CN107648618B - 一种药物递送体系及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种药物递送体系及其制备方法与应用，所述药物递送体系包括分子识别部分、组装部分、响应部分、功能分子部分和任选的长循环部分，所述组装部分与响应部分连接，所述分子识别部分连接至响应部分或组装部分，所述功能分子部分连接在组装部分中远离响应部分的一端的侧链上，所述长循环部分与响应部分连接，通过本发明制备方法制备的药物递送体系，大大提高了药物或成像剂的分子递送效率，增强病灶部位滞留时间，提高了药物或者造影剂的病灶部位富集效率，提高药物生物利用度、减少给药频次、提高药物的安全性，为纳米药物的临床转化的瓶颈问题提供了新的递药思路和技术手段。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料领域，涉及一种药物递送体系及其制备方法与应用。
背景技术
超分子纳米药物递送作为纳米药物递送中一支重要的组成部分，其中一些典型的纳米载体如脂质体等已经成功进入临床使用。但是，超分子纳米药物递送体系依然面临着比较严峻的挑战，例如由于非共价的组成使其在复杂生理环境下的稳定性备受质疑。此外，纳米材料由于其不同的表面理化性质、尺寸效应、形状效应、材料构成等等也使得不同的纳米递送体系表现出来迥异的生理界面作用、代谢途径以及生理毒性等性质。针对这些问题，纳米材料的研发和改进近年来有了长足的发展，但是低的药物递送效率依然存在。根据2016年发表的综述报道(Nature Reviews Materials 2016,1,16014)，近10年来的各类纳米药物递送体系在活体内的药物平均递送效率低于0.7％。因此提高药物递送效率，同时减少纳米药物生物毒性依然是纳米药物递送体系发展中的两大重要任务。
在超分子组装基元中，多肽为基础的超分子组装体系由于其生物相容性好、合成方法成熟等特点成为首先的材料体系。在大量的体外超分子自组装研究中，多肽的自组装的主要推动力为弱作用力，例如：氢键、范德华力、静电相互作用、π-π相互作用等。并且通过氨基酸序列的设计，可实现特定形貌的可控超分子自组装。同时，多肽的超分子组装可以在复杂的生理环境中实现。例如，Xu研究组利用细胞内的磷酸酶使得入胞的多肽去磷酸化，增强的疏水作用导致在细胞内发生了凝胶化的超分子组装。Rao研究组利用一种生物正交反应，成功实现了多肽分子在细胞内的超分子组装。本研究也在前期设计了叶绿素修饰的多肽材料，通过明胶酶的分子剪切实现了在活体内的纳米纤维结构的超分子组装。
近年来我们提出了“活体自组装”理念，其精髓在于将单分子药物主动靶向递送到病灶部位并实现原位的分子裁剪和组装，使得组装体具有特殊的生物功能，有望实现高效的药物递送和长期置留。这种方法结合了小分子和纳米材料各自的优势，不仅可以大大提高分子的递送效率，还能极大程度的降低系统生物毒性。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种药物递送体系及其制备方法与应用，巧妙设计多肽序列，实现在活体内的超分子组装体系用于高效药物递送。同时，在复杂生理环境中获取药物动力学信息，证实了活体自组装策略的高效药物递送和长效药物滞留。该药物递送体系，为纳米材料递送提供了新思路和新的材料设计理念。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种药物递送体系，所述药物递送体系包括分子识别部分、组装部分、响应部分、功能分子部分和任选的长循环部分，所述组装部分与响应部分连接，所述分子识别部分连接至响应部分或组装部分，所述功能分子部分连接在组装部分中远离响应部分的一端的侧链上，所述长循环部分与响应部分连接。
在本发明中，药物递送体系可以主动靶向到病灶部位，在病灶部位通过被激活的高表达的酶对分子进行裁剪实现高效的原位组装，形成特定的纳米结构，长期高效滞留在病灶部位，实现药物的高效递送和长效富集。
在本发明中，裁剪是通过病灶部位过表达的特定酶进行的，包括肿瘤微环境中过表达的MMP家族、肿瘤相关层纤维细胞膜过表达的蛋白酶FAPα、细胞内被激活的caspase家族和组织蛋白酶CatB(cathepsin B)、细菌感染微环境过表达的白明胶酶(gelatinase)或凝固酶(coagulase)、急性肝损伤中过表达的谷氨酰胺转肽酶、神经纤维肿瘤中高表达的谷氨酰胺转移酶等。
其中，本发明中不含有长循环部分的药物递送体系结构如图12A所示。
其中，本发明中含有长循环部分的药物递送体系结构如图12B所示。
在本发明中，所述分子识别部分为具有蛋白识别或受体靶向功能的多肽序列。
优选地，所述分子识别部分为多肽序列AVPI、VAPI、RGD或GFLG中的任意一种。
优选地，所述多肽序列AVPI、VAPI对应的识别蛋白为X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP蛋白)、多肽序列RGD对应的识别蛋白为整合素αvβ3，多肽序列GFLG对应的识别蛋白为组织蛋白酶CatB。
进一步优选为AVPI序列和与其对应识别的XIAP蛋白、RGD序列和与其对应的识别蛋白整合素αvβ3。
在本发明中，所述响应部分为含有功能酶底物的多肽序列。
优选地，所述功能酶为水解酶、聚合酶、转肽酶或端粒酶中的任意一种。
优选地，所述响应部分的响应性序列长度为3～10个氨基酸，例如氨基酸个数可以是3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个。
优选地，所述响应部分被酶切后连接在组装部分的一端上的氨基酸个数少于3个。
优选地，所述响应部分为肿瘤微环境过表达的MMP-2酶的多肽底物、Caspase3/7响应序列、FAP-α响应序列、组织蛋白酶CatB响应序列、细菌感染微环境中白明胶酶和凝固酶的底物序列、急性肝损伤中过表达的谷氨酰胺转肽酶底物序列或神经纤维肿瘤中高表达的谷氨酰胺转移酶底物序列中的任意一种；进一步优选为Caspase3/7响应序列DEVD或FAP-α响应序列GPA。
在本发明中，所述组装部分为具有β-折叠组装、β-转角组装或α-螺旋组装功能的多肽序列，优选具有β-折叠组装功能的多肽序列。
优选地，所述具有β-折叠组装功能的多肽序列为KLVFFAED、AIIGLMV或RARADADARARADADA，优选多肽序列KLVFFAED。
优选地，所述具有β-转角组装功能的多肽序列为VKVKVRVKDPPTKVKVRVKV或者VKVKVKVKDPPTKVKVKVKV。
优选地，所述具有α-螺旋组装功能的多肽序列为KLAQAVE、KLARAVE或KLAYANE。
在本发明中，多肽的组装通过非共价键超分子组装或者共价键聚合组装实现；所述的超分子组装驱动力为氢键、输水作用、范德华力、π-π堆积或静电相互作用等；组装过程为成核生长过程，在生理条件下组装的最低浓度小于10-6M。
在本发明中，所述功能分子部分为药物分子、造影剂、核酸或蛋白质类分子中的任意一种。
优选地，所述功能分子为化疗药物、成像剂或放疗药物中的任意一种。
优选地，所述化疗药物为DOX。
优选地，所述成像剂为Cy系列的光学造影剂、Cy系列的光声造影剂、Gd(III)核磁造影剂、全氟碳超声造影剂或18F放射探针中的任意一种；进一步地，优选成像剂为Cy7-Cl分子，其结构如下所示：
优选地，所述放疗药物为氮-三(羟甲基)甲基甘氨酸与三磺化三苯基膦共同耦合的99mTc、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸耦合的177Lu3+或1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸耦合的90Y3+中的任意一种。
优选地，所述功能分子通过生物可降解的化学键或生物惰性的化学键连接在组装部分中远离响应部分的一端的侧链上；所述生物可降解的化学键应用于药物释放，所述生物惰性的化学键应用于稳定成像剂。
在本发明中，所述长循环部分为聚乙二醇链，分子量为1000-5000，例如可以是1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000。
优选地，所述聚乙二醇链的分子量为2000。
在本发明中，所述药物递送体系具有如式I或式II所示的结构：
在本发明中，通过多肽固相合成法合成分子识别部分、响应部分和组装部分的多肽序列并连接，而后连接上功能分子和任选的长循环部分，得到所述药物递送体系。
优选地，所述药物递送体系中多肽的分子量为2500～5000，例如可以是2500、2700、2900、3500、3700、4000、4100、4500、4800或5000。
在本发明中，所述式I所示结构的分子为AVPIAQKDEVDKLVFFAEC(Cy)G，其中剪切位点位于V与D之间，式I所示结构的分子合成步骤如下所述：
(1)将第一个氨基酸(赖氨酸)的C端固定于树脂上，N端利用Fmoc进行保护；
(2)脱去步骤(1)中第一个氨基酸的N端保护，而后连接下一个氨基酸进行反应；最终将所有氨基酸连接成固定于树脂的多肽；
(3)将步骤(2)所述的多肽与荧光分子Cy7-Cl反应，经处理纯化得到式I所示结构的分子。
优选地，步骤(1)中所述树脂为0.35mM修饰密度的Wang树脂。
优选地，步骤(2)中脱去N端保护的试剂为在DMF中体积分数为20％的六氢吡啶。
优选地，步骤(2)中脱保护检测试剂为茚三酮。
优选地，步骤(2)中连接氨基酸制备得到多肽所用的方法为：将要连接上的氨基酸的羧基用0.4M的N-甲基吗啉(NMM)和10倍于氨基酸的苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)的DMF溶液活化，加入到脱去保护的树脂中反应2小时，而后依次连接氨基酸，得到多肽。
优选地，步骤(3)多肽与Cy7-Cl的反应式如下所示：
优选地，步骤(3)中多肽与Cy7-Cl反应的摩尔比为1:1～1.2，例如可以是1:1、1:1.05、1:1.1、1:1.15或1:1.2，优选1:1.1。
优选地，步骤(3)的反应在磷酸盐缓冲液(PBS)中室温进行。
优选地，步骤(3)反应的时间为1～3小时，例如可以是1小时、1.5小时、2小时、2.5小时或3小时，优选2小时。
优选地，步骤(3)中处理纯化的方法为：用二氯甲烷洗3次反应液，除去未反应的Cy7-Cl分子，而后将水相加入到透析袋中用水透析纯化，冻干得到式I所示结构的分子。
在本发明中，所述式II所示结构的分子为mPEG-GPAKLVFFGC(Cy)GRGD，其中剪切位点位于P与A之间，式II所示结构的成像分子合成步骤如下所述：
(1)此步骤与式I所示结构的分子合成步骤(1)相同；
(2)此步骤与式I所示结构的分子合成步骤(2)相同；
(3)将甲氧基PEG与上述步骤(2)得到的多肽在树脂中进行反应，洗脱、纯化，得到纯化的多肽；
(4)将步骤(3)中得到的纯化多肽与Cy7-Cl反应，反应结束后得到所述式II所示结构的分子。
优选地，步骤(3)中所述甲氧基PEG的分子量为1000-5000，例如可以是1000、2000、3000、4000或5000，优选2000。
优选地，步骤(3)中所述甲氧基PEG经过NHS活化。
优选地，步骤(3)中所述反应为常温震荡反应10-15小时，例如可以是10小时、11小时、12小时、13小时、14小时或15小时。
优选地，步骤(3)中所述洗脱使用的洗脱剂为含有体积分数为2.5％水和2.5％三异丙基硅烷的三氟乙酸溶液。
优选地，步骤(3)中所述洗脱后，旋转蒸发除去三氟乙酸，而后用无水乙醚沉淀，洗涤、干燥得到式II所示结构的分子的粗产品。
优选地，步骤(3)中将所述粗产品利用反相制备液相色谱纯化，得到纯化的多肽。
优选地，步骤(4)中多肽与Cy7-Cl反应投料摩尔比为1:1～1.2，例如可以是1:1、1:1.05、1:1.1、1:1.15或1:1.2，优选1:1.1。
优选地，步骤(4)的反应在磷酸盐缓冲液(PBS)中室温进行。
优选地，步骤(4)反应的时间为1～3小时，例如可以是1小时、1.5小时、2小时、2.5小时或3小时，优选2小时。
优选地，步骤(4)中结束后处理的方法为：用二氯甲烷洗3次反应液，除去未反应的Cy7-Cl分子，而后将水相加入到透析袋中用水透析纯化，冻干得到式I所示结构的分子。
在本发明中，通过上述制备方法制备得到的药物递送体系，在病灶部位可以被酶剪切组装成纳米纤维，具有纳米材料在病灶部位的药时曲线下面积(AUC0-∞)大，清除半衰(T1/2(β))期长、药物缓释的功能，即表现出有效富集、长效滞留和缓慢释药的特点；在病灶以外的重要器官中，表现小分子行为，具有快速的分布半衰期(T1/2(α))和清除半衰期(T1/2(β))以及低药物毒性的特点。
在本发明中，药物分子的标记可以实现在生理环境下高效释放药物分子，释放的药物分子无修饰残留，保持药物分子功能，修饰方法如下所示：
药物分子与多肽在PBS缓冲液中，室温反应2小时，得到药物分子修饰的多肽分子。
在本发明中，提供一种所述的药物递送体系作为药物递送材料或造影剂材料的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
在本发明中，药物递送体系可以主动靶向到病灶部位，在病灶部位通过被激活的高表达的酶对分子进行裁剪实现高效的原位组装，形成特定的纳米结构，长期高效滞留在病灶部位，实现药物的高效递送和长效富集。
在本发明中，药物递送体系中药物的动力学行为表现是：在病灶部位表现纳米材料行为(有效富集、长效滞留和缓慢释药等)；在病灶部位之外的器官中表现小分子行为(快速清除和低药物毒性)。所述纳米药物递送体系可以提高药物或者造影剂的病灶部位富集效率，提高药物生物利用度、减少给药频次、提高药物的安全性，为纳米药物的临床转化的瓶颈问题提供了新的递药思路和技术手段。
附图说明
图1是本发明实施例1制备的多肽成像剂分子结构及其剪切位点图。
图2是本发明实施例1制备的多肽成像剂分子结构的质谱图。
图3是本发明实施例1制备的多肽成像剂分子在细胞内的识别以及响应组装过程示意图。
图4A是本发明实施例1制备的多肽成像剂分子圆二色谱图。
图4B是本发明实施例1制备的多肽成像剂分子红外光谱图。
图4C是本发明实施例1制备的多肽成像剂分子X射线衍射图。
图4D是本发明实施例1制备的多肽成像剂分子组装成β-折叠结构示意图。
图4E是本发明实施例1制备的多肽成像剂分子被剪切后的纳米组装结构扫描电镜图(标尺100nm)。
图4F是本发明实施例1制备的多肽成像剂分子被剪切后的纳米组装结构的纳米纤维直径示意图。
图5是本发明实施例1制备的多肽成像剂分子在细胞成像中应用结果图。
图6A是本发明实施例1制备的多肽成像剂分子在小鼠中的成像图。
图6B是本发明实施例1制备的多肽成像剂分子在小鼠器官成像的分布图。
图7是本发明实施例2制备的多肽药物分子结构及其酶切位点图。
图8A是本发明实施例2制备的多肽药物分子的质谱表征数据图。
图8B是本发明实施例2制备的多肽药物分子被剪切后的纳米形貌电镜图(标尺0.2μm)。
图9A是本发明实施例2制备的多肽药物分子在肿瘤及肿瘤相关层纤维细胞表面的特异性纤维形貌不组装的对照分子示意图。
图9B是本发明实施例2制备的多肽药物分子在肿瘤及肿瘤相关层纤维细胞表面的特异性纤维形貌组装示意图。
图10A是本发明实施例2制备的多肽药物分子在小鼠体内的特异性富集图。
图10B是本发明实施例2制备的多肽药物分子不组装的对照分子在小鼠体内富集图。
图11是本发明实施例2制备的多肽药物分子在小鼠体内的肿瘤光热治疗效果图。
图12A本发明中不含长循环部分的药物递送体系结构示意图。
图12B本发明中含有长循环部分的药物递送体系结构示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例通过以下方法制备多肽成像剂(式I所示结构的分子)：
该分子以Cy7为功能分子，分子识别部分序列为AVPIAQK，响应部分的底物多肽序列为DEVD，组装部分的多肽序列为KLVFFAECG，分子结构、剪切位点如图1所示，合成步骤如下：
选用0.35mM修饰密度的Wang树脂，将第一个氨基酸(赖氨酸)的N端被Fmoc保护，C端固定于树脂上。用体积分数在DMF中为20％的六氢吡啶溶液脱去N端的Fmoc保护，然后用茚三酮测试法检测脱保护结果。然后将下一个氨基酸的羧基用0.4M的N-甲基吗啉(NMM)和10倍于氨基酸的苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)的DMF溶液活化，并加入到脱去保护的树脂中反应2小时。按此方法，将剩余的所有氨基酸都通过缩合反应连接上去，形成固定于树脂的连接多肽；而后将多肽分子和Cy7-Cl按照投料的摩尔比1:1.1在PBS中室温反应2h。反应液用二氯甲烷洗3次除去未反应的Cy7-Cl分子，将水相加入到透析袋中用去离子水透析纯化，最后冻干得到Cy7-Cl标记的多肽成像剂分子(式I所示结构的分子)，分子的质谱表征如图2所示。
多肽成像剂的测试：
上述制备得到的分子在细胞内识别与组装过程的示意图如图3所示，具体过程如下：
多肽成像剂分子(AVPIAQKDEVDKLVFFAEC(Cy)G)通过小分子扩散途径进入细胞；随后在细胞质中特异性的与凋亡蛋白抑制剂结合，激活Caspase-3/7；激活的Caspase-3/7对分子进行剪切，在原位自组装形成纳米纤维的结构；形成的纳米纤维具有β-sheet结构可以稳定Cy7分子的荧光信号。
多肽成像剂分子被Caspase-3剪切后，剩余的分子部分会快速实现纤维化组装，组装结构表征结果如图4A-4F所示，在HEPES缓冲溶液中多肽成像剂分子与Caspase-3以底物与酶的比例为1μM/U相互作用2h，圆二光谱(CD)(图4A所示)和傅里叶红外光谱(FTIR)表征(图4B所示)中显示，修饰Cy7分子后多肽成像剂表现为无规则折叠，而剪切后的底物分子表现为典型的反平行β-折叠组装结构；随后通过XRD(图4C、图4D所示)和TEM(图4E、图4F所示)观察到的纳米纤维直径为5.8±0.6nm，与底物模拟的结构相吻合。
将多肽成像剂分子与XIAP过表达的肿瘤细胞H460以及XIAP低表达的肿瘤细胞A549和正常细胞293T共孵育，如图5所示，结果表明XIAP的特异性识别以及分子剪切可以有效实现细胞内的原位纳米纤维组装，并实现有效延长成像时间到48小时，同时实现了特异性的细胞成像。
将多肽成像剂分子以尾静脉注射方式注射到非小细胞肺癌小鼠模型中，可以在小鼠体内实现特异性的肿瘤成像，如图6A所示，成像时间可以延长到5天，同时，器官分布表明，图6B所示，该方法可以实现在肿瘤处的高量富集并减少在肝肾等代谢器官中的滞留。
通过计算多肽成像剂分子在小鼠体内的代谢动力行为，如表1-4所示，通过成像剂分子(具有识别组装功能)、无识别功能对照分子(无识别单元但是有组装单元)以及有识别功能小分子(有识别单元无组装单元的小分子)之间的对比，证实该药物递送体系，可以实现在肿瘤部位的纳米材料代谢特征，同时在其他脏器中表现为小分子药物的代谢行为。
表1.尾静脉注射48小时间的药物浓度时间曲线下的面积AUC0→48(mg/L·h)
表2尾静脉注射的主要脏器分布半衰期T1/2(α)(h)
表3.尾静脉注射的主要脏器清除半衰期T1/2(β)(h)
表4.分子在肿瘤部位的药代动力学参数
实施例2
本实施例通过以下方法制备多肽药物分子(式II所示结构的分子)：
该分子以Cy7为光热治疗药物，分子的靶向识别序列为RGD，响应性底物多肽序列为GPA，组装多肽序列为KLVFFGCG；分子结构以及相应位点如图7所示，合成步骤如下：
(1)选用0.35mM修饰密度的Wang树脂，将第一个氨基酸(赖氨酸)的N端被Fmoc保护，C端固定于树脂上。用体积分数在DMF中为20％的六氢吡啶溶液脱去N端的Fmoc保护，然后用茚三酮测试法检测脱保护结果。然后将下一个氨基酸的羧基用0.4M的N-甲基吗啉(NMM)和10倍于氨基酸的苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)的DMF溶液活化，并加入到脱去保护的树脂中反应2小时。按此方法，将剩余的所有氨基酸都通过缩合反应连接上去，形成固定于树脂的连接多肽。
(2)将NHS活化的甲氧基PEG2000，与上述合成多肽的树脂进行反应，常温震荡反应12小时后，然后用含有2.5％水和2.5％三异丙基硅烷的三氟乙酸溶液将合成好的多肽从树脂上脱除，同时脱除氨基酸的侧链保护；将三氟乙酸用旋转蒸发法去除，然后多肽的粗产物用无水乙醚沉淀，洗涤并干燥；最后选用反相制备液相色谱，将多肽纯化。纯化过程的条件为：流动相是含有0.1％三氟乙酸的乙腈和含有0.1％三氟乙酸的双蒸水；参数是梯度洗脱从体积分数5％乙腈和95％水到60％乙腈和40％水，流速为10mL/min，处理时间为30min。
(3)将多肽分子和Cy7-Cl按照投料的摩尔比1:1.1在PBS中室温反应2h。反应液用二氯甲烷洗3次除去未反应的Cy7-Cl分子，将水相加入到透析袋中用去离子水透析纯化，最后冻干得到多肽药物分子(式II所示结构的分子)，质谱数据如图8A所示。
上述实施例制备的多肽药物分子可以靶向到整合素αvβ3过表达的肿瘤细胞，被肿瘤相关层纤维细胞膜表面过表达的FAP-α蛋白剪切，可以在肿瘤相关层纤维细胞表面形成纳米纤维组装，微观结构如图8B所示，结果表明，该分子特异性的在肿瘤相关层纤维细胞表面定位形成纳米纤维组装，并实现高量富集。
将多肽药物分子以尾静脉给药方式，注射到小鼠体内，如图9A与图9B所示，其中PC3为肿瘤细胞，CRF为肿瘤相关层纤维细胞。相较于不发生组装的分子，该多肽药物分子可以特异性的富集滞留在肿瘤部位，而不组装的对照分子则无法特异性富集，如图10A、图10B所示；此外，通过与PBS缓冲液、不组装的对照分子对比结果(如图11)显示，该多肽药物分子对肿瘤抑制效果非常显著，能够实现对肿瘤的光热治疗。
实施例3
本实施例通过以下方法制备多肽成像剂(式I所示结构的分子)：
该分子以Cy7为功能分子，分子识别部分序列为AVPIAQK，响应部分的底物多肽序列为DEVD，组装部分的多肽序列为KLVFFAECG，分子结构、剪切位点如图1所示，合成步骤如下：
选用0.35mM修饰密度的Wang树脂，将第一个氨基酸(赖氨酸)的N端被Fmoc保护，C端固定于树脂上。用体积分数在DMF中为20％的六氢吡啶溶液脱去N端的Fmoc保护，然后用茚三酮测试法检测脱保护结果。然后将下一个氨基酸的羧基用0.4M的N-甲基吗啉(NMM)和10倍于氨基酸的苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)的DMF溶液活化，并加入到脱去保护的树脂中反应2小时。按此方法，将剩余的所有氨基酸都通过缩合反应连接上去，形成固定于树脂的连接多肽；而后将多肽分子和Cy7-Cl按照投料的摩尔比1:1在PBS中室温反应1h。反应液用二氯甲烷洗3次除去未反应的Cy7-Cl分子，将水相加入到透析袋中用去离子水透析纯化，最后冻干得到Cy7-Cl标记的多肽成像剂分子(式I所示结构的分子)。
实施例4
本实施例通过以下方法制备多肽成像剂(式I所示结构的分子)：
该分子以Cy7为功能分子，分子识别部分序列为AVPIAQK，响应部分的底物多肽序列为DEVD，组装部分的多肽序列为KLVFFAECG，分子结构、剪切位点如图1所示，合成步骤如下：
选用0.35mM修饰密度的Wang树脂，将第一个氨基酸(赖氨酸)的N端被Fmoc保护，C端固定于树脂上。用体积分数在DMF中为20％的六氢吡啶溶液脱去N端的Fmoc保护，然后用茚三酮测试法检测脱保护结果。然后将下一个氨基酸的羧基用0.4M的N-甲基吗啉(NMM)和10倍于氨基酸的苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)的DMF溶液活化，并加入到脱去保护的树脂中反应2小时。按此方法，将剩余的所有氨基酸都通过缩合反应连接上去，形成固定于树脂的连接多肽；而后将多肽分子和Cy7-Cl按照投料的摩尔比1:1.2在PBS中室温反应3h。反应液用二氯甲烷洗3次除去未反应的Cy7-Cl分子，将水相加入到透析袋中用去离子水透析纯化，最后冻干得到Cy7-Cl标记的多肽成像剂分子(式I所示结构的分子)。
实施例5
本实施例通过以下方法制备多肽药物分子(式II所示结构的分子)：
该分子以Cy7为光热治疗药物，分子的靶向识别序列为RGD，响应性底物多肽序列为GPA，组装多肽序列为KLVFFGCG；分子结构以及相应位点如图7所示，合成步骤如下：
(1)选用0.35mM修饰密度的Wang树脂，将第一个氨基酸(赖氨酸)的N端被Fmoc保护，C端固定于树脂上。用体积分数在DMF中为20％的六氢吡啶溶液脱去N端的Fmoc保护，然后用茚三酮测试法检测脱保护结果。然后将下一个氨基酸的羧基用0.4M的N-甲基吗啉(NMM)和10倍于氨基酸的苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)的DMF溶液活化，并加入到脱去保护的树脂中反应2小时。按此方法，将剩余的所有氨基酸都通过缩合反应连接上去，形成固定于树脂的连接多肽。
(2)将NHS活化的甲氧基PEG1000，与上述合成多肽的树脂进行反应，常温震荡反应15小时后，然后用含有2.5％水和2.5％三异丙基硅烷的三氟乙酸溶液将合成好的多肽从树脂上脱除，同时脱除氨基酸的侧链保护；将三氟乙酸用旋转蒸发法去除，然后多肽的粗产物用无水乙醚沉淀，洗涤并干燥；最后选用反相制备液相色谱，将多肽纯化。纯化过程的条件为：流动相是含有0.1％三氟乙酸的乙腈和含有0.1％三氟乙酸的双蒸水；参数是梯度洗脱从体积分数5％乙腈和95％水到60％乙腈和40％水，流速为10mL/min，处理时间为30min。
(3)将多肽分子和Cy7-Cl按照投料的摩尔比1:1在PBS中室温反应3h。反应液用二氯甲烷洗3次除去未反应的Cy7-Cl分子，将水相加入到透析袋中用去离子水透析纯化，最后冻干得到多肽药物分子(式II所示结构的分子)。
实施例6
本实施例通过以下方法制备多肽药物分子(式II所示结构的分子)：
该分子以Cy7为光热治疗药物，分子的靶向识别序列为RGD，响应性底物多肽序列为GPA，组装多肽序列为KLVFFGCG；分子结构以及相应位点如图7所示，合成步骤如下：
(1)选用0.35mM修饰密度的Wang树脂，将第一个氨基酸(赖氨酸)的N端被Fmoc保护，C端固定于树脂上。用体积分数在DMF中为20％的六氢吡啶溶液脱去N端的Fmoc保护，然后用茚三酮测试法检测脱保护结果。然后将下一个氨基酸的羧基用0.4M的N-甲基吗啉(NMM)和10倍于氨基酸的苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)的DMF溶液活化，并加入到脱去保护的树脂中反应2小时。按此方法，将剩余的所有氨基酸都通过缩合反应连接上去，形成固定于树脂的连接多肽。
(2)将NHS活化的甲氧基PEG5000，与上述合成多肽的树脂进行反应，常温震荡反应10小时后，然后用含有2.5％水和2.5％三异丙基硅烷的三氟乙酸溶液将合成好的多肽从树脂上脱除，同时脱除氨基酸的侧链保护；将三氟乙酸用旋转蒸发法去除，然后多肽的粗产物用无水乙醚沉淀，洗涤并干燥；最后选用反相制备液相色谱，将多肽纯化。纯化过程的条件为：流动相是含有0.1％三氟乙酸的乙腈和含有0.1％三氟乙酸的双蒸水；参数是梯度洗脱从体积分为5％乙腈和95％水到60％乙腈和40％水，流速为10mL/min，处理时间为30min。
(3)将多肽分子和Cy7-Cl按照投料的摩尔比1:1.2在PBS中室温反应1h。反应液用二氯甲烷洗3次除去未反应的Cy7-Cl分子，将水相加入到透析袋中用去离子水透析纯化，最后冻干得到多肽药物分子(式II所示结构的分子)。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种药物递送体系及其制备方法与应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (4)
1.一种药物递送体系，其特征在于，所述药物递送体系包括分子识别部分、组装部分、响应部分、功能分子部分和任选的长循环部分，所述组装部分与响应部分连接，所述分子识别部分连接至响应部分或组装部分，所述功能分子部分连接在组装部分中远离响应部分的一端的侧链上，所述长循环部分与响应部分连接；
所述分子识别部分为多肽序列AVPI或RGD；所述响应部分为Caspase3/7响应序列DEVD或FAP-α响应序列GPA；所述组装部分为多肽序列KLVFFAED；所述功能分子部分为Cy7-Cl；所述长循环部分为聚乙二醇链；
所述药物递送体系具有如式I或式II所示的结构：
2.根据权利要求1所述的药物递送体系，其特征在于，所述聚乙二醇链的分子量为1000-5000。
3.根据权利要求2所述的药物递送体系，其特征在于，所述聚乙二醇链的分子量为2000。
4.根据权利要求1-3任一项所述的药物递送体系的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：通过多肽固相合成法合成分子识别部分多肽序列AVPI或RGD、响应部分Caspase3/7响应序列DEVD或FAP-α响应序列GPA和组装部分的多肽序列KLVFFAED并连接，而后连接上功能分子Cy7-Cl和任选的长循环部分聚乙二醇链，得到所述药物递送体系。
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