动量而发生。仅由于对颗粒赋予的动量而引起颗粒穿过细胞壁或细胞膜的易位的装置或方法的非限制性例子是生物射弹、基因枪、显微注射、和/或刺穿感染(impalefection)技术。
在本发明的一些实施方案中，可以在一种或多种肽上在各种和/或多个位点处工程化改造“添加”或“访客”分子的多个附接位点或填充。此特性可以例如在细胞内的分子位点的特异性靶向和编辑中采用，用于诸如生物模拟物、靶向投递等领域，用于非遗传修饰生物体选项，及在性状和疾病抗性选项方面在多种树或蔬菜作物中的瞬时转化选项(This property can be employed,forexample,in specific targeting and editing of molecular sites within cells for areassuch as biomimetics,targeted deliveries,for non genetically modified organismoptions,and transient transformation options in a variety of tree or vegetablecrops for trait and disease resistance options)。也可以采用本发明的实施方案来开发合适的生物传感器。另外，可以与本发明的方法一起采用人工染色体(ACES)作为目前的真核载体的备选，用于精确靶向和同源重组选项。
一般地，本发明的具体实施方案涉及适合于投递带负电荷的分子，诸如例如DNA/RNA的多功能性荧光纳米颗粒的用途。在发光量子点(QD)的表面上掺入载体和细胞穿透肽(CPP)/归巢肽(HP)(在本文中统称为“CPP”)，诸如R9、TAT、MPG和γ-玉米醇溶蛋白。QD-肽缀合物用于以植物原位途径对拟南芥(Arabidopsis)进行有效DNA投递。QD-肽生物缀合物没有展现出与拟南芥花轴生长和结籽相关的毒性效应。鉴定出几种稳定的T1转化体，并分析幼苗。在植物中显示了基于载体的DNA投递和使用QD建立稳定转化。可以用巧妙的选项工程化改造复合物有效负载以投递生物分子并被精确靶向至细胞和细胞区室中。在具体的实施方案中，此类自身荧光QD的用途可以用于植物中的成像选项。
依照本发明的某些实施方案，可以提供一种将感兴趣的分子导入具有细胞壁的植物细胞中以实现植物和种子的稳定转化的方法。该方法包括提供具有细胞壁的植物细胞，并使量子点(QD)与一种或多种细胞穿透肽(CPP)相互作用，以形成QD-肽缀合物，并将一种或多种感兴趣的分子附着于一种或多种CPP以形成活化的QD-肽缀合物。将细胞和活化的QD-肽缀合物在容许其摄取到具有细胞壁的细胞中的条件下置于彼此接触中。
在一些实施方案中，将几种肽与QD纳米颗粒共价偶联，并投递到植物细胞中。将具有R9、γ-玉米醇溶蛋白和MPG CPP的纳米颗粒成功投递到植物中以实现植物的稳定转化。在其它实施方案中，使用经标记的生物分子来追踪货物在细胞质中的命运。实现这些QD-肽-DNA缀合物的有效摄取，并且DNA和QD-肽缀合物之间的复合物是稳定的，如通过经由回收的种子和抗性T1幼苗传递的稳定转化证明的。
在其它方面，本发明涉及QD“载体”肽-缀合物作为有效负载的应用，用于巧妙投递生物官能化生物分子(例如DNA/RNA和酶投递)的多官能化选项、成像及用于各种生物技术诊断学和感测功能。本策略可以提供相当能适用的表面和包囊化学，如此促进一大批具有不同官能性的分子的合成。就这些材料在生物分子和基因投递中的潜在用途而言的关键特性以此类系统中可用的末端基团的高密度限定。这些促成分子表面特征，提供多个附着位点(例如，用于缀合信号或靶向模块)，以及测定分子体积，其对于将其它分子螯合至此复合物的能力是重要的。缀合的载体肽在QD和附着的货物两者投递方面同时发挥功能。此外，通过将货物与载体肽直接复合，可以消除QD表面上附着种类数目的权衡。由于带负电荷的寡核苷酸不能自身移位细胞壁/膜屏障和细胞膜，本发明提供了用于DNA整合、基因调节、和编辑策略的有效投递系统，等等。
依照本发明的实施方案，具有细胞壁的植物细胞可以是包含完整且全部细胞壁的任何植物细胞。具有细胞壁的细胞的例子包括但不限于藻类、烟草、胡萝卜、玉米、芸苔(canola)、油菜籽、棉花、棕榈、花生、大豆、甘蔗、稻属物种(Oryza sp.)、拟南芥属物种(Arabidopsis sp.)、和蓖麻属物种(Ricinussp.)，优选地烟草、胡萝卜、玉米、棉花、芸苔、大豆和甘蔗；更优选地烟草和胡萝卜。本发明的实施方案可以包括来自任何组织或它们存在的任何地方的包含细胞壁的细胞，包括但不限于在胚、分生细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、花、种子、荚果、茎和组织培养物中。
在本发明的实施方案中，感兴趣的分子可以是可以投递到依照本发明的植物细胞的任何分子。感兴趣的分子或感兴趣分子的组分可以包含但不限于核酸、DNA、RNA、RNAi分子、基因、质粒、粘粒、YAC、BAC、植物人工染色体、植物微型染色体、植物工程性状基因座DNA；多肽、酶、激素、糖肽、糖、脂肪、信号传导肽、抗体、维生素、信使、第二信使、氨基酸、cAMP、药物、除草剂、杀真菌剂、抗生素、和/或其组合。
本发明的实施方案包括用于预防或治疗疾病的方法。非限制性的例示性实施方案包括使用本发明的方法对有此需要的细胞投递杀真菌剂、抗生素、和/或其它药物。
在本发明的方面，QD-肽缀合物可以被摄取入细胞的各个部分中。可以摄取QD-肽缀合物的位置的例子包括但不限于胞质溶胶、细胞核、液泡形成体、质体、黄化质体、色质体、白色体、油质体、蛋白质体、造粉体、叶绿体、和双层膜的腔。在本发明的其它实施方案中，可以经由共质体或质外体途径发生包含细胞壁的细胞对QD-肽缀合物的摄取。
本发明的其它实施方案包括经遗传修饰的植物细胞及其生成方法，其中植物细胞具有经由本发明的方法导入其中的一种或多种核酸。在实施方案的一个例子中，可以经由依照本发明的QD-肽缀合物将包含感兴趣的基因和选择标志的质粒导入具有细胞壁的植物细胞中。在其它实施方案中，可以选择已经稳定地整合了感兴趣的基因和/或选择标志的稳定转化体。在备选的实施方案中，可以增殖现在包含感兴趣的基因的植物细胞以生成包含感兴趣的分子的其它细胞。在其它实施方案中，现在包含感兴趣的分子的植物细胞可以是可再生细胞，其可以用于再生包含感兴趣的分子的全植物。
在另一方面，本发明提供了创建在组织培养中使用的包含感兴趣分子的可再生植物细胞的方法。优选地，组织培养将能够再生与所述可再生细胞具有基本上相同的基因型的植物。此类组织培养物中的可再生细胞可以是胚、原生质体、分生细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、花、种子、荚果或茎。更进一步，本发明的实施方案提供了自本发明的组织培养物再生的植物。
或者，本发明提供了将期望的性状导入具有细胞壁的植物细胞中的方法，其中该方法包括：将QD-肽缀合物和能够为植物细胞提供期望的性状的感兴趣分子置于与细胞的接触中，并允许所述QD-肽缀合物被摄取穿过细胞壁。期望性状的例子包括但不限于选自下组的性状：雄性不育、除草剂抗性、昆虫抗性、和对细菌性疾病、真菌性疾病、和/或病毒性疾病的抗性。
本发明的其它方面提供了生成包含期望的性状或感兴趣分子的稳定化植物系的方法，其中可以首先通过穿过植物细胞壁摄取QD-肽缀合物来导入期望的性状或感兴趣的分子。生成稳定化的植物系的方法是本领域普通技术人员公知的，并且可以包括如下的技术，诸如但不限于自交、回交、杂种生成、群体杂交等。包含首先通过穿过细胞壁摄取QD-肽缀合物来导入植物细胞(或其祖先)中的期望的性状或感兴趣分子的所有植物和植物细胞在本发明范围内。有利地，包含首先通过穿过细胞壁摄取QD-肽缀合物来导入植物或细胞(或其祖先)中的期望的性状或感兴趣分子的植物细胞可以用于与其它不同植物细胞杂交以生成具有卓越特征的第一代(F1)杂种细胞、种子、和/或植物。
在感兴趣的分子包含一种或多种基因的实施方案中，基因可以是显性或隐性等位基因。举例而言，所述基因会赋予的性状诸如除草剂抗性、抗虫性、细菌抗性、真菌抗性、病毒疾病抗性、雄性能育、雄性不育、提高的营养质量、和工业用途。
随着使分离和表征编码特定蛋白质或RNA产物(例如RNAi)的基因成为可能的分子生物学技术的出现，植物生物学领域的科学家对以下方面形成了强烈的兴趣，即工程化改造细胞的基因组以含有和表达外来基因，或者另外的或经修饰型式的天然或内源基因(可能由不同启动子驱动)，以便以特定的方式改变细胞的性状。此类外来的另外的和/或经修饰的基因在本文中统称为“转基因”。在过去15至20年里，已经开发了数种用于产生转基因细胞的方法，并且在具体的实施方案中，本发明涉及转化型式的细胞及其生成方法，其通过经由穿过细胞壁摄取QD-肽缀合物将转基因导入具有细胞壁的细胞来进行。在本发明的实施方案中，转基因可以包含在表达载体中。
细胞转化可以牵涉构建会在特定细胞中发挥功能的表达载体。此类载体可以包含包括在调节元件(例如启动子)控制下的或者与调节元件(例如启动子)可操作连接的基因的DNA。表达载体可以含有一种或多种此类可操作连接的基因/调节元件组合。载体可以是质粒形式，而且可以单独或者与其它质粒联合使用，以如下文所描述的那样使用转化方法提供经转化的细胞，从而将转基因掺入包含细胞壁的植物细胞的遗传物质中。
依照本发明方法的QD-肽缀合物的使用已经生成了稳定转化的植物，并且以表型表明了稳定转化的除草剂基因的表达，在所述表型中赋予了转基因T1植物高除草剂耐受性。显示了此植物是能育的，因为它生成了T2种子。
用于经由QD-肽缀合物摄取的表达载体：标志物基因
表达载体可以包括至少一种与调节元件(例如启动子)可操作连接的遗传标志，其容许通过负选择(即抑制不含该选择标志基因的细胞生长)或者通过正选择(即筛选由该遗传标志编码的产物)回收含有所述标志的经转化细胞。许多用于转化的选择标志基因是转化领域中公知的，包括例如编码在代谢上使可以作为抗生素或除草剂的选择性化学剂解毒的酶的基因，或者编码可对抑制剂不敏感的改变了的靶物的基因。几种正选择方法也是本领域中已知的。
一种通常适合于植物转化的选择标志基因可以包括在植物调节信号控制下的新霉素磷酸转移酶II(nptII)基因，其赋予对卡那霉素的抗性。参见例如Fraley等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,80:4803(1983)。另一种常用的选择标志基因可以是潮霉素磷酸转移酶基因，其赋予对抗生素潮霉素的抗性。参见例如Vanden Elzen等,Plant Mol.Biol.,5:299(1985)。
赋予对抗生素抗性的细菌起源的另外的选择标志基因包括庆大霉素乙酰转移酶、链霉素磷酸转移酶、氨基糖苷-3’-腺苷酰转移酶(adenyl transferase)和博来霉素抗性决定子。参见Hayford等,Plant Physiol.86:1216(1988)；Jones等,Mol.Gen.Genet.,210:86(1987)；Svab等,Plant Mol.Biol.14:197(1990)；Hille等,Plant Mol.Biol.7:171(1986)。其它选择标志基因赋予对除草剂诸如草甘膦、草铵膦(glufosinate)或溴苯腈(bromoxynil)的抗性。参见Comai等,Nature 317:741-744(1985)；Gordon Kamm等,Plant Cell 2:603-618(1990)；和Stalker等,Science 242:419-423(1988)。
其它适合于植物转化的选择标志基因不是细菌起源的。这些基因包括例如小鼠二氢叶酸还原酶、植物5-烯醇丙酮酰莽草酸(enolpyruvylshikimate)-3-磷酸合酶和植物乙酰乳酸合酶。参见Eichholtz等,Somatic Cell Mol.Genet.13:67(1987)；Shah等,Science 233:478(1986)；Charest等,Plant Cell Rep.8:643(1990)。
另一类适合于植物转化的标志基因需要筛选据推测经转化的植物细胞，而不对经转化的细胞直接遗传选择对毒性物质诸如抗生素的抗性。这些基因特别可用于量化或显现基因在特定组织中表达的空间样式，并且通常称为报告基因，因为它们可以与基因或基因调节序列融合以调查基因表达。通常用于筛选经转化的细胞的基因包括β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、β-半乳糖苷酶、萤光素酶和氯霉素乙酰转移酶。参见Jefferson,R.A.,Plant Mol.Biol.Rep.5:387(1987)；Teeri等,EMBO J.8:343(1989)；Koncz等,Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.84:131(1987)；DeBlock等,EMBO J.3:1681(1984)。
最近，已经可获得用于显现GUS活性的体内方法，其不需要破坏植物组织。Molecular Probes publication 2908,Imagene,GreenTM,第1页-第4页(1993)；和Naleway等,J.Cell Biol.115:151a(1991)。然而，还没有证明这些用于显现GUS活性的体内方法对于回收经转化的细胞是有用的，这是由于低灵敏度、高荧光背景和与使用萤光素酶基因作为选择标志有关的限制。
新近，已经利用编码荧光蛋白(例如，GFP、EGFP、EBFP、ECFP、和YFP)的基因作为原核和真核细胞中基因表达的标志物。参见Chalfie等,Science 263:802(1994)。荧光蛋白和荧光蛋白突变体可以作为可筛选标志物使用。
用于经由QD-肽缀合物摄取的表达载体：启动子
表达载体中包含的基因必须由包含调节元件(例如启动子)的核苷酸序列驱动。数种类型的启动子现在是转化领域中公知的，可以单独使用或者与启动子联合使用的其它调节元件也是如此。
如本文中所使用的，“启动子”包括提及如下的DNA区域，其可以在转录起始的上游，而且可以牵涉识别和结合RNA聚合酶和其它蛋白质以启动转录。“植物启动子”可以是能够在植物细胞中启动转录的启动子。在发育控制下的启动子的例子包括优先在某些组织诸如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞、或厚壁组织中启动转录的启动子。此类启动子称为“组织优选性的”。仅在某些组织中启动转录的启动子称为“组织特异性的”。“细胞类型”特异性启动子主要在一种或多种器官中的某些细胞类型(例如根或叶中的维管细胞)中驱动表达。“诱导型”启动子可以是可在环境控制下的启动子。可招致诱导型启动子转录的环境条件的例子包括缺氧条件或光的存在。组织特异性的、组织优选性的、细胞类型特异性的、和诱导型启动子构成“非组成性”启动子类。“组成性”启动子可以是可在大多数环境条件下有活性的启动子。
A.诱导型启动子
可以将诱导型启动子与细胞中表达的基因可操作连接。任选地，可以将诱导型启动子与编码信号序列的核苷酸序列可操作连接，所述核苷酸序列可以与用于在细胞中表达的基因可操作连接。通过诱导型启动子，转录速率响应诱导剂而升高。
可以在本发明中使用任何诱导型启动子。参见Ward等,Plant Mol.Biol.22:361-366(1993)。例示性诱导型启动子包括但不限于：那些响应铜的ACEI系统的启动子(Mett等,PNAS 90:4567-4571(1993))；响应苯磺酰胺除草剂安全剂的来自玉米的In2基因(Hershey等,Mol.Gen.Genetics 227:229-237(1991)；和Gatz等,Mol.Gen.Genetics 243:32-38(1994))；和来自Tn10的Tet阻抑物(Gatz等,Mol.Gen.Genetics 227:229-237(1991))。特别有用的诱导型启动子可以是响应植物正常不响应的诱导剂的启动子。例示性诱导型启动子可以是来自类固醇激素基因的诱导型启动子，其转录活性可以受糖皮质激素诱导。Schena等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:0421(1991)。
B.组成性启动子
将组成性启动子与细胞中表达的基因可操作连接，或者可以将组成性启动子与编码信号序列的核苷酸序列可操作连接，所述编码信号序列的核苷酸序列可以与用于在细胞中表达的基因可操作连接。
可以在本发明中利用不同的组成性启动子。例示性的组成性启动子包括但不限于：来自植物病毒的启动子，诸如来自CaMV的35S启动子(Odell等,Nature 313:810-812(1985))；来自稻肌动蛋白基因的启动子(McElroy等,PlantCell 2:163-171(1990))；来自泛素的启动子(Christensen等,Plant Mol.Biol.12:619-632(1989)，和Christensen等,Plant Mol.Biol.18:675-689(1992))；来自pEMU的启动子(Last等,Theor.Appl.Genet.81:581-588(1991))；来自MAS的启动子(Velten等,EMBOJ.3:2723-2730(1984))；和来自玉米H3组蛋白的启动子(Lepetit等,Mol.Gen.Genetics 231:276-285(1992)，和Atanassova等,PlantJournal 2(3):291-300(1992))。ALS启动子，即欧洲油菜(Brassica napus)ALS3结构基因5’的Xba1/NcoI片段(或与所述Xba1/NcoI片段相似的核苷酸序列)代表一种特别有用的组成性启动子。参见PCT申请WO 96/30530。
C.组织特异性或组织优选性启动子
可以将组织特异性启动子与用于在细胞中表达的基因可操作连接。任选地，可以将组织特异性启动子与编码信号序列的核苷酸序列可操作连接，所述编码信号序列的核苷酸序列可以与用于在细胞中表达的基因可操作连接。用与组织特异性启动子可操作连接的感兴趣基因转化的植物可以专门或优先在特定组织中生成转基因的蛋白质产物。
可以在本发明中利用任何组织特异性或组织优选性启动子。例示性组织特异性或组织优选性启动子包括但不限于：根优选性启动子，诸如来自菜豆蛋白基因的启动子(Murai等,Science 23:476-482(1983)，和Sengupta Gopalan等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:3320-3324(1985))；叶特异性和光诱导型启动子，诸如来自cab或1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(rubisco)的启动子(Simpson等,EMBO J.4(11):2723-2729(1985)，和Timko等,Nature 318:579-582(1985))；花药特异性启动子，诸如来自LAT52的启动子(Twell等,Mol.Gen.Genetics 217:240-245(1989))；花粉特异性启动子，诸如来自Zm13的启动子(Guerrero等,Mol.Gen.Genetics 244:161-168(1993))或小孢子优选性启动子，诸如来自apg的启动子(Twell等,Sex.Plant Reprod.6:217-224(1993))。
可以通过将编码信号序列的核苷酸序列可操作连接至编码感兴趣蛋白质的基因的5’和/或3’区域的手段来实现由转基因生成的蛋白质向亚细胞区室诸如叶绿体、液泡、过氧化物酶体、乙醛酸循环体、细胞壁或线粒体的转运或者分泌入质外体中。可以在蛋白质合成和加工过程中测定在结构基因的5’和/或3’端的靶向序列，其中编码的蛋白质最后可以被区室化(compartmentalized)。或者，可以将此类亚细胞区室靶向性蛋白质与QD-肽缀合物直接连接以将用感兴趣的分子包被的QD-肽缀合物引导至期望的亚细胞区室。
信号序列的存在将多肽引导至胞内细胞器或亚细胞区室，或者分泌至质外体。许多信号序列是本领域中已知的。参见例如Becker等,Plant Mol.Biol.20:49(1992)；P.S.Close,Master’s Thesis,Iowa State University(1993)；C.Knox等,“Structure and Organization of Two Divergent Alpha-Amylase Genes fromBarley,”Plant Mol.Biol.9:3-17(1987)；Lerner等,Plant Physiol.91:124-129(1989)；Fontes等,Plant Cell 3:483-496(1991)；Matsuoka等,Proc.Natl Acad.Sci.88:834(1991)；Gould等,J.Cell.Biol.108:1657(1989)；Creissen等,Plant J.2:129(1991)；Kalderon等,A short amino acid sequence able to specify nuclearlocation,Cell 39:499-509(1984)；Steifel等,Expression of a maize cell wallhydroxyproline-rich glycoprotein gene in early leaf and root vasculardifferentiation,Plant Cell 2:785-793(1990)。
外来蛋白质基因和农艺学基因
通过根据本发明的转基因植物，可以以商业量生产外来蛋白质。如此，用于选择和繁殖经转化植物的技术(它们是本领域中充分了解的)产生多种转基因植物，它们以常规方式收获，然后可以从感兴趣的组织或总生物量提取外来蛋白质。可以通过由例如Heney和Orr,Anal.Biochem.114:92-6(1981)所讨论的已知方法来实现从植物生物量的蛋白质提取。
在本发明的各方面，为商业生产外来蛋白质提供的转基因植物可以是细胞或植物。在其它方面，感兴趣的生物量可以是种子。对于相对少数的显示较高表达水平的转基因植物，可以主要经由常规的RFLP、PCR和SSR分析(其鉴定整合DNA分子的近似染色体位置)来产生遗传图谱。关于这方面的例示性方法，参见Glick和Thompson,Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology,CRC Press,Boca Raton 269:284(1993)。关于染色体位置的图谱信息对于主题转基因植物的所有权保护可以是有用的。如果可以进行未经授权的繁殖和与其它种质进行杂交，则可以将整合区域的图谱与可疑植物的类似图谱进行比较以确定后者是否与主题植物具有共同亲本(parentage)。图谱比较会牵涉杂交、RFLP、PCR、SSR和测序，它们都是常规技术。
同样地，可以在经转化的细胞或其后代中表达农艺学基因。更具体地，可以经由本发明的方法对植物进行遗传工程化改造以表达农艺学感兴趣的各种表型。可以在这方面使用的例示性基因包括但不限于下文进行归类的基因。
1.赋予对害虫或疾病的抗性并编码下列各项的基因：
A)植物疾病抗性基因。植物防御常常由植物中的疾病抗性基因(R)产物与病原体中相应无毒力(Avr)基因产物之间的特异性相互作用激活。可以用克隆的抗性基因转化植物品种以工程化改造对特定病原体株有抗性的植物。参见例如Jones等,Science 266:789(1994)(克隆对黄枝孢霉(Cladosporiumfulvum)有抗性的番茄Cf-9基因)；Martin等,Science 262:1432(1993)(对丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)有抗性的番茄Pto基因编码蛋白质激酶)；Mindrinos等,Cell 78:1089(1994)(对丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)有抗性的拟南芥(Arabidops)RSP2基因)。
B)赋予对害虫诸如大豆胞囊线虫有抗性的基因。参见例如PCT申请WO96/30517；PCT申请WO 93/19181。
C)苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)蛋白、其衍生物或以其为模型的合成多肽。参见例如Geiser等,Gene 48:109(1986)，其披露了Btδ-内毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，编码δ-内毒素基因的DNA分子可以购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，Manassas，Va.，例如以ATCC保藏号40098、670136、31995和31998购得。
D)凝集素。参见例如Van Damme等,Plant Molec.Biol.24:25(1994)的公开内容，其披露了数种君子兰(Clivia miniata)甘露糖结合凝集素基因的核苷酸序列。
E)维生素结合蛋白诸如抗生物素蛋白。参见PCT申请US93/06487。该申请教导了抗生物素蛋白和抗生物素蛋白同源物作为针对虫害的杀幼虫剂的用途。
F)酶抑制剂，例如蛋白酶或蛋白水解酶抑制剂或淀粉酶抑制剂。参见例如Abe等,J.Biol.Chem.262:16793(1987)(稻半胱氨酸蛋白水解酶抑制剂的核苷酸序列)；Huub等,Plant Molec.Biol.21:985(1993)(编码烟草蛋白水解酶抑制剂I的cDNA的核苷酸序列)；Sumitani等,Biosci.Biotech.Biochem.57:1243(1993)(硝孢链霉菌(Streptomyces nitrosporeus)α-淀粉酶抑制剂的核苷酸序列)；和美国专利号5,494,813(Hepher和Atkinson，1996年2月27日公开)。
G)昆虫特异性激素或信息素，诸如蜕皮类固醇或保幼激素，其变体、基于其的模拟物、或其拮抗剂或激动剂。参见例如Hammock等,Nature344:458(1990)披露的克隆的保幼激素酯酶(即一种保幼激素灭活剂)的杆状病毒表达的内容。
H)昆虫特异性肽或神经肽，其在表达后破坏受到影响的害虫的生理学。例如参见Regan,J.Biol.Chem.269:9(1994)(表达克隆产生编码昆虫利尿激素受体的DNA)和Pratt等,Biochem.Biophys.Res.Comm.163:1243(1989)(可以在太平洋折翅蠊(Diploptera puntata)中鉴定出咽侧体抑制素(allostatin))的公开内容。还可参见Tomalski等的美国专利号5,266,317，其披露了编码昆虫特异性、麻痹性神经毒素的基因。
I)在自然界由蛇、黄蜂(wasp)或任何其它生物体生成的昆虫特异性毒液。例如参见Pang等,Gene 116:165(1992)，是关于编码蝎昆虫毒性肽的基因在植物中的异源表达的公开内容。
J)酶，其负责超积累单萜、倍半萜、类固醇、异羟肟酸、类苯丙烷衍生物或另一具有杀昆虫活性的非蛋白质分子。
K)牵涉对生物学活性分子的修饰(包括翻译后修饰)的酶；例如，糖酵解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、壳多糖酶(chitinase)和葡聚糖酶(不管是天然的还是合成的)。参见以Scott等名义的PCT申请WO93/02197，其披露了callase基因的核苷酸序列。含有壳多糖酶编码序列的DNA分子可以例如从ATCC以保藏号39637和67152获得。还可参见Kramer等,Insect Biochem.Molec.Biol.23:691(1993)(其教导了编码烟草天蛾壳多糖酶的cDNA的核苷酸序列)和Kawalleck等,Plant Molec.Biol.21:673(1993)(其提供了欧芹ubi4-2多聚泛素基因的核苷酸序列)。
L)刺激信号转导的分子。例如参见Botella等,Plant Molec.Biol.24:757(1994)(关于绿豆钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列)和Griess等,Plant Physiol.104:1467(1994)(其提供了玉米钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列)的公开内容。
M)疏水矩肽(hydrophobic moment peptide)。参见PCT申请WO 95/16776(抑制真菌植物病原体的鲎抗菌肽(Tachyplesin)的肽衍生物的公开内容)和PCT申请WO 95/18855(教导了赋予疾病抗性的合成抗微生物肽)。
N)膜通透酶、通道形成剂或通道阻断剂。例如参见Jaynes等,Plant Sci.89:43(1993)公开的杀菌肽-β溶胞肽类似物(cecropin-β lytic peptide analog)的异源表达以使转基因烟草植物对青枯假单胞菌(Pseudomonas solanacearum)有抗性。
O)病毒侵入蛋白或自其衍生的复合毒素。例如，病毒外壳蛋白在经转化植物细胞中的积累赋予对由可衍生出该外壳蛋白基因的病毒及相关病毒招致的病毒感染和/或疾病形成的抗性。参见Beachy等,Ann.rev.Phytopathol.28:451(1990)。已经对经转化的植物赋予了针对苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草线条病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草蚀刻病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒的外壳蛋白介导的抗性。同上。
P)昆虫特异性抗体或自其衍生的免疫毒素。如此，靶向昆虫肠中的重要代谢功能的抗体会使受影响的酶失活，这杀死昆虫。参见Taylor等,摘要号497,Seventh Int’l Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions(Edinburgh,Scotland)(1994)(经由生成单链抗体片段进行的转基因烟草中的酶促失活)。
Q)病毒特异性抗体。参见例如Tavladoraki等,Nature 366:469(1993)，其显示了表达重组抗体基因的转基因植物受到保护免于病毒攻击。
R)在自然界由病原体或寄生物生成的发育阻滞蛋白(developmental-arrestive protein)。例如，真菌内α-l,4-D-多聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁同-α-1,4-D-半乳糖醛酸酶(galacturonase)来促进真菌定殖(colonization)和植物营养物释放。参见Lamb等,Bio/Technology 10:1436(1992)。编码豆内多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的基因的克隆和表征可以由Toubart等,Plant J.2:367(1992)描述。
S)在自然界由植物生成的发育阻滞蛋白。例如Logemann等,Bio/Technology 10:305(1992)显示了表达大麦核糖体失活基因的转基因植物对真菌疾病具有升高的抗性。
2.赋予对除草剂的抗性的基因：
A)抑制生长点或分生组织的除草剂，诸如咪唑啉酮、磺酰胺或磺酰脲。在这类中的例示性基因编码突变的ALS和AHAS酶，如分别由例如Lee等,EMBO J.7:1241(1988)和Miki等,Theor.Appl.Genet.80:449(1990)所描述的。
B)草甘膦(分别由例如突变体5-烯醇丙酮酰莽草酸(enolpyruvylshikimate)-3-磷酸合酶(EPSP)基因(经由导入重组核酸和/或天然EPSP基因的体内诱变的各种形式)、aroA基因和草甘膦乙酰基转移酶(GAT)基因赋予的抗性)、其它膦酰基化合物诸如草铵膦(glufosinate)(来自链霉菌属物种(Streptomyces species)，包括吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)和绿色产色链霉菌(Streptomyces viridichromogenes)的草铵膦乙酰基转移酶(PAT)基因)、和吡啶氧基或苯氧基丙酸和环己酮(ACC酶抑制剂编码基因)，见例如Shah等的美国专利No.4,940,835和Barry等的美国专利6,248,876，其披露了可以对植物赋予草甘膦抗性的EPSP形式的核苷酸序列。编码突变体aroA基因的DNA分子可以以ATCC保藏号39256获得，并且突变体基因的核苷酸序列可以在Comai的美国专利No.4,769,061中披露。Kumada等的欧洲专利申请No.0 333 033和Goodman等的美国专利No.4,975,374披露了对除草剂诸如L-膦丝菌素(L-phophinothricin)赋予抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。PAT基因的核苷酸序列可以参见Leemans等的欧洲申请No.0 242 246，DeGreef等,Bio/Technology 7:61(1989)描述了生成表达编码PAT活性的嵌合bar基因的转基因植物。赋予对苯氧基丙酸和环己酮，诸如稀禾定(sethoxydim)和吡氟氯禾灵(haloxyfop)的抗性的基因的例子包括Marshall等,Theor.Appl.Genet.83:435(1992)描述的Acc1 S1、Acc1 S2和Acc1 S3基因。能够赋予草甘膦抗性的GAT基因记载于Castle等的WO 2005012515。赋予对2,4-D、苯氧基丙酸和吡啶基氧基生长素除草剂的抗性的基因记载于归于Dow AgroSciencesLLC的WO 2005107437。
C)抑制光合作用的除草剂，诸如三嗪(psbA和gs+基因)或苯基氰(腈水解酶基因)。Przibila等,Plant Cell 3:169(1991)描述了用编码突变的psbA基因的质粒转化衣滴虫(Chlamydomonas)。腈水解酶基因的核苷酸序列披露于Stalker的美国专利号4,810,648，并且含有这些基因的DNA分子可以以ATCC保藏号53435、67441、和67442获得。编码谷胱甘肽S-转移酶的DNA的克隆和表达可以由Hayes等,Biochem.J.285:173(1992)描述。
3.赋予或促成增值(value-added)性状的基因，诸如：
A)经修饰的脂肪酸代谢，例如通过用硬脂酰-ACP去饱和酶的反义基因转化植物以提高植物的硬脂酸含量。参见Knultzon等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:2624(1992)。
B)降低的肌醇六磷酸盐含量——1)肌醇六磷酸酶编码基因的导入会增强肌醇六磷酸盐的分解，向经转化的植物添加更多游离的磷酸盐。例如，参见Van Hartingsveldt等,Gene 127:87(1993)，关于黑曲霉(Aspergillus niger)肌醇六磷酸酶基因的核苷酸序列的公开内容。2)可以导入降低肌醇六磷酸盐含量的基因。例如在玉米中，这可以如下实现，即克隆与单一等位基因有关的DNA，然后再次导入，所述单一等位基因可以负责特征为低水平肌醇六磷酸的玉米突变体。参见Raboy等,Maydica 35:383(1990)。
C)例如通过用编码改变淀粉分支样式的酶的基因转化植物来实现的经修饰的碳水化合物组成。参见Shiroza等,J.Bacteol.170:810(1988)(链球菌(Streptococcus)突变体果糖基转移酶基因的核苷酸序列)，Steinmetz等,Mol.Gen.Genet.20:220(1985)(枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的核苷酸序列可以是果聚糖蔗糖酶(levansucrase)基因)；Pen等,Bio/Technology 10:29 2(1992)(表达地衣芽胞杆菌(Bacillus lichenifonn)α-淀粉酶的转基因植物的生成)；Elliot等,Plant Molec.Biol.21:515(1993)(番茄转化酶基因的核苷酸序列)；Sogaard等,J.Biol.Chem.268:22480(1993)(定点诱变可以是大麦α-淀粉酶基因的)；和Fisher等,Plant Physiol.102:1045(1993)(玉米胚乳淀粉分支酶II)。
实施例
本发明在以下实施例中进一步描述，所述实施例作为例示提供，而并不意图以任何方式限制本发明。
实施例1
肽的合成
表1中列出了以下细胞穿透肽(CPP)序列；R9(Futaki et al.,2001,Suzuki,et al.,2002)、MPG(Morris,1997and Morris,1999)、和γ-ZEIN(Kogan et al.,2001 and 2002)。这些肽由American Peptide Company(Sunnyvale,CA)以C端酰胺合成。使用本领域公知的方案使用质谱分光光度计测试样品的完整性。
表1：合成肽的氨基酸序列和分子量
量子点–肽缀合物的制备
生成量子点(QD)和CPP缀合物。通过将约1mg sulfo-SMCC添加至200μl50mM磷酸钠pH7.4中的200μl胺量子点(QD514;n=2.3nmol)活化胺官能化的量子点，其购自EvidentTech(Troy,NY)。将CPP与缀合缓冲液(1mM EDTA,0.1M磷酸盐,0.15M NaCl,pH7.2)中的马来酰亚胺活化的量子点独立混合，并于4℃温育过夜。在缀合后，将QD-CPP缀合物以90,000rpm离心3小时，并将团粒在PBS(磷酸盐缓冲盐水)溶液中溶解。制备具有QD与CPP摩尔比为1:100直到1:300的QD-CPP缀合物。
细胞穿透肽介导的QD货物(Cargo)上的DNA投递
将质粒DNA，即pDAB3831(图1)与QD-CPP缀合物复合。在将DNA与QD-CPP缀合物复合前，将质粒DNA变性，并容许再退火。这通过将DNA在无DNA酶水中稀释至终体积10μl来实现。通过将溶液加热至70℃达5分钟，然后容许溶液缓慢冷却至室温来使溶液变性。然后，将DNA以CPP-DNA与QD终浓度1:100与QD-CPP缀合物复合。于37℃将QD-CPP-DNA复合实施1小时。最终，添加无菌3%蔗糖，直到实现最终体积10ml。使用QD-CPP-DNA复合物溶液来转化拟南芥的花芽。
用QD-CPP-DNA复合物转化拟南芥
供植物原位(in planta)转化用的植物材料
种子的同步萌发对于确保T0植物中花发育的一致性是重要的。将来自拟南芥哥伦比亚栽培种(Arabidopsis thaliana cv.Columbia)的种子在0.1%琼脂溶液中悬浮，并于4℃温育48小时以完成分层。将60mg种子称重，并转移到15ml管。添加13ml0.1%琼脂溶液，并涡旋振荡，直到将种子均匀分散。这生成4.6mg种子/1ml溶液(或约230个种子/ml)的浓度。制备6管(72ml溶液)以播种4个浅箱(flat)，其在每个盘中含有18个(3-1/2英寸；8.89-cm)盆。将种子于4℃温育48小时以完成分层。以每盆1.0ml分层种子个别播种每个盆。在播种所有盆时，将繁殖罩(propagation dome)置于盘上以保持土壤湿润。在播种日后5天除去罩。使种子萌发，并将植物在Conviron(CMP4030和CMP3244型,Controlled Environments Limited,Winnipeg,Manitoba,Canada)中在长日照条件(16小时光照/8小时黑暗)下以光强度120-150μmol/m2秒在恒定温度(22℃)和湿度(40-50%)下种植。在播种植物后10至14天用霍格兰溶液(Hoagland’ssolution)，接着用DI水给植物浇水以使土壤保持润而不湿。播种日后4周后，将花修剪以产生二级花(secondary flower)的更一致生长。在播种后第5周中，将植物制备好进行转化方法。
植物原位转化和筛选T 1 抗性植物：
使用对Clough和Bent(S.J.Clough and A.F.Bent,1998,Plant J.16:735-43)修改的方案完成拟南芥哥伦比亚栽培种的转化。用QD-CPP-DNA溶液生成10ml悬浮液，并用于处理拟南芥植物(主要为未成熟的花簇及一些已受精的长角果)。在浸渍植物前，将至浓度0.05%(250ul/500ml)-0.005%的SilwetL-77添加至QD-CPP-DNA溶液，并完全混合。将植物的地上部分在QD-CPP-DNA溶液中在温和搅动的情况下浸渍2至30秒。将经处理的植物在塑料罩覆盖下于22-24℃保持16至24小时。将植物转移至Conviron，并容许生长至成熟，并收集种子。使用选择盘(10.5”x21”x1”盘)来筛选来自T0植物的大批收获种子，在每个盘上约10,000个种子。使用两个对照来确保整个完成选择喷雾，即Col-0阴性转化对照和在PAT(膦丝菌素乙酰基转移酶)选择标志物方面纯合的哥伦比亚种子作为阳性转化对照。为了实现同步，将种子在播种前在0.1%琼脂溶液中分层48小时。为了提供每选择盘10,000个种子，将200mg种子添加至0.1%琼脂溶液，并涡旋振荡，直到将种子均匀分布。然后，在充满Sunshine混合物LP5的选择盘上播种分层种子，并用霍格兰溶液地下灌溉。为了使选择喷雾有效，重要的是，将40ml悬浮种子均匀播种到选择盘上。在播种后，将繁殖罩置于每个选择盘上，并种植植物以进行选择。播种后约5天除去繁殖罩。
另外，完成对照实验。在此实验中，使用仅含有DNA(其与QD-CPP缀合物没有复合)的溶液来转化拟南芥。上述方案用于转化单独的DNA作为对照。
经转化植物的选择
容许新鲜收获的T1种子于室温干燥7天。将T1种子在26.5x51-cm萌发盘上播种，每个接收200mg分层T1种子(约10,000个种子)等分试样，所述分层T1种子先前已经在40ml 0.1%琼脂糖溶液中悬浮，并于4℃贮存2天以完成休眠需要并确保同步种子萌发。
将Sunshine混合物LP5用细蛭石覆盖，并用霍格兰溶液地下灌溉直到潮湿，然后容许重力引流。用移液管将每40ml分层种子等分试样均匀播种到蛭石上，并用湿度罩覆盖4-5天。在出土喷雾后使用草丁磷进行初始转化体选择前1天除去罩。
种子后7天(DAP)，使用DeVilbiss压缩空气喷雾尖端以每次应用投递有效率280g ae/ha草丁磷，以10ml/盘(703L/ha)的喷雾体积用0.2%Liberty除草剂(200g ae/L草丁磷,Bayer Crop Sciences,Kansas City,MO)溶液在5天内对T1植物(分别是子叶和2-4叶阶段)喷雾5次。在最终喷雾后4-7天鉴定存活者(活跃生长的植物)，并将其个别移植到用盆栽培养基(Metro Mix 360)制备的3-英寸(7.62-cm)盆。将移植的植物用湿度罩覆盖3-4天，并如先前那样在22℃生长室中放置或直接移到温室。随后，将罩除去，并将植物在温室(22±5℃,50±30%RH,14小时光照:10小时黑暗，最小值500μE/m2s1自然光+补充光)中培养。
分子分析
使用植物DNAZOL试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)依照制造商的说明书从6周龄植物的总叶材料提取来自拟南芥转基因植物的基因组DNA。设计PCR引物以检测yfp和pat转基因。Yfp引物以SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5呈现。Pat引物以SEQ ID NO:6和SEQID NO:7呈现。
SEQ ID NO:45′-TGTTCCACGGCAAGATCCCCTACG-3′
SEQ ID NO:55′-TATTCATCTGGGTGTGATCGGCCA-3′
SEQ ID NO:65′-GGAGAGGAGACCAGTTGAGATTAG-3′
SEQ ID NO:75′-AGATCTGGGTAACTGGCCTAACTG-3′
使用TaKaRa ExTaq试剂盒(Takara,Otsu,Shiga,Japan)完成针对pat和yfp的PCR扩增反应。将基因产物在总反应体积50μl中扩增。PCR反应含有100ng基因组DNA模板、1X ExTaq反应缓冲液、.2mM dNTP、10pMol每种引物和.025个单位/μL ExTaq。使用以下PCR条件：于96℃持续5分钟的1个循环和以下条件的31个循环：94℃持续15秒，65℃持续30秒，72℃持续1分钟，以及72℃持续7分钟的最终延伸。将PCR扩增产物通过.8%TAE琼脂糖凝胶电泳分析，并通过溴化乙啶染色显现。表2呈现了从这些反应获得的扩增产物的结果。
表2：在此实验中使用的基于QD的载体缀合物的PCR结果，其中仅显示代表性样品。
Figure BDA0000419939730000221
实施例2：经由量子点细胞穿透肽缀合物的植物原位活体成像
经由DHLA帽化的QD和QD-CPP缀合物的活体成像
如先前美国临时专利No.61/319764和Chen等,2007所描述的那样将由细胞穿透肽(CPP)和黄色荧光蛋白(YFP)组成的融合蛋白生成并分离。将各种细胞穿透肽在pET280细菌表达载体内的独特NcoI–SpeI限制性位点处在YFP编码序列上游亚克隆。诱导蛋白质的表达，并将它们分离并纯化，如记载于美国临时专利No.61/319764和Chen等,2007的。表3中列出了CPP-YFP融合的序列。
表3：细胞穿透肽和黄色荧光蛋白融合的核苷酸序列
Figure BDA0000419939730000231
Figure BDA0000419939730000261
使用热配位性溶剂混合物中的有机金属前体的逐步反应遵循先前描述的规程合成DHLA帽化的、具有以620nm为中心的发射最大值的QD。参见Aron等,2006;Lu等,2007;Doyon等,2006;Collins等,2003;及Lanio等,2000。如先前描述的，通过用双官能性配体交换天然的帽化壳(其主要由三辛基膦(TOP)和三辛基氧膦(TOPO)组成)使纳米晶体成为亲水的。参见Lie等,2002;Mani等,2006;Desjarlais and Berg,1993。使用两组亲水性QD：(1)用二氢硫辛酸帽化的纳米晶体和(2)用9:1配体摩尔比的附加有聚乙二醇(Mw约600)的二氢硫辛酸(DHLA-PEG)和以生物素为末端的DHLA聚乙二醇(Mw约400)(DHLA-PEG-生物素)的混合物帽化的纳米晶体。所得的QD分别称为DHLA-QD和DHLA-PEG-生物素-QD。
在上文描述的CPP分子(γ-ZEIN、MPG和R9)外，使用先前描述的方案(Aron等,2006)将两个额外的分子PEP1和TAT(表4)与DHLA帽化的QD装配在一起。将如上文描述的合适摩尔比的QD-CPP缀合物添加至10mM Tris-ClpH8.0缓冲液中的0.3μM510-620nm发射的DHLA帽化的QD，并于室温温育30分钟。使用凝胶电泳表征缀合物，其中观察到与CPP装配在一起的QD的电泳迁移率变化。将样品在1X TBE缓冲液(0.09M Tris,0.002M Na2-EDTA,0.09M硼酸,pH8.3)中稀释，并在1%或2%琼脂糖凝胶上运行。通过观察复合物的荧光监测改变每个QD的CPP分子数目的效果。通过激发QD和/或蛋白质，并观察凝胶内分开的荧光条带的图像产生凝胶图像。另外，通过监测自身装配后QD和CPP之间的能量转移的变化确认缀合物形成。
表4：合成肽的氨基酸序列和分子量
植物细胞内量子点-CPP缀合物的摄取和亚细胞定位
将QD生物缀合物用完全培养基稀释，并添加至拟南芥簇细胞培养物，即具有完整壁的JTNT1烟草和胡萝卜(美国临时专利No.61/319764)单细胞培养物。将溶液以40-150μg/ml于37℃温育1-4小时。将以每个QD为50个CPP分子的由1:5或1:10QD/CPP比组成的混合的QD缀合物与细胞培养物一起温育。通过用1X PBS或细胞培养基将培养物清洗至少三次除去过量的未结合的QD缀合物。然后，将细胞于室温温育30分钟，并用PBS清洗两次。
使用Leica共焦显微镜实施落射荧光图像收集。使用装备有565nm二向性滤光器的双重检查系统收集并定量并排分开荧光图像。对于620nm QD，对QD-CPP复合物成像。于488nm激发细胞成像样品，并将发射用565nm二向性滤光器收集/分开并解卷积。于λ<620nm收集QD荧光，并于λ>537nm收集YFP荧光尾部(若CPP融合标签在没有QD的情况下单独使用)。扣除对QD窗的YFP泄漏作为解卷积的一部分。于488nm激发单独的620nm QD，并将其相应的发射用565nm二向性滤光器分开并解卷积。使用氙(Xe)灯激发DAPI和Calcuofluor荧光，并使用DAPI立方体(D350/50X(用于激发),二色性400DCLP,D460/50m(用于检测))收集发射。使用Xe灯激发AF647-TF，并使用Cy5立方体(激发HQ620/60X,二色性Q660LP,发射HQ700/75m)检测荧光。激发/检测立方体两者由Chroma Technology(Bellows Falls,VT)提供。使用明亮的光源收集微差干涉对比(DIC)图像。
如此，用LSM710Zeiss共焦显微镜成像观察到含有不同细胞穿透肽的官能化QD追踪拟南芥、胡萝卜和JTNT1烟草细胞的单一有壁细胞中的定位。QD具有较高的对代谢降解的抗性和较高的对光漂白的抗性。将与CPP，诸如R9、MPG、γ-玉米醇溶蛋白、PEP1和TAT复合的QD胺与拟南芥、胡萝卜和JTNT1的单细胞一起温育30分钟，并将细胞用培养基清洗，并使用LSM710Zeiss共焦显微镜成像。装配有Axio Observer Z1倒置显微镜的Zeiss LSM710共焦扫描仪以激发波长使用，用于3小时摄取实验，并使用561nm的激发波长，用于5小时摄取实验。
结果指示具有完整壁的活的拟南芥、JTNT1烟草和胡萝卜悬浮细胞没有显示λ=620nm的荧光。然而，在将QD620导入细胞中时，观察到QD对植物细胞的内在化。在Calcofluor(细胞壁染料)和QD620荧光范围的蓝色和红色发射中拍摄的通道图像分别显示了蓝色荧光(指示细胞壁的存在)或红色荧光，指示核的存在，其中QD620由于核中的靶向而定位。所有图像的覆盖图显示了内在化的QD在细胞质和核中浓缩。
证明缀合有CPP的QD620对拟南芥、JTNT1和胡萝卜悬浮细胞的核中的靶向。通过用核染料DAPI对核复染色确认核的靶向。DAPI是一种在活植物细胞中相当经常使用的重要核染料。此染料是由紫外光激发的荧光染料，其在与核中的DNA结合时显示蓝色荧光。尽管Calcofluor发射范围在蓝色中，但是它仅对壁是特异性的。QD620CPP缀合物的图像和经DAPI染色的图像的覆盖图显示核中QD-MPG缀合物的共定位。
内在化的与MPG、R9、γ-玉米醇溶蛋白、PEP1和TAT CPP缀合的QD620具有表征的表面电荷数值，并且在9.5466-10.1586mv的范围中测量其zeta电势值。缀合物大小的流体力学数值在122-342nm的范围中。在将这些颗粒缀合物与拟南芥、JTNT1烟草和胡萝卜悬浮细胞一起温育时，缀合物被内在化到完整细胞中，并在核中定位，指示与仅用单独的QD620胺缀合物处理(其中主要在细胞质中且偶尔在核中看到颗粒)形成对比，QD缀合物在活细胞中的核靶向。用与细胞穿透肽(MPG、TAT、PEP1、R9和γ-玉米醇溶蛋白)复合的量子点观察到对拟南芥、JTNT1烟草和胡萝卜细胞的核中的移位。
本实施例例示了有细胞穿透肽标签的QD作为荧光颗粒载体用于活细胞追踪研究的用途。QD发挥稳定信标的功能。
实施例3：经由聚苯乙烯细胞穿透肽缀合物的植物原位活体成像
完成与CPP融合的聚苯乙烯纳米颗粒的投递和细胞定位。将复合的聚苯乙烯/CPP纳米颗粒移位到活植物细胞中，并靶向至特定的细胞区室。
在JTNT1烟草单细胞中用细胞穿透肽TAT标记聚苯乙烯纳米颗粒的内在化。
Tat肽与羧基化FluoSphere的缀合
在具有和没有部分TAT细胞穿透肽的情况中测试FluoSphere荧光聚苯乙烯纳米颗粒(20nm直径)对有壁的JTNT1烟草单细胞中的摄取的评估。
FluoSphere(Invitrogen,Carlsbad,CA)获自4℃贮存，并通过添加1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDCL)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)制备。将所得的混合物温育1小时以容许EDCL与FluoSphere起反应。将TAT细胞穿透肽(具有经ter-叔丁醇保护的羧基端)与FluoSphere复合。将TAT–FluoSphere复合物于室温温育过夜以形成复合物。使用50,000分子量截留限制的Amicon,Ultra-4离心过滤单元纯化复合物。将保留的TAT-FluoSphere复合物转移至干净小瓶。将TAT–FluoSphere复合物于4℃贮存，直到实验需要。
在JTNT1烟草悬浮细胞中用TAT-Fluosphere和未缀合的Fluospheres进行 的细胞摄取研究
将JTNT1单细胞悬浮液在NT1B培养基中制备，调节至含有3%甘油。将20μl刚刚超声处理且涡旋振荡的Tat-FluoSphere和未复合的FluoSphere添加至JTNT1细胞，并温育30、60或120分钟。通过以700rpm将管离心5分钟分离JTNT1单细胞。将上清液除去，并使用2mL各份NT1B将细胞漂洗两次。将清洗的JTNT1细胞在1mL含有甘油的NT1B培养基中重悬，并将一些细胞移液到不同玻璃载玻片上，并使用在明视场模式中且含有过滤立方体组以记录580nm的荧光发射的竖立荧光显微镜显现。使用显微镜来捕获已经用TAT-FluoSphere复合物处理的JTNT1细胞的图像。ImageJ软件用于展示并覆盖(堆叠)明视场和荧光图像以易于测定JTNT1烟草细胞内FluoSphere的位置。
用TAT-FluoSphere复合物对JTNT1烟草细胞处理120分钟导致TAT-FluoSphere复合物的内在化及对细胞核的靶向。30分钟处理没有导致TAT-FluoSphere复合物的显著细胞摄取。注意到，一些TAT-FluoSphere复合物与JTNT1甘油单细胞壁有关。TAT-FluoSphere复合物的60分钟处理导致JTNT1单细胞内一些复合物的内在化。在细胞外周附近观察到大量观察到的TAT-FluoSphere复合物，然而，少数复合物极其接近JTNT1烟草细胞核出现。在处理120分钟后，相当大量的TAT-FluoSphere复合物在JTNT1烟草细胞内被摄取，并且被靶向至这些细胞的核。
在拟南芥悬浮细胞中用TAT、MPG和γ-玉米醇溶蛋白细胞穿透肽(CPPS)标记聚苯乙烯纳米颗粒的内在化。
细胞穿透肽与羧基化的FluoSphere的缀合和对拟南芥悬浮细胞中的细胞 摄取。
标记不同类型的CPP以使用共焦显微术评估纳米颗粒穿过细胞壁和细胞膜摄取到活拟南芥悬浮细胞的细胞质和核中。将FluoSpheres与细胞穿透肽(TAT、MPG和λ-玉米醇溶蛋白)复合，如上文描述的。将所得的CPP-FluoSphere复合物与0.1mL拟南芥聚集体细胞悬浮液混合，并于室温在黑暗中温育3小时(第一项实验)或5小时(第二项实验)。将细胞悬浮液离心，并除去上清液。将细胞在新鲜的培养基中重悬。将一滴重悬的细胞悬浮液移液到玻璃盖玻片上，并使用真空油脂来形成细胞悬浮液微滴的周边，之后将第二玻璃盖玻片置于细胞悬浮液上方以形成两个盖玻片间细胞三明治物。使用共焦显微镜(装备有Axio Observer Z1倒置显微镜的Zeiss LSM710共焦扫描仪，所述AxioObserver Z1倒置显微镜具有激发波长514nm(对于3小时摄取实验)和561nm(对于5小时摄取实验)来对暴露于CPP-FluoSphere复合物后3小时和5小时的拟南芥聚集体细胞成像。
拟南芥聚集体细胞在通过共焦显微镜上的激光以561nm和514nm激发时没有展现出明显的自身荧光。然而，拟南芥原生质体在此波长展现出一些自身荧光。细胞的背景自身荧光没有干扰CPP-FluoSphere复合物摄取实验的成像。
对用CPP-FluoSphere缀合物暴露后5小时的拟南芥原生质体成像，然后用Calcofluor染料复染。原生质体内在化CPP–FluoSphere缀合物，即使原生质体在再生细胞壁物质。细胞测定为活的，如通过在共焦显微术下观察时的活性原生质体链证明的。另外，观察到单细胞在细胞核中摄取TAT细胞穿透肽FluoSphere复合物。观察到用指示的γ-玉米醇溶蛋白细胞穿透肽FluoSphere缀合物暴露后5小时后的拟南芥聚集体细胞在细胞核内含有FluoSphere。这些图像指示γ-玉米醇溶蛋白细胞穿透肽介导的FluoSphere对细胞核中的转运。
暴露于未修饰的FluoSphere后6小时观察到且用Calcofluor复染色的拟南芥原生质体没有内在化到拟南芥原生质体中，并且没有转运到细胞核中。观察结果注意到塌缩的和死亡的原生质体与未修饰的FluoSphere的关联。如此，证明了未修饰的FluoSphere没有移位到活的拟南芥原生质体的细胞中。然而，塌缩细胞或死亡细胞内在化未修饰的FluoSphere。此观察结果指示在细胞的膜完整性受损时，未修饰的FluoSphere受到内在化，但是未修饰的FluoSphere没有内在化到拥有完整细胞壁和细胞膜的活细胞中。
这些例子显示了CPP融合标签提供了对细胞的有效投递和靶向。此外，根据使用的CPP类型，可以特异性靶向核。这些CPP–Fluosphere缀合物的使用可以促进细胞不透性大分子的摄取。虽然使用此办法容许使用较少的QD或聚苯乙烯NP进行细胞标记，但是它仍依赖于细胞的内吞能力，因为标记在于4℃温育的细胞或与抑制剂诸如渥曼青霉素(Wortmannin)一起温育的细胞中是消除的。
作为新颖探针用于拟南芥植物细胞中的亚细胞区室的体内成像的经 PAMAM-TRITC标记的树枝状聚合物(dendrimer)缀合物
可以用于量化完整的有壁的活细胞中的胞吞的基于纳米颗粒的信标可以容许牵涉植物体内胞吞的细胞器的成像。此外，在不使染料褪色或漂白的情况下实现此成像。最终，可以用此类基于纳米颗粒的信标实现活植物细胞中颗粒或货物投递的追踪。
本实施例呈现了用经PAMAM树枝状聚合物-TRITC标记的颗粒进行的活植物细胞中内吞区室的成像。使用这些颗粒用于活体成像，代替苯乙烯基染料，诸如FM4-64，其已知用于植物液泡运输和胞吞研究。已知它们随时间过程从一个区室移动到另一个，如此提供对活植物细胞内的内吞区室成像的有效手段。然而，有可能使用经荧光标记的PAMAM树枝状聚合物颗粒来显示内吞行为，并且可以将生物分子作为树枝状聚合物上的货物加标签或拴系在一起以研究活植物细胞中的运输(与仅对泡囊染色的苯乙烯基染料不一样)。渥曼青霉素处理在此研究中抑制胞吞，证明了PAMAM树枝状聚合物颗粒包被内体小泡，并可以在小泡追踪研究中用作信标。证明了经PAMAM树枝状聚合物-TRITC标记的颗粒用于追踪胞吞的用途，并且通过使用渥曼青霉素导致对胞吞的抑制。如此，提供了颗粒作为活细胞成像中的信标用于植物细胞中的小泡追踪研究的新作用的例子。
TRITC标记和PAMAM树枝状聚合物
依照Pasupathy等,2008标记经TRITC标记的PAMAM树枝状聚合物。将经TRITC标记的PAMAM树枝状聚合物添加至0.5ml来自7天龄培养物的拟南芥悬浮细胞等分试样。另外，将Calcofluor染料添加至混合物，5分钟后进行成像。将植物培养物与TRITC-树枝状聚合物复合物一起温育30分钟，然后，立即在共焦显微镜下检查它们。对于几个对照样品，将25μL 10μM渥曼青霉素(MP Biomedicals,Solon,OH)添加至培养物，30分钟后添加TRITC-树枝状聚合物复合物。然后，将样品再温育30分钟。使用LSM710共焦显微镜遵循上文描述的方案对活细胞和簇成像。不与树枝状聚合物一起温育的对照细胞在经由共焦显微术观察时没有产生背景。
共焦激光扫描显微术(CLSM)
为了观察处理细胞中TRITC-PAMAM复合物的细胞关联以及为了在相应温育时间持续时间情况下观察未处理对照，将细胞用培养基或PBS缓冲液(pH7.4)漂洗两次，并添加Calcofluor以将细胞壁染色5分钟，然后立即在共焦显微镜下检查。通过具有600-620nm氩激光的CLSM(Carl Zeiss LSM-710,Germany)观察细胞以对活细胞成像。在这里，在单一平面中并且还以z-截面观察到TRITC-PAMAM的胞内分布。
来自渥曼青霉素未处理细胞的结果显示了用经TRITC标记的PAMAM树枝状聚合物染色细胞和内体的膜。经TRITC标记的PAMAM树枝状聚合物转运到内体中。有可能经由共焦激光扫描显微镜追踪细胞内体内移位通过完整细胞壁的PAMAM树枝状聚合物。PAMAM树枝状聚合物经由胞吞过程移位到细胞中。在存在渥曼青霉素的情况中，经TRITC标记的PAMAM树枝状聚合物在细胞膜中定位。由于胞吞过程受到抑制，PAMAM树枝状聚合物-CPP复合物没有移位到拟南芥细胞的胞质溶胶中。
虽然本发明已经在某些实施方案中进行了描述，但是可以在本公开内容的精神和范围内进一步修饰本发明。因此，本申请意图覆盖本发明使用其一般原理的任何变型、用途、或改编。此外，本申请意图覆盖诸如在本发明所属领域中的已知或习惯实践内且落入所附权利要求书的限定内的本公开内容的偏离及其等同方案。
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Claims (20)

1.一种将感兴趣的分子导入具有细胞壁的植物细胞中以实现植物和种子的稳定转化的方法，该方法包括：
提供所述具有细胞壁的植物细胞；
使量子点(QD)与一种或多种细胞穿透肽(CPP)相互作用以形成QD-肽缀合物；
将一种或多种感兴趣的分子附接于所述一种或多种CPP以形成活化的QD-肽缀合物；
将所述具有细胞壁的细胞和所述活化的QD-肽缀合物置于彼此接触中；并
容许将所述QD-肽缀合物和所述感兴趣的分子摄取到所述具有细胞壁的细胞中。
2.依照权利要求1的方法，其中使QD与一种或多种CPP接触包括将所述一种或多种CPP装配到所述QD的表面上。
3.依照权利要求1的方法，其中将一种或多种感兴趣的分子附接于所述一种或多种CPP包括所述感兴趣分子的带负电荷的基团与所述CPP的末端的带电荷的氨基基团相互作用。
4.依照权利要求1的方法，其进一步包括容许将所述QD-肽缀合物摄取到所述包含细胞壁的植物细胞的区室中。
5.依照权利要求4的方法，其中所述区室选自下组：胞质溶胶、细胞核、液泡形成体、质体、黄化质体、色质体、白色体、油质体、蛋白质体、造粉体、叶绿体、和双层膜的腔。
6.依照权利要求1的方法，其中所述包含细胞壁的植物细胞选自下组：烟草、胡萝卜、玉米、芸苔(canola)、油菜籽(rapeseed)、棉花、棕榈、花生、大豆、稻属物种(Oryza sp.)、拟南芥属物种(Arabidopsis sp.)、蓖麻属物种(Ricinus sp.)、和甘蔗细胞。
7.依照权利要求1的方法，其中所述植物细胞来自选自下组的组织：胚、分生组织、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、花、种子、荚果和茎。
8.依照权利要求1的方法，其中所述一种或多种CPP由选自R9、MPG、TAT、γ-玉米醇溶蛋白和MPG肽的组组成。
9.依照权利要求1的方法，其中所述感兴趣的分子包括选自下组的组分：核酸、DNA、RNA、RNAi分子、基因、质粒、粘粒、YAC、BAC、多肽、酶、激素、糖肽、糖、脂肪、信号传导肽、抗体、维生素、信使、第二信使、氨基酸、cAMP、药物、除草剂、杀真菌剂、抗生素、及其组合。
10.依照权利要求9的方法，其中所述感兴趣的分子包括基因。
11.依照权利要求10的方法，其中所述基因是外来蛋白质基因、农学基因、或标志物基因。
12.依照权利要求9的方法，其进一步包括选择已稳定整合所述感兴趣分子的细胞。
13.依照权利要求12的方法，其中所述选定的细胞是可再生细胞。
14.依照权利要求13的方法，其进一步包括自所述可再生细胞再生植物。
15.一种稳定表达基因的方法，该方法包括：
提供具有细胞壁的植物细胞；
使量子点(QD)与一种或多种细胞穿透肽(CPP)相互作用以形成QD-肽缀合物；
将一种或多种基因附接于所述一种或多种CPP以形成活化的QD-肽缀合物；
将所述具有细胞壁的细胞和所述活化的QD-肽缀合物置于彼此接触中；并
容许将所述QD-肽缀合物和所述一种或多种基因摄取到所述具有细胞壁的细胞中；并
在具有所述植物细胞的植物的后代中表达所述基因。
16.依照权利要求15的方法，其中在叶绿体中表达所述基因。
17.依照权利要求15的方法，其进一步包括选择稳定表达所述基因的细胞。
18.一种用于将分子物质转移入植物细胞中的方法，其包括：
使量子点(QD)与一种或多种细胞穿透肽(CPP)相互作用以形成QD-肽缀合物；
使所述QD-肽缀合物与质粒DNA相互作用以形成活化的QD-肽缀合物结构；并
使所述活化的QD-肽缀合物结构与携带完整壁的植物细胞在允许所述一种或多种CPP和来自所述质粒DNA的所述一种或多种基因摄取入所述植物细胞中的条件下接触。
19.权利要求18的方法，其进一步包括在具有所述植物细胞的植物的后代中稳定表达所述基因。
20.一种筛选并鉴定植物转化的方法，其包括：
提供具有细胞壁的植物细胞；
使量子点(QD)与一种或多种细胞穿透肽(CPP)相互作用以形成QD-肽缀合物；
将一种或多种感兴趣的分子附接于所述一种或多种CPP以形成活化的QD-肽缀合物；
将所述具有细胞壁的细胞和所述活化的QD-肽缀合物置于彼此接触中；
容许将所述QD-肽缀合物和所述感兴趣的分子摄取到所述具有细胞壁的细胞中；并
对所述具有细胞壁的植物细胞成像。
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