CN111603573B - 一种spect分子影像探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种SPECT分子影像探针及其制备方法和应用，所述SPECT分子影像探针为多肽类分子，包括血液长循环部分、响应组装滞留部分、SPECT功能部分和特异性靶向部分；其中，所述SPECT功能部分包括放射性元素。本发明的靶向SPECT影像分子可在体内实现长时间的血液循环并靶向、特异性地富集到肿瘤部位，在该部位通过“组装滞留效应”实现肿瘤的长效SPECT成像，具有很好的临床应用前景。

Description

一种SPECT分子影像探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及分子影像技术领域，尤其涉及一种SPECT分子影像探针及其制备方法和应用。

背景技术

分子影像学(molecular imaging)是运用影像学手段显示组织水平、细胞和亚细胞水平的特定分子，反映活体状态下分子水平变化，对其生物学行为在影像方面进行定性和定量研究的科学。

目前常用的分子影像学技术包括核医学正电子断层显像(positron emission

tomography，PET)、单光子发射断层显像(single photon emission computedtomography,SPECT)、磁共振(magnetic resonance imaging,MRI)、超声和光学成像等。其中作为高敏感性的成像模式，核医学技术一直走在分子成像的前列。临床上现已使用氟代脱氧葡萄糖分子探针(FDG)来检测高糖代谢。

核医学成像技术包括正电子发射断层成像(PET)和单光子发射计算机断层成像(SPECT)，是目前最成熟的分子显像技术。具有放射性的药物进入体内后会与脏器或组织相互作用并参与体内代谢。放射性核素在自发衰变过程中会产生γ射线，被信号收集装置捕获后通过计算机形成图像，从而可以获得核素或核素标记物在脏器和组织中的分布代谢规律，进而对疾病做出诊断。

胰腺癌是一种病因及发病机制至今不明的高度恶性的消化系肿瘤。在全球范围内，胰腺癌的发病率呈逐渐上升趋势，据相关统计数据显示，2016年美国胰腺癌新增53070例患者，占恶性肿瘤死亡率的第4位，而2015年我国胰腺癌死亡率居第6位。胰腺癌患者早期诊断困难，手术切除后复发率高，预后差，患者术后5年生存率为7％～25％。胰腺癌起病隐匿，早期无特异性临床症状及体征，大多数患者诊断时已失去手术切除最佳时期。因此，如何通过血液学、影像学、组织病理学及细胞学等检查早期诊断胰腺癌是肿瘤研究中面临的问题，而提高胰腺癌的诊断率不仅能提高患者手术切除的成功率，而且能为患者的内科治疗提供依据。SPECT是一种融合功能代谢显像和解剖形态成像的新技术，在肿瘤的诊断、分期、病灶定位、疗效及复发监测等方面具有重要作用。

CN108949147A公开了一种分子影像探针，所述分子影像探针为多肽类分子，包括位于一端的特异性靶向部分、中间的响应组装滞留部分和侧链的显色部分；其中，所述响应组装滞留部分包括响应序列和组装序列，所述分子影像探针通过特异性靶向部分识别肿瘤细胞，通过“组装滞留效应”在肿瘤微环境组装滞留，实现在肿瘤组织高量和长效成像，通过近红外光激发，实现在肿瘤病灶部位的稳定、长效术中成像导航，实现可视化定位肿瘤。

CN107343963A公开了一种用于SPECT显像的核素^99mTc标记石墨烯纳米探针及其制备方法与应用，尤其是一种^99mTc直接标记超小尺寸的医用高分子功能化石墨烯(mfGO)制成的纳米探针^99mTc-mfGO。该纳米探针利用纳米材料mfGO本身的化学和物理作用直接进行^99mTc标记，不需连接螯合剂，且标记效率大于95％，不用分离步骤。该纳米探针可以经过静脉注射和局部皮肤注射，应用于体内肿瘤成像和淋巴结成像。该纳米探针具有多用于的优点：制备过程简便、高效，可用于大批量制备；用于肿瘤和淋巴结的摄取明显，对比度高，有利于成像应用。

CN105412950A公开了一种具有MRI/SPECT双模态影像肿瘤靶向多功能纳米探针及其制备和应用，纳米探针包括由Fe@Fe3O4纳米粒子、偶联在Fe@Fe3O4纳米粒子表层的脂质体DSPE-PEG-RGD和脂质体DSPE-PEG组成的MNPs-DSPE-PEG-RGD纳米探针，还可以在MNPs-DSPE-PEG-RGD纳米探针上标记放射性核素I¹²⁵，组成MNPs-DSPE-PEG-RGD-I¹²⁵纳米探针；其通过将DSPE-PEG-RGD和DSPE-PEG溶于有机溶剂中，加入Fe@Fe3O4纳米粒子溶液，混合均匀，得到MNPs-DSPE-PEG-RGD纳米探针，再用氯胺-T法标记I¹²⁵，即得到MNPs-DSPE-PEG-RGD-I¹²⁵纳米探针。制得的纳米探针MNPs-DSPE-PEG-RGD用于人脑胶质瘤MRI磁共振成像，MNPs-DSPE-PEG-RGD-I¹²⁵纳米探针用于SPECT显像。与现有技术相比，该发明具有靶向性强，能在同一种分子上进行多种分子影像探针等优点。

因此，迫切需要研发一种靶向特异性识别肿瘤的探针，通过标记放射性核素探查疾病过程中细胞和分子水平的异常，帮助提高手术精准度和成功率，可以在尚无解剖改变的疾病前检出异常，为探索疾病的发生、发展，评价药物效果发挥巨大作用，因此具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种SPECT分子影像探针及其制备方法和应用，所述SPECT分子影像探针可以特异性识别肿瘤细胞，并在肿瘤部位组装滞留，通过SPECT功能部分实现在肿瘤组织高量和长效成像，从而为肿瘤的早期诊断提供信息，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种SPECT分子影像探针，所述SPECT分子影像探针为多肽类分子，包括血液长循环部分、响应组装滞留部分、SPECT功能部分和特异性靶向部分；

其中，所述SPECT功能部分包括放射性元素。

本发明中，具有特异性靶向的SPECT分子探针会特异性识别肿瘤细胞表面过表达的整合素αvβ3，通过主动靶向在肿瘤细胞表面富集；肿瘤微环境中过表达的FAP-α蛋白会对该SPECT分子探针特异性剪切，从而响应组装滞留部分会在原位形成β-sheet纤维组装体。携带放射性核素的分子探针的聚集滞留可以增SPECT信号，延长成像时间，增强肿瘤的成像灵敏度，为肿瘤早期诊断提供影像水平的支持。

优选地，所述放射性元素包括^99mTc、⁶⁷Ga、²⁰¹Tl、¹²³I、¹³¹I或In中的任一种或至少两种的组合，优选为^99mTc。

优选地，所述SPECT功能部分还包括螯合剂，所述螯合剂螯合放射性元素。

优选地，所述螯合剂包括联肼尼克酰胺HYNIC。

本发明中，SPECT功能部分包括螯合剂和放射性元素标记，^99mTc是SPECT脏器显像中最理想的放射性核素，通过螯合剂HYNIC标记到多肽分子探针上，结合多肽类材料生物相容性良好优点以及组装滞留的策略，在肿瘤的SPECT成像发展和应用方面具有良好前景。

优选地，所述血液长循环部分由聚乙二醇组成。

优选地，所述聚乙二醇包括PEG-200、PEG-400、PEG-600、PEG-800、PEG-1000、PEG-1500、PEG-2000、PEG-3000或PEG-4000中的任意一种或至少两种的组合，优选为PEG-2000。

本发明中，通过血液长循环部分延长SPECT分子影像探针在体内的循环时间，使探针更好地在肿瘤区富集，增强响应信号，便于识别和临床操作。

优选地，所述响应组装滞留部分包括响应序列、组装序列和荧光部分。

优选地，所述响应序列为SEQ ID NO.1，具体为G-P-X。

优选地，所述X包括G、A、V、L、I、F、P、S、T、H、W、C、D、E、K、Y、M、N、Q或R，优选为G。

本发明中，响应序列可以被胰腺肿瘤过表达的FAP-α酶特异性剪切，其中当X为G时，即G-P-G的被识别效率高，有助于SPECT分子影像探针的成像与滞留。优选地，所述组装序列为SEQ ID NO.2，具体为K-A-I-I-G-L-M-V。

本发明中，组装序列是β-淀粉样蛋白中的组装驱动单元，可以通过疏水相互作用和氢键相互作用形成纤维，具有良好的组装性质。

优选地，所述荧光部分为C-荧光分子-G。

优选地，所述荧光分子为荧光发射波段500nm以上的亲水性荧光染料，优选为近红外荧光染料分子。

优选地，所述近红外荧光染料分子包括IR783和/或IR820，优选为IR783。

优选地，所述荧光分子与组装序列通过半胱氨酸侧链巯基进行定位修饰。

优选地，所述响应组装滞留部分的序列为G-P-G-K-A-I-I-G-L-M-V-C(IR783)-G。

优选地，所述SPECT功能部分与响应组装滞留部分通过赖氨酸侧链氨基进行定位修饰。

优选地，所述特异性靶向部分包括RGD和/或cRGD，优选为RGD。

优选地，所述特异性靶向部分靶向的肿瘤包括乳腺癌、肺癌、胰腺癌或胃癌中的任意一种或至少两种的组合，优选为胰腺癌。

优选地，所述SPECT分子影像探针的多肽序列为PEG-G-P-G-K(HYNIC-^99mTc)-A-I-I-G-L-M-V-C(IR783)-G-R-G-D。

所述SPECT分子影像探针具有如式I所示的结构：

第二方面，本发明提供一种制备如第一方面所述的SPECT分子影像探针的方法，包括如下步骤：

(1)将第一方面所述的SPECT分子影像探针包含的氨基酸依次缩合成多肽；

(2)在步骤(1)所得多肽的响应序列N端修饰PEG分子；

(3)在步骤(2)所得多肽的赖氨酸侧链上修饰螯合剂，纯化；

(4)将步骤(3)所得多肽的半胱氨酸侧链巯基与荧光分子偶联，分离纯化；

(5)将步骤(4)所得多肽分子溶于^99mTcO₄溶液中，加入N-三(羟甲基)甲基甘氨酸和SnCl₂醇溶液，加热反应，冷却纯化得SPECT分子影像探针。

本发明中，通过合理设计制备SPECT分子影像探针的具体步骤和条件，提高所述探针在体内的稳定性与滞留效应，制备过程的具体步骤不可调换。

优选地，步骤(5)所述加热的温度为90-100℃，例如可以是90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃，优选为95℃；

优选地，步骤(5)所述的反应时间为20-40min，例如可以是20min、25min、30min、35min或40min，优选为30min；

优选地，步骤(5)所述纯化的方式为固相萃取。

第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的SPECT分子影像探针用于制备肿瘤的术前诊断的试剂和/或试剂盒的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明提供的SPECT分子影像探针能在体内长效循环，特异性识别肿瘤细胞并富集，增强响应信号，成像时间长，有效降低信噪比，提高手术精准度和成功率，降低术后复发，为患者提供良好的术后生活质量；

(2)本发明的SPECT分子影像探针良好的组装特性，可以在FAP-α酶剪切后形成纤维样组装体，并长时间滞留在肿瘤部位；

(3)本发明的SPECT分子影像探针同时兼具放射性成像信号和荧光信号，较其他SPECT分子影像探针具有多模态成像的优点，能同时提供SPECT和荧光信息；

(4)本发明的SPECT分子影像探针可在尚无解剖改变的疾病前检出异常，为探索疾病的发生、发展，评价药物效果发挥巨大作用。

附图说明

图1是本发明测试例1的SPECT分子影像探针在FAP-α剪切后形成β-sheet结构的圆二色谱图；

图2是本发明测试例2的SPECT分子影像探针在胰腺癌Miapaca-2细胞的靶向富集图，其中第一行从左至右为SPECT分子影像探针与被Miapaca-2表达的FAP-α酶剪切并组装形成纤维的荧光场视野、明场视野和复合场视野，第二行从左至右为不具备组装性质的对照分子探针被Miapaca-2表达的FAP-α酶剪切后没有滞留的荧光场视野、明场视野和复合场视野。

图3是本发明测试例3的SPECT分子影像探针的组织病理学切片图；

图4是本发明测试例4的SPECT分子影像探针在皮下肿瘤的成像效果图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例1分子影像探针的制备

本实施例通过以下方法制备分子影像探针：

(1)采用Fmoc固相合成法，选用Wang树脂的修饰密度为0.35mM，在树脂上合成所述多肽，用1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)的DMF溶液脱去氨基端的Fmoc保护，将下一个氨基酸的羧基用4-甲基吗啉和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的DMF溶液进行活化，然后与脱保护的第一个氨基酸进行缩合反应，重复上述步骤，直到完成所有氨基酸的缩合；

(2)将上述合成的多肽用DBU的DMF溶液脱去氨基端的Fmoc保护，加入N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-2000(NHS-PEG-2000)，用4-甲基吗啉和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的DMF溶液进行活化，然后与脱保护的前一个氨基酸进行缩合反应，得到PEG修饰的多肽分子；

(3)将上述合成的多肽用水合肼的DMF溶液脱去Lys赖氨酸侧链的保护基团N-l-(4,4-二甲基-2,6-二氧环亚己基)乙基(Dde),加入N-羟基琥珀酰亚胺-联肼尼克酰胺(NHS-HYNIC)，用4-甲基吗啉和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的DMF溶液进行活化，得到HYNIC修饰的多肽分子；

(3)将所述合成的多肽用含有2.5％水和2.5％三异丙基硅烷的三氟乙酸溶液将合成好的多肽从树脂上脱除，同时脱除氨基酸的侧链保护；将三氟乙酸用旋转蒸发法去除，然后多肽的粗产物用无水乙醚沉淀，洗涤并干燥；最后选用反相制备液相色谱，将多肽纯化；

(5)将IR783分子在pH7.5-8.5的Tris缓冲液中与步骤(4)得到的多肽上Cys侧链巯基进行偶联反应，避光室温搅拌反应过夜后，通过透析将未反应的IR783进行分离，随后将透析液蒸发浓缩萃取后，得到IR783修饰的多肽分子；

(6)将上述合成的多肽分子溶于^99mTcO₄溶液中，加入N-三(羟甲基)甲基甘氨酸和新配制的SnCl₂(3mg/mL，乙醇)，混合物在95℃反应30min，冷却后通过固相萃取方式进行纯化，得到最终SPECT分子探针，即PEG-Gly-Pro-Gly-Lys(HYNIC-^99mTc)-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Cys(IR783)-Gly-Arg-Gly-Asp。

SPECT分子影像探针的功能测试

测试例1

将实施例1制备得到的SPECT分子影像探针在体外溶液中与FAP-α酶作用后测试圆二色光谱，结果见图1。

由图1可知，本发明的SPECT分子影像探针可以被FAP-α剪切并组装形成β-sheet结构。

测试例2

将实施例1制备得到的SPECT分子影像探针与人胰腺癌Miapaca-2细胞共同培养，以只具有主动靶向的分子探针作为对照，对照分子探针为PEG-G-P-G-K(HYNIC-^99mTc)-A-G-A-G-A-G-A-C(IR783)-G-R-G-D，将影像探针与对照探针分别与Miapaca-2细胞共同培养1h，然后用PBS洗涤三次，通过共聚焦显微镜进行成像，结果如图2所示，其中第一行从左至右为SPECT分子影像探针与被Miapaca-2表达的FAP-α酶剪切并组装形成纤维的荧光场视野、明场视野和复合场视野，第二行从左至右为不具备组装性质的对照分子探针被Miapaca-2表达的FAP-α酶剪切后没有滞留的荧光场视野、明场视野和复合场视野。

由图2可知，本发明的分子影像探针具有主动靶向和组装滞留效应，与只具有主动靶向的分子探针对比，本发明的分子影像探针在肿瘤细胞聚集，成像效果更佳。

测试例3

将实施例1制备得到的SPECT分子影像探针通过尾静脉方式注射到小鼠体内，72h后通过组织病理学切片研究其生物安全性，结果如图3所示。

由图3可知，本发明的SPECT分子影像探针对小鼠主要器官没有明显损伤。

测试例4

将实施例1制备得到的SPECT分子影像探针以尾静脉注射的方式注射到小鼠体内，12h后对小鼠进行SPECT成像，结果如图4所示；

由图4可知，图中小鼠腋下为皮下接种的胰腺癌肿瘤，通过SPECT成像肿瘤部位可见明显信号，其他部位没有明显信号，结果表明该分子影像探针的特异性靶向识别以及组装滞留效应能实现肿瘤病灶成像，并且实现长效成像。

综上所述，本发明提供了一种简单高效的SPECT分子影像探针及其制备方法，该SPECT分子影像探针结合多肽材料良好的生物相容性和^99mTc对脏器优越的SPECT成像优势，通过特异性靶向部分识别肿瘤细胞，通过“组装滞留效应(AIR)”在肿瘤微环境组装滞留，实现在肿瘤组织高量和长效成像，通过放射性核素实现在肿瘤组织高量和长效成像，从而为肿瘤的早期诊断提供信息，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 国家纳米科学中心

<120> 一种SPECT分子影像探针及其制备方法和应用

<130> 2019

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 1

Gly Pro Xaa

1

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 2

Lys Ala Ile Ile Gly Leu Met Val

1 5

Claims (9)

1.一种SPECT分子影像探针，其特征在于，所述SPECT分子影像探针为多肽类分子，包括血液长循环部分、响应组装滞留部分、SPECT功能部分和特异性靶向部分；

所述SPECT分子影像探针的多肽序列为PEG-G-P-G-K(HYNIC-^99mTc)-A-I-I-G-L-M-V-C(IR783)-G-R-G-D。

2.根据权利要求1所述的SPECT分子影像探针，其特征在于，所述聚乙二醇包括PEG-200、PEG-400、PEG-600、PEG-800、PEG-1000、PEG-1500、PEG-2000、PEG-3000或PEG-4000中的任意一种或至少两种的组合。

3.根据权利要求2所述的SPECT分子影像探针，其特征在于，所述聚乙二醇为PEG-2000。

4.根据权利要求1所述的SPECT分子影像探针，其特征在于，所述特异性靶向部分靶向的肿瘤包括乳腺癌、肺癌、胰腺癌或胃癌中的任意一种或至少两种的组合。

5.根据权利要求4所述的SPECT分子影像探针，其特征在于，所述特异性靶向部分靶向的肿瘤为胰腺癌。

6.一种制备如权利要求1-5任一项所述的SPECT分子影像探针的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将权利要求1-5任一项所述的SPECT分子影像探针包含的氨基酸依次缩合成多肽；

（2）在步骤（1）所得多肽的响应序列N端修饰PEG分子；

（3）在步骤（2）所得多肽的赖氨酸侧链上修饰螯合剂，纯化；

（4）将步骤（3）所得多肽的半胱氨酸侧链巯基与荧光分子偶联，分离纯化；

（5）将步骤（4）所得多肽分子溶于^99mTcO₄溶液中，加入N-三(羟甲基)甲基甘氨酸和SnCl₂醇溶液，加热反应，冷却纯化得SPECT分子影像探针。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（5）所述加热的温度为90-100℃；

步骤（5）所述的反应时间为20-40min；

步骤（5）所述纯化的方式为固相萃取。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（5）所述加热的温度为95℃；

步骤（5）所述的反应时间为30min。

9.一种如权利要求1-5任一项所述的SPECT分子影像探针用于制备肿瘤的术前诊断的试剂和/或试剂盒的应用。

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