CN105950133B - 一种活细胞超分辨光学成像探针及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种活细胞超分辨光学成像探针及其制备方法,所述以量子点作为荧光团,在量子点表面同时偶联细胞膜穿透肽和核酸适配体,所述细胞膜穿透肽用以使探针穿透活细胞膜,所述核酸适配体用以与活细胞核膜受体蛋白特异性结合,实现探针的细胞核定位。本发明利用具有闪烁效应的量子点作为荧光团,其高的发光强度和荧光闪烁特性,使其适用于基于单分子定位法的超分辨光学成像;同时,本发明使用具有闪烁效应的量子点作为荧光团,不需要特殊的成像缓冲液,因此适用于活细胞超分辨成像;另外,本发明操作简单方便,造价低廉,有效地节约了时间成本和经济成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种活细胞超分辨光学成像探针及其制备方法,属于纳米材料技术。
背景技术
光学显微镜的分辨率受到衍射极限的限制,通常只能达到200-300nm。近年来,科学家们针对光学显微镜的分辨率极限,开发出了几类能突破衍射极限的超分辨光学显微镜,例如受激发射损耗显微镜(STED)、结构光照明显微镜(SIM)、随机光学重建显微镜(STORM)以及光活化定位显微镜(PALM)等。其中,以STORM/PALM技术能达到的分辨率最为突出,它们的成像原理相似,都基于单分子定位技术。2014年诺贝尔化学奖即是授予了三位在超分辨荧光显微成像领域取得开创性成果的科学家。
PALM/STORM技术中,荧光标记探针至关重要,它能直接决定成像效果(如分辨率、成像速度等)。PALM/STORM技术要求标记探针具有以下特点:量子产率高、亮态占空比小、可开关次数多、光稳定性好、标记密度高以及生物毒性低等。目前已有不少可用于PALM/STORM成像的有机染料分子(如Alexa fluo 647、Cy3、Cy5)以及荧光蛋白等。但就上述PALM/STORM技术所需探针的特点来说,这些已有的光学标记探针或多或少存在着一些不足,例如量子产率不够高、光稳定性不好、靶向特异性差等。因此,开发满足PALM/STORM技术应用需求的,可用于活细胞光学超分辨成像的探针依旧是目前超分辨成像领域亟待解决的问题。
发明内容
发明目的:为了克服现有技术中存在的不足,本发明提供一种活细胞超分辨光学成像探针及其制备方法,是一种适用于活细胞的核膜受体超分辨光学成像的探针及其制备方法。
技术方案:为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
一种活细胞超分辨光学成像探针,以量子点作为荧光团,在量子点表面同时偶联细胞膜穿透肽和核酸适配体,所述细胞膜穿透肽用以使探针穿透活细胞膜,所述核酸适配体用以与活细胞核膜受体蛋白特异性结合,实现探针的细胞核定位。该探针能穿透活细胞膜进入活细胞,并最终定位至活细胞核膜受体上,以实现活细胞核膜受体的超分辨率光学成像。
优选的,所述细胞膜穿透肽和核酸适配体均通过羧基配体连接在量子点上,羧基配体为小分子配体;羧基配体的一端为巯基,羧基配体通过巯基共价连接至量子点表面;羧基配体的另一端为羧基,羧基配体通过羧基偶联细胞膜穿透肽和核酸适配体。
优选的,所述核酸适配体5‘端修饰氨基,细胞膜穿透肽和核酸适配体均通过氨基羧基偶联反应连接至量子点表面。
一种活细胞超分辨光学成像探针的制备方法,包括如下步骤:
(1)为具有荧光闪烁(blink)效应的量子点修饰羧基配体;羧基配体的一端为巯基,羧基配体的另一端为羧基,羧基配体通过巯基共价连接至量子点表面;
(2)在修饰了羧基配体的量子点表面同时偶联细胞膜穿透肽和核酸适配体;核酸适配体5‘端修饰氨基,细胞膜穿透肽和核酸适配体均通过氨基羧基偶联反应连接至量子点表面;
(3)超滤提纯获得基于量子点的活细胞超分辨光学成像探针。
所述量子点具有荧光闪烁(blink)效应,能够适用于基于单分子定位法的超分辨率光学成像应用
有益效果:本发明提供的活细胞超分辨光学成像探针及其制备方法,相对于现有技术,具有如下优点:1、本发明利用具有闪烁效应的量子点作为荧光团,其高的发光强度和荧光闪烁特性,使其适用于基于单分子定位法的超分辨光学成像;2、本发明使用具有闪烁效应的量子点作为荧光团,不需要特殊的成像缓冲液,因此适用于活细胞超分辨成像;3、本发明操作简单方便,造价低廉,有效地节约了时间成本和经济成本。
附图说明
图1为本发明探针的制备过程;
图2为本发明探针穿透活细胞膜并定位至活细胞核膜受体蛋白的示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作更进一步的说明。
本实施例中涉及的量子点为CdSe/ZnS油相量子点,其荧光发射波长为640nm;涉及的羧基小分子配体为巯基乙酸;涉及的细胞膜穿透肽为YGRKKRRQRRR,涉及的核酸适配体序列为5'-NH2-TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3';涉及的细胞为HeLa细胞。
在制备探针时,首先取500μL CdSe/ZnS量子点,加入1mL甲醇并以3000rpm离心10min,弃除上清后将沉淀分散至2mL氯仿中。加入100μL四甲基氢氧化铵和100μL巯基乙酸后,剧烈搅拌2h。加入2mL去离子水,静止分层后收集上层的修饰了羧基配体的量子点。
然后在离心管中加入4mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和6mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)粉末后,加入200μL的修饰了羧基配体的量子点溶液,再加入400μL的去离子水,室温振荡反应30min。之后加入100μL 10mg/mL的细胞膜穿透肽和100μL10μM的核酸适配体,室温过夜振荡反应。最后将混合溶液移至超滤管中以8000rpm,12min超滤提纯四次,将沉淀分散至200μL PBS(10mM pH 7.4)缓冲液中即得到了基于量子点的活细胞超分辨光学成像探针。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种活细胞超分辨光学成像探针,其特征在于:以量子点作为荧光团,在量子点表面同时偶联细胞膜穿透肽和核酸适配体,所述细胞膜穿透肽用以使探针穿透活细胞膜,所述核酸适配体用以与活细胞核膜受体蛋白特异性结合,实现探针的细胞核定位;所述细胞膜穿透肽和核酸适配体均通过羧基配体连接在量子点上,羧基配体为小分子配体;羧基配体的一端为巯基,羧基配体通过巯基共价连接至量子点表面;羧基配体的另一端为羧基,羧基配体通过羧基偶联细胞膜穿透肽和核酸适配体。
2.根据权利要求1所述的活细胞超分辨光学成像探针,其特征在于:所述核酸适配体5‘端修饰氨基,细胞膜穿透肽和核酸适配体均通过氨基羧基偶联反应连接至量子点表面。
3.一种活细胞超分辨光学成像探针的制备方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)为具有荧光闪烁效应的量子点修饰羧基配体;羧基配体的一端为巯基,羧基配体的另一端为羧基,羧基配体通过巯基共价连接至量子点表面;
(2)在修饰了羧基配体的量子点表面同时偶联细胞膜穿透肽和核酸适配体;核酸适配体5‘端修饰氨基,细胞膜穿透肽和核酸适配体均通过氨基羧基偶联反应连接至量子点表面;
(3)超滤提纯获得基于量子点的活细胞超分辨光学成像探针。
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