CN104707150B - 肿瘤酶激活的量子点探针及其制备方法与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种肿瘤酶激活的量子点探针，所述肿瘤酶激活的量子点探针为经修饰含有功能肽的量子点探针，其中，所述功能肽的一端连接有淬灭剂，以及所述肿瘤酶能够特异性识别并切断所述功能肽以使量子点发光。所述的肿瘤酶激活的量子点探针在正常组织中处于荧光淬灭状态，而在肿瘤部位荧光恢复，即此量子点探针兼备在正常组织中的隐形性与在肿瘤部位的肿瘤酶敏感性的双重性能，最终实现肿瘤诊断检测功能。本发明还涉及肿瘤酶激活的量子点探针的制备方法及其在制备用于肿瘤诊断检测的试剂中的用途。本发明提供的经修饰后含功能肽的量子点有效实现了肿瘤诊断检测功能，有望成为肿瘤诊断检测的有效前体探针。
Description
技术领域
本发明涉及一种肿瘤诊断检测前体探针及其制备方法与用途，且更具体而言，涉及一种肿瘤酶激活的量子点探针及其制备方法与用途。本发明的肿瘤酶激活的量子点探针是一种可有效诊断检测肿瘤的探针。
背景技术
肿瘤作为全球较大的公共卫生问题之一，严重危害着人类的健康。据报道，在我国，癌症的发病率逐年升高，死亡率高达87%，已成为中国城市和农村居民的第一位死因。相比之下，早期癌症患者的治疗康健程度远远高于晚期患者。如果可以对肿瘤进行早期诊断检测并明确定位治疗，最终将大大提高肿瘤患者的生存率，因此早发现早治疗成为治疗癌症的有效方式，鉴于此，研究开发有效的肿瘤诊断检测探针迫在眉睫。
近年来，具有独特荧光特性的量子点在生物化学、分子生物学、蛋白质组学、基因组学、生物分子相互作用等研究领域中已得到广泛应用，尤其是在生物医学领域中，量子点可以作为一种标记物应用于肿瘤研究，前景十分广阔。量子点（Quantum Dots，QDs）又称为半导体纳米晶（Nanocrystals，NCs）或半导体纳米粒子（Nanoparticles，NPs），是一种主要由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族和Ⅳ族元素组成，其半径小于或接近于激子玻尔半径的半导体纳米晶粒。
量子点的发射波长可以通过控制其粒径的大小进行调控，其激发光谱宽而且连续分布，而发射光谱窄。传统的有机染料则是激发光谱窄而发射光谱宽。基于量子点的这种光学特性，我们可以在连续的激发光谱中选取适宜的激发波长降低背景荧光对检测信号的干扰。量子点的斯托克斯位移较大，能够有效避免发射谱与激发谱的重叠，提高检测的灵敏度，相比之下有机荧光染料的斯托克斯位移小，通常会被组织自发荧光所淹没。量子点作为多电子体系，其发光强度是有机荧光染料的若干倍。在生物体内有机荧光染料的发光强度由于散射等原因而衰减，相比之下，量子点更适合作为生物体内的荧光探针。有机荧光染料的荧光信号会随着照射时间延长很快发生褪色，而量子点则可以持续相对较长时间不褪色，其荧光寿命和耐光漂白的稳定性均为有机荧光染料的百倍之上，这一特征对于标记生物体内目标的研究是十分重要的。
量子点在生物体内表现出来的各种优良特性使其成为一种极具潜力的荧光探针，可以对肿瘤组织进行准确的定位标记。量子点在生物体内对肿瘤的靶向成像有两种方式：被动靶向和主动靶向。被动靶向是指由于丰富的肿瘤新生血管，较宽的血管内皮细胞间隙以及不完整的基底膜的存在，纳米粒子因此从这些肿瘤新生血管中渗透进肿瘤组织内，而肿瘤组织中又缺乏有效的淋巴引流系统，造成纳米粒子通过肿瘤的高通透性和滞留效应优先聚集在体内肿瘤部位，进而实现被动靶向。主动靶向是指通过肿瘤微环境中相关配体-受体或抗体-抗原等特异性结合的靶向作用性，最终实现主动靶向，目前量子点对肿瘤主动靶向成像主要有肽段耦联制成的量子点探针和抗体耦联制成的量子点探针。
综合肿瘤微环境中生成因子特异性表达、肿瘤血管的生成特点以及肿瘤部位低氧、低pH等特点，Akerman等将可特异性标记肺血管内皮细胞、肿瘤组织血管淋巴管和肿瘤细胞的三种不同肽段分别添加到CdTe/ZnS量子点表面，尾静脉注射后成功实现了对肿瘤组织的标记。Steven等将PEG修饰后的量子点注入种植C6神经胶质瘤细胞的大鼠体内，于24h后切片观察含量子点的巨噬细胞和神经胶质细胞聚集在神经胶质瘤，同时部分量子点被巨噬细胞带到了肝、肾及淋巴组织中。利用整合素integrinαVβ3可与精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽（RGD）特异性结合的原理，Cai等将连有RGD肽段的量子点应用于肿瘤新生血管成像，注射后随时间推进荧光信号逐渐增强，切片结果显示量子点荧光主要分布于肿瘤组织新生血管上。
随着分子生物学以及分子遗传学等交叉学科的迅速发展，目前有关肿瘤的研究已经深入到分子和基因水平。研究者们已经认识到肿瘤的进展是一个多因素参与、多步骤渐进的过程。而在肿瘤的发生发展中，特异性分子标志物是区别于其他组织部位的明显存在，因此能够将肿瘤酶应用于肿瘤筛查中已成为当前研究热点。相关研究证实，肿瘤酶，包括MMP-2及legumain，在多种肿瘤中呈高表达状态，如乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、中枢神经系统肿瘤、淋巴癌、黑色素瘤。其在肿瘤中通过降解细胞外基质、促进肿瘤部位新生血管生成、调节肿瘤细胞间的粘附性能等机制，促进肿瘤发生侵袭或转移。因此，肿瘤酶的活性增强及表达量增多在多种恶性肿瘤侵袭、转移以及预后中起到了至关重要的作用。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，发明人致力于研究通过对量子点采用修饰技术从而得到的一种肿瘤酶激活的量子点探针在肿瘤诊断检测中的应用，此量子点探针兼备在正常组织中的隐形性与在肿瘤部位的肿瘤酶敏感性的双重性能。本发明人发现，量子点经巯基化线性分子修饰后，生理条件下比较稳定，并可大大降低量子点的毒性，增加作用位点。同时功能肽的应用可实现穿膜和肿瘤靶向的双重作用，淬灭剂的引入使此前体探针在正常组织中处于荧光淬灭状态，而在肿瘤部位荧光恢复，降低量子点在其他组织器官中聚集造成的影响，最终实现肿瘤诊断检测功能。本申请的肿瘤酶激活的量子点探针不仅实现了特异性诊断检测肿瘤功能，而且兼备正常组织中隐形性与肿瘤部位中酶敏感性的双重性能，为提高肿瘤的准确诊断检测找到了新方向。
本发明的一个目的是提供一种肿瘤酶激活的量子点探针。
本发明的另一个目的是提供一种制备所述肿瘤酶激活的量子点探针的方法。
本发明的再一个目的是提供所述肿瘤酶激活的量子点探针在制备肿瘤诊断检测试剂中的用途。
本发明的又一个目的是提供一种功能肽。所述功能肽可以作为上述肿瘤酶激活的量子点探针的一部分，肿瘤酶激活量子点探针的过程即通过肿瘤酶与功能肽相互作用完成。
根据本发明的一个方面，提供了一种肿瘤酶激活的量子点探针，所述肿瘤酶激活的量子点探针为经修饰含有功能肽的量子点探针，其中，所述功能肽的一端连接有淬灭剂，以及所述肿瘤酶能够特异性识别并切断所述功能肽以使量子点发光。
本发明中，优选地，所述功能肽的长度为19-33个氨基酸。
本发明中，优选地，在所述功能肽N端氨基酸的氨基处引入N-羟基琥珀酰亚胺酯活化的淬灭剂，包括BHQ-3羧酸，琥珀酰亚胺酯（BHQ-3Carboxylic Acid，SuccinimidylEster），及QSY-21羧酸，琥珀酰亚胺酯（QSY21Carboxylic Acid，Succinimidyl Ester）。
本发明中，优选地，所述功能肽包含肿瘤酶底物肽和穿膜肽，二者共同实现靶向和穿膜的双重作用。其中，所述肿瘤酶底物肽含有特异性肿瘤酶酶切位点，在肿瘤部位的肿瘤酶的作用下可被特异性识别并切断。其中，所述穿膜肽可以在肿瘤酶激活的量子点探针体系中发挥双重作用：①作为穿膜肽，帮助探针进入细胞；②作为阳离子肽，与带负电的修饰后量子点自组装形成探针。因此，本发明中，优选地，所述肿瘤酶激活的量子点探针可以是通过使经修饰后带负电的量子点与带正电的连接有淬灭剂的功能肽自组装连接而成。本发明中，优选地，所述淬灭剂是偶联在所述肿瘤酶底物肽上。本发明中，优选地，所述肿瘤酶底物肽位于所述功能肽的N端，所述穿膜肽位于所述功能肽在C端。
本发明中，优选地，所述功能肽的长度为19-33个氨基酸。
本发明中，优选地，所述肿瘤酶可以是天冬酰氨内肽酶legumain或基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2,MMP-2)。
本发明中，优选地，例如，所述肿瘤酶底物肽的氨基酸序列可为legumain酶切特异性序列PTN，或者MMP-2酶切特异性序列PLGVR或PLGLAG，或者为含有上述序列的氨基酸序列。
本发明中，优选地，所述穿膜肽的氨基酸序列可为富含精氨酸或赖氨酸的氨基酸序列，序列长度为3-20个氨基酸，优选为8-16个。
本发明中，更优选地，所述穿膜肽氨基酸序列为VSRRRRRRGGRRRR。
本发明中，更优选地，可在所述功能肽的氨基末端引入含有ε-氨基的氨基酸，例如，赖氨酸。本发明中，更优选地，可在含有ε-氨基的氨基酸与肿瘤酶底物肽之间和/或在肿瘤酶底物肽与穿膜肽之间设置保护所述特异性肿瘤酶酶切位点的氨基酸。更优选地，所述保护所述特异性肿瘤酶酶切位点的氨基酸的数量可为1-6个。
本发明中，最优选地，就肿瘤酶激活的量子点探针而言，当所述肿瘤酶是legumain时，所述功能肽的序列为KPTNGGGVSRRRRRRGGRRRR（SEQ ID NO:1）；当所述肿瘤酶是MMP-2时，所述功能肽的序列为KGGPLGVRGGVSRRRRRRGGRRRR（SEQ ID NO:2）或KGGPLGLAGGGVSRRRRRRGGRRRR（SEQ ID NO:3）。
本发明中，优选地，所述肿瘤酶激活的量子点探针中，所述量子点可以是碲化镉（CdTe）量子点。
本发明中，优选地，所述肿瘤酶激活的量子点探针中，所述量子点可以是通过水相方法合成的。
本发明中，优选地，在所述肿瘤酶激活的量子点探针中，所述量子点可以是经巯基化线性大分子修饰的，例如，经巯基化低分子量肝素修饰的。更优选地，所述低分子量肝素的分子量可为3500-5500。
本发明中，优选地，所述肿瘤酶激活的量子点探针的发射波长为600nm以上，更优选为600nm-900nm。
本发明中，所述肿瘤酶激活的量子点探针在正常组织中处于荧光淬灭状态，而在肿瘤部位荧光恢复，即此量子点探针兼备在正常组织中的隐形性能与在肿瘤部位的肿瘤酶敏感性的双重性能，最终实现肿瘤诊断检测功能。
根据本发明的另一个方面，提供了一种制备所述肿瘤酶激活的量子点探针的方法，包括以下步骤：
（1）巯基丙酸稳定量子点的制备。例如，可以参考文献：Zou,L,Gu,Z.Y.,Zhang,N.,et al.(2008)Ultrafast synthesis of highly luminescent green-to near infrared-emiting CdTe nanocrystals in aqueous phase.J.Mater.Chem,18,2807-2815。具体可以是，适量氯化镉与巯基丙酸混合，调pH11.9，室温下边搅拌边加入适量碲粉与硼氢化钠氮气保护下加热反应适时生成的碲氢化钠前体，氮气保护下回流反应适时，纯化干燥，即得巯基丙酸稳定的量子点，发射波长600nm及以上。
（2）巯基化低分子量肝素的制备：（a）使低分子量肝素在pH2.0-4.0缓冲液中经高碘酸钠氧化，（b）将（a）所得氧化产物于pH6.0-8.0缓冲液中与半胱氨酸盐酸盐反应，（c）向（b）所得产物中缓慢加入硼氢化钠。
（3）巯基化低分子量肝素修饰量子点的制备：于巯基丙酸稳定的量子点溶液中加入巯基化低分子量肝素，平衡反应适时即得。
（4）连接有淬灭剂的功能肽的制备：将适量功能肽与淬灭剂于N-甲基吗啉催化下在无水二甲基亚砜中反应适时即得，并经高效液相色谱仪分析制备产物。
（5）自组装合成：将步骤（3）制得的巯基化低分子量肝素修饰量子点少量多次快速涡旋加入步骤（4）制得连接有淬灭剂的功能肽中，室温平衡（例如，30分钟）即得。
本发明中，优选地，所述连接有淬灭剂的功能肽是在功能肽N端氨基酸的氨基处以化学反应方法引入N-羟基琥珀酰亚胺酯活化的淬灭剂，包括BHQ-3羧酸，琥珀酰亚胺酯（BHQ-3Carboxylic Acid，Succinimidyl Ester），及QSY-21羧酸，琥珀酰亚胺酯（QSY21Carboxylic Acid，Succinimidyl Ester）。
本发明中，优选地，上述步骤（3）中，所述巯基化低分子量肝素修饰量子点与连接有淬灭剂的功能肽自组装质量比例为1:1至100:1间的任一比例。
根据本发明的再一个方面，提供了所述肿瘤酶激活的量子点探针在制备用于肿瘤诊断检测的试剂中的用途。
本发明中还提供了肿瘤酶激活的量子点探针在制备肿瘤诊断检测试剂中的用途。
本发明中，所述肿瘤包括所有肿瘤酶表达的肿瘤。优选地，所述肿瘤包括乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、中枢神经系统肿瘤、淋巴癌、黑色素瘤。
根据本发明的又一个方面，提供了一种功能肽，所述功能肽包含肿瘤酶底物肽和穿膜肽，其中，所述肿瘤酶底物肽含有特异性肿瘤酶酶切位点，在肿瘤部位的肿瘤酶的作用下可被特异性识别并切断。
本发明中，优选地，所述功能肽的长度为19-33个氨基酸。
本发明中，优选地，例如，所述肿瘤酶底物肽的氨基酸序列可为legumain酶切特异性序列PTN，或者MMP-2酶切特异性序列PLGVR或PLGLAG，或者为含有上述序列的氨基酸序列。
本发明中，优选地，所述穿膜肽的氨基酸序列可为富含精氨酸或赖氨酸的氨基酸序列，序列长度为3-20个氨基酸，优选为8-16个。
本发明中，更优选地，所述穿膜肽氨基酸序列为VSRRRRRRGGRRRR。
本发明中，更优选地，可在所述功能肽的氨基末端引入含有ε-氨基的氨基酸，例如，赖氨酸。本发明中，更优选地，可在含有ε-氨基的氨基酸与肿瘤酶底物肽之间和/或在肿瘤酶底物肽与穿膜肽之间设置保护所述特异性肿瘤酶酶切位点的氨基酸。更优选地，所述保护所述特异性肿瘤酶酶切位点的氨基酸的数量可为1-6个。
本发明中，最优选地，所述功能肽的序列为KPTNGGGVSRRRRRRGGRRRR（SEQ ID NO:1）；KGGPLGVRGGVSRRRRRRGGRRRR（SEQ ID NO:2）；或者KGGPLGLAGGGVSRRRRRRGGRRRR（SEQ IDNO:3）。
附图说明
图1为根据本发明的一个实施方式的低分子量肝素修饰量子点和肿瘤酶激活的量子点探针的结构图。
图2为根据本发明的一个实施方式的肿瘤酶激活的量子点探针的作用机理图。
图3为显示根据本发明的实施例3的巯基化低分子量肝素修饰量子点和实施例1的巯基丙酸稳定的量子点的荧光光谱图。
图4为根据本发明实施例1的巯基丙酸稳定的量子点和实施例3的巯基化低分子量肝素修饰量子点的琼脂糖凝胶电泳图。其中：A为巯基丙酸稳定的量子点，B为巯基丙酸稳定的量子点与巯基化低分子量肝素摩尔比3:8的反应产物，C为巯基丙酸稳定的量子点与巯基化低分子量肝素摩尔比3:4的反应产物，D为巯基丙酸稳定的量子点与巯基化低分子量肝素摩尔比3:2的反应产物，E为巯基丙酸稳定的量子点与巯基化低分子量肝素摩尔比3:1的反应产物，F为巯基丙酸稳定的量子点与巯基化低分子量肝素摩尔比6:1的反应产物。
图5为根据本发明的实施例6的连接有淬灭剂的legumain型功能肽的质谱图。其中A图为正离子模式，B图为负离子模式。
图6为根据本发明的实施例6的连接有淬灭剂的MMP-2型功能肽的质谱图。其中A图为正离子模式，B图为负离子模式。
图7为根据本发明的实施例6的legumain型肿瘤酶激活的量子点探针的粒径图。
图8为根据本发明的实施例3和实施例6中的巯基化低分子量肝素修饰量子点和肿瘤酶激活的量子点探针的TEM（透射电镜）图。其中：A、B、C为低分子量肝素修饰的量子点，D、E为legumain型肿瘤酶激活的量子点探针，F为MMP-2型肿瘤酶激活的量子点探针。
图9为根据本发明的实施例3的巯基化低分子量肝素修饰量子点与实施例5的连接有淬灭剂的功能肽（SEQ ID NO:1）不同比例自组装的荧光光谱图。
图10为根据本发明的实施例7的legumain酶切型肿瘤酶激活的量子点探针体外特异性与非特异性酶切效果图。
图11为根据本发明的实施例7的legumain酶切型肿瘤酶激活的量子点探针在293T（legumain-）细胞与293T（legumain+）细胞中的摄取细胞图。其中：A、B、C、D分别为legumain酶切型肿瘤酶激活的量子点探针在293T（legumain-）细胞中摄取明场图、药物摄取图、核染色图、合并图，E、F、G、H分别为legumain酶切型肿瘤酶激活的量子点探针在293T（legumain+）细胞中摄取明场图、药物摄取图、核染色图、合并图。
图12为根据本发明的实施例7的legumain型肿瘤酶激活的量子点探针在293T（legumain-）细胞与293T（legumain+）细胞中的摄取流式图。其中：左图：A为巯基化低分子量肝素修饰的量子点在293T（legumain-）细胞中摄取情况，B为legumain酶切型肿瘤酶激活的量子点探针在293T（legumain-）细胞中摄取情况，C为巯基化低分子量肝素修饰的量子点在293T（legumain+）细胞中摄取情况，D为legumain酶切型肿瘤酶激活的量子点探针在293T（legumain+）细胞中摄取情况；右图：E为巯基化低分子量肝素修饰的量子点分别在293T（legumain-）细胞和293T（legumain+）细胞摄取的FL3-H中位荧光值，以及legumain型肿瘤酶激活的量子点探针分别在293T（legumain-）细胞和293T（legumain+）细胞摄取的FL3-H中位荧光值。
图13为根据本发明的实施例6的MMP-2酶切型肿瘤酶激活的量子点探针（SEQ IDNO:2）体外特异性与非特异性酶切效果图。
图14为根据本发明的实施例1的不同浓度的巯基丙酸稳定的量子点、实施例3中的不同浓度低分子量肝素修饰的量子点，以及实施例6中MMP-2型肿瘤酶激活的量子点探针（SEQ ID NO:3）对人类胚胎肾细胞293T细胞增殖的半数抑制率的图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明加以进一步说明，以下实施方式只以举例的方式描述本发明。但这些实施例并不意味着对本发明加以任何限制。很明显，本领域普通技术人员可在本发明的范围和实质内，对本发明进行各种变通和修改。需要了解的是，本发明意欲涵盖在所附权利要求书中包括的变通和修改。
制备实施例
实施例1巯基丙酸稳定的量子点的合成纯化
a分别称取25.4mg碲粉（购自国药集团化学试剂有限公司）和50mg硼氢化钠（购自国药集团化学试剂有限公司）于圆底烧瓶中，在氮气保护下加入5ml超纯水，80℃油浴反应1-1.5h至紫红色，即得碲氢化钠前体溶液。
b称取45.7mg水合氯化镉（购自国药集团化学试剂有限公司），加入30μL纯度99%的巯基丙酸溶液（购自Alfa Aesar），继续加入40ml超纯水，搅拌至充分溶解，调节pH至11.9，在氮气保护下滴加十分之一的步骤a中制得的碲氢化钠前体溶液，并回流反应适时，荧光分光光度计（Hitachi）监测反应结果，发射波长达600nm及以上即可停止反应。
c量子点的纯化
加入3-4倍异丙醇，混匀，8000g离心20min，弃上清，加入10-20ml异丙醇，混匀，8000g离心20min，弃上清。真空干燥器中60℃干燥2h后备用。
实施例2巯基化低分子量肝素的合成
a将50mg低分子量肝素（依诺肝素钠，分子量3500-5500，购自河北常山生化药业股份有限公司）溶于10ml柠檬酸缓冲液（0.1M，pH3.0）中，加入21.4mg高碘酸钠，室温反应2h，用截留分子量为3500的透析袋透析，即得氧化低分子量肝素。
b将步骤a中制得的氧化低分子量肝素与11.4mg半胱氨酸盐酸盐于总体积20ml磷酸盐缓冲液（0.1M，pH7.0）中室温反应2h。
c向b中缓慢滴加10ml新制0.33M硼氢化钠水溶液，室温反应1h，用截留分子量为3500的透析袋透析，4℃储存备用。
实施例3巯基化低分子量肝素修饰量子点的合成
a于实施例2所得储备液中加入1/5体积新制0.33M硼氢化钠水溶液，室温反应1h。
b将实施例1所得巯基丙酸稳定的量子点用PBS稀释至OD310=1.0，加入不同量实施例3中步骤a所得，避光反应12h。
c纯化：向b中加入3-4倍体积异丙醇，混匀，8000g离心20min，弃上清，加入10-20ml异丙醇，混匀，8000g离心20min，弃上清，60℃真空干燥2h即得。
实施例4巯基丙酸稳定的量子点与巯基化低分子量肝素修饰量子点的表征
将实施例1制得的巯基丙酸稳定的量子点与实施例3制得的巯基化低分子量肝素修饰量子点分别表征，用荧光分光光度计（Hitachi，型号F4600，JP）测其荧光谱图，结果如图3所示，反应前巯基丙酸稳定的量子点发射波长646.6nm，巯基丙酸稳定的量子点经配体交换后周围极性减小，导致其定向极化率降低，斯托克斯位移较小，因此反应后巯基化低分子量肝素修饰的量子点发射波长减小至644.2nm。
利用琼脂糖凝胶电泳，根据其修饰后带电量以及分子量的区别，定性分析经不同量巯基化低分子量肝素修饰的量子点产物，参与反应的巯基丙酸稳定的量子点与巯基化低分子量肝素的摩尔比分别为3:8，3:4，3:2，3:1，6:1，结果如图4所示。泳动速率整体趋势先增后减，即随着修饰分子增多，电荷量增加，导致泳动速率增加，修饰分子继续增多，分子量增大，导致泳动速率减小。
用JEM-200CX透射电子显微镜（Hitachi，JP）对实施例3制得的巯基化低分子量肝素修饰的量子点的形貌及均匀性进行分析，结果如图8A、8B、8C所示。
结果证明，用此方法可得到粒径均匀，性能良好的巯基化低分子量肝素修饰的量子点。
实施例5功能肽的制备
a.legumain酶切型功能肽KPTNGGGVSRRRRRRGGRRRR（SEQ ID NO:1）的制备
参照多肽固相合成法，多肽链段均在2-氯-三苯甲基氯树脂上，从羧基端向氨基端延长，由此制得legumain酶切型功能肽KPTNGGGVSRRRRRRGGRRRR（SEQ ID NO:1）。
b.MMP-2酶切型功能肽KGGPLGVRGGVSRRRRRRGGRRRR（SEQ ID NO:2）及KGGPLGLAGGGVSRRRRRRGGRRRR（SEQ ID NO:3）的制备
制备方法同实步骤a，参照多肽固相合成法，多肽链段均在2-氯-三苯甲基氯树脂上，从羧基端向氨基端延长，由此制得MMP-2酶切型功能肽KGGPLGVRGGVSRRRRRRGGRRRR（SEQID NO:2）及KGGPLGLAGGGVSRRRRRRGGRRRR（SEQ ID NO:3）。
实施例6连接有淬灭剂的功能肽的合成过程与表征
a.连接有淬灭剂的legumain酶切型功能肽的制备
将BHQ-3或QSY-21（购自Biosearch Technologies）与1.2倍量功能肽（legumain酶切型，KPTNGGGVSRRRRRRGGRRRR（SEQ ID NO:1））的N,N-二甲基甲酰胺（DMF，购自国药集团化学试剂有限公司）溶液混合，加入1.5倍量N,N-二异丙基乙胺（DIEA，购自国药集团化学试剂有限公司），常温避光反应40h。高效液相色谱分析法监测合成过程，制备液相制备产物。DMSO溶解储存备用。
用质谱验证合成产物，结果如图5所示。
b.连接有淬灭剂的MMP-2酶切型功能肽的制备
将BHQ-3或QSY-21（购自Biosearch Technologies）与1.2倍量功能肽（MMP-2酶切型，KGGPLGVRGGVSRRRRRRGGRRRR（SEQ ID NO:2）或KGGPLGLAGGGVSRRRRRRGGRRRR（SEQ IDNO:3）的无水二甲基亚砜（DMSO，购自阿拉丁试剂）溶液混合，加入适量N-甲基吗啉（购自国药集团化学试剂有限公司），常温避光反应40h。高效液相色谱分析法监测合成过程，制备液相制备产物。DMSO溶解储存备用。
用质谱验证合成产物，如图6所示。
结果证明，合成方法有效，产物纯度较好。
实施例7肿瘤酶激活的量子点探针的自组装合成与表征
a.legumain型肿瘤酶激活的量子点探针的自组装合成
将适量的实施例3中制备的巯基化低分子量肝素修饰量子点少量多次快速涡旋加入实施例5中制备的连接有淬灭剂的功能肽（SEQ ID NO:1）中，巯基化低分子量肝素修饰量子点与连淬灭剂的功能肽自组装质量比例为10:1，荧光强度随之减弱。
b.MMP-2型肿瘤酶激活的量子点探针的自组装合成
制备同步骤a，将适量的实施例3中制备的巯基化低分子量肝素修饰的量子点少量多次快速涡旋加入实施例5中制备的连接有淬灭剂的功能肽（SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3）中。
由此制得legumain型肿瘤酶激活的量子点（SEQ ID NO:1）、MMP-2型肿瘤酶激活的量子点（SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3）。
用MALVERN ZELASIZER N粒度仪分析仪（型号ZEN3690，Malvern，UK）对legumain型肿瘤酶激活的量子点探针的粒径进行测定分析，结果如图7所示。
用JEM-200CX透射电子显微镜（日本日立公司）对legumain型肿瘤酶激活的量子点探针（SEQ ID NO:1）和MMP-2型肿瘤酶激活的量子点探针(SEQ ID NO:2)的形貌及均匀性进行分析，如图8D、8E为legumain型肿瘤酶激活的量子点探针（SEQ ID NO:1），8F为MMP-2型肿瘤酶激活的量子点探针（SEQ ID NO:2）。
用荧光分光光度计（型号F4600，Hitachi，JP）分析不同比例自组装形成legumain型肿瘤酶激活的量子点探针后荧光强度变化，结果如图9所示，其中巯基化低分子量肝素修饰的量子点与连接淬灭剂的功能肽（SEQ ID NO:1）的比例分别为100:0，100:1，40:1，20:1，10:1，1:1。
结果证明，此自组装方法可有效合成粒径均匀，荧光可调，可稳定存在的体系。
实验实施例
实验实施例1实施例7制备的legumain型肿瘤酶激活的量子点探针的活性
a.质粒提取
DQ891884.2（GenBank）是编码legumain酶的基因，本实施例中使用它作为报告基因。其克隆载体为pcDNA3，克隆位点为EcoRI/XhoI。将pcDNA3载体在JM109大肠杆菌中转化，于LB培养基中37℃，250rpm培养箱中过夜培养来扩增。质粒的提取和纯化使用Tiangenendofree maxi plasmid kit试剂盒，通过去内毒素纯化质粒过程完成。纯化后的质粒通过紫外260nm，280nm的吸收比值验证纯度和质量。稀释至0.2mg/ml，保存于-20℃备用。
b.体外转染实验
本实验主要采取293T细胞系为实验对象，使用外源质粒转染，复合物制备方法为PEI（线性PEI25kDa，PolyPlus-transfection公司）与实验实施例1步骤a所得legumain质粒以质量比1.3:1以等体积混合孵育30min。具体转染方法如下：将293T细胞系分别以6×104个/孔的密度接种到24孔板中，在培养箱（37℃、5%CO2）中培养24h，转染实验前将孔内旧培养基吸弃，加入上述复合物，补加无血清DMEM培养基至500μL每孔，与细胞共培养4h。然后将含复合物的培养基吸弃，重新加入500μL新鲜含血清DMEM培养基继续培养48h。
c.legumain酶活性检测
将b所得细胞的培养基吸弃，PBS润洗后每孔加入50-100μL裂解液，充分吹打以裂解细胞。吹打后的细胞裂解液反复冻融三次，然后以14000rpm离心20min，取上清20μL加入300μL含底物肽（AAN-ASN）的检测液中，37℃反应20min，利用荧光分光光度计检测其荧光值，激发波长为380nm。检测结果显示，转染后的293T细胞裂解液中含legumain酶，酶含量是未转染细胞裂解液的4-5倍。
d.酶切实验
特异性酶切实验结果如图10所示，legumain酶可切断legumain酶切型肿瘤酶激活的量子点探针，使荧光恢复，随着酶量增加，荧光恢复程度增大。
非特异性酶切实验结果如图10所示，胰酶不可切断肿瘤酶激活的量子点探针，胰酶量增加，荧光不会恢复。
体外酶切实验验证了legumain酶对legumain酶切型肿瘤酶激活的量子点探针的特异性酶切作用，初步证明了此体系的可行性。
e.细胞摄取
向b所得legumain+细胞与同样培养时间未经转染293T细胞中，加入等量的巯基化低分子量肝素修饰的量子点与legumain酶切型肿瘤酶激活的量子点探针，有血清培养基中共孵育时间5h。
用荧光显微镜（Hitachi，JP）检测细胞摄取状况，如图11所示。legumain酶切型肿瘤酶激活的量子点探针在转染前后293T细胞中摄取情况有明显区别，图11A-D显示转染前293T（legumain-）细胞中几乎无荧光（11A：明场图，11B：摄取图，11C核染色图，11D合并图），而图11E-H显示转染后293T（legumain+）细胞中可拍摄到明显荧光（11E：明场图，11F：摄取图，11G核染色图，11H合并图）。经DAPI染核后发现，QD红色荧光与DAPI蓝色重叠。
流式细胞仪定量分析细胞摄取状况，如图12所示。图A和C分别是实施例3制备的巯基化低分子量肝素修饰量子点在293T（legumain-）细胞和293T（legumain+）细胞中的摄取，图B和D分别是实施例7制备的legumain酶切型肿瘤酶激活的量子点探针在293T（legumain-）细胞和293T（legumain+）细胞中的摄取。由中位荧光值确定肿瘤酶激活的量子点探针在293T（legumain+）细胞中的摄取约是293T（legumain-）细胞中摄取的3倍。这说明，legumain酶切型肿瘤酶激活的量子点探针可进入细胞并被legumain酶特异性识别，切断功能肽后恢复荧光，最终实现肿瘤诊断检测功能。
实验实施例2实施例7制备的MMP-2型肿瘤酶激活的量子点探针的活性
a.酶切实验
特异性酶切实验结果如图13所示，MMP-2酶可特异性切断MMP-2酶切型肿瘤酶激活的量子点探针(SEQ ID NO:2)，使荧光恢复，其恢复程度与酶用量正相关。
非特异性酶切实验结果如图13所示，胰酶不可切断MMP-2酶切型肿瘤酶激活的量子点探针(SEQ ID NO:2)，恢复程度与胰酶用量无关。
体外酶切实验验证了MMP-2酶对MMP-2酶切型肿瘤酶激活的量子点探针的特异性酶切作用，证实了此肿瘤酶激活的量子点探针体系的实际可行性。
b.细胞毒性
取对数生长期的293T细胞消化后以1.5×104个/孔的密度接种到96孔板种，每孔加入100μL细胞悬液，用含血清DMEM培养基培养至80%-90%细胞面积（37℃，5%CO2）。通过预实验确定最佳药物剂量范围为0-400μg，分别加入0、3、6、12、24、48、96、192、384μg MMP-2型肿瘤酶激活的量子点探针（SEQ ID NO:3），每个浓度6个复孔，培养24h，加入MTT（5mg/mL，购自美国Amresco公司）20μL，培养4h，加DMSO200μL，震荡使结晶物充分溶解混匀。
用酶标仪（型号：51119300FI，Fisher）测定各组OD值，主波长为570nm，参考波长为490nm。计算各组的细胞增殖抑制率：增殖抑制率（%）=（对照组OD值-实验组OD值）/对照组OD值×100%。结果如图14所示。
此外，本发明人还采用类似方法测定了legumain型肿瘤酶激活的量子点探针（SEQID NO:1）与另一种MMP-2型肿瘤酶激活的量子点探针（SEQ ID NO:2）的毒性，证实二者的毒性数据是相似的，即最大给药剂量484μg时细胞存活率不低于75%。
结果表明，巯基化低分子量肝素修饰的量子点经修饰后其毒性较巯基丙酸稳定的量子点有明显降低，肿瘤酶激活的量子点探针的毒性极小，在可接受的安全范围内，适合用于肿瘤诊断检测。
综上所述，肿瘤酶激活的量子点探针兼备在正常组织中的隐形性与在肿瘤部位的肿瘤酶敏感性的双重性能，可有效靶向肿瘤细胞，在肿瘤酶特异性作用下量子点探针恢复荧光，达到肿瘤诊断检测效果，有望成为新型的肿瘤诊断检测药物。
Claims (26)
1.一种肿瘤酶激活的量子点探针，所述肿瘤酶激活的量子点探针为经修饰含有功能肽的量子点探针，其中，所述功能肽的一端连接有淬灭剂，以及所述肿瘤酶能够特异性识别并切断所述功能肽以使量子点发光，其中，所述功能肽包含肿瘤酶底物肽和穿膜肽，其中，所述肿瘤酶底物肽含有特异性肿瘤酶酶切位点，在肿瘤部位的肿瘤酶的作用下可被特异性识别并切断。
2.根据权利要求1所述的肿瘤酶激活的量子点探针，其中，所述功能肽的长度为19-33个氨基酸。
3.根据权利要求1所述的肿瘤酶激活的量子点探针，其中，所述肿瘤酶激活的量子点探针是通过使经修饰后带负电的量子点与带正电的连接有淬灭剂的功能肽自组装连接而成。
4.根据权利要求1所述的肿瘤酶激活的量子点探针，其中，所述肿瘤酶底物肽位于所述功能肽的N端，所述穿膜肽位于所述功能肽在C端。
5.根据权利要求4所述的肿瘤酶激活的量子点探针，其中，所述淬灭剂偶联在所述肿瘤酶底物肽上。
6.根据权利要求1所述的肿瘤酶激活的量子点探针，其中，所述肿瘤酶是天冬酰氨内肽酶legumain或基质金属蛋白酶-2(MMP-2)。
7.根据权利要求6所述的肿瘤酶激活的量子点探针，其中，所述肿瘤酶底物肽的氨基酸序列为legumain酶切特异性序列PTN，或者MMP-2酶切特异性序列PLGVR或PLGLAG，或者为含有上述序列的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的肿瘤酶激活的量子点探针，其中，所述穿膜肽的氨基酸序列为富含精氨酸或赖氨酸的氨基酸序列。
9.根据权利要求8所述的肿瘤酶激活的量子点探针，其中，所述穿膜肽的氨基酸序列长度为3-20个氨基酸。
10.根据权利要求8所述的肿瘤酶激活的量子点探针，其中，所述穿膜肽的氨基酸序列长度为8-16氨基酸。
11.根据权利要求8所述的肿瘤酶激活的量子点探针，其中，所述穿膜肽氨基酸序列为VSRRRRRRGGRRRR。
12.根据权利要求1所述的肿瘤酶激活的量子点探针，其中，在所述功能肽的氨基末端引入含有ε-氨基的氨基酸。
13.根据权利要求12所述的肿瘤酶激活的量子点探针，其中，在含有ε-氨基的氨基酸与肿瘤酶底物肽之间和/或在肿瘤酶底物肽与穿膜肽之间设置保护所述特异性肿瘤酶酶切位点的氨基酸。
14.根据权利要求13所述的肿瘤酶激活的量子点探针，其中，所述保护所述特异性肿瘤酶酶切位点的氨基酸的数量为1-6个。
15.根据权利要求1所述的肿瘤酶激活的量子点探针，其中，当所述肿瘤酶是legumain时，所述功能肽的序列为KPTNGGGVSRRRRRRGGRRRR(SEQ ID NO:1)；当所述肿瘤酶是MMP-2时，所述功能肽的序列为KGGPLGVRGGVSRRRRRRGGRRRR(SEQ ID NO:2)或KGGPLGLAGGGVSRRRRRRGGRRRR(SEQ ID NO:3)。
16.根据权利要求1所述的肿瘤酶激活的量子点探针，其中，在所述肿瘤酶激活的量子点探针中，所述量子点是碲化镉(CdTe)量子点。
17.根据权利要求1所述的肿瘤酶激活的量子点探针，其中，在所述肿瘤酶激活的量子点探针中，所述量子点是经巯基化线性大分子修饰的。
18.根据权利要求17所述的肿瘤酶激活的量子点探针，其中，所述量子点是经巯基化低分子量肝素修饰的。
19.根据权利要求18所述的肿瘤酶激活的量子点探针，其中，所述低分子量肝素的分子量为3500-5500。
20.根据权利要求1所述的肿瘤酶激活的量子点探针，其中，所述肿瘤酶激活的量子点探针的发射波长为600nm以上。
21.根据权利要求20所述的肿瘤酶激活的量子点探针，其中，所述肿瘤酶激活的量子点探针的发射波长为600nm-900nm。
22.一种制备权利要求1所述的肿瘤酶激活的量子点探针的方法，包括以下步骤：
(1)巯基丙酸稳定量子点的制备；
(2)巯基化低分子量肝素的制备：(a)使低分子量肝素在pH2.0-4.0缓冲液中经高碘酸钠氧化，(b)将(a)所得氧化产物于pH6.0-8.0缓冲液中与半胱氨酸盐酸盐反应，(c)向(b)所得产物中缓慢加入硼氢化钠；
(3)巯基化低分子量肝素修饰量子点的制备：于巯基丙酸稳定的量子点溶液中加入巯基化低分子量肝素，平衡反应即得；
(4)连接有淬灭剂的功能肽的制备：将功能肽与淬灭剂于N-甲基吗啉催化下在无水二甲基亚砜中反应即得，并经高效液相色谱仪分析制备产物；
(5)自组装合成：将步骤(3)制得的巯基化低分子量肝素修饰量子点少量多次快速涡旋加入步骤(4)制得连接有淬灭剂的功能肽中，室温平衡即得。
23.根据权利要求22所述的制备肿瘤酶激活的量子点探针的方法，其中，上述步骤(3)中，所述巯基化低分子量肝素修饰量子点与连接有淬灭剂的功能肽自组装质量比例为1:1至100:1间的任一比例。
24.权利要求1至21中任一项所述的肿瘤酶激活的量子点探针在制备用于肿瘤诊断检测的试剂中的用途。
25.根据权利要求24所述的用途，其中，所述肿瘤包括所有肿瘤酶表达的肿瘤。
26.根据权利要求24所述的用途，其中，所述肿瘤包括乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、中枢神经系统肿瘤、淋巴癌、黑色素瘤。
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