BR112013024220B1 - Métodos de introdução de um ácido nucleico de interesse em uma célula vegetal com parede celular, de expressão estável de um gene e de transferência de um gene para uma célula vegetal - Google Patents

Abstract

conjugados de ponto quântico e peptídio veículo adequados para aplicações de formação de imagens e distribuição em plantas. apresentam-se métodos para a introdução de uma molécula de interesse em uma célula vegetal com uma parede celular mediante uso de um conjugado qd-peptídio com um ponto quântico (qd) com um ou mais peptídios de penetração celular (cpps). apresentam-se métodos para a modificação genética ou outra de plantas e para o tratamento ou prevenção de doenças em células vegetais compreendendo uma parede celular.

Description

REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE

[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Norte-americana Provisória N° de Série 61/466.804, depositado em 23 de março de 2011.

CAMPO TÉCNICO

[0002] A presente exposição refere-se, genericamente, a métodos para a introdução de uma molécula de interesse em uma célula vegetal com parede celular mediante uso de um conjugado QD-peptídio com um ponto quântico (QD) com um ou mais peptídios de penetração celular (CPPs).

ANTECEDENTES

[0003] Nanopartículas têm propriedades únicas que foram exploradas para uso na distribuição de DNA a células. Nanopartículas metálicas, como nanopartículas de (Au) têm sido usadas para distribuição de DNA por causa de sua baixa citotoxicidade e facilidade de funcionalização com vários ligantes de significado biológico. Além de nanopartículas metálicas, nanopartículas semicondutoras (por exemplo, pontos quânticos) ("QD") dentro da faixa de tamanho de 3 - 5 nm também foram usadas como veículos para distribuir moléculas a células. DNA e proteínas podem ser ligadas ao ligante fixado à superfície do QD (veja, por exemplo, F. Patolsky e outros, J. Am. Chem. Soc. 125, 13918 (2003)).

[0004] Nanopartículas têm sido usadas para distribuir DNA plasmidial a uma variedade de células animais. Descobriu-se que, quando nanopartículas revestidas com DNA são incubadas com células sem uma parede celular, as células captam as nanopartículas e começam a expressar quaisquer genes codificados no DNA. Entretanto, a atual distribuição de genes vegetais é desafiadora devido à presença de paredes na célula vegetal, o que leva à dependência comum de meios de distribuição invasivos para a transformação de plantas. Quando se deseja uma distribuição mediada por nanopartículas a células normalmente com uma parede celular, a parede da célula é removida antes da adição das partículas aos protoplastos da planta (veja F. Torney e outros, Nature Nanotechnol. 2 (2007)). Em células vegetais, a parede celular se apresenta como uma barreira à distribuição de moléculas aplicadas de maneira exógena. Muitos métodos invasivos, como pistola de gene (biolística), microinjeção, eletroporação e Agrobacterium, foram empregados para se conseguir a distribuição de genes e pequenas moléculas a essas células vegetais com parede, mas a distribuição de proteínas só foi conseguida por microinjeção. A distribuição de moléculas pequenas e proteínas na presença de uma parede de célula vegetal continua inexplorada e seria vantajosa para desenvolver tecnologias que permitissem sua implementação em células/tecidos ou órgãos vegetais para manipulações in vitro e in vivo.

[0005] Peptídios de penetração celular (CPPs) são uma classe nova e de rápido crescimento de peptídios curtos que sabidamente desempenham um importante papel na translocação de uma ampla gama de complexos de carga, incluindo proteínas e DNA, através das biomembranas em linhagens celulares de mamíferos e humanas. J. Schwartz e S. Zhang (2000), Peptide-Mediated Cellular Delivery, Curr. Opin. Mol. Ther. 2:162-167; Ü. Langel (2002), Preface in Cell Penetrating Peptides; Processes and Applications, Ü. Langel, editor, CRC Press, Boca Raton; E. Vives e B. Lebleu (2002), The Tat-Derived Cell-Penetrating Peptide in Cell-Penetrating Peptides; Processes and Applications, Ü. Langel, editor, CRC Press, Boca Raton, pp. 3-22. Embora se tenha demonstrado que CPPs facilitem a distribuição de carga em células de mamíferos, o uso de CPP em células vegetais para estudos de transfecção foi limitado por inúmeros fatores. Um grande obstáculo à adaptação dessa tecnologia a plantas é que, diferentemente de células animais, as células vegetais apresentam um sistema de barreira dupla (parede celular e membrana plasmática) para a internalização de CPPs e suas cargas. Consequentemente, CPPs têm de superar essas duas barreiras para uma translocação eficiente. CPPs foram usadas em células vegetais, mas tipicamente se baseiam no uso de agentes e técnicas de permeabilização com o uso de CPPs para efetuar a distribuição de carga às células vegetais. O domínio de transdução da proteína TAT de HIV-1 (PTD) é um dos peptídios de translocação melhor estudados. Relatos recentes demonstraram o potencial de TAT-PTD e seus oligômeros para distribuição de plasmídios por formação de um complexo com o DNA negativamente carregado em células de mamíferos. I. Ignatovich, E. Dizhe, A. Pavlotskaya, B. Akifiev, S. Burov, S. Orlov e A. Perevozchikov (2003), Complexes of Plasmid DNA with Basic Domain 47-57 of the HIV-1 Tat Protein Are Transferred to Mammalian Cells by Endocytosis-mediated Pathways, J. Biol. Chem. 278:42625-42636; C. Rudolph, C. Plank, J. Lausier, U. Schillinger, R.H. Müller e J. Rosenecker (2003), Oligomers of the Arginine-Rich Motif of the HIV-1 TAT Protein are Capable of Transferring Plasmid DNA into Cells, J. Biol. Chem. 278:11411-11418; Z. Siprashvili, F. Scholl, S. Oliver, A. Adams, C. Contag, P. Wender e P. Khavari (2003), Gene Transfer via Reversible Plasmid Condensation with Cysteine-Flanked, Internally Spaced Arginine-Rich Peptides, Hum. Gene. Ther. 14 (13):1225-33; I. Hellgren, J. Gorman e C. Sylvén (2004), Factors Controlling the Efficiency of Tat-mediated Plasmid DNA Transfer, J. Drug. Target. 12 (1):39-47. Outros peptídios que mostraram ter propriedades de translocação incluem pVEC, transportan, penetratina, peptídios pep-1 e seus fragmentos.

[0006] O revestimento de QDs com peptídios é uma abordagem que se tornou popular na manipulação da superfície de nanopartículas para vários processos biotecnológicos. Por exemplo, a fixação de peptídios de penetração celular, como poliarginina e peptídios derivados de TAT, à superfície do QD permitiu a translocação de QDs em células animais. Recentemente, CPPs se tornaram amplamente usadas como veículos para a distribuição celular de moléculas em pesquisa biomédica básica e aplicada. Quando seu auxílio, agora é possível introduzir substâncias impermeáveis na membrana, como ácidos nucleicos pépticos (PNA), proteínas, oligonucleotídeos ou nanopartículas em células de mamíferos. Há uma atração crescente de biólogos de plantas pelo uso de CPPs para a distribuição de biomoléculas a células e sua expressão transitória. Assim, ainda há necessidade de um método de incorporação estável de genes e outras moléculas de interesse em plantas mediante o uso de distribuição à base de nanopartículas.

DESCRIÇÃO

[0007] As seguintes modalidades são descritas em conjunto com sistemas, ferramentas e métodos que devem ser exemplificativos e ilustrativos e não limitativos do âmbito.

[0008] Uma modalidade da invenção inclui um método de introdução de uma molécula de interesse em uma célula vegetal com parece celular para efetuar transformação estável de uma planta e sementes. O método inclui o fornecimento da célula vegetal com parede celular e a interação de um ponto quântico (QD) com um ou mais peptídios de penetração celular (CPPs) para formar um conjugado QD- peptídio, e a fixação de uma ou mais moléculas de interesse a um ou mais CPPs para formar um conjugado QD-peptídio ativado. A célula e o conjugado QD-peptídio ativado são postos em contato entre si, sob condições que permitam sua captação pela célula com a parede celular.

[0009] Outra modalidade da invenção inclui um método de expressão estável de um gene. O método inclui o fornecimento de uma célula vegetal com parede celular, a interação de um ponto quântico (QD) com um ou mais peptídios de penetração celular (CPPs) para formar um conjugado QD-peptídio, e a fixação de um ou mais genes aos um ou mais CPPs para formar um conjugado QD-peptídio ativado. A célula vegetal com parede celular e o conjugado QD-peptídio ativado são postos em contato entre si, e o conjugado QD-peptídio e os um ou mais genes são postos sob condições que permitam sua captação pela célula vegetal com parede celular. O gene na descendência de uma planta com a célula vegetal é, então, expressado.

[00010] Ainda outra modalidade da invenção inclui um método para a transferência de uma substância molecular para uma célula vegetal. O método inclui a interação de um ponto quântico (QD) com um ou mais peptídios de penetração celular (CPPs) para formar um conjugado QD- peptídio, e a interação do conjugado QD-peptídio com um DNA plasmidial para formar uma estrutura de conjugado QD-peptídio ativado. A estrutura de conjugado QD-peptídio ativado é posta em contato com uma célula vegetal portadora de parede intacta sob condições que permitam a captação dos um ou mais CPPs e um ou mais genes do DNA plasmidial pela célula vegetal.

[00011] Outra modalidade particular da invenção inclui um método de triagem e identificação de transformação da planta. O método inclui o fornecimento de uma célula vegetal com parede celular, a interação de um ponto quântico (QD) com um ou mais peptídios de penetração celular (CPPs) para formar um conjugado QD-peptídio, e a fixação de uma ou mais moléculas de interesse a um ou mais CPPs para formar um conjugado QD-peptídio ativado. A célula com uma parede celular e o conjugado QD-peptídio ativado são postos em contato entre si, e o conjugado QD-peptídio e a molécula de interesse são postos sob condições que permitam sua captação pela célula vegetal com parede celular. Forma-se, então, uma imagem da célula vegetal com a parede celular.

[00012] Além dos aspectos e modalidades exemplificativos acima descritos, aspectos e modalidades adicionais ficarão claros em vista das descrições a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00013] A FIG. 1 ilustra uma modalidade de um conjugado ponto quântico/peptídio.

[00014] A FIG. 2 ilustra um mapa do plasmídio pDAB3831.

MODO(S) PARA REALIZAR A INVENÇÃO

[00015] Na descrição e tabelas que se seguem, são usados inúmeros termos. Para proporcionar um entendimento claro e consistente do relatório e reivindicações, incluindo o âmbito a ser dado a esses termos, as seguintes definições são fornecidas:

[00016] Retrocruzamento. Retrocruzamento pode ser um processo em que um reprodutor cruza repetidamente a descendência híbrida com um dos ascendentes, por exemplo, um híbrido de primeira geração F1 com um dos genótipos ascendentes do híbrido F1.

[00017] Embrião. O embrião pode ser a pequena planta contida na semente madura.

[00018] Resistente a um herbicida. A resistência a uma dosagem de um herbicida se refere à capacidade de uma planta sobreviver (isto é, a planta pode não ser morta) a essa dosagem de herbicida. Em alguns casos, plantas tolerantes podem amarelecer temporariamente ou, de outra forma, exibir alguma lesão induzida por herbicida (por exemplo, perfilhamento excessivo e/ou inibição do crescimento), mas se recuperam.

[00019] Estabilizado. Estabilizado se refere a características de uma planta que são passadas de maneira reproduzível de uma geração para a geração seguinte de plantas endogâmicas da mesma variedade.

[00020] Captação. Captação se refere à translocação de uma partícula, como ponto quânticos, peptídios veículos, peptídios de penetração celular, e peptídios guiados, através de uma parede celular ou uma membrana celular, em que a translocação não ocorre apenas como resultado do momento conferido à partícula por algo diferente da célula na qual a partícula está sendo captada. Exemplos não limitativos de dispositivos ou métodos que causam translocação de uma partícula através de uma parede celular ou uma membrana celular apenas como resultado do momento conferido às partículas são tecnologias biolísticas, de pistola de genes, de microinjeção e/ou impalefecção.

[00021] Em algumas modalidades da invenção, múltiplos sítios de fixação ou o acréscimo de uma molécula "adicional" ou "hóspede"podem ser manipulados em um ou mais peptídios em vários e/ou múltiplos sítios. Essa propriedade pode ser empregada, por exemplo, na seleção e edição específicas de sítios moleculares dentro de células para áreas como biomimética, distribuições direcionadas, para opções de organismos não modificados geneticamente e opções em várias colheitas de árvores ou legumes para opções de traços e resistência a doenças. Modalidades da invenção também podem ser empregadas para desenvolver biossensores adequados. Além disso, cromossomos artificiais (ACES) podem ser empregados com os métodos da invenção como uma alternativa aos atuais vetores eucarióticos para opções de direcionamento preciso e recombinação homóloga.

[00022] Modalidades particulares da invenção se referem genericamente ao uso de nanopartículas fluorescentes multifuncionais adequadas para a distribuição de moléculas negativamente carrregadas como, por exemplo, DNA/RNA. Peptídios veículos e de penetração celular (CPPs)/peptídios guiados (HPs) (aqui coletivamente chamados de "CPPs"), como R9, TAT, MPG e Y-Zeína, foram incorporados na superfície de pontos quânticos luminescentes (QDs). Conjugados QD- peptídio foram usados para uma distribuição eficiente de DNA em vias in planta de Arabidopsis. Bioconjugados QD-peptídio não exibiram nenhum efeito tóxico com relação ao crescimento de eixos florais de Arabidopsis e conjunto de sementes. Vários transformantes T1 estáveis foram identificados, e as mudas foram analisadas. A distribuição à base de veículo de DNA e o estabelecimento de transformação estável usando QDs foram demonstrados em plantas. Cargas complexas podem ser manipuladas com opções inteligentes para distribuir biomoléculas que são direcionadas para as células e compartimentos celulares com precisão. Em modalidades particulares, o uso desses QDs autofluorescentes pode ser feito para opções de formação de imagens em plantas.

[00023] De acordo com certas modalidades da invenção, pode-se fornecer um método de introdução de uma molécula de interesse em uma célula vegetal com parece celular para efetuar transformação estável de uma planta e sementes. O método inclui o fornecimento da célula vegetal com parede celular e a interação de um ponto quântico (QD) com um ou mais peptídios de penetração celular (CPPs) para formar um conjugado QD-peptídio, e a fixação de uma ou mais moléculas de interesse a um ou mais CPPs para formar um conjugado QD-peptídio ativado. A célula e o conjugado QD-peptídio ativado são postos em contato entre si, sob condições que permitam sua captação pela célula com a parede celular.

[00024] Em algumas modalidades, vários peptídios foram covalentemente acoplados a nanopartículas QD e distribuídos a células vegetais. Nanopartículas com R9, Y-Zeína e MPG CPPs foram distribuídas com sucesso a plantas para se obter uma transformação estável de plantas. Em outras modalidades, foram usadas biomoléculas marcadas para rastrear o destino da carga no citoplasma. Uma captação eficaz desses conjugados QD-peptídio-DNA foi conseguida, e o complexo entre o DNA e o conjugado QD-peptídio era estável, conforme demonstrado pela transformação estável que é transmitida mediante sementes e mudas T1 resistentes recuperadas.

[00025] Em outros aspectos, a invenção se refere à aplicação de conjugados QD-Peptídio "veículo"como uma carga para opções de multifuncionalização para a distribuição inteligente de biomoléculas biofuncionalizadas (por exemplo, DNA/RNA e distribuição de enzimas), formação de imagens e para vários diagnósticos biotecnológicos e funções de leitura. A presente estratégia pode oferecer uma química de superfície e encapsulação que seja muito adaptável, facilitando, assim, a síntese de uma ampla gama de moléculas com diferentes funcionalidades. As propriedades chave em termos de uso potencial desses materiais na distribuição de biomoléculas e genes são definidas pela alta densidade de grupos terminais disponíveis nesses sistemas. Eles contribuem para as características superficiais das moléculas, oferecem múltiplos sítios de fixação (por exemplo, para conjugação de frações de sinal ou direcionamento) e determinam o volume molecular, que é importante para a capacidade de sequestrar outras moléculas para esse complexo. Os peptídios veículos conjugados funcionam simultaneamente para a distribuição tanto do QD, quanto da carga fixada. Além disso, com a formação de um complexo da carga diretamente com o peptídio veículo, os compromissos no número de espécies fixadas na superfície do QD podem ser eliminados. Como oligonucleotídeos negativamente carregados não são capazes de translocar as barreiras de parede/membrana celular e a membrana celular por si mesmos, a presente invenção apresenta, entre outros, sistemas de distribuição eficazes para integração de DNA, regulação de genes e estratégias de edição.

[00026] De acordo com modalidades da presente invenção, uma célula vegetal com parede celular pode ser qualquer célula vegetal compreendendo uma parede celular intacta e inteira. Exemplos de células com uma parede celular incluem, mas não estão limitadas a, algas, tabaco, cenoura, milho, canola, colza, algodão, palma, amendoim, soja, cana-de-açúcar, Oryza sp., Arabidopsis sp. e Ricinus sp., de preferência tabaco, cenouras, milho, algodão, canola, soja e cana-de-açúcar; mais preferivelmente tabaco e cenouras. Modalidades da invenção podem incluir células compreendendo uma parede celular de qualquer tecido ou onde quer que sejam encontradas, incluindo, mas não limitados a, em embriões, células meristemáticas, calo, pólen, folhas, anteras, raízes, pontas da raiz, flores, sementes, vagens, caules e cultura de tecido.

[00027] Em modalidades da invenção, a molécula de interesse pode ser qualquer molécula que possa ser distribuída a uma célula vegetal de acordo com a presente invenção. Moléculas de interesse, ou componentes de moléculas de interesse, podem compreender, mas não se limitam a, ácidos nucleicos, DNA, RNA, moléculas de RNAi, genes, plasmídios, cosmídios, YACs, BACs, Cromossomos Artificiais de Plantas, Minicromossomos de Plantas, DNA de Loci de Traços Manipulados em Plantas; polipeptídios, enzimas, hormônios, glico- peptídios, açúcares, gorduras, peptídios de sinalização, anticorpos, vitaminas, mensageiros, mensageiros secundários, aminoácidos, cAMP, fármacos, herbicidas, fungicidas, antibióticos e/ou suas combinações.

[00028] Modalidades da invenção incluem métodos para a prevenção ou tratamento de doença. Modalidades exemplificativas não limitativas incluem a distribuição de fungicidas, antibióticos e/ou outros fármacos a células necessitadas usando métodos da presente invenção.

[00029] Em aspectos da invenção, o conjugado QD-peptídio pode ser captado em várias partes das células. Exemplos de localizações em que o conjugado QD-peptídio pode ser captado incluem, mas não estão limitados a, citosol, núcleo, tonoplastos, plastídios, etioplastos, cromoplastos, leucoplastos, elaioplastos, proteinoplastos, amiloplastos, cloroplastos e o lúmen de uma membrana dupla. Em outras modalidades da invenção, o conjugado QD-peptídio pode ser captado por uma célula compreendendo uma parede celular mediante a via simplástica ou apoplástica.

[00030] Modalidades adicionais da invenção incluem células vegetais geneticamente modificadas e métodos para sua geração, em que as células vegetais têm um ou mais ácidos nucleicos introduzidos mediante métodos da presente invenção. Em um exemplo de uma modalidade, um plasmídio compreendendo um gene de interesse e um marcador selecionável podem ser introduzidos em uma célula vegetal com parede celular mediante um conjugado QD-peptídio de acordo com a presente invenção. Em modalidades adicionais, podem-se selecionar transformantes estáveis que tenham integrado de maneira estável o gene de interesse e/ou o marcador selecionável. Em modalidades alternativas, uma célula vegetal agora compreendendo o gene de interesse pode ser propagada para produzir outras células compreendendo uma molécula de interesse. Em outras modalidades, células vegetais agora compreendendo uma molécula de interesse podem ser uma célula regenerável que pode ser usada para regenerar uma planta inteira que inclua a molécula de interesse.

[00031] Em outro aspecto, a presente invenção apresenta métodos de criação de células vegetais regeneráveis compreendendo uma molécula de interesse para uso em cultura de tecido. A cultura de tecido será, de preferência, capaz de regenerar plantas com substancialmente o mesmo genótipo que as células regeneráveis. As células regeneráveis nessas culturas de tecido podem ser embriões, protoplastos, células meristemáticas, calo, pólen, folhas, anteras, raízes, pontas da raiz, flores, sementes, vagens ou caules. Além disso, uma modalidade da invenção apresenta plantas regeneradas a partir das culturas de tecido da invenção.

[00032] Alternativamente, a presente invenção apresenta um método de introdução de um traço desejado em uma célula vegetal com parede celular, em que o método compreende: a colocação de um conjugado QD-peptídio e uma molécula de interesse capaz de conferir o traço desejado à célula vegetal em contato com a célula, permitindo-se a captação do conjugado QD-peptídio através da parede celular. Exemplos de traços desejados incluem, mas não estão limitados a, traços selecionados de esterilidade masculina, resistência a herbicidas, resistência a insetos e resistência a doenças bacterianas, doenças fúngicas e/ou doenças virais.

[00033] Aspectos adicionais da invenção proporcionam métodos de geração de linhagens de plantas estabilizadas compreendendo um traço desejado ou molécula de interesse, em que o traço desejado ou molécula de interesse pode ser primeiro introduzido por captação de um conjugado QD-peptídio através de uma parede celular de planta. Métodos de geração de linhagens de plantas estabilizadas são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e podem incluir técnicas como, mas não limitadas a, reprodução assexuada, retrocruzamentos, produção de híbridos, cruzamentos com populações e outros. Todas as plantas e células vegetais compreendendo um traço desejado ou molécula de interesse primeiro introduzida na célula vegetal (ou seus predecessores) por captação de um conjugado QD-peptídio através de uma parede celular estão dentro do âmbito desta invenção. Vantajosamente, as células vegetais compreendendo um traço desejado ou molécula de interesse primeiro introduzida na planta ou célula (ou seus predecessores) por captação de um conjugado QD- peptídio através de uma parede celular podem ser usadas em cruzamentos com outras, ou diferentes, células vegetais para produzir células híbridas de primeira geração (F1), sementes e/ou plantas com características superiores.

[00034] Em modalidades em que a molécula de interesse compreende um ou mais genes, o(s) gene(s) pode(m) ser um alelo dominante ou recessivo. A título de exemplo, o(s) gene(s) conferirá(ão) traços como resistência a herbicidas, resistência a insetos, resistência a bactérias, resistência a fungos, resistência a doenças virais, fertilidade masculina, esterilidade masculina, qualidade nutricional aumentada e uso industrial.

[00035] Com o advento de técnicas de biologia molecular que permitiram o isolamento e caracterização de genes que codificam produtos de proteína ou RNA específicos (por exemplo, RNAi), os cientistas no campo da biologia de plantas desenvolveram um forte interesse na manipulação do genoma de células para conterem e expressarem genes estranhos ou versões adicionais ou modificadas de genes nativos ou endógenos (talvez acionados por diferentes promotors) para alterar os traços de uma célula de maneira específica. Esses genes estranhos adicionais e/ou modificados são aqui chamados coletivamente de "transgenes." Nos últimos quinze ou vinte anos, vários métodos para a produção de células transgênicas foram desenvolvidos e, em modalidades particulares, a presente invenção se refere a versões transformadas de células e métodos para sua produção mediante introdução em uma célula com uma parede celular de um transgene pela captação de um conjugado QD-peptídio através de uma parede celular. Em modalidades da invenção, o transgene pode estar contido em um vetor de expressão.

[00036] A transformação celular pode envolver a construção de um vetor de expressão que funcione em uma célula particular. Esse vetor pode compreender o DNA que inclui um gene sob o controle de, ou operacionalmente ligado a, um elemento regulador (por exemplo, um promotor). O vetor de expressão pode conter uma ou mais dessas combinações gene operacionalmente ligado/elemento regulador. O(s) vetor(es) pode(m) estar na forma de um plasmídio e pode(m) ser usado(s) isoladamente ou em combinação com outros plasmídios para fornecer células transformadas usando métodos de transformação conforme aqui descritos para incorporar um transgene(s) no material genético de uma célula vegetal compreendendo uma parede celular.

[00037] O uso de conjugados QD-peptídio de acordo com métodos da presente invenção produziu plantas transformadas de maneira estável e demonstrou a expressão do gene herbicida transformado de maneira estável com o fenótipo em que elevada tolerância a herbicida foi conferida à planta T1 transgênica. Essa planta se mostrou fértil, pois produziu sementes T2.

[00038] Vetores de Expressão Para Captação mediante conjugado QD-peptídio: Genes Marcadores

[00039] Vetores de expressão podem incluir pelo menos um marcador genético, operacionalmente ligado a um elemento regulador (um promotor, por exemplo) que permita que células transformadas contendo o marcador sejam recuperadas por seleção negativa (isto é, inibição do crescimento de células que não contenham o gene marcador selecionável) ou por seleção positiva (isto é, triagem do produto codificado pelo marcador genético). Muitos genes marcadores selecionáveis para transformação são bem conhecidos nas técnicas de transformação e incluem, por exemplo, genes que codificam enzimas que detoxificam metabolicamente um agente químico seletivo que pode ser um antibiótico ou um herbicida, ou genes que codificam um alvo alterado que pode ser insensível ao inibidor. Também são conhecidos alguns métodos de seleção positiva na técnica.

[00040] Um gene marcador selecionável comumente usado adequado para transformação de plantas pode incluir o gene da neomicina fosfotransferase II (nptII) sob o controle de sinais reguladores de plantas, que confere resistência a canamicina. Veja, por exemplo, Fraley e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:4803 (1983). Outro gene marcador selecionável comumente usado pode ser o gene da higromicina fosfotransferase, que confere resistência ao antibiótico higromicina. Veja, por exemplo, Vanden Elzen e outros, Plant Mol. Biol. 5:299 (1985).

[00041] Genes marcadores selecionáveis adicionais de origem bacteriana que conferem resistência a antibióticos incluem gentamicina acetil transferase, estreptomicina fosfotransferase, aminoglicosida-3‘- adenil transferase e o determinante de resistência a bleomicina. Veja Hayford e outros, Plant Physiol. 86:1216 (1988); Jones e outros, Mol. Gen. Genet. 210:86 (1987); Svab e outros, Plant Mol. Biol. 14:197 (1990); Hille e outros, Plant Mol. Biol. 7:171 (1986). Outros genes marcadores selecionáveis conferem resistência a herbicidas, como glifosato, glufosinato ou bromoxinil. Veja Comai e outros, Nature 317:741-744 (1985); Gordon-Kamm e outros, Plant Cell 2:603-618 (1990); e Stalker e outros, Science 242:419-423 (1988).

[00042] Outros genes marcadores selecionáveis adequados para transformação de plantas não são de origem bacteriana. Esses genes incluem, por exemplo, di-hidrofolato redutase de camundongo, 5- enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintetase de planta e acetolactato sintetase de planta. Veja Eichholtz e outros, Somatic Cell Mol. Genet. 13:67 (1987); Shah e outros, Science 233:478 (1986); Charest e outros, Plant Cell Rep. 8:643 (1990).

[00043] Outra classe de genes marcadores adequados para transformação de plantas requer a triagem de células vegetais presumivelmente transformadas, em vez da seleção genética direta de células transformadas quanto a resistência a uma substância tóxica, como um antibiótico. Esses genes são particularmente úteis para quantificar ou visualizar o padrão espacial de expressão de um gene em tecidos específicos e são frequentemente chamados de genes repórteres, porque podem ser fusionados a um gene ou sequência reguladora de gene para a investigação da expressão do gene. Genes para triagem de células transformadas comumente usados incluem β- glucuronidase (GUS), β-galactosidase, luciferase e cloranfenicol acetiltransferase. Veja R.A. Jefferson, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387 (1987); Teeri e outros, EMBO J. 8:343 (1989); Koncz e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:131 (1987), DeBlock e outros, EMBO J. 3:1681 (1984).

[00044] Recentemente, métodos in vivo para visualização da atividade da GUS que não requerem a destruição de tecido da planta se tornaram disponíveis. Molecular Probes publicação 2908, Imagene Green®, p. 1-4(1993) e Naleway e outros, J. Cell Biol. 115:151a (1991). Entretanto, esses métodos in vivo para visualização da atividade da GUS não se mostraram úteis para a recuperação de células transformadas por causa da baixa sensibilidade, fundos altamente fluorescentes e limitações associadas ao uso de genes da luciferase como marcadores selecionáveis.

[00045] Mais recentemente, genes que codificam Proteínas Fluorescentes (por exemplo, GFP, EGFP, EBFP, ECFP, e YFP) foram utilizados como marcadores para a expressão de gene em células procarióticas e eucarióticas. Veja Chalfie e outros, Science 263:802 (1994). Proteínas fluorescentes e mutações de proteínas fluorescentes podem ser usadas como marcadores de triagem.

[00046] Vetores de Expressão Para Captação Mediante Conjugados QD-peptídio: Promotores

[00047] Os genes incluídos em vetores de expressão têm de ser acionados por uma sequência nucleotídica compreendendo um elemento regulador, por exemplo, um promotor. Vários tipos de promotores são atualmente bem conhecidos nas técnicas de transformação, assim como outros elementos reguladores que podem ser usados isoladamente ou em combinação com promotores.

[00048] Conforme aqui usado, "promotor" inclui a referência a uma região do DNA que pode estar a montante do início de transcrição e que pode estar envolvida no reconhecimento e ligação de RNA polimerase e outras proteínas para iniciar a transcrição. Um "promotor de planta" pode ser um promotor capaz de iniciar a transcrição em células vegetais. Exemplos de promotores sob controle do desenvolvimento incluem promotores que iniciam preferencialmente a transcrição em certos tecidos, como folhas, raízes, sementes, fibras, vasos do xilema, traqueídes ou esclerênquima. Esses promotores são chamados de "preferido pelo tecido". Promotores que só iniciam a transcrição em certos tecidos são chamados de "específicos para tecido". Um promotor específico para um "tipo celular" aciona principalmente a expressão em certos tipos de célula em um ou mais órgãos, por exemplo, células vasculares em raízes ou folhas. Um promotor "induzível"pode ser um promotor que possa estar sob controle ambiental. Exemplos de condições ambientais que podem afetar a transcrição por promotores induzíveis incluem condições anaeróbicas ou a presença de luz. Promotores específicos para tecido, preferido pelo tecido, específico para tipo celular e induzíveis constituem a classe de promotores "não constitutivos". Um promotor "constitutivo" pode ser um promotor que possa ser ativado sob a maioria das condições ambientais.

A. Promotores Induzíveis

[00049] Um promotor induzível pode estar operacionalmente ligado a um gene para expressão em uma célula. Opcionalmente, o promotor induzível pode estar operacionalmente ligado a uma sequência nucleotídica que codifique uma sequência de sinal que pode estar operacionalmente ligada a um gene para expressão em uma célula. Com um promotor induzível, a taxa de transcrição aumenta em resposta a um agente indutor.

[00050] Qualquer promotor induzível pode ser usado na presente invenção. Veja Ward e outros, Plant Mol. Biol. 22:361-366 (1993). Promotores induzíveis exemplificativos incluem, mas não estão limitados a: aqueles do sistema ACEI que responde a cobre (Mett e outros, PNAS 90:4567-4571 (1993)); gene In2 do milho que responde a agentes protetores de herbicida de benzenossulfonamida (Hershey e outros, Mol. Gen. Genetics 227:229-237 (1991); e Gatz e outros, Mol. Gen. Genetics 243:32-38 (1994)); e repressor Tet de Tn10 (Gatz e outros, Mol. Gen. Genetics 227:229-237 (1991)). Um promotor induzível particularmente útil pode ser um promotor que responda a um agente indutor ao qual as plantas normalmente não respondam. Um promotor induzível exemplificativo pode ser o promotor induzível de um gene de hormônio esteroide, cuja atividade transcricional pode ser induzida por um hormônio glucocorticoesteroide. Schena e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:0421 (1991).

B. Promotores Constitutivos

[00051] Um promotor constitutivo pode estar operacionalmente ligado a um gene para expressão em uma célula ou o promotor constitutivo pode estar operacionalmente ligado a uma sequência nucleotídica que codifique uma sequência de sinal que pode estar operacionalmente ligada a um gene para expressão em uma célula.

[00052] Diferentes promotores constitutivos podem ser utilizados na presente invenção. Promotores constitutivos exemplificativos incluem, mas não estão limitados a: promotores de vírus de plantas, como o promotor 35S de CaMV (Odell e outros, Nature 313:810-812 (1985)); promotores dos genes da actina do arroz (McElroy e outros, Plant Cell 2:163-171 (1990)); ubiquitina (Christensen e outros, Plant Mol. Biol. 12:619-632 (1989) e Christensen e outros, Plant Mol. Biol. 18:675-689 (1992)); pEMU (Last e outros, Theor. Appl. Genet. 81:581-588 (1991)); MAS (Velten e outros, EMBO J. 3:2723-2730 (1984)); e histona H3 do milho (Lepetit e outros, Mol. Gen. Genetics 231:276-285 (1992) e Atanassova e outros, Plant Journal 2 (3): 291-300 (1992)). O promotor ALS, fragmento Xba1/NcoI 5‘ com relação ao gene estrutural ALS3 de Brassica napus (ou uma sequência nucleotídica similar ao dito fragmento Xba1/NcoI), representa um promotor constitutivo particularmente útil. Veja o pedido PCT WO 96/30530.

C. Promotores Específicos Para Tecido ou Preferidos Pelo Tecido

[00053] Um promotor específico para tecido pode estar operacionalmente ligado a um gene para expressão em uma célula. Opcionalmente, o promotor específico para tecido pode estar operacionalmente ligado a uma sequência nucleotídica que codifique uma sequência de sinal que pode estar operacionalmente ligada a um gene para expressão em uma célula. Plantas transformadas com um gene de interesse operacionalmente ligado a um promotor específico para tecido podem produzir o produto de proteína do transgene exclusivamente, ou de preferência, em um tecido específico.

[00054] Qualquer promotor específico para tecido ou preferido pelo tecido pode ser utilizado na presente invenção. Promotores específicos para tecido ou preferidos pelo tecido exemplificativos incluem, mas não estão limitados a, um promotor preferido pela raiz, como o do gene da faseolina (Murai e outros, Science 23:476-482 (1983) e Sengupta- Gopalan e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3320-3324 (1985)); um promotor específico para folha e induzido pela luz, como o de cab ou rubisco (Simpson e outros, EMBO J. 4(11):2723-2729 (1985) e Timko e outros, Nature 318:579-582 (1985)); um promotor específico para antera, como o de LAT52 (Twell e outros, Mol. Gen. Genetics 217:240245 (1989)); um promotor específico para pólen, como o de Zm13 (Guerrero e outros, Mol. Gen. Genetics 244:161-168 (1993)) ou um promotor específico para microsporo, como o de apg (Twell e outros, Sex. Plant Reprod. 6:217-224 (1993)).

[00055] O transporte da proteína produzida por transgenes para um compartimento subcelular, como o cloroplasto, vacúolo, peroxissomo, glioxissomo, parede celular ou mitocôndria, ou para secreção no apoplasto, pode ser realizado por meio da ligação operacional da sequência nucleotídica que codifica uma sequência de sinal à região 5‘ e/ou 3‘ de um gene que codifica a proteína de interesse. Sequências de direcionamento na extremidade 5‘ e/ou 3‘ do gene estrutural podem determinar, durante a síntese e processamento da proteína, onde a proteína codificada pode ser por fim compartimentalizada. Alternativamente, essas proteínas direcionadas a compartimento subcelular podem ser ligadas diretamente a um conjugado QD-peptídio para direcionar o conjugado QD-peptídio revestido com a molécula de interesse para o compartimento subcelular desejado.

[00056] A presença de uma sequência de sinal direciona um polipeptídio para uma organela intracelular ou compartimento subcelular, ou para secreção no apoplasto. São conhecidas muitas sequências de sinal na técnica. Veja, por exemplo, Becker e outros, Plant Mol. Biol. 20:49 (1992); P.S. Close, Master’s Thesis, Iowa State University (1993); C. Knox e outros, "Structure and Organization of Two Divergent Alpha-Amylase Genes from Barley," Plant Mol. Biol. 9:3-17 (1987); Lerner e outros, Plant Physiol. 91:124-129 (1989); Fontes e outros, Plant Cell 3:483-496 (1991); Matsuoka e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. 88:834 (1991); Gould e outros, J. Cell. Biol. 108:1657 (1989); Creissen e outros, Plant J. 2:129 (1991); Kalderon, e outros, A short amino acid sequence able to specify nuclear location, Cell 39:499-509 (1984); Steifel, e outros, Expression of a maize cell wall hydroxyprolinerich glycoprotein gene in early leaf e root vascular differentiation, Plant Cell 2:785-793 (1990).

Genes de Proteínas Estranhas e Genes Agronômicos

[00057] Com plantas transgênicas de acordo com a presente invenção, uma proteína estranha pode ser produzida em quantidades comerciais. Assim, técnicas para a seleção e propagação de plantas transformadas, que são bem entendidas na técnica, fornecem uma pluralidade de plantas transgênicas que são colhidas de maneira convencional, e uma proteína estranha pode ser, então, extraída de um tecido de interesse ou da biomassa total. A extração da proteína da biomassa da planta pode ser realizada por métodos conhecidos, que são discutidos, por exemplo, por Heney e Orr, Anal. Biochem. 114:92-6 (1981).

[00058] Em aspectos da invenção, a planta transgênica apresentada para produção comercial de proteína estranha pode ser uma célula ou uma planta. Em outros aspectos, a biomassa de interesse pode ser uma semente. Para o número relativamente pequeno de plantas transgênicas que mostrem níveis de expressão mais elevados, pode-se gerar um mapa genético principalmente mediante análise RFLP, PCR e SSR convencional, que identifica a localização cromossômica aproximada da molécula de DNA integrada. Para metodologias exemplificativas com relação a isso, veja Glick e Thompson, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology CRC Press, Boca Raton 269:284 (1993). A informação do mapa referente à localização cromossômica pode ser útil para a proteção de direitos sobre a planta transgênica em questão. Se uma propagação não autorizada puder ser realizada, e cruzamentos forem feitos com outro germoplasma, o mapa da região de integração pode ser comparado com mapas similares para plantas suspeitas para determinar se estas últimas têm uma ascendência comum com a planta em questão. Comparações de mapas envolveriam hibridizações, RFLP, PCR, SSR e sequenciamento, todas técnicas convencionais.

[00059] Da mesma forma, genes agronômicos podem ser expressados em células transformadas ou sua descendência. Mais particularmente, as plantas podem ser geneticamente manipuladas mediante os métodos da invenção para expressar vários fenótipos de interesse agronômico. Genes exemplificativos que podem ser usados com relação a isso incluem, mas não estão limitados a, aqueles categorizados abaixo.

1. Genes Que Conferem Resistência a Pragas ou Doenças e que Codificam:

[00060] A) Genes de resistência a doenças de plantas. As defesas da planta são frequentemente ativadas por interação específica entre o produto de um gene de resistência a doença (R) na planta e o produto de um gene de avirulência correspondente (Avr) no patógeno. Uma variedade de planta pode ser transformada com genes de resistência clonados para manipular plantas que sejam resistentes a cepas de patógenos específicas. Veja, por exemplo, Jones e outros, Science 266:789 (1994) (clonagem do gene Cf-9 de tomate para resistência a Cladosporium fulvum); Martin e outros, Science 262:1432 (1993) (o gene Pto do tomate para resistência a Pseudomonas syringae pv. tomato codifica uma proteína quinase); Mindrinos e outros, Cell 78:1089 (1994) (Arabidopsis pode ser o gene RSP2 para resistência a Pseudomonas syringae).

[00061] B) Um gene que confira resistência a uma praga, como nematódeo do cisto da soja. Veja, por exemplo, Pedido PCT WO 96/30517; Pedido PCT WO 93/19181.

[00062] C) Uma proteína de Bacillus thuringiensis, seu derivado ou um polipeptídio sintético modelado a partir dela. Veja, por exemplo, Geiser e outros, Gene 48:109 (1986), que a apresenta a clonagem e sequência nucleotídica de um gene da δ-endotoxina de Bt. Além disso, moléculas de DNA que codificam genes de δ-endotoxina podem ser adquiridos na Coleção Americana de Cultura de Tipo, Manassas, Va., por exemplo, sob os N° de Acesso ATCC 40098, 67136, 31995 e 31998.

[00063] D) Uma lectina. Veja, por exemplo, a exposição de Van Damme e outros, Plant Molec. Biol. 24:25 (1994), que apresenta as sequências nucleotídicas de vários genes de lectina de ligação a manose de Clivia miniata.

[00064] E) Uma proteína de ligação a vitamina, como avidina. Veja o pedido PCT US93/06487. O pedido ensina o uso de avidina e homólogos de avidina como larvicidas contra pragas de insetos.

[00065] F) Um inibidor de enzima, por exemplo, um inibidor de protease ou proteinase ou um inibidor de amilase. Veja, por exemplo, Abe e outros, J. Biol. Chem. 262:16793 (1987) (sequência nucleotídica do inibidor da cisteína proteinase do arroz), Huub e outros, Plant Molec. Biol. 21:985 (1993) (sequência nucleotídica do cDNA que codifica o inibidor I da proteinase do tabaco), Sumitani e outros, Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243 (1993) (sequência nucleotídica do inibidor de alfa- amila de Streptomyces nitrosporeus) e patente norte-americana n° 5.494.813 (Hepher e Atkinson, expedida em 27 de fevereiro de 1996).

[00066] G) Um hormônio específico para inseto ou feromônio, como um ecdiesteroide ou hormônio juvenil, sua variante, um mimético baseado nele ou seu antagonista ou agonista. Veja, por exemplo, a exposição de Hammock e outros, Nature 344:458 (1990), da expressão em baculovírus de esterase de hormônio juvenil clonado, um inativador de hormônio juvenil.

[00067] H) Um peptídio ou neuropeptídio específico para inseto que, com a expressão, rompa a fisiologia da praga afetada. Por exemplo, veja as exposições de Regan, J. Biol. Chem. 269:9 (1994) (a clonagem de expressão fornece DNA que codifica o receptor de hormônio diurético de inseto), e Pratt e outros, Biochem. Biophys. Res. Comm. 163:1243 (1989) (uma alostatina pode ser identificada em Diploptera puntata). Veja também a patente norte-americana n° 5.266.317, de Tomalski e outros, que apresenta genes que codificam neurotoxinas paralíticas específicas para insetos.

[00068] I) Um veneno específico para inseto produzido na natureza por uma cobra, uma vespa ou qualquer outro organismo. Por exemplo, veja Pang e outros, Gene 116:165 (1992), para exposição da expressão heteróloga em plantas de um gene que codifica um peptídio insetotóxico de escorpião.

[00069] J) Uma enzima responsável pela hiperacumulação de um monoterpeno, um sesquiterpeno, um esteroide, ácido hidroxâmico, um derivado fenilpropanoide ou outra molécula não proteica com atividade inseticida.

[00070] K) Uma enzima envolvida na modificação, incluindo a modificação pós-tradução, de uma molécula biologicamente ativa; por exemplo, uma enzima glicolítica, uma enzima proteolítica, uma enzima lipolítica, uma nuclease, uma ciclase, uma transaminase, uma esterase, uma hidrolase, uma fosfatase, uma quinase, uma fosforilase, uma polimerase, uma elastase, uma quitinase e uma glucanase, natural ou sintética. Veja o pedido PCT WO 93/02197 em nome de Scott e outros, que apresenta a sequência nucleotídica de um gene de calase. Moléculas de DNA que contenham sequências codificadoras de quitinase podem ser obtidas, por exemplo, na ATCC sob os N°s de Acesso 39637 e 67152. Veja também Kramer e outros, Insect Biochem. Molec. Biol. 23:691 (1993), que ensinam a sequência nucleotídica de um cDNA que codifica a quitinase da lagarta do tabaco, e Kawalleck e outros, Plant Molec. Biol. 21:673 (1993), que apresentam a sequência nucleotídica do gene de ubi4-2 poliubiquitina da salsinha.

[00071] L) Uma molécula que estimule a transdução de sinal. Por exemplo, veja a exposição de Botella e outros, Plant Molec. Biol. 24:757 (1994), de sequências nucleotídicas para clones de cDNA da calmodulina de feijão-mungo, e Griess e outros, Plant Physiol. 104:1467 (1994), que apresentam a sequência nucleotídica de um clone de cDNA da calmodulina do milho.

[00072] M) Um A peptídio de momento hidrofóbico. Veja o pedido PCT WO 95/16776 (exposição de derivados peptídicos de Taquiplesina, que inibe patógenos fúngicos de plantas) e o pedido PCT WO 95/18855 (ensina peptídios antimicrobianos sintéticos que conferem resistência a doenças).

[00073] N) Uma permease de membrana, um formador de canal ou um bloqueador de canal. Por exemplo, veja a exposição de Jaynes e outros, Plant Sci. 89:43 (1993), da expressão heteróloga de um análogo do peptídio cecropin-β lítico para tornar plantas de tabaco transgênicas resistentes a Pseudomonas solanacearum.

[00074] O) Uma proteína invasiva viral ou uma toxina complexa derivada dela. Por exemplo, a acumulação de proteínas de revestimento viral em células vegetais transformadas confere resistência a infeções virais e/ou ao desenvolvimento da doença provocada pelo vírus do qual o gene da proteína de revestimento pode ser derivado, assim como por vírus relacionados. Veja Beachy e outros, Ann. Rev. Phytopathol. 28:451 (1990). A resistência mediada por proteína de revestimento foi conferida a plantas transformadas contra o vírus do mosaico da alfalfa, vírus do mosaico do pepino, vírus da necrose branca do tabaco, vírus X da batata, vírus Y da batata, vírus do listrado do tabaco, vírus "rattle" do tabaco e vírus do mosaico do tabaco. Id.

[00075] P) Um anticorpo específico para inseto ou uma imunotoxina derivada dele. Assim, um anticorpo direcionado para uma função metabólica crítica no intestino do inseto inativaria uma enzima afetada, matando o inseto. Cf. Taylor e outros, Abstract n° 497, Seventh Int’l Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions (Edinburgo, Escócia) (1994) (inativação enzimática em tabaco transgênico mediante produção de fragmentos de anticorpos de cadeia simples).

[00076] Q) Um anticorpo específico para vírus. Veja, por exemplo, Tavladoraki e outros, Nature 366:469 (1993), que mostram que plantas transgênicas que expressam genes de anticorpos recombinantes são protegidas contra ataques de vírus.

[00077] R) Uma proteína que interrompa o desenvolvimento produzida na natureza por um patógeno ou um parasita. Por exemplo, endo α-1,4-D-poligalacturonases fúngicas facilitam a colonização fúngica e a liberação de nutrientes da planta por solubilização da homo- α -1,4-D-galacturonase da parede celular da planta. Veja Lamb e outros, Bio/Technology 10:1436 (1992). A clonagem e caracterização de um gene que codificam uma proteína inibidora de endopoligalacturonase de feijão podem ser descrita por Toubart e outros, Plant J. 2:367 (1992).

[00078] S) Uma proteína que interrompa o desenvolvido produzida na natureza por uma planta. Por exemplo, Logemann e outros, Bio/Technology 10:305 (1992), demonstraram que plantas transgênicas que expressam o gene inativador do ribossomo de cevada têm uma resistência aumentada a doenças fúngicas.

2. Genes Que Conferem Resistência a um Herbicida:

[00079] A) Um herbicida que inibe o ponto de crescimento ou meristema, como uma imidazolinona, sulfonamida ou a sulfonilureia. Genes exemplificativos nessa categoria codificam a enzima ALS e AHAS mutante, conforme descrito, por exemplo, por Lee e outros, EMBO J. 7:1241 (1988), e Miki e outros, Theor. Appl. Genet. 80:449 (1990), respectivamente.

[00080] B) Genes de glifosato (resistência conferida, por exemplo, por 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintetase mutante (EPSPs)) (mediante a introdução de ácidos nucleicos recombinantes e/ou várias formas de mutagênese in vivo de genes de EPSPs nativos), genes de aroA e genes glifosato acetil transferase (GAT), respectivamente), outros compostos fosfono como genes de glufosinato (fosfinotricina acetil transferase (PAT) de espécies de Streptomyces species, incluindo Streptomyces hygroscopicus e Streptomyces viridichromogenes), e ácidos piridinóxi ou fenóxi propiônicos e cicloexonas (genes que codificam inibidor de ACCase). Veja, por exemplo, a patente norte- americana n° 4.940.835 de Shah, e outros, e a patente norte-americana n° 6.248.876 de Barry e outros, que apresentam sequências nucleotídicas de formas de EPSPs que podem resistência a glifosato a uma planta. Uma molécula de DNA que codifica um gene de aroA mutante pode ser obtido sob o número de acesso ATCC 39256, e a sequência nucleotídica do gene mutante pode ser apresentada na patente norte-americana n° 4.769.061 de Comai. O pedido de patente europeia n° 0 333 033 de Kumada e outros, e a patente norte-americana n° 4.975.374 de Goodman e outros, apresentam sequências nucleotídicas de genes de glutamina sintetase que conferem resistência a herbicidas como L-fosfinotricina. A sequência nucleotídica de um gene de PAT podem ser apresentada no pedido de patente europeia n° 0 242 246 de Leemans e outros DeGreef e outros, Bio/Technology 7:61 (1989), descrevem a produção de plantas transgênicas que expressam genes bar quiméricos que codificam a atividade de PAT. Exemplos de genes que conferem resistência a ácidos fenóxi propiônicos e cicloexonas, como setoxidim e haloxifop, incluem os genes de Acc1-S1, Acc1-S2 e Acc1-S3 descritos por Marshall e outros, Theor. Appl. Genet. 83:435 (1992). Genes de GAT capazes de conferir resistência a glifosato são descritos no WO 2005012515 de Castle e outros Genes que conferem resistência aos herbicidas 2,4-D, ácido fenoxipropiônico e piridilóxi auxina são descritos no WO 2005107437 cedido a Dow AgroSciences LLC.

[00081] C) Um herbicida que inibe a fotossíntese, como uma triazina (genes psbA e gs+) ou uma benzonitrila (gene de nitrilase). Przibila e outros, Plant Cell 3:169 (1991), descrevem a transformação de Chlamydomonas com plasmídios que codificam genes psbA mutantes. Sequências nucleotídicas para genes de nitrilase são apresentados na patente norte-americana n° 4.810.648 de Stalker, e moléculas de DNA contendo esses genes estão disponíveis sob os N° de Acesso ATCC 53435, 67441 e 67442. A clonagem e expressão do DNA que codifica uma glutationa S-transferase podem ser descritas por Hayes e outros, Biochem. J. 285:173 (1992).

3. Genes que Conferem ou Contribuem Para um Traço de Valor Adicionado, como:

[00082] A) Metabolismo de ácido graxo modificado, por exemplo, por transformação de uma planta com um gene antissentido de estearil-ACP dessaturase para aumentar o teor de ácido esteárico da planta. Veja Knultzon e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:2624 (1992).

[00083] B) Teor de fitato diminuído: 1) A introdução de um gene codificador de fitase aumentaria a degradação de fitato, acrescentando mais fosfato livre à planta transformada. Por exemplo, veja Van Hartingsveldt e outros, Gene 127:87 (1993), para uma exposição da sequência nucleotídica de um gene de fitase de Aspergillus niger. 2) Pode-se introduzir um gene que reduza o teor de fitato. No milho, por exemplo, isso poderia ser realizado por clonagem e, então, reintrodução de DNA associado ao alelo único que pode ser responsável por mutantes de milho caracterizados por baixos níveis de ácido fítico. Veja Raboy e outros, Maydica 35:383 (1990).

[00084] C) Composição de carboidratos modificada efetuada, por exemplo, por transformação de plantas com um gene que codifica uma enzima que altera o padrão de ramificação do amido. Veja Shiroza e outros, J. Bacteol. 170:810 (1988) (sequência nucleotídica do gene da frutosiltransferase de Streptococcus mutants), Steinmetz e outros, Mol. Gen. Genet. 20:220 (1985) (sequência nucleotídica de Bacillus subtilis pode ser o gene da levansacarase), Pen e outros, Bio/Technology 10:292 (1992) (a produção de plantas transgênicas que expressam Bacillus lichenifonn pode ser α-amilase), Elliot e outros, Plant Molec. Biol. 21:515 (1993) (sequências nucleotídicas de genes da invertase do tomato), Sogaard e outros, J. Biol. Chem. 268:22480 (1993) (a mutagênese direcionada a sítio pode ser do gene da α-amilase da cevada), e Fisher e outros, Plant Physiol. 102:1045 (1993) (enzima II de ramificação do amido de endosperma do milho).

EXEMPLOS

[00085] A presente invenção é adicionalmente descrita nos exemplos a seguir, que são oferecidos a título de ilustração e não pretendem limitar a invenção de forma alguma.

EXEMPLO 1 Síntese de Peptídios

[00086] As seguintes sequências de Peptídio de Penetração Celular (CPP); R9 (Futaki e outros, 2001, Suzuki, e outros, 2002), MPG (Morris, 1997 e Morris, 1999), e Y-ZEÍNA (Kogan e outros, 2001 e 2002) são relacionadas na Tabela 1. Esses peptídios foram sintetizados pela American Peptide Company (Sunnyvale, CA) como amidas C-terminais. A integridade das amostras foi testadas usando-se um Espectrofotômetro de massa com protocolos reconhecidos na técnica. Tabela 1: Sequências de Aminoácidos e Massas Moleculares dos Peptídios Sintetizados

Preparação de Conjugados de Ponto Quântico-Peptídio

[00087] Foram produzidos conjugados de ponto quântico (QD) e CPP. Pontos quânticos funcionalizados com amina, adquiridos na EvidentTech (Troy, NY), foram ativados por adição de aproximadamente 1 mg de sulfo-SMCC a 200 μL de pontos quânticos com amina (QD514; n = 2,3 nmoles) em 200 μL de fosfato de sódio a 50 mM, pH 7,4. Os CPPs foram independentemente misturados com o ponto quântico ativado com maleimida em tampão de conjugação (1 mM de EDTA, 0,1 M de fosfato, 0,15 M de NaCl, pH 7,2) e incubados a 4°C durante uma noite. Após a conjugação, os conjugados QD-CPP foram centrifugados a 90.000 rpm durante 3 horas, e a pelota foi dissolvida em uma solução de PBS (Salina Tamponada com Fosfato). Foram preparados conjugados QD-CPP com uma razão molar de QD para CPP de 1:100 até 1:300.

[00088] Distribuição de DNA Mediada por Peptídio de Penetração Celular em Carga de QD

[00089] Formou-se um complexo de DNA plasmidial, pDAB3831 (Figura 1), com o conjugado QD-CPP. Antes da formação do complexo de DNA com o conjugado QD-CPP, o DNA plasmidial foi desnaturado e deixado reanelar. Isso foi completado por diluição do DNA a um volume final de 10 μL em água livre de DNase. A solução foi desnaturada por aquecimento da solução a 70°C durante 5 minutos e, então, deixando- se a solução resfriar lentamente até a temperatura ambiente. Formouse, então, um complexo do DNA como o conjugado QD-CPP a concentrações finais de 1:100 de CPP-DNA para QD. A formação de complexo QD-CPP-DNA foi realizada durante 1 hora a 37°C. Finalmente, adicionou-se sacarose a 3% estéril até um volume final de 10 mL ser atingido. A solução de complexo QD-CPP-DNA foi usada para transformar os botões de flores de Arabidopsis thaliana.

Transformação de Arabidopsis thaliana com Complexo QD-CPP-DNA Material de planta para transformação in planta

[00090] A germinação sincronizada de sementes é importante para assegurar a uniformidade do desenvolvimento floral nas plantas T0. As sementes de Arabidopsis thaliana cv. Columbia foram postas em suspensão em solução de ágar a 0,1% e incubadas a 4°C durante 48 horas para completar a estratificação. 60 mg de sementes foram pesados e transferidos para um tubo de 15 mL. 13 mL de solução de ágar a 0,1% foram adicionados e se remoinhou até que as sementes estivessem uniformemente dispersadas. Isso cria uma concentração de 4,6 mg de sementes/ 1 mL de solução (ou cerca de 230 sementes / mL). 6 tubos (72 mL de solução) foram preparados para semear 4 bandejas que continham 18 vasos (8,89 cm (3-1/2 polegadas)) em cada bandeja. As sementes foram incubadas a 4°C durante 48 horas para completar a estratificação. Cada vaso foi semeado individualmente a 1,0 mL de sementes estratificadas por vaso. Quando todos os vasos foram semeados, domos de propagação foram colocados sobre as bandejas para manter o solo úmido. Os domos foram removidos 5 dias após a data de semeadura. As sementes foram germinadas, e as plantas foram cultivadas em um Conviron (modelos CMP4030 e CMP3244, Controlled Environments Limited, Winnipeg, Manitoba, Canadá) sob condições de dia longo (16 horas de luz/8 horas de escuridão) a uma intensidade de luz de 120 - 150 μmoles/m2s sob temperatura (22°C) e umidade (40 - 50%) constantes. As plantas foram aguadas 10 a 14 dias após a semeadura das plantas com solução de Hoagland e, subsequentemente, com água DI para manter o solo úmido, mas não molhado. 4 semanas após a data da semeadura, as flores foram cortadas para produzir um crescimento mais uniforme das flores secundárias. No 5a semana após a semeadura, as plantas foram preparadas para o processo de transformação.

Transformação in planta e triagem de plantas resistentes Ti:

[00091] A transformação de Arabidopsis thaliana cv. Columbia foi completada usando-se um protocolo modificado de Clough e Bent (S.J. Clough e A.F. Bent, 1998, Plant J. 16:735-43). Prepararam-se 10 mL de suspensão com a solução de QD-CPP-DNA, que foram usados para tratamentos das plantas de Arabidopsis (principalmente aglomerados de flores imaturas com algumas síliquas fertilizadas). Antes de mergulhas as plantas, adicionou-se Silwet L-77 a uma concentração de 0,05% (250 μL/500 mL) - 0,005% à solução de QD-CPP-DNA, e se misturou bem. As partes acima do solo da planta foram mergulhadas na solução de QD-CPP-DNA durante 2 a 30 segundos, com agitação suave. As plantas tratadas foram mantidas sob uma cobertura de domo de plástico durante 16 a 24 horas a 22 - 24°C. As plantas foram transferidas para os Convirons e deixadas crescer até a maturidade e para coletar sementes. Bandejas de seleção (bandejas de 26,7 cm x 53,3 cm x 2,5 cm (10,5" x 21" x 1")) foram usadas para a triagem de sementes de colheita brutas de plantas T0, aproximadamente 10.000 sementes em cada bandeja. Foram usados dois controles para assegurar que a pulverização de seleção fosse feita corretamente, controle de transformação negativa Col-0 e semente homozigótica Columbia para marcador selecionável PAT (fosfinotricina acetil transferase) como um controle de transformação positiva. Para conseguir a sincronização, as sementes foram estratificadas em uma solução de ágar a 0,1% durante 48 horas antes da semeadura. Para fornecer 10.000 sementes por bandeja de seleção, 200 mg de sementes foram adicionadas a uma solução de ágar a 0,1% e remoinhadas até que as sementes estivessem uniformemente distribuídas. As sementes estratificadas for a, então, semeadas em bandejas de seleção cheias de mistura Sunshine LP5 e subirrigadas com solução de Hoagland. Para que a pulverização de seleção seja eficaz, é importante que os 40 mL de sementes em suspensão sejam semeados uniformemente na bandeja de seleção. Após a semeadura, domos de propagação foram colocados em cada bandeja de seleção, e as plantas foram cultivadas para seleção. Os domos de propagação foram removidos aproximadamente 5 dias após a semeadura.

[00092] Além disso, completou-se um experimento de controle. Nesse experimento, uma solução contendo apenas DNA, não em complexo com o conjugado QD-CPP, foi usado para transformar Arabidopsis thaliana. Usou-se o protocolo acima para a transformação do DNA apenas como um controle.

Seleção de plantas transformadas

[00093] Sementes T1 recém colhidas foi deixadas secar durante 7 dias à temperatura ambiente. As sementes T1 foram cultivadas em bandejas de germinação de 26,5 x 51 cm, cada uma recebendo uma alíquota de 200 mg de sementes T1 estratificadas (~10.000 sementes) que haviam sido previamente postas em suspensão em 40 mL de solução de agarose a 0,1% e armazenadas a 4°C durante 2 dias para completar as exigências de dormência completa e assegurar uma germinação sincrônica das sementes.

[00094] A mistura Sunshine LP5 foi coberta com vermiculita fina e subirrigada com solução de Hoagland até ficar molhada, então, deixada drenar por gravidade. Cada alíquota de 40 mL de sementes estratificadas foi semeada uniformemente sobre a vermiculita com uma pipeta e coberta com domos de umidade durante 4 - 5 dias. Os domos foram removidos 1 dia antes da seleção de transformantes inicial usando pulverização em pós-emergência de glufosinato.

[00095] Sete dias após o plantio (DAP), plantas T1 (cotilédone e estágio de 2 - 4 folhas, respectivamente) foram pulverizadas cinco vezes durante cinco dias com uma solução a 0,2% de herbicida Liberty (200 g ae/L de glufosinato, Bayer Crop Sciences, Kansas City, MO) a um volume de pulverização de 10 mL/bandeja (703 L/ha) usando um bico de pulverização de ar comprimido DeVilbiss para distribuir uma taxa efetiva de 280 g ae/ha de glufosinato por aplicação. Os sobreviventes (plantas crescendo ativamente) foram identificadas 4 - 7 dias após a pulverização final e transplantados individualmente em vasos de 7,62 cm (3 polegadas) preparados com meio de envasamento (Metro Mix 360). As plantas transplantadas foram cobertas com domos de umidade durante 3 - 4 dias e colocadas em uma câmara de crescimento a 22°C como antes ou movidas diretamente para a estufa. Os domos foram subsequentemente removidos, e as plantas cultivadas na estufa (22 ± 5°C, 50 ± 30% de UR, 14 horas de luz: 10 horas de escuro, mínimo de 500 μE/m2s1 de luz natural + suplementar).

Análise Molecular

[00096] O DNA genômico de plantas transgênicas Arabidopsis foi extraído do material de folha total de plantas de 6 semanas de idade usando o kit Plant DNAZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Foram projetados iniciadores de PCR para detecção dos transgenes yfp e pat. Os iniciadores yfp são apresentados como SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:5. Os iniciadores pat são apresentados como SEQ ID NO:6 e SEQID NO:7.

[00097] SEQ ID NO:4: 5‘-TGTTCCACGGCAAGATCCCCTACG-3‘

[00098] SEQ ID NO:5: 5‘-TATTCATCTGGGTGTGATCGGCCA-3‘

[00099] SEQ ID NO:6: 5‘-GGAGAGGAGACCAGTTGAGATTAG-3‘

[000100] SEQ ID NO:7: 5‘-AGATCTGGGTAACTGGCCTAACTG-3‘

[000101] As reações de amplificação por PCR para pat e yfp foram completadas usando-se o kit TaKaRa ExTaq (Takara, Otsu, Shiga, Japão). Os produtos de genes foram amplificados em um volume de reação total de 50 μL. A reação de PCR continha 100 ng de molde de DNA genômico, 1X tampão de reação ExTaq, 0,2 mM de dNTP, 10 pMoles de cada iniciador e 0,025 unidades/μL de ExTaq. Foram usadas as seguintes condições de PCR: 1 ciclo a 96°C durante 5 min e 31 ciclos das seguintes condições: 94°C durante 15 s, 65°C durante 30 s, 72°C durante 1 min e uma extensão final de 72°C durante 7 min. O produto de amplificação de PCR foi analisado por eletroforese em gel de agarose com 0,8% de TAE e visualizado por coloração com brometo de etídio. A Tabela 2 apresenta os resultados dos produtos de amplificação que foram obtidos com essas reações. Tabela 2: Resultados de PCR para conjugados à base de QD e veículo usados neste experimento, em que se mostram apenas amostras representativas.

EXEMPLO 2: FORMAÇÃO DE IMAGEM AO VIVO EM PLANTA MEDIANTE CONJUGADOS DE PONTO QUÂNTICO E PEPTÍDIO DE PENETRAÇÃO CELULAR Formação de imagem ao vivo mediante QD rematado com DHLA e conjugado QD-CPP

[000102] Proteínas de fusão consistindo em peptídios de penetração celular (CPP) e proteína fluorescente amarela (YFP) foram produzidas e isoladas conforme anteriormente descrito na Patente Norte-americana Provisória n° 61/319764 e em Chen e outros, 2007. Os vários peptídios de penetração celular foram subclonados a montante da sequência codificadora de YFP nos sítios de restrição NcoI - SpeI únicos dentro de um vetor de expressão bacteriana pET280. A expressão das proteínas foi induzida, e elas foram isoladas e purificadas conforme descrito na Patente Norte-americana Provisória n° 61/319764 e em Chen e outros, 2007. As sequências das fusões CPP-YFP são relacionadas na Tabela 3. Tabela 3: Sequências nucleotídicas de fusões de peptídio de penetração celular e proteína fluorescente amarela

[000103] QDs rematados com DHLA com um máximo de emissão centrado em 620 nm foram sintetizados usando-se reações por etapas de precursores organometálicos em misturas de solventes de coordenação quentes segundo os procedimentos anteriormente descritos. Veja Aron e outros, 2006; Lu e outros, 2007; Doyon e outros, 2006; Collins e outros, 2003; e Lanio e outros, 2000. Os nanocristais foram tornados hidrofílicos por troca do invólucro de remate nativo, composto principalmente por trioctil fosfina (TOP) e óxido de trioctil fosfina (TOPO), por ligantes bifuncionais conforme anteriormente descrito. Veja Lie e outros, 2002; Mani e outros, 2006; Desjarlais e Berg, 1993. Dois conjuntos de QDs hidrofílicos foram usados: (1) nanocristais rematados com ácido di-hidrolipoico, e (2) nanocristais rematados com uma mistura de ácido di-hidrolipoico com apêndice de polietileno glicol (Mw ~600) (DHLA-PEG) e DHLA polietileno glicol (Mw ~400) terminado com biotina (DHLA-PEG-biotina) com uma razão molar de 9:1 dos ligantes. Os QDs resultantes foram chamados de DHLA-QDs e DHLA- PEG-biotina-QDs, respectivamente.

[000104] Além das moléculas de CPP acima descritas (Y-ZEÍNA, MPG e R9), duas moléculas adicionais, PEP1 e TAT (Tabela 4), foram montadas com os QDs rematados com DHLA usando o protocolo anteriormente descrito (Aron e outros, 2006). Conjugados QD-CPP de razões molares apropriadas conforme acima descrito foram adicionadas a 0,3 μM de QDs rematados com DHLA emitindo a 510 - 620 nm em 10 mM de tampão Tris-Cl, pH 8,0, e incubados à temperatura ambiente durante 30 minutos. Os conjugados foram caracterizados usando-se eletroforese em gel, em que uma alteração na mobilidade eletroforética dos QDs montados com CPPs foi observada. As amostras foram diluídas em 1X tampão TBE (0,09 M de Tris, 0,002 M de Na2-EDTA, 0,09 M de ácido bórico, pH 8,3) e corridos em géis de agarose a 1% ou 2%. O efeito da variação do número de moléculas de CPP por QD foi monitorizado por observação da fluorescência do complexo. As imagens no gel foram produzidas por excitação do QD e/ou da proteína e observação das imagens quanto a bandas fluorescentes separadas dentro dos géis. Além disso, a formação de conjugado foi confirmada por monitorização de alterações na transferência de energia entre os QDs e as CPPs durante a automontagem. Tabela 4: Sequências de aminoácidos e massas moleculares do peptídios sintetizados

[000105] Captação e a ocalização subcelular do conjugado ponto quântico-CPP dentro de células vegetais

[000106] Bioconjugados de QD foram diluídos com meio de cultura completo e adicionados a culturas celulares aglomeradas de Arabidopsis, culturas celular únicas de tabaco JTNT1 e cenoura (Patente Norte-americana Provisória n° 61/319764) com paredes intactadas. A solução foi incubada a 37°C durante 1 - 4 horas a 40 - 150 μg/mL. Conjugados QD mistos consistindo em razões de QD/CPP de 1:5 ou 1:10 a 50 moléculas de CPP por QD foram incubados com as culturas celulares. O excesso de conjugados QD não ligados foi removido por lavagem da cultura pelo menos três vezes com 1X PBS ou meio de cultura celular. As células foram, então, incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente e lavadas duas vezes com PBS.

[000107] A coleta de imagem de epifluorescência foi realizada usando-se um microscópio confocal Leica. As imagens de fluorescência divididas lado a lado foram coletadas e quantificadas usando-se um sistema de visualização dupla equipado com um filtro dicroico de 565 nm. Para QDs de 620 nm, fez-se a imagem do o complexo QD-CPP. Para imagens celulares, as amostras foram excitadas a 488 nm, e as emissões foram coletadas/separadas com o filtro dicroico de 565 nm e desconvoludas. A fluorescência do QD foi coletada a À < 620 nm, e a cauda fluorescente de YFP foi coletada a À > 537 nm se a etiqueta de fusão CPP fosse usada isoladamente, sem os QDs. O vazamento de YFP na janela de QD é subtraída como parte da desconvolução. Os QDs de 620 nm isolados são excitados a 488 nm, e suas respectivas emissões são separadas com o filtro dicroico de 565 nm e desconvoludas. A fluorescência de DAPI e Calcuofluor é excitada usando uma lâmpada de xenônio (Xe), e a emissão é coletada usando um cubo DAPI (D350/50X para exitação, 400DCLP dicroico, D460/50m para detecção). AF647-TF é excitado usando a lâmpada de Xe, e a fluorescência é detectada usando um cubo Cy5 (HQ620/60X de excitação, Q660LP dicroico, HQ700/75m de emissão). Ambos os cubos de excitação/detecção são fornecidos pela Chroma Technology (Bellows Falls, VT). Imagens de contraste de interferência diferentecial (DIC) são coletadas usando-se uma fonte de luz brilhante.

[000108] Assim, os QDs funcionalizados contendo diferentes peptídios de penetração celular para rastrear a localização em células com parede simples de Arabidopsis, cenoura e tabaco JTNT1 foram observados com imagem por microscópio confocal Zeiss LSM710. Os QDs têm uma resistência à degradação metabólica mais elevada e uma resistência a fotoalvejamento mais elevada. QD aminas em complexo com CPPs como R9, MPG, Y-ZEÍNA, PEP1 e TAT foram incubadas com células únicas de Arabidopsis, cenoura e JTNT1 durante 30 minutos, e as células foram lavadas com meio, tomando-se a imagem com um microscópio confocal Zeiss LSM710. Um scanner confocal Zeiss LSM710 equipado com um microscópio invertido Axio Observer Z1 foi usado com comprimento de onda de excitação para um experimento de captação de 3 horas, e o comprimento de onda de excitação de 561 nm foi usado para um experimento de captação de 5 horas.

[000109] Os resultados indicaram que as células em suspensão de Arabidopsis, tabaco JTNT1 e cenoura vivas com paredes intactadas não mostravam a fluorescência de À= 620 nm. Entretanto, quando os QD620 foram introduzidos nas células, observou-se a internalização do QD nas células vegetais. Imagens de canais feitas na emissão azul e vermelha para Calcofluor , a coloração de parede celular e a faixa fluorescente de QD620, respectivamente, mostraram fluorescência azul, indicando a presença de parede celular, ou fluorescência vermelha, indicando a presença do núcleo onde o QD620 está localizado devido ao direcionamento para o núcleo. Uma superposição de todas as imagens ilustrou que os QDs internalizados estavam concentrados no citoplasma e no núcleo.

[000110] Demonstrou-se o direcionamento de QD620 conjugado com CPP para o núcleo de células em suspensão de Arabidopsis, JTNT1 e cenoura. O direcionamento para o núcleo foi confirmado por contracoloração do núcleo com o corante nuclear DAPI. DAPI é um corante nuclear vital, usado muito comumente em células vegetais vivas. Esse corante é um corante fluorescente que é excitado por luz ultravioleta, mostrando fluorescência azul quando ligado a DNA no núcleo. Embora a faixa de emissão de Calcofluor esteja no azul, só é específica para a parede. A superposição das imagens dos conjugados QD620 CPP e imagens tingidas com DAPI mostrou a colocalização dos conjugados QD-MPG no núcleo.

[000111] Os QD620 conjugados com CPPs MPG, R9, Y-ZEÍNA, PEP1 e TAT internalizados têm valores de carga de superfície caracterizados, e seus valores de potencial zeta foram medidos na faixa de 9,5466 - 10,1586 mv. Os valores hidrodinâmicos dos tamanhos dos conjugados estavam na faixa de 122 - 342 nm. Quando esses conjugados em partículas foram incubados com as células em suspensão de Arabidopsis, tabaco JTNT1 e cenoura, os conjugados foram internalizados nas células intactadas e se localizaram no núcleo, indicando o direcionamento nuclear dos conjugados de QD nas células vivas, em oposição ao tratamento com apenas conjugado de QD620 amina, em que as partículas são vistas principalmente no citoplasma e ocasionalmente no núcleo. A translocação para o núcleo de células de Arabidopsis, tabaco JTNT1 e cenoura foi observada com Pontos Quânticos em complexo com os Peptídios de Penetração Celular (MPG, TAT, PEP1, R9 e Y-zeína).

[000112] Este exemplo exemplifica o uso de QDs etiquetados com Peptídios de Penetração Celular como veículos de partículas fluorescentes para estudos de rastreamento em células vivas. Os QDs funcionam como faróis estáveis.

EXEMPLO 3: FORMAÇÃO DE IMAGEM AO VIVO NA PLANTA MEDIANTE CONJUGADOS DE POLIESTIRENO E PEPTÍDIO DE PENETRAÇÃO CELULAR

[000113] Completou-se a distribuição e localização celular de nanopartículas de poliestireno fusionadas com CPPs. As nanopartículas de poliestireno/CPP em complexo foram translocadas para células vegetais vivas e direcionadas a compartimentos celulares específicos.

[000114] A internalização de nanopartículas de poliestireno foi marcada com o Peptídio de Penetração Celular, TAT, em células únicas de tabaco JTNT1.

[000115] Conjugação do peptídio Tat a FluoSpheres carboxiladas

[000116] A avaliação da captação de nanopartículas de poliestireno fluorescentes FluoSphere (20 nm de diâmetro) em células únicas de tabaco JTNT1 com parede foi testada com o sem um Peptídio de Penetração Celular TAT parcial.

[000117] As FluoSpheres (Invitrogen, Carlsbad, CA) foram obtidas de um armazenamento a 4°C e preparadas por adição de cloridrato de 1- etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDCL) e N- hidroxissuccinimida (NHS). O coquetel resultante foi incubado durante 1 hora para permitir que o EDCL reagisse com as FluoSpheres. Formouse um complexo de peptídio de penetração celular TAT (com uma terminação carbóxi protegida com terc-butanol) com as FluoSpheres. O complexo de TAT - FluoSphere foi incubado durante uma noite à temperatura ambiente para formar um complexo. O complexo foi purificado usando-se uma Unidade de Filtro Centrífugo Ultra-4 da Amicon com um limite de corte de peso molecular de 50.000. O complexo de TAT - FluoSphere retido foi transferido para um frasco limpo. O complexo de TAT - FluoSphere foi armazenado a 4°C até ser necessário para os experimentos.

[000118] Estudos de captação celular com TAT - Fluospheres e Fluospheres não conjugadas em células em suspensão de tabaco JTNT1

[000119] Suspensões de células únicas JTNT1 foram preparadas em meio NT1B, ajustado para conter 3% de glicerol. 20 μL de Tat- FluoSpheres recém sonicadas e remoinhadas e FluoSpheres não em complexo foram adicionadas às células JTNT1 e incubadas durante 30, 60 ou 120 minutos. As células únicas JTNT1 foram isoladas por centrifugação dos tubos durante 5 minutos a 700 rpm. O sobrenadante foi removido, e as células enxaguadas duas vezes usando porções de 2 mL de NT1B. As células JTNT1 lavadas foram ressuspensas em 1mL do meio NT1B contendo glicerol, e algumas das células foram pipetadas em lâminas de vidro separadas e visualizadas usando-se um microscópio de fluorescência vertical, no modo de campo brilhante e contendo um conjunto de cubo de filtro para registrar a emissão de fluorescência a 580 nm. O microscópio foi usado para capturar imagens das células JTNT1 que haviam sido tratadas com o complexo TAT- FluoSphere. Usou-se o software ImageJ para exibir e superpor (empilhar) as imagens de campo brilhante e fluorescência para facilitar a determinação da localização das FluoSpheres dentro das células de tabaco JTNT1.

[000120] O tratamento de 120 minutos com complexo TAT- FluoSphere das células de tabaco JTNT1 resultou na internalização do complexo TAT-FluoSphere e direcionamento para o núcleo das células. O tratamento de 30 minutos não resultou em uma captação celular significativa do complexo TAT-FluoSphere. Notou-se que parte do complexo TAT-FluoSphere estava associado às paredes das células únicas com glicerol de JTNT1. O tratamento de 60 minutos do complexou TAT-FluoSpheres resultou na internalização de parte do complexo dentro das células únicas de JTNT1. Um grande número dos complexos TAT-FluoSphere observados foram observados próximo à periferia das células; entretanto, alguns poucos complexos apareceram em grande proximidade do núcleo das células tabaco JTNT1. Após 120 minutos de tratamento, um número significativo dos complexos TAT- FluoSpheres foram captados dentro das células de tabaco JTNT1 e direcionados para o núcleo dessas células.

[000121] A internalização de nanopartículas de poliestireno foi marcada com peptídios de penetração celular (CPPS) TAT, MPG e Y- ZEÍNA em células em suspensão de Arabidopsis.

[000122] Conjugação de peptídios de penetração celular a FluoSpheres carbgoxiladas e captação celular em células em suspensão de Arabidopsis

[000123] Diferentes tipos de CPPs foram marcados para se avaliar a captação de nanopartículas através de paredes celulares e membranas celular até o citoplasma e núcleos de células em suspensão de Arabidopsis vivas usando microscopia confocal. Formaram-se complexos de FluoSpheres com peptídios de penetração celular (TAT, MPG, e À-zeína) conforme acima descrito. O complexo CPP- FluoSphere resultante foi misturado com 0,1 mL de suspensão celular agregada de Arabidopsis e incubado à temperatura ambiente no escuro durante 3 horas (primeiro experimento) ou durante 5 horas (segundo experimento). As suspensões cleulares foram centrifugadas, e o sobrenadante foi removido. As células foram ressuspensas em meio de cultura fresco. Uma gota das suspensões celulares ressuspensas foi pipetada sobre uma lamínula de vidro, e se usou graxa de vácuo para formar um perímetro em torno da gotícula de suspensão celular antes de se colocar uma segunda lamínula de vidro sobre a suspensão cleular para formar um sanduíche de células entre as duas lamínulas. Um microscópio confocal (scanner confocal LSM710 Zeiss equipado com um microscópio invertido Axio Observer Z1 com comprimento de onda de excitação de 514 nm durante o experimento de captação de 3 horas, e 561 nm para o experimento de captação de 5 horas) foi usado para formar uma imagem às células agregadas de Arabidopsis 3 horas e 5 horas após a exposição ao complexo CPP-FluoSphere.

[000124] As células agregadas de Arabidopsis não exibiram nenhuma autofluorescência aparente quando excitadas a 561 nm e 514 nm pelo laser no microscópio confocal. Entretanto, protoplastos de Arabidopsis exibiram alguma autofluorescência a esse comprimento de onda. A autofluorescência de fundo das células não interferiu com a formação de imagem dos experimentos de captação de complexo CPP- FluoSphere.

[000125] Formaram-se imagens dos protoplastos de Arabidopsis 5 horas após a exposição com conjugados CPP- FluoSpheres, que foram, então, contra-tingidos com um corante Calcoflúor. Os conjugados CPP - FluoSpheres foram internalizados pelos protoplastos, mesmo que os protoplastos estivessem regenerando materiais de parede celular. Determinou-se que as células estavam vivs, conforme evidenciado por filamentos de protoplasto ativos quando observados sob microscopia confocal. Além disso, observou-se uma única célula captar o complexo de peptídio de penetração celular TAT e FluoSphere no núcleo da célula. Observou-se que as células agregadas de Arabidopsis 5 horas após a exposição com os conjugados de peptídio de penetração celular Y-zeína e FluoSphere indicados continham FluoSpheres dentro dos núcleos celulares. Essas imagens indicaram que o peptídio de penetração celular Y-zeína mediou o transporte das FluoSpheres para dentro dos núcleos celulares.

[000126] Os protoplastos de Arabidopsis observados 6 horas após a exposição a FluoSpheres não modificadas e contratingidos com Calcofluor não internalizaram nos protoplastos de Arabidopsis e não foram transportados para os núcleos celulares. As observações notaram a associação de protoplastos colapsados e mortos com FluoSpheres não modificadas. Assim, demonstrou-se que as FluoSpheres não modificadas não foram translocadas para dentro da célula dos protoplastos de Arabidopsis vivos. Entretanto, as células colapsadas ou células mortas internalizaram a FluoSpheres não modificadas. Essa observação indica que, quando a integridade da membrana das células está comprometida, FluoSpheres não modificadas são internalizadas, mas FluoSpheres não modificadas não são internalizadas em células vivas que possuam uma parede celular e membrana celular intactas.

[000127] Esses exemplos mostram que etiquetas de fusão com CPP proporcionam uma distribuição e direcionamento eficientes na célula. Além disso, dependendo do tipo de CPP usado, os núcleos podem ser especificamente buscados. O uso desses conjugados de CPP- Fluosphere pode facilitar a captação de macromoléculas impermeáveis nas células. Embora o uso dessa abordagem permita a marcação celular usando menos QDs ou poliestireno NPs, ainda é dependente da capacidade endocítica das células, foi a marcação foi abrogada em células incubadas a 4°C ou incubadas com um inibidor, como Wortmannin.

[000128] Conjugados de dendrímero marcados com PAMAM-TRITC usados como novas sondas para formação de imagem in vivo de compartimentos subcelulares em células vegetais de Arabidopsis.

[000129] Um farol à base de nanopartícula que pode ser usado para quantificar a endocitose em células vivas, com parede e intactas pode permitir a formação de imagens das organelas envolvidas na endocitose de plantas in vivo. Além disso, essa formação de imagem é realizada sem desvanecimento ou alvejamento do corante. Finalmente, o rastreamento da distribuição de partícula ou carga nas células vegetais vivas pode ser realizado com esse farol à base de nanopartícula.

[000130] Este exemplo apresenta a formação de imagem de um compartimento endocítico em células vegetais vivas com partículas marcadas de Dendrímero PAMAM-TRITC. O uso dessas partículas para formação de imagens ao vivo, em vez de corantes de estirila, como FM4-64, que são conhecidos para uso em estudos de tráfego vacuolar e endocitose em plantas. Sabe-se que eles se movem de um compartimento para outro no decorrer do tempo, proporcionando, dessa forma, um meio eficaz para formar imagens de compartimentos endocíticos dentro de células vegetais vivas. Entretanto, é possível usar uma partícula de dendrímero PAMAM fluorescentemente marcada para mostrar o comportamento endocitótico, e as biomoléculas podem ser etiquetadas ou fixadas como cargas em dendrímeros para estudar o tráfego em células vegetais vivas (diferentemente dos corantes estirial, que só tingem as vesículas). O tratamento com wortmannin inibiu a endocitose neste estudo, demonstrando que a partícula de dendrímero PAMAM reveste as vesículas de endossomo e poderia ser usada como um farol em estudos de rastreamento vesicular. O uso de partículas marcadas de Dentrímero PAMAM-TRITC para o rastreamento da endocitose foi demonstrado, e resultou na inibição da endocitose com o uso de wortmannin. Assim, apresentou-se um exemplo de um novo papel para a partícula como farol na formação de imagens em células vivas para estudos de rastreamento vesicular em células vegetais.

Marcação com TRITC e dentrímero PAMAM

[000131] Os dendrímeros PAMAM marcados com TRITC foram marcados de acordo com Pasupathy e outros, 2008. O dendrímero PAMAM marcado com TRITC foi adicionado a uma alíquota de 0,5 mL de células em suspensão de Arabidopsis thaliana de culturas de 7 dias de idade. Além disso, o corante Calcofluor foi adicionado à mistura 5 minutos da formação da imagem. As culturas de plantas foram incubadas durante 30 minutos com os complexos TRITC-Dendrímero e, então, foram imediatamente examinados sob o microscópio confocal. Para várias amostras de controle 25 μL de wortmannin a 10 μM (MP Biomedicals, Solon, OH) foram adicionados à cultura 30 minutos antes da adição dos complexos TRITC-Dendrímero. As amostras foram, então, incubadas mais uma vez durante 30 minutos. Formaram-se imagens das células vivas e dos aglomerados usando o microscópio confocal LSM710, segundo o protocolo acima descrito. Células de controle que não foram incubadas com dendrímeros não produziram um fundo quando visualizadas mediante microscopia confocal.

Microscopia de Varredura a Laser Confocal (CLSM)

[000132] Para observar a associação celular de complexos TRITC- PAMAM nas células tratadas e para visualizar o controle não tratado com a respectiva duração do tempo de incubação, as células foram enxaguadas com meio de cultura ou tampão PBS (pH 7,4) duas vezes, e se adicionou Calcofluor para tingir a parede celular durante 5 minutos e, então, se examinou imediatamente sob o microscópio confocal. As células foram observadas por CLSM (Carl Zeiss LSM-710, Alemanha) com um laser de argônio de 600 - 620 nm para formar imagens das células ao vivo. Aqui, a distribuição intracelular do TRITC-PAMAM foi observada em um único plano e também como seções z.

[000133] Os resultados das células não tratadas com Wortmanin mostraram que as membranas das células e os endossomos foram tingidos com o Dentrímero PAMAM marcado com TRITC. Os dentrímeros PAMAM marcados com TRITC foram transportados para dentro dos endossomos. Era possível rastrear o Dendrímero PAMAM dentro dos endossomos das células translocados através da parede celular intacta mediante a microscopia de varredura a laser confocal. O Dendrímero PAMAM foi translocado para dentro da célula mediante o processo de endocitose. Na presença de Wortmannin, o dendrímero PAMAM marcado com TRITC se localizou na membrana da célula. Como o processo de endocitose foi inibidor, o complexo Dentrímero PAMAM - CPP não translocou para dentro do citosol das células de Arabidopsis.

[000134] Embora esta invenção tenha sido descrita em certas modalidades, a presente invenção pode ser adicionalmente modificada dentro do espírito e do âmbito desta exposição. Este pedido, portanto, se destina a cobrir quaisquer variações, usos ou adaptações da invenção usando seus princípios gerais. Além disso, este pedido pretende cobrir esses afastamentos da presente exposição que sejam conhecidos ou prática comum na técnica à qual esta invenção se refere e que se encontrem dentro dos limites das reivindicações anexas e seus equivalentes.

Claims (18)

1. Método de introdução de um ácido nucleico de interesse em uma célula vegetal com parece celular para efetuar transformação estável de uma planta e sementes, caracterizado pelo fato de que compreende: o fornecimento da célula vegetal com parede celular; a interação de um ponto quântico (QD) com um ou mais peptídios de penetração celular (CPPs) para formar um conjugado QD- peptídio; a ligação de um ou mais ácidos nucleicos de interesse a um ou mais CPPs para formar um conjugado QD-peptídio ativado; a colocação da célula com parede celular e o conjugado QD- peptídio ativado em contato entre si; e a permissão da captação do conjugado QD-peptídio e dos um ou mais ácidos nucleicos de interesse dentro da célula com a parede celular; e a seleção de células que tenham integrado de maneira estável os um ou mais ácidos nucleicos de interesse.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a interação de um QD com um ou mais CPPs compreende a montagem do CPP sobre a superfície do QD.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fixação de um ou mais ácidos nucleicos de interesse ao CPP compreende a interação de grupos negativamente carregados dos um ou mais ácidos nucleicos de interesse com grupos amino carregados na extremidade C-terminal do CPP.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente permitir a captação do conjugado QD-peptídio em um compartimento da célula vegetal compreendendo parede celular.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o compartimento é selecionado do grupo que consiste em citossol, núcleo, tonoplastos, plastídio, etioplasto, cromoplasto, leucoplasto, elaioplasto, proteinoplasto, amiloplasto, cloroplasto e o lúmen da membrana dupla.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula vegetal compreendendo parede celular é selecionada do grupo que consiste em células de tabaco, cenoura, milho, canola, colza, algodão, palma, amendoim, soja, Oryza sp., Arabidopsis sp., Ricinus sp. e cana-de-açúcar.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula vegetal é de um tecido selecionado do grupo que consiste em embrião, meristemática, calo, pólen, folhas, anteras, raízes, pontas da raiz, flores, sementes, vagens e caules.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o CPP é selecionado do grupo consistindo dos peptídios R9, MPG, TAT, Y-Zeína e MPG.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o um ou mais ácidos nucleicos de interesse são selecionados do grupo que consiste em DNA, RNA, moléculas de RNAi, genes, plasmídios, cosmídios, YACs, BACs e suas combinações.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico de interesse compreende um gene.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o gene é um gene de proteína estranha, um gene agronômico ou um gene marcador.

12. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que as células selecionadas são células regeneráveis.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a regeneração de uma planta a partir das células regeneráveis.

14. Método de expressão estável de um gene, caracterizado pelo fato de que compreende: o fornecimento de uma célula vegetal com parede celular; a interação de um ponto quântico (QD) com um peptídio de penetração celular (CPP) para formar um conjugado QD-peptídio; a ligação de um ou mais genes ao CPP para formar um conjugado QD-peptídio ativado; a colocação da célula com parede celular e o conjugado QD- peptídio ativado em contato entre si; e a permissão da captação do conjugado QD-peptídio e os um ou mais genes dentro da célula com parede celular; e selecionar células que expressem estavelmente o gene para produzir uma planta de descendência; a expressão do gene na descendência de uma planta com a célula vegetal.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o gene é expresso em um cloroplasto.

16. Método para a transferência de um gene para uma célula vegetal, caracterizado pelo fato de que compreende: a interação de um ponto quântico (QD) com um peptídio de penetração celular (CPP) para formar um conjugado QD-peptídio; a interação do conjugado QD-peptídio com um DNA plasmidial compreendendo um ou mais genes para formar uma estrutura de conjugado QD-peptídio ativado; e o contato da estrutura de conjugado QD-peptídio ativado com uma célula vegetal portadora de parede celular intacta sob condições que permitam a captação do CPP e o um ou mais genes do DNA plasmidial pela célula vegetal.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente selecionar células que expressam de maneira estável o gene para produzir a descendência de uma planta.

18. Método de triagem e identificação de plantas transformadas, caracterizado pelo fato de que compreende: o fornecimento de uma célula vegetal com parede celular; a interação de um ponto quântico (QD) com um peptídio de penetração celular (CPP) para formar um conjugado QD-peptídio; a ligação de um ou mais ácidos nucleicos de interesse ao CPP para formar um conjugado QD-peptídio ativado; a colocação da célula com parede celular e o conjugado QD- peptídeo ativado em contato entre si; a permissão da captação do conjugado QD-peptídio e dos um ou mais ácidos nucleicos de interesse dentro da célula com parede celular; e a formação de uma imagem da célula vegetal com parede celular.

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