CN112972424B - 一种抗肿瘤多肽纳米药物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抗肿瘤多肽纳米药物及其制备方法和应用，所述抗肿瘤多肽纳米药物包括依次连接的亲水分子、组装肽和功能肽；所述功能肽包括碳酸氢根修饰的阳离子治疗性多肽，所述碳酸氢根修饰的位点为精氨酸。本发明还提供了所述抗肿瘤多肽纳米药物的制备方法，包括：通过化学合成法合成组装肽和功能肽，再将亲水分子与组装肽偶联，得到中间肽，碳酸氢根修饰后，再在自组装缓冲液中进行自组装，得到所述抗肿瘤多肽纳米药物。本发明所述抗肿瘤多肽纳米药物具有酸响应性和肿瘤微环境响应性，可以结合在肿瘤细胞的细胞膜上并破坏其通透性，实现耐药肿瘤的高效可持续性杀伤；体内滞留时间长，抑制肿瘤生长效果显著。

Description

一种抗肿瘤多肽纳米药物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种抗肿瘤多肽纳米药物及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤是一种发病率和死亡率都很高的疾病，化疗一直都是临床医生抗击癌症的一个有力工具。然而，在化疗过程中癌细胞可能会获得对抗癌药物的耐药能力，最终导致化疗失败。这些肿瘤细胞最初对药物是敏感的，但后来以耐药的形式复发。耐药性也可以在一些癌症中固有地发生，例如肾透明细胞癌、人乳腺癌等。耐药性产生的一个重要原因就是药物外排，导致病灶部位药物浓度不够，无法发挥药物作用。
目前，多肽纳米药物通常通过增加病灶部位药物浓度、改变药物发挥作用方式来治疗各种类型的肿瘤。CN103936834A公开了一种高效pH选择性抗肿瘤多肽及其应用，所述抗肿瘤多肽富含组氨酸且具有膜裂解和抗肿瘤活性，能选择性地杀死酸性条件下的肿瘤细胞，对肺癌细胞和乳腺癌细胞均有杀伤作用，在小鼠异种移植模型中抑制了肿瘤的生长。此发明得到的抗肿瘤多肽通过插入、裂解细胞膜，增加了其通透性，导致了肿瘤细胞活性降低，甚至死亡。
CN108078958A公开了一种抗肿瘤多肽纳米药物及其制备方法和应用，所述抗肿瘤多肽纳米药物包括两亲性抗肿瘤多肽以及与两亲性抗肿瘤多肽偶联的酸响应性功能分子。此发明制备得到的抗肿瘤多肽纳米药物克服了普通多肽药物半衰期短的瓶颈，是一种具有肿瘤部位弱酸环境和蛋白酶双重响应性、生物相容性好、稳定性强、安全性高、生物利用度高和良好抗肿瘤功能的肿瘤免疫治疗多肽纳米药物。
CN104940949A公开了一种抗肿瘤多肽纳米药物及其制备方法和应用，所述抗肿瘤多肽纳米药物包含两亲性抗肿瘤多肽以及与两亲性抗肿瘤多肽偶联的酸响应性功能分子。此发明的抗肿瘤多肽纳米药物生物相容性好，毒副作用低，具有酸响应性，生物利用度高，具有高生物安全性。制备方法简单，自组装过程中不生成共价健，没有逆反应，制备得到的抗肿瘤多肽纳米药物具有广阔的应用前景。
然而，上述三篇专利公开的抗肿瘤多肽和多肽纳米药物存在肿瘤部位滞留时间短、容易代谢，而且对耐药性肿瘤治疗效果不明朗等不足，使其在活体上的应用受到一定的限制。
因此，如何提供一种对耐药性肿瘤治疗效果良好、毒副作用低、滞留时间较长的多肽纳米药物，已成为亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种抗肿瘤多肽纳米药物及其制备方法和应用，所述抗肿瘤多肽纳米药物在未到达肿瘤部位时呈无规则卷曲的纳米微粒，到达肿瘤部位后在酸性环境下转为具有生物活性的纳米纤维，持续结合在细胞膜上，破坏细胞膜的通透性，可应用于耐药肿瘤的治疗中。
为达此目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种抗肿瘤多肽纳米药物，所述抗肿瘤多肽纳米药物包括依次连接的亲水分子、组装肽和功能肽；
所述功能肽包括碳酸氢根修饰的阳离子治疗性多肽，所述碳酸氢根修饰的位点为精氨酸。
本发明中，所述抗肿瘤多肽纳米药物由依次相连的亲水分子、组装肽和功能肽组成，在正常生理状态下，亲水分子具有亲水性，组装肽和功能肽具有疏水性，整个多肽纳米药物由于亲疏水的相互作用组装形成纳米微粒。其中，功能肽中精氨酸上的胍基经化学反应处理后形成碳酸氢胍，修饰在阳离子治疗性多肽上，碳酸氢根可以屏蔽多肽分子的正电信号，使其二级结构变为无活性的无规卷曲结构；当到达肿瘤部位后，功能肽上的碳酸氢胍被酸性环境酸化为胍基，构象由无活性的无规卷曲结构变为有活性的α-螺旋结构，组装肽和功能肽共同进行组装，纳米微粒转变为纳米纤维，从而发挥杀伤肿瘤的作用；通过上述转变过程，可以保证多肽在循环中的稳定性，并且使药物具有酸响应性和对肿瘤的靶向性，提高了特异性，降低了对正常组织和细胞的毒副作用。
优选地，所述亲水分子包括亲水性多肽和/或糖分子。
优选地，所述亲水性多肽为半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、酪氨酸或苏氨酸中的任意一种或至少两种氨基酸形成的多肽，例如可以是半胱氨酸和甘氨酸组成的多肽或天门冬酰胺、酪氨酸和苏氨酸组成的多肽。
优选地，所述亲水性多肽中氨基酸的数量不多于3，例如可以是1、2或3。
优选地，所述糖分子包括2,3,4,6-四-乙酰-β-D吡喃葡萄糖苷和/或2,3,4,6-四-乙酰-β-D甘露糖苷，优选为2,3,4,6-四-乙酰-β-D吡喃葡萄糖苷。
优选地，所述组装肽的氨基酸序列包括SEQ ID No.1～11中的任意一种，优选为SEQ ID No.11所示的氨基酸序列。
SEQ ID No.1：XAAA；(其中，X表示任意一种氨基酸)
SEQ ID No.2：AEAKAEAK；
SEQ ID No.3：KLVFFAE；
SEQ ID No.4：VKVKVKVKDPPTKVKVKVKV；(其中，D表示D型构象的氨基酸)
SEQ ID No.5：YPGDV；
SEQ ID No.6：AAAAAAD；
SEQ ID No.7：VVVVVVD；
SEQ ID No.8：LLKK；
SEQ ID No.9：SIKVAV；
SEQ ID No.10：VPGVG；
SEQ ID No.11：KLVFF。
优选地，所述阳离子治疗性多肽包括含有精氨酸的抗菌肽和/或含有精氨酸的穿模肽。
优选地，所述阳离子治疗性多肽包括SEQ ID No.12～29中的任意一种氨基酸序列所示的多肽、多聚精氨酸或聚(PRR)n中的任意一种，优选为SEQ ID No.15所示的氨基酸序列。
SEQ ID No.12：
AGRGKQGGKVRAKAKTRSSRAGLQFPVGRVHRLLRKGNY；
SEQ ID No.13：TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK；
SEQ ID No.14：RAGLQFPVGRVHRLLRK；
SEQ ID No.15：RAGLQFPVGRLLRRLLRRLLR；
SEQ ID No.16：RAGLQWPIGRLLRRLLRRLLR；
SEQ ID No.17：RVVRQWPIGRVVRRVVRRVVR；
SEQ ID No.18：RQIKIWFQNRRMKWKK；
SEQ ID No.19：TRQARRNRRRRWRERQR；
SEQ ID No.20：KMTRAQRRAAARRNRWTAR；
SEQ ID No.21：VKRGLKLRHVRPRVTRMDV；
SEQ ID No.22：KETWWETWWTEWSQPKKRKV；
SEQ ID No.23：TRRNKRNRIQEQLNRK；
SEQ ID No.24：VRLPPPVRLPPPVRLPPP；
SEQ ID No.25：RRIRPRPPRLPRPRPRPLPFPRPG；
SEQ ID No.26：PIEVCMYREP；
SEQ ID No.27：MVRRFLVTLRIRRACGPPRVRV；
SEQ ID No.28：LLIILRRRIRKQAHAHSK；
SEQ ID No.29：RKKRRQRRR。
优选地，所述多聚精氨酸的数量为5～12，例如可以是5、6、7、8、9、10、11或12。
本发明中，所述(PRR)n为脯氨酸-精氨酸-精氨酸的聚合物。
优选地，所述n的数量为2～8，例如可以是2、3、4、5、6、7或8，若n＝2则所述(PRR)2的结构为脯氨酸-精氨酸-精氨酸-脯氨酸-精氨酸-精氨酸。
优选地，所述亲水分子通过点击反应与所述组装肽共价偶联。
优选地，所述组装肽通过酰胺缩合与所述功能肽共价偶联。
优选地，所述抗肿瘤多肽纳米药物包括式I所示的化合物：
Figure BDA0002984917630000041
优选地，所述抗肿瘤多肽纳米药物在酸性环境下由纳米微粒组装成纳米纤维。
优选地，所述纳米微粒的直径为40～60nm，例如可以是40nm、41nm、42nm、43nm、44nm、45nm、46nm、47nm、48nm、49nm、50nm、51nm、52nm、53nm、54nm、55nm、56nm、57nm、58nm、59nm或60nm，优选为50nm。
优选地，所述纳米纤维的宽度为15～25nm，例如可以是15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、21nm、22nm、23nm、24nm或25nm，优选为20nm。
优选地，所述纳米纤维的长度不小于1μm，例如可以是1μm、1.5μm、2μm、2.5μm或3μm。
本发明中，所述纳米纤维并不进入细胞内部，结合在肿瘤细胞的细胞膜上，破坏细胞膜的通透性，可用于耐药肿瘤的治疗中，并且在破坏一个肿瘤细胞后，可以脱落下来结合到邻近的肿瘤细胞上，实现耐药性肿瘤的持续杀伤。
优选地，所述组装的驱动力包括氢键、范德华力或π-π相互作用中的任意一种或至少两种的组合，例如可以是氢键、范德华力、π-π相互作用或范德华力和π-π相互作用的组合。
优选地，所述纳米纤维的空间结构包括α-螺旋、β-片层或β-发夹中的任意一种或至少两种的组合，例如可以是α-螺旋、β-片层、β-发夹或α-螺旋和β-片层的组合。
本发明中，所述抗肿瘤多肽纳米药物的工作原理如图1所示：
所述抗肿瘤多肽纳米药物在人体正常组织的生理环境下成纳米微粒结构，功能肽上修饰的碳酸氢根中和了正电信号，没有生物学功能；当运输到肿瘤部位时，在酸性环境的作用下，功能肽上的碳酸氢胍被酸性环境酸化为胍基，功能肽构象由无活性的无规卷曲结构变为有活性的α-螺旋结构，并进一步形成尺寸较大的纳米纤维，可以结合在肿瘤细胞的细胞膜上，破坏其通透性，引起肿瘤细胞的裂解后，还可以再次结合到邻近的肿瘤细胞上发挥杀伤功效，实现持续性高效杀伤，对具有耐药性的肿瘤细胞的杀伤效果更为显著。
第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的抗肿瘤多肽纳米药物的制备方法，所述制备方法包括：
通过化学合成法合成组装肽和功能肽，再将亲水分子与组装肽偶联，得到中间肽，碳酸氢根修饰后，再在自组装缓冲液中进行自组装，得到所述抗肿瘤多肽纳米药物。
本发明中，所述制备方法技术成熟，成功率高，本领域的技术人员容易掌握，促进了相关产品的生产与使用，为产品的批量化生产及在实际临床医学上的应用创造了条件。
优选地，所述化学合成法包括固相合成法。
优选地，所述碳酸氢根修饰的步骤包括：
将所述中间肽溶解在液体中，通入二氧化碳。
优选地，所述液体包括磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液的pH为7.3～7.5，例如可以是7.3、7.4或7.5，优选为7.4。
优选地，所述通入二氧化碳的时间为1～3h，例如可以是1h、1.5h、2h、2.5h或3h，优选为2h。
优选地，所述自组装缓冲液包括水、磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液或HEPES缓冲液中的任意一种，优选为磷酸盐缓冲液。
优选地，所述自组装缓冲液的pH为7.0～8.0，例如可以是7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0，优选为7.4。
作为优选技术方案，本发明所述抗肿瘤多肽纳米药物的制备方法，包括以下步骤：
通过固相合成法合成组装肽和功能肽，再将亲水分子与组装肽偶联，得到中间肽；
将所述中间肽溶解在pH为7.3～7.5的磷酸缓冲液中，通入二氧化碳，处理1～3h；
再在pH为7.0～8.0的自组装缓冲液中进行自组装，得到所述抗肿瘤多肽纳米药物。
第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述的抗肿瘤多肽纳米药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明中，所述抗肿瘤多肽纳米药物具有酸响应性和肿瘤靶向性，特异性好，对正常组织的毒副作用较小；所述抗肿瘤多肽纳米药物可以实现对耐药性肿瘤的持续高效杀伤，治疗效果显著；制备方法成熟，可批量化生产，具有极高的应用价值。
本发明中，所述肿瘤包括乳腺癌、肾癌、膀胱癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、宫颈癌、神经胶质细胞瘤以及黑色素瘤等实体肿瘤，优选为发生耐药的上述癌症，最优选为肾透明细胞癌。
优选地，所述抗肿瘤药物的给药方式包括静脉给药、皮下给药或腹腔给药中的任意一种，优选为静脉给药。
优选地，所述抗肿瘤药物的给药浓度为不大于100μM，例如可以是60μM、65μM、70μM、75μM、80μM、85μM、90μM、95μM或100μM，优选为80μM。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明所述抗肿瘤多肽纳米药物在正常生理状态下保持微粒状态，在酸性环境下重组装成纳米纤维并与肿瘤细胞结合，具有酸响应性和肿瘤微环境响应性，可以降低纳米药物在血液循环中对正常组织的毒副作用，并提高药物的局部浓度，特异性杀伤肿瘤细胞；
(2)所述抗肿瘤多肽纳米药物组装形成的纳米纤维的长度不小于20nm，甚至达到微米级别，尺寸较大，可持续结合在肿瘤细胞表面而不进入细胞内，破坏细胞膜的通透性，使细胞内容物流出，降低细胞活力，可以用于耐药肿瘤的治疗中，并且在破坏一个肿瘤细胞后，可以脱落下来结合到邻近的肿瘤细胞，实现高效可持续性杀伤；在活体内的滞留时间较长，抑制肿瘤细胞的生长，治疗效果显著；
(3)所述抗肿瘤多肽纳米药物的制备方法成熟，可实现批量化生产，促进了产品的推广与使用，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明所述抗肿瘤多肽纳米药物的工作原理图；
图2为本发明实施例1中制备的阳离子治疗性多肽、组装肽和β-D吡喃葡萄糖偶联物的ESI-MS表征图片；
图3为本发明实施例1中碳酸氢根修饰后的阳离子治疗性多肽、组装肽和β-D吡喃葡萄糖偶联物的傅里叶红外光谱表征图片；
图4是本发明实施例2中所述抗肿瘤多肽纳米药物在pH为6.5的磷酸缓冲液中的傅里叶红外光谱表征图片；
图5是本发明实施例2中所述抗肿瘤多肽纳米药物在pH为6.5和pH为7.4的磷酸缓冲液中的圆二色谱的表征图片；
图6A是本发明实施例2中所述抗肿瘤多肽纳米药物在pH为7.4的磷酸缓冲液中的透射电镜的图片(比例尺＝200nm)；
图6B是本发明实施例2中所述抗肿瘤多肽纳米药物在pH为6.5的磷酸缓冲液的透射电镜的图片(比例尺＝200nm)；
图7是本发明实施例2中所述抗肿瘤多肽纳米药物在pH为6.5的磷酸缓冲液中0h和2h的动态光散射仪的结果图片；
图8是本发明实施例3中FITC标记的抗肿瘤多肽纳米药物在pH为6.5和pH为7.4的培养液中与Caki-2细胞共孵育后的激光共聚焦的图片(比例尺＝20μm)；
图9是本发明实施例3中所述抗肿瘤多肽纳米药物在pH为6.5和pH为7.4的培养液中与Caki-2细胞共孵育后的乳酸脱氢酶泄漏实验的结果图片；
图10是本发明实施例3中所述抗肿瘤多肽纳米药物在pH为6.5和pH为7.4的培养液中与Caki-2细胞共孵育后的细胞活力检测实验的结果图片；
图11是本发明实施例4中Cy5标记的抗肿瘤多肽纳米药物在活体内的滞留能力的结果图片；
图12是本发明实施例4中Cy5标记的抗肿瘤多肽纳米药物在活体内的抑制肿瘤生长的结果图片。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
材料：
Wang树脂和氨基酸购自吉尔生化(上海)有限公司；
六氢吡啶、N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吗啉、水合肼、三异丙基硅烷和三氟乙酸购自国药化学试剂北京有限公司；
苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、己炔酸、溴化亚铜和抗坏血酸钠购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；
2-叠氮-2,3,4,6-四-乙酰-β-D吡喃葡萄糖苷购自江苏艾康生物医药研发有限公司；
三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺购自北京鸿跃创新科技有限公司；
FITC购自北京友谊中联生物科技有限公司；
Cy5购自北京索莱宝科技有限公司；
Caki-2细胞通过正规渠道商购得；
小鼠来自北京维通利华实验动物科技有限公司。
实施例1
本实施例合成一种抗肿瘤多肽纳米药物，所述抗肿瘤多肽纳米药物包括依次连接的亲水分子、组装肽和功能肽；
所述功能肽包括碳酸氢根修饰的阳离子治疗性多肽，所述碳酸氢根修饰的位点为精氨酸。
所述亲水分子为2,3,4,6-四-乙酰-β-D吡喃葡萄糖苷，所述组装肽的的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示，所述功能肽的氨基酸序列如SEQ ID No.15所示。
SEQ ID No.11：KLVFF；
SEQ ID No.15：RAGLQFPVGRLLRRLLRRLLR。
所述抗肿瘤多肽纳米药物的分子结构如式I所示：
Figure BDA0002984917630000091
所述抗肿瘤多肽纳米药物的制备方法包括如下步骤：
(1)通过固相合成法合成组装肽和功能肽，再将亲水分子与组装肽偶联，得到中间肽；
选用0.35mM修饰密度的Wang树脂(精氨酸C端被固定于树脂上，N端被Fmoc保护)，用六氢吡啶和N,N-二甲基甲酰胺体积比为1:4的混合溶液脱去N端的Fmoc保护，并用茚三酮测试法检测脱保护是否成功。按照第一个氨基酸摩尔质量的10倍来称量氨基酸和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯。接着加入偶联剂(N-甲基吗啉和N,N-二甲基甲酰胺体积比为5:95的混合溶液)，用搅拌器搅拌使其溶解。将溶液转移至多肽合成管中，反应45min。重复上述操作，将剩余的所有氨基酸都通过缩合反应连接上去；
将氨基酸摩尔质量10倍的己炔酸和合成好的多肽树脂悬浮在偶联剂(N-甲基吗啉和N,N-二甲基甲酰胺体积比为5:95的混合溶液)体系中，通过氨基酸上的氨基与己炔酸上的羧基之间的酰胺化反应将己炔酸偶联到多肽分子上；将2-叠氮-2,3,4,6-四-乙酰-β-D吡喃葡萄糖苷和多肽树脂悬浮在N,N-二甲基甲酰胺溶剂中，加入溴化亚铜、抗坏血酸钠和三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺(物质的量比为1:2:1)，通过叠氮与炔基之间的加成反应将葡萄糖苷偶联到多肽分子上，得到的肽树脂上偶联阳离子治疗性多肽、组装肽和2,3,4,6-四-乙酰-β-D吡喃葡萄糖苷；
用N,N-二甲基甲酰胺将肽树脂洗入多肽合成管中，用5％水合肼在N,N-二甲基甲酰胺中脱除单糖上的乙酰基16h，最后用含有2.5％水和2.5％三异丙基硅烷的三氟乙酸溶液将合成好的多肽从树脂上脱除，同时脱除氨基酸的侧链保护。将三氟乙酸用旋转蒸发法去除，多肽的粗产物用无水乙醚沉淀，洗涤并干燥，得到阳离子治疗性多肽、组装肽和β-D吡喃葡萄糖偶联物。
对所得多肽偶联物进行ESI-MS表征，结果如图2所示。
由图可知，所得产物的质谱为：
C173H291N55O38[M+5H]5+:750.85,[M+4H]4+:938.32,[M+3H]3+:1250.76,[M+2H]2+:1875.63,[M+H]+:3750.26.Found ESI-MS:m/z 750.85,938.2,1250.6
上述结果表明所述阳离子治疗性多肽、组装肽和β-D吡喃葡萄糖偶联物制备成功。
(2)碳酸氢根修饰
将步骤(1)中制备得到的阳离子治疗性多肽、组装肽和β-D吡喃葡萄糖偶联物溶解在pH为7.4的磷酸缓冲液中，通入二氧化碳，处理2h；碳酸氢根被修饰在精氨酸的胍基上，冻干后，进行傅里叶红外光谱表征，结果如图3所示。
由图可知，碳酸氢根被成功引入所述多肽中，精氨酸上的胍基已转化为碳酸氢胍，碳酸氢根修饰成功。
再在pH为7.4的磷酸盐溶液中进行自组装，得到所述抗肿瘤多肽纳米药物。
同时，采用相同的方法合成阳离子治疗性多肽、组装肽和β-D吡喃葡萄糖偶联物，与FITC-N＝C＝S分子溶解在20％的乙腈/水(体积比为2:8)混合溶液中，多肽分子和异硫氰酸荧光素酯(FITC)添加量的摩尔比为1:1，在室温下反应12h。反应液加入透析袋中用去离子水透析纯化，冻干，采用相同的方法在避光条件下进行碳酸氢根修饰后，得到FITC标记的抗肿瘤多肽纳米药物，分子式如式II所示。
Figure BDA0002984917630000111
另外，采用相同的方法合成阳离子治疗性多肽、组装肽和β-D吡喃葡萄糖偶联物，和菁染料(Cy5)分子溶解在PBS溶液中，多肽分子和Cy5添加量的摩尔比为1:1，在室温下反应2h。反应液用二氯甲烷洗3次除去未反应的Cy5分子，将水相加入到透析袋中用去离子水透析纯化，冻干，采用相同的方法在避光条件下进行碳酸氢根修饰后，得到Cy5标记的抗肿瘤多肽纳米药物，分子式如式III所示。
Figure BDA0002984917630000112
实施例2
本实施例验证实施例1制备的抗肿瘤多肽纳米药物在酸性条件下的组装过程。
将所述抗肿瘤多肽纳米药物溶解在pH为6.5的磷酸缓冲液中，使用傅里叶红外光谱进行表征，结果如图4所示。
由图可知，傅里叶红外光谱中无碳酸氢根的特征峰，而且在1630处观察到β-sheet组装结构的特征峰，1541处是α-helix的酰胺二带的特征峰，1659是α-helix的酰胺一带的特征峰，说明在pH为6.5的微酸性缓冲体系中，多肽纳米药物上的碳酸氢胍能够与质子酸反应脱去碳酸氢根，并形成β-sheet和α-helix的结构。
进一步通过圆二色谱对所述抗肿瘤多肽纳米药物在pH为7.4和pH为6.5的磷酸缓冲液中的二级结构进行观察，结果如图5所示。
由图可知，pH为7.4的磷酸缓冲液中的抗肿瘤多肽纳米药物在200nm处观察到随机(Random)结构的负特征峰，说明所述抗肿瘤多肽纳米药物在中性缓冲体系下以无规的形式存在，由于胍基上修饰碳酸氢根，功能肽表现为无规卷曲结构；对于pH为6.5的磷酸缓冲液中的抗肿瘤多肽纳米药物来说，在200nm处观察到β-sheet和α-helix结构的特征正峰，在215nm处观察到β-sheet结构的特征负峰，在215nm和225nm处观察到α-helix结构的特征负峰，说明抗肿瘤多肽纳米药物在微酸性缓冲体系下可转变成以β-sheet为结构特征的超分子组装体，且功能肽在脱去胍基上的碳酸氢根后恢复到阳离子治疗性多肽原本的α-helix结构。
此外，通过透射电镜(六硼化镧透射电子显微镜，Tecnai G2 20S-TWIN(T-20)，美国FEI公司)对所述抗肿瘤多肽纳米药物在pH为7.4和pH为6.5的磷酸缓冲液中的形貌进行观察，所得抗肿瘤多肽纳米药物的形貌图如图6A和图6B所示。
由图可知，在中性缓冲体系中，多肽纳米药物聚集形成50nm左右的纳米颗粒(图6A)，在微酸性缓冲体系中，多肽纳米药物组装成纳米纤维(图6B)，证明在不同pH的环境中多肽纳米药物组装的形貌不同。
另外，通过动态光散射仪监测了所述抗肿瘤多肽纳米药物在pH为6.5的微酸性缓冲体系中粒径分布与电位随时间的变化的图片(0h和2h)，结果如图7所示。
由图可知，随着时间的延长，在微酸性缓冲体系中2h后，抗肿瘤多肽纳米药物的粒径逐渐由70nm的窄分布转为100～1000nm的宽分布，电位也由0mv到+7mv，证明了在微酸性缓冲体系中，抗肿瘤多肽纳米药物通过组装发生了形貌转变。
实施例3
本实施例验证实施例1制备的抗肿瘤多肽纳米药物在细胞水平上对肿瘤细胞的杀伤作用。
选用耐药的人肾透明细胞癌细胞Caki-2细胞，将FITC标记的抗肿瘤多肽纳米药物按20×10-6M的浓度分别在pH为7.4和pH为6.5的细胞培养液中与Caki-2细胞共孵育2h，并用PBS清洗3次，在激光共聚焦显微镜(多光束激光共聚焦成像系统，UltraVIEW VoX(U-Vox)，珀金埃尔默仪器(上海)有限公司)下观察多肽纳米药物对细胞的作用，结果如图8所示。
由图可知，FITC标记的抗肿瘤多肽纳米药物与Caki-2细胞在pH为6.5培养液中共孵育2h后，在Caki-2细胞表面可以观察到明显的绿色荧光，说明多肽纳米药物能够精准靶向并且滞留到Caki-2细胞表面；而在pH为7.4培养液中共孵育2h后，在Caki-2细胞表面没有观察到明显的绿色荧光，这说明所述抗肿瘤多肽纳米药物与细胞的结合具有酸响应性。
为了进一步研究所述抗肿瘤多肽纳米药物对癌细胞通透性的影响，进行了乳酸脱氢酶泄漏实验。将抗肿瘤多肽纳米药物按20×10-6M的浓度在pH为7.4和pH为6.5的细胞培养液中分别与Caki-2细胞共孵育2h，取上清液用酶标仪测量450nm的吸光度，计算上清液中乳酸脱氢酶的含量，结果如图9所示。
由图可知，抗肿瘤多肽纳米药物与Caki-2细胞在pH为6.5的培养液中共孵育2h后，乳酸脱氢酶泄漏明显，说明细胞膜被破坏，证明了抗肿瘤多肽纳米药物能够破坏Caki-2细胞的通透性，在pH为7.4的培养液中孵育后的Caki-2细胞的乳酸脱氢酶泄漏量无明显变化，证明所述抗肿瘤多肽纳米药物对肿瘤细胞膜通透性的破坏作用具有酸响应性。
最后，将抗肿瘤多肽纳米药物与Caki-2细胞在pH 6.5培养液中共孵育，测量细胞活力，结果如图10所示。
由图可知，所述抗肿瘤多肽纳米药物在pH为6.5培养液中对Caki-2细胞具有显著的杀伤效果，并且随药物浓度的增加，对细胞的杀伤能力增强，而在pH为7.4的培养液中对Caki-2细胞的杀伤能力则不明显，进一步验证了所述抗肿瘤多肽纳米药物对细胞的杀伤具作用有酸响应性。
实施例4
本实施例验证实施例1制备的抗肿瘤多肽纳米药物在活体水平上对肿瘤细胞的杀伤作用。
用人肾透明细胞癌细胞进行小鼠移植瘤的建立。取1×106个Caki-2肿瘤细胞注射到小鼠右腿皮下，2周后肿瘤成型(n＝5)。将Cy5标记的抗肿瘤多肽纳米药物以尾静脉注射方式注射到人肾透明细胞癌小鼠模型中，用IVIS小动物成像仪进行成像，验证其在活体内的滞留能力，结果如图11所示。
由图可知，所述抗肿瘤多肽纳米药物在体内的滞留能力明显强于生理盐水组，这说明其在活体内的滞留时间更长，治疗时间也更长，可实现肿瘤的高效可持续性杀伤。
另外，将Cy5标记的多肽纳米药物以尾静脉注射方式注射到人肾透明细胞癌小鼠模型中，验证其抑制肿瘤生长的能力，结果如图12所示。
由图可知，相较于生理盐水对照组，抗肿瘤多肽纳米药物组小鼠体内的肿瘤体积明显较小，说明其可以抑制肿瘤生长，且效果显著。这说明所述抗肿瘤多肽纳米药物对肿瘤生长具有良好的抑制作用，可应用于相关的治疗中。
综上所述，本发明提供了一种抗肿瘤多肽纳米药物，其具有酸响应性及肿瘤微环境响应性，毒副作用较小，可以在酸性环境下组装形成纳米纤维，与肿瘤细胞结合并破坏其通透性，并降低其细胞活力；在活体中的滞留时间较长，抑制细胞增殖的效果明显，可应用于耐药肿瘤的相关治疗中；制备方法成熟高效，具有广阔的应用前景。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 国家纳米科学中心
<120> 一种抗肿瘤多肽纳米药物及其制备方法和应用
<130> 2021
<160> 29
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 1
Xaa Ala Ala Ala
1
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 2
Ala Glu Ala Lys Ala Glu Ala Lys
1 5
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 3
Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu
1 5
<210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 4
Val Lys Val Lys Val Lys Val Lys Pro Pro Thr Lys Val Lys Val Lys
1 5 10 15
Val Lys Val
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 5
Tyr Pro Gly Asp Val
1 5
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 6
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp
1 5
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 7
Val Val Val Val Val Val Asp
1 5
<210> 8
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 8
Leu Leu Lys Lys
1
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 9
Ser Ile Lys Val Ala Val
1 5
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 10
Val Pro Gly Val Gly
1 5
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 11
Lys Leu Val Phe Phe
1 5
<210> 12
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 12
Ala Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys Thr
1 5 10 15
Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg
20 25 30
Leu Leu Arg Lys Gly Asn Tyr
35
<210> 13
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 13
Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His
1 5 10 15
Arg Leu Leu Arg Lys
20
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 14
Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg Leu Leu Arg
1 5 10 15
Lys
<210> 15
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 15
Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu
1 5 10 15
Arg Arg Leu Leu Arg
20
<210> 16
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 16
Arg Ala Gly Leu Gln Trp Pro Ile Gly Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu
1 5 10 15
Arg Arg Leu Leu Arg
20
<210> 17
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 17
Arg Val Val Arg Gln Trp Pro Ile Gly Arg Val Val Arg Arg Val Val
1 5 10 15
Arg Arg Val Val Arg
20
<210> 18
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 18
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 19
Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg Gln
1 5 10 15
Arg
<210> 20
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 20
Lys Met Thr Arg Ala Gln Arg Arg Ala Ala Ala Arg Arg Asn Arg Trp
1 5 10 15
Thr Ala Arg
<210> 21
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 21
Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg
1 5 10 15
Met Asp Val
<210> 22
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 22
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys
1 5 10 15
Lys Arg Lys Val
20
<210> 23
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 23
Thr Arg Arg Asn Lys Arg Asn Arg Ile Gln Glu Gln Leu Asn Arg Lys
1 5 10 15
<210> 24
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 24
Val Arg Leu Pro Pro Pro Val Arg Leu Pro Pro Pro Val Arg Leu Pro
1 5 10 15
Pro Pro
<210> 25
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 25
Arg Arg Ile Arg Pro Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Arg Pro Arg
1 5 10 15
Pro Leu Pro Phe Pro Arg Pro Gly
20
<210> 26
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 26
Pro Ile Glu Val Cys Met Tyr Arg Glu Pro
1 5 10
<210> 27
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 27
Met Val Arg Arg Phe Leu Val Thr Leu Arg Ile Arg Arg Ala Cys Gly
1 5 10 15
Pro Pro Arg Val Arg Val
20
<210> 28
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 28
Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His
1 5 10 15
Ser Lys
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 29
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5

Claims (29)

1.一种抗肿瘤多肽纳米药物，其特征在于，所述抗肿瘤多肽纳米药物包括依次连接的亲水分子、组装肽和功能肽；
所述功能肽为碳酸氢根修饰的阳离子治疗性多肽，所述碳酸氢根修饰的位点为精氨酸上的胍基；所述亲水分子为2,3,4,6-四-乙酰-β-D吡喃葡萄糖苷和/或2,3,4,6-四-乙酰-β-D甘露糖苷；所述组装肽的氨基酸序列为SEQ ID No.11所示的氨基酸序列；所述阳离子治疗性多肽的氨基酸序列为SEQ ID No.15所示的氨基酸序列；
所述抗肿瘤多肽纳米药物由包括如下步骤的制备方法制备得到：
通过化学合成法合成组装肽和功能肽，再将亲水分子与组装肽偶联，得到中间肽，碳酸氢根修饰后，再在自组装缓冲液中进行自组装，得到所述抗肿瘤多肽纳米药物，所述碳酸氢根修饰的步骤包括：将所述中间肽溶解在液体中，通入二氧化碳。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤多肽纳米药物，其特征在于，所述亲水分子为2,3,4,6-四-乙酰-β-D吡喃葡萄糖苷。
3.根据权利要求1所述的抗肿瘤多肽纳米药物，其特征在于，所述亲水分子通过点击反应与所述组装肽共价偶联。
4.根据权利要求1所述的抗肿瘤多肽纳米药物，其特征在于，所述组装肽通过酰胺缩合与所述功能肽共价偶联。
5.根据权利要求1所述的抗肿瘤多肽纳米药物，其特征在于，所述抗肿瘤多肽纳米药物为式I所示的化合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE002A
式I。
6.根据权利要求1所述的抗肿瘤多肽纳米药物，其特征在于，所述抗肿瘤多肽纳米药物在酸性环境下由纳米微粒组装成纳米纤维。
7.根据权利要求6所述的抗肿瘤多肽纳米药物，其特征在于，所述纳米微粒的直径为40~60 nm。
8.根据权利要求7所述的抗肿瘤多肽纳米药物，其特征在于，所述纳米微粒的直径为50nm。
9.根据权利要求6所述的抗肿瘤多肽纳米药物，其特征在于，所述纳米纤维的宽度为15~25 nm。
10.根据权利要求9所述的抗肿瘤多肽纳米药物，其特征在于，所述纳米纤维的宽度为20 nm。
11.根据权利要求6所述的抗肿瘤多肽纳米药物，其特征在于，所述纳米纤维的长度不小于1 μm。
12.根据权利要求6所述的抗肿瘤多肽纳米药物，其特征在于，所述抗肿瘤多肽纳米药物在酸性环境下由纳米微粒组装成纳米纤维，所述组装的驱动力为氢键、范德华力或π-π相互作用中的任意一种或至少两种的组合。
13.根据权利要求6所述的抗肿瘤多肽纳米药物，其特征在于，所述纳米纤维的空间结构为α-螺旋和/或β-片层。
14.一种如权利要求1~13中任一项所述的抗肿瘤多肽纳米药物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
通过化学合成法合成组装肽和功能肽，再将亲水分子与组装肽偶联，得到中间肽，碳酸氢根修饰后，再在自组装缓冲液中进行自组装，得到所述抗肿瘤多肽纳米药物，所述碳酸氢根修饰的步骤包括：将所述中间肽溶解在液体中，通入二氧化碳。
15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述化学合成法包括固相合成法。
16.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述液体包括磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液的pH为7.3~7.5。
17.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述磷酸缓冲液的pH为7.4。
18.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述通入二氧化碳的时间为1~3 h。
19.根据权利要求18所述的制备方法，其特征在于，所述通入二氧化碳的时间为2 h。
20.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述自组装缓冲液包括磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液或HEPES缓冲液中的任意一种。
21.根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于，所述自组装缓冲液为磷酸盐缓冲液。
22.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述自组装缓冲液的pH为7.0~8.0。
23.根据权利要求22所述的制备方法，其特征在于，所述自组装缓冲液的pH为7.4。
24.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
通过固相合成法合成组装肽和功能肽，再将亲水分子与组装肽偶联，得到中间肽；
将所述中间肽溶解在pH为7.3~7.5的磷酸缓冲液中，通入二氧化碳，处理1~3 h；
再在pH为7.0~8.0的自组装缓冲液中进行自组装，得到所述抗肿瘤多肽纳米药物。
25.如权利要求1~13中任一项所述的抗肿瘤多肽纳米药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
26.如权利要求25所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物的给药方式包括静脉给药、皮下给药或腹腔给药中的任意一种。
27.如权利要求26所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物的给药方式为静脉给药。
28.如权利要求25所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物的给药浓度为不大于100μM。
29.如权利要求28所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物的给药浓度为80 μM。
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