CN108752429B - 两亲性多肽p13及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种两亲性多肽P13及其制备方法，属于多肽领域。本发明的两亲性多肽的氨基酸序列中包括亲水段DGRHHH和疏水段，疏水段由L和A氨基酸组成，具体地，氨基酸序列为DGRHHHLLLAAAA。本发明还提供了一种制备该两亲性多肽P13的方法，该制备方法为固相合成法。本发明提供的两亲性多肽P13对癌细胞具有主动靶向识别，同时具有海绵质子效应，即逃逸能力，在作为药物传递载体的开发和应用方面有重要价值。

Description

两亲性多肽P13及其制备方法

技术领域

本发明属于多肽领域，更具体地说，涉及一种两亲性多肽P13及其制备方法，该两亲性多肽对癌细胞具有主动靶向识别和质子海绵效应。

背景技术

近年来，恶性肿瘤发病率多年持续上升，已成为一个必须高度重视的公共卫生问题乃至社会问题。全球每年新发癌症病例超1000万，死亡人数超700万，我国目前每年新增350万癌症患者，每年癌症死亡人数达250万人，伴随着老龄化的加剧、环境问题的凸显、不健康的生活习惯，癌症的发病率以年均3％～5％的速度递增。在部分城市，癌症超过了心血管疾病，成了致人于死地的“第一杀手”。中国的癌症患者被确诊时，绝大多数已处于中晚期，5 年生存率大约在30％左右。虽然在癌症基础研究和临床治疗领域投入巨大，但所取得的成果仍不令人满意。

目前临床上有多种用于癌症治疗的药物，比如紫杉醇(Paclitaxel，PTX)是一种常见的化疗药物，对多种肿瘤都具有抗肿瘤活性，包括乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌等。但是PTX 易致心脏毒性、超敏反应、肾毒性、神经毒性等不良反应，以及PTX在体内非选择性分布，限制了它的临床运用。基于纳米递送系统(Nano-delivery system，NDS)靶向肿瘤的治疗方式已经成为克服常规化疗药物特异性的缺乏的有效方法，临床研究表明NDS可以改善药物的治疗指数和药代动力学特征：将药物包载在水溶性的NDS中可以克服溶解度的问题，提高药物在血液循环中的稳定性和循环时间，同时保护药物免于生物降解；特殊结构或经过特异性修饰的NDS可以改变药物在体内的分布情况，提高对于肿瘤的靶向性，降低毒副作用。

但是仍然有一些不足之处，主要体现在释药上不够灵敏与迅速，原位肿瘤抑瘤效果不够理想，治疗晚期部分裸鼠肿瘤出现器官间的转移。由于肿瘤细胞中存在复杂的基因调控机制，导致了单纯化疗在治疗肿瘤转移上具有一定的局限性。近年来，随着对肿瘤细胞中分子功能、上下游调控机制和临床病理特点的深入了解，通过基因技术降低肿瘤细胞扩散能力已成为一个新的研究方向。

中国专利申请号为2017106499394，申请公开日为2017年11月21日的专利申请文件公开了一种两亲性多肽DGRGGGAAAA及其制备方法、新型抗癌药物传递系统及其制备方法，该多肽的制备方法包括：1)以DMF为溶剂，DCM为膨胀剂，DIC为催化剂，利用固相合成法合成DGRGGGAAAA；2)将DGRGGGAAAA和阿霉素(DOX)混合溶于水中，然后将体系进行多次透析，最后将透析后的体系进行离心处理去上清液以得到新型抗癌药物传递系统。该两亲性多肽DGRGGGAAAA的设计理念为：以RGD为靶向端和亲水端，考虑到疏水性越强溶血性越强，即对人体正常细胞的毒副作用越大，故以四个疏水性氨基酸A为疏水端，又因为烷基链少于10个碳无法自组装，故在RGD和A₄之间加入具有足够自由度和低空间位阻的连接肽G₃。但是该专利中公开的两亲性多肽在体内容易被溶酶体消噬，降低了药物的利用率。而且该多肽疏水性比较小，能包载的药物较少。因此需要进一步研究得到性能更好的两亲性多肽。

发明内容

1.要解决的问题

现有两亲性药物传递载体均是通过内吞作用进入溶酶体，然而溶酶体酸性环境会消噬分解药物载体，使其利用率大大降低，针对该问题，本发明提供一种两亲性多肽P13及其制备方法，该制备方法采用固相合成法制备两亲性多肽P13，两亲性多肽P13对癌细胞具有主动靶向识别和质子海绵效应，使得该P13肽作为药物运输载体的靶向效果最大化。

2.技术方案

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种两亲性多肽P13，所述的两亲性多肽P13的氨基酸序列中包括亲水段DGRHHH和疏水段，疏水段由L和A氨基酸组成。

更进一步地，所述的两亲性多肽P13的氨基酸序列为DGRHHHLLLAAAA，分子结构式如下所示：

上述的两亲性多肽P13的制备方法，包括以下步骤：

1)将基体树脂浸泡于溶剂中，接着加入N，N-二异丙基乙胺DIEA、天冬氨酸Fmoc-Asp (OtBu)-OH进行接触反应，然后洗涤、封头处理、脱保护，最后洗涤直至茚三酮检测为蓝色以得到二级树脂；

2)将所述二级树脂依次与多种化合物进行多次改性处理得到三级树脂；每次所述改性处理为：将二级树脂与所述化合物在1-羟基苯并三氮唑HoBt、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐HBTU的存在下进行接触反应，然后经过脱保护、洗涤直至茚三酮检测为蓝色以得到三级树脂；单次改性处理中的化合物依次独立为Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、 Fmoc-His(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH；

3)将所述三级树脂洗涤、干燥，然后与切割液进行切割反应以制得所述两亲性多肽P13。

更进一步地，在步骤1)中，所述浸泡至少满足以下条件：浸泡温度为15-30℃，浸泡时间为10-30min；

所述接触反应至少满足以下条件：反应温度为15-30℃，反应时间为0.5-2h。

更进一步地，在步骤1)中，相对于0.25g的所述基体树脂，所述DIEA的用量为0.3-0.8mL，所述Fmoc-Asp(OtBu)-OH的用量为0.08-0.49g；

在步骤1)中，所述封头处理采用二氯甲烷DCM、甲醇和DIEA加入体系中进行；相对于0.25g的所述基体树脂，所述DCM的用量为5-20mL，所述甲醇的用量为0.3-0.8mL，所述DIEA的用量为0.3-0.8mL；

步骤1)中所述溶剂选自DCM、DMF中的至少一者，所述基体树脂选自2-氯三苯甲基氯树脂、Wang树脂、MBHA树脂和Rink树脂中的至少一者。

更进一步地，在步骤2)中，所述接触反应至少满足以下条件：反应温度为15-30℃，反应时间为0.5-2h；

在单次改性处理中，相对于0.25g所述基体树脂，所述HoBt的用量为0.2-0.3g，所述HBTU 的用量为0.2-0.5g，所述化合物的用量依次为：所述Fmoc-Gly-OH的用量为0.2-0.6g、Fmoc-Arg (pbf)-OH的用量为0.5-0.8g、Fmoc-His(OtBu)-OH的用量为0.5-0.8g、Fmoc-Gly-OH的用量为 0.2-0.6g、Fmoc-Ala-OH的用量为0.2-0.6g。

更进一步地，在步骤3)中，所述切割液由三氟乙酸TFA、三异丙基硅烷TIS、1，2-乙二硫醇EDT和水组成；所述TFA、TIS、EDT和水的体积比为95∶(1.5-2.5)∶(1.5-2)∶(1-2)；相对于0.25g的所述基体树脂，所述切割液的用量为10-15mL：

在步骤3)中，所述切割反应满足以下条件：切割温度为15-30℃，切割时间为1.5-3h；

在步骤3)中，所述干燥满足以下条件：干燥温度为30-35℃，干燥时间为1-2h。

更进一步地，在步骤1)-3)中，所述添料采用过量添加的方式进行，即最大可能的保证反应的充分性，并且多量的试剂不会残留在反应体系内。

更进一步地，在步骤1)-3)中，所述脱保护的脱保护试剂由哌啶PIP、DMF组成，所述PIP、DMF的体积比为1∶3-5。

更进一步地，在所述切割反应之后，所述制备方法还包括提纯：首先采用冰甲基叔丁醚离心沉降得到粗品，经滤膜过滤后，接着通过色谱柱梯度洗脱法进行二次提纯；其中，梯度洗脱法中洗脱液A：0.1％TFA/H₂O，洗脱液B：0.1％TFA/80％乙腈-H₂O(V/V)；

在所述二次提纯过程中，滤膜孔径为0.25-0.45μm，洗脱时间为0-30min，检测波长为 214nm，柱温为20-32℃，流动相流速1.0-1.4mL/min，进样量3-5mL；

在30min内，梯度洗脱20％B→80％B(由20％B提升到80％B)；

色谱柱选择C18柱，规格可选择10μm，30mm×250mm、3.5μm，4.6mm×250mm、5μm，4.6mm×150mm。

通过上述技术方案，本发明以基体树脂为载体，在树脂上合成由天冬氨酸D、甘氨酸G、精氨酸R、组氨酸H、亮氨酸L、丙氨酸A组成的两亲性多肽P13。

3.有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明设计合成的带有D、G、R、H、L、A的小分子两亲性多肽，最后用切割液 A(TFA、TIS、EDT和水组成)将此序列多肽从树脂上切割下来，用冰甲基叔丁醚沉析法拿到粗品，用HPLC纯化得到纯品；该两亲性多肽对Hela细胞等多种癌细胞都具有明显的主动识别结合的作用，并且在模拟溶酶体环境中，具有较强的缓冲能力，表明该肽不会被溶酶体等酸性环境捕获消噬，其具有较强的逃逸能力，即质子海绵效应，因此相比较与现有技术的多肽(CN 2017106499394)，具有更高的药物利用率，表明P13肽在作为药物传递载体的开发和应用方面有重要价值；

(2)本发明分别合成并检测四条两亲性多肽的酸碱缓冲能力测试，即DGRGGGAAAALLL、DGRLLLAAAA、DGRHHHAAAA、DGRHHHLLLAAAA，分析得到疏水性氨基酸亮氨酸L具有良好的质子缓冲能力，同时还发现，相较于直接把具有缓冲能力的氨基酸加入两亲性肽链的末端，插入亲水端和疏水端之间可以更好的提高酸碱缓冲能力；

(3)本发明以最终得到的酸碱缓冲能力最好的两亲性多肽链DGRHHHLLLAAAA做细胞毒性实验，结果表明，相较于目前市场广泛使用于癌症治疗的药物阿霉素，经过DGRHHHLLLAAAA包载修饰阿霉素之后的纳米微球有更多的药物进入细胞质中(图4所示)；

(4)本发明设计的两亲性多肽P13具有主动靶向识别癌细胞受体αvβ3整合素，同时具有质子海绵效应，不仅能把基因与药物递送到肿瘤部位，而且还能把基因与药物分别传送到各自作用的位点，在溶酶体低pH下发挥质子海绵效应而保护基因免受降解，并且具有较强的透膜和内涵体逃逸能力，具有理想的抑瘤效果；

(5)本发明提供的多肽P13的制备方法，结合P13自身的特点，选择了HBTU作为催化剂进行反应，克服了现有技术中的DIC催化剂存在的反应时间长，容易导致已经连接上的肽键断裂的缺陷；而且，本发明P13肽链比较长，连接的步骤多，如果用DIC催化剂，长时间反应，会增加很多副产物，而HBTU可以提高目的产物的含量，效果更好；

(6)本发明制备方法中采用的切割液(TFA、TIS、EDT和水的体积比为95∶(1.5-2.5)∶ (1.5-2)∶(1-2))比现有常用的切割液相比(如CN 2017106499394中的切割液)，切割更彻底，制备效率更高；

(7)本发明的制备方法，结合使用的催化剂、切割液等条件，最终选择了甲基叔丁醚对反应物进行沉降纯化，在本发明的条件下，发明人发现甲基叔丁醚对多肽中残留的有机溶剂除掉的比较彻底，如果采用常用的乙醚进行离心，会有有机溶剂残留，从而导致多肽结块，而不是粉末状，而且残留的有机溶剂会增加对正常细胞的毒性。

附图说明

图1为本发明实施例1的两亲性多肽P13质谱图；

图2为本发明实施例1的两亲性多肽P13液相图；

图3为本发明实施例1的两亲性多肽P13红外光谱图；

图4为本发明实施例1的两亲性多肽P13包载药物阿霉素之后形成P13-DOX的细胞摄取图；

图5为本发明实施例1的两亲性多肽P13质子海绵效应图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明提供了一种两亲性多肽P13，所述的两亲性多肽P13的氨基酸序列中包括亲水段 DGRHHH和疏水段由L和A氨基酸组成。

更进一步地，所述的两亲性多肽P13的氨基酸序列为DGRHHHLLLAAAA，分子结构式如下所示：

本发明还提供了一种上述的两亲性多肽P13的制备方法，包括：

1)将基体树脂浸泡于溶剂中，接着加入N，N-二异丙基乙胺(DIEA)、天冬氨酸Fmoc-Asp (OtBu)-OH进行接触反应，然后洗涤、封头处理、脱保护，最后洗涤直至茚三酮检测为蓝色以得到二级树脂；

2)将所述二级树脂依次与多种化合物进行多次改性处理得到三级树脂；每次所述改性处理为：将二级树脂与所述化合物在1-羟基苯并三氮唑(HoBt)、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)的存在下进行接触反应，然后经过脱保护、洗涤直至茚三酮检测为蓝色以得到三级树脂；单次改性处理中的化合物依次独立为Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-His(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH；

3)将所述三级树脂洗涤、干燥，然后与切割液进行切割反应以制得所述两亲性多肽P13。

在本发明的步骤1)中，浸泡的条件可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高浸泡效果，优选地，在步骤1)中，浸泡至少满足以下条件：浸泡温度为15-30℃，浸泡时间为10-30min。

在本发明的步骤1)中，接触反应的条件可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高产率以及反应速率，优选地，接触反应至少满足以下条件：反应温度为15-30℃，反应时间为 0.5-2h。

在本发明的步骤1)中，物料的用量可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高产率，优选地，在步骤1)中，相对于0.25g的所述基体树脂，所述DIEA的用量为0.3-0.8mL，所述Fmoc-Asp(OtBu)-OH的用量为0.08-0.49g。

在本发明的步骤1)中，封头处理的条件可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高产率，优选地，在步骤1)中，封头处理采用二氯甲烷DCM、甲醇和DIEA加入体系中进行。

在本发明的步骤1)中，封头处理的试剂的用量可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高产率，优选地，相对于0.25g的所述基体树脂，所述DCM的用量为5-20mL，所述甲醇的用量为0.3-0.8mL，所述DIEA的用量为0.3-0.8mL。

在本发明的步骤1)中，溶剂的种类可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高产率，优选地，溶剂选自DCM、DMF中的至少一者，基体树脂选自2-氯三苯甲基氯树脂、Wang树脂、MBHA树脂和rink树脂中的至少一者。

在本发明的步骤2)中，接触反应的条件可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高产率，优选地，在步骤2)中，接触反应至少满足以下条件：反应温度为15-30℃，反应时间为0.5-2h。

在本发明的步骤2)中，物料的用量以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高产率，优选地，在单次改性处理中，相对于0.25g所述基体树脂，所述HoBt的用量为0.2-0.3g，所述HBTU的用量为0.2-0.5g，所述化合物的用量依次为：所述Fmoc-Gly-OH的用量为0.2-0.6g、 Fmoc-Arg(pbf)-OH的用量为0.5-0.8g、Fmoc-His(OtBu)-OH的用量为0.5-0.8g、Fmoc-Gly-OH 的用量为0.2-0.6g、Fmoc-Ala-OH的用量为0.2-0.6g。

在本发明的步骤3)中，切割液的组分以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高产率，优选地，在步骤3)中，所述切割液由TFA(三氟乙酸)、TIS(三异丙基硅烷)、EDT(1，2-乙二硫醇)和水组成。其中，各组分的具体含量可以在宽的范围内变化，但是为了进一步提高切割效果，优选地，所述TFA、TIS、EDT和水的体积比为95∶1.5-2.5∶1.5-2∶1-2。

在本发明的步骤3)中，切割液的用量以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高产率，优选地，相对于0.25g的所述基体树脂，所述切割液的用量为10-15mL。

在本发明的步骤3)中，切割反应的条件以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高产率，优选地，在步骤3)中，切割反应满足以下条件：切割温度为15-30℃，切割时间为1.5-3h。

在本发明的步骤3)中，干燥的条件以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高产率，干燥满足以下条件：干燥温度为30-35℃，干燥时间为1-2h。

在本发明的步骤1)-3)中，洗涤的操作以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高产率，优选地，在步骤1)-3)中，所述添料采用过量添加的方式进行，即最大可能的保证反应的充分性，并且多量的试剂不会残留在反应体系内。

在本发明的步骤1)-3)中，脱保护采用的试剂以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高产率，优选地，在步骤1)-3)中，所述脱保护的脱保护试剂由哌啶PIP、DMF组成，所述PIP、DMF的体积比为1∶(3-5)。

在本发明中，产物的提纯方式可以是多种，但是为了简化提纯步骤以及提高提纯效果，优选地，在切割反应之后，该制备方法还包括提纯：首先采用冰甲基叔丁醚离心沉降得到粗品，经滤膜过滤后，接着通过色谱柱梯度洗脱法进行二次提纯，其中，梯度洗脱法中洗脱液 A：0.1％TFA/H₂O，洗脱液B：0.1％TFA/80％乙腈-H₂O(V/V)；

二次提纯的具体条件可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高提纯效果，优选地，在二次提纯过程中滤膜孔径为0.25-0.45μm，洗脱时间为0-30min，检测波长为214nm，柱温为20-32℃，流动相流速1.0-1.4mL/min，进样量3-5mL；更优选地，在30min内，梯度洗脱20％B→80％B；进一步优选地，色谱柱选择C18柱，规格可选择10μm，30mm×250mm、 3.5μm，4.6mm×250mm、5μm，4.6mm×150mm。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

实施例1

1)将0.25g 2-氯三苯甲基氯树脂于5mL、15℃DCM中浸泡10min，接着加入0.3mLDIEA、 0.08gFmoc-Asp(OtBu)-OH于15℃下反应30min，然后进行洗涤；

2)将5mL DCM、0.3mL甲醇和0.3mL DIEA加入反应体系中进行封头处理，接着加入哌啶进行脱保护，然后洗涤反应体系，直至茚三酮检测为蓝色；

3)将0.2g Fmoc-Gly-OH、0.2g HoBt、0.2g HBTU加入反应体系中于15℃下接触反应 30min，洗涤后加入哌啶进行脱保护，再次洗涤反应体系，直至经过茚三酮检测为蓝色；依次加入0.5g Fmoc-Arg(pbf)-OH、0.5g Fmoc-His(OtBu)-OH、0.2g Fmoc-Gly-OH、0.2gFmoc-Ala-OH于15℃下反应30min；

4)依次通过DMF、DCM、甲醇洗涤，然后于30℃下干燥1h至粉末状，加入10mL切割液A(TFA、TIS、EDT和水的体积比为95∶1.5∶1.5∶2)切割树脂与肽链，加入冰甲基叔丁醚离心沉降得到粗品；

5)将粗品进行高效液相纯化得到高纯度两亲性多肽P13，产率为80.33％，具体为：在开始工作之前先使用95％的乙腈冲洗柱子10min，以保证色谱柱内残留的样品等杂质影响制备效果；将400mg粗品使用乙腈和水的混合溶液溶解成5mL溶液，经0.25μm滤膜过滤，进行梯度洗脱，梯度洗脱法中洗脱液A：0.1％TFA/H₂O，洗脱液B：0.1％TFA/80％乙腈-H₂O(V/V)，洗脱时间为0-30min，检测波长为214nm，柱温为20℃，流动相流速1.0mL/min，进样量5mL。

实施例2

1)将0.25g 2-氯三苯甲基氯树脂于5mL、20℃DCM中浸泡20min，接着加入0.5mLDIEA、 0.2gFmoc-Asp(OtBu)-OH于20℃下反应60min，然后进行洗涤；

2)将10mL DCM、0.5mL甲醇和0.5mL DIEA加入反应体系中进行封头处理，接着加入哌啶进行脱保护，然后洗涤反应体系，直至茚三酮检测为蓝色；

3)将0.4g Fmoc-Gly-OH、0.3g HoBt、0.3g HBTU加入反应体系中于20℃下接触反应 60min，洗涤后加入哌啶进行脱保护，再次洗涤反应体系，直至经过茚三酮检测为蓝色；依次加入0.6g Fmoc-Arg(pbf)-OH、0.6g Fmoc-His(OtBu)-OH、0.4g Fmoc-Gly-OH、0.4gFmoc-Ala-OH于20℃下反应60min；

4)依次通过DMF、DCM、甲醇洗涤，然后于30℃下干燥1h至粉末状，加入12mL切割液A(TFA、TIS、EDT和水的体积比为95∶2∶2∶1)切割树脂与肽链，加入冰甲基叔丁醚离心沉降得到粗品；

5)将粗品进行高效液相纯化得到高纯度两亲性多肽P13，产率为79.17％，具体为：在开始工作之前先使用95％的乙腈冲洗柱子10min，以保证色谱柱内残留的样品等杂质影响制备效果；将329mg粗品使用乙腈和水的混合溶液溶解成5mL溶液，经0.45μm滤膜过滤，进行梯度洗脱，梯度洗脱法中洗脱液A：0.1％TFA/H₂O，洗脱液B：0.1％TFA/80％乙腈-H₂O(V/V)，洗脱时间为0-30min，检测波长为214nm，柱温为25℃，流动相流速1.2mL/min，进样量5mL。

实施例3

1)将0.25g 2-氯三苯甲基氯树脂于20mL、30℃DCM中浸泡20min，接着加入0.8mLDIEA、0.49g Fmoc-Asp(OtBu)-OH于30℃下反应120min，然后进行洗涤；

2)将20mL DCM、0.8mL甲醇和0.8mL DIEA加入反应体系中进行封头处理，接着加入哌啶进行脱保护，然后洗涤反应体系，直至茚三酮检测为蓝色；

3)将0.6g Fmoc-Gly-OH、0.3g HoBt、0.5g HBTU加入反应体系中于35℃下接触反应 120min，洗涤后加入哌啶进行脱保护，再次洗涤反应体系，直至经过茚三酮检测为蓝色；依次加入0.8g Fmoc-Arg(pbf)-OH、0.8g Fmoc-His(OtBu)-OH、0.6g Fmoc-Gly-OH、0.6gFmoc-Ala-OH于30℃下反应120min；

4)依次通过DMF、DCM、甲醇洗涤，然后于30℃下干燥1h至粉末状，加入15mL切割液A(TFA、TIS、EDT和水的体积比为95∶2.5∶1.5∶1)切割树脂与肽链，加入冰甲基叔丁醚离心沉降得到粗品；

5)将粗品进行高效液相纯化得到高纯度两亲性多肽P13，产率为79.24％，具体为：在开始工作之前先使用95％的乙腈冲洗柱子10min，以保证色谱柱内残留的样品等杂质影响制备效果；将361mg粗品使用乙腈和水的混合溶液溶解成5mL溶液，经0.45μm滤膜过滤，进行梯度洗脱，梯度洗脱法中洗脱液A：0.1％TFA/H₂O，洗脱液B：0.1％TFA/80％乙腈-H₂O(V/V)，洗脱时间为0-30min，检测波长为214nm，柱温为30℃，流动相流速1.4mL/min，进样量5mL。

实施例4

利用液质联用质谱仪(LC-MS)、液相色谱(HPLC)、红外光谱(IR)分析实施例1中两亲性多肽P13的分子量及结构，检测结果参见图1、图2、图3，

由图1可知主要物质分子量为1381.70，和DGRHHHLLLAAAA的理论分子量一致，并通过高效液相色谱进一步纯化，图2为纯化图。

图3中，3277cm^-1为vNH、1627cm^-1为vC＝O、1541cm^-1为βNH、1436cm^-1为vCN，是典型的酰胺结构；2958cm^-1为v_asCH2和v_sCH2烷烃，考虑为精氨酸和天冬氨酸侧链CH₂； 1203cm^-1、1184cm^-1为vC-O以及vC-N，考虑为天冬氨酸侧链COOH、精氨酸和组氨酸侧链的C-N，应为P13肽链的亲水端，2644cm^-1、623-1060cm^-1处的峰为疏水端C-H键。

实施例5

1)两亲性多肽P13包载药物阿霉素(DOX)之后形成P13-DOX的细胞摄取作用

从液氮或干冰容器中取出Hela细胞冷冻管，立即放入37℃水槽快速解冻，随后移至2mL 含RPMI-1640、10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的完全培养基中800rpm离心去掉上清液，用上述完全培养基将下层沉淀细胞重悬后移入到细胞培养皿中，放置于二氧化碳(CO₂)细胞培养箱中在37℃和5％CO₂的条件下培养。将复苏的Hela传代三次以上，待细胞状态良好后方可进行下面实验。将Hela细胞孵育至90％的细胞呈贴壁状态，然后用1mL的0.25％胰蛋白酶在培养箱消化2min，800rpm离心5min，用完全培养基重悬Hela细胞后，用血球计数板确定Hela细胞数量，用完全培养基稀释重悬Hela细胞浓度为8×10⁴/mL。

Hela细胞铺24孔板(5×10⁴个细胞/孔)，待细胞孵育至贴壁时，加入P13-DOX纳米微球，在恒温二氧化碳培养箱，经过2h、6h孵育后，细胞通过DAPI(一种染细胞核的染料)染色后，在扫描型激光共聚焦显微镜(FV1200，日本OLYMPUS)观察成像。

通过图4可知，本发明设计的两亲性多肽P13作为药物载体，可以使更多的药物进入癌细胞中，即两亲性多肽P13对于对癌细胞具有较强的主动识别能力。

2)两亲性多肽P13海绵质子效应图

采用酸碱滴定法测定。将P10-L3(即DGRGGGAAAALLL)、DGRLLLAAAA、 DGRHHHAAAA、P13肽溶解于蒸馏水中，配成浓度1mg/mL溶液。以4mol/L NaOH液调节pH至12，然后以1mol/LHCl液滴定(每次10μL，滴加直至pH＝2)；以超纯水配置的 NaCl溶液(浓度1mg/mL)为空白对照，以pH计测定。

通过图5可知，与P10-L3、DGRLLLAAAA、DGRHHHAAAA相比，本发明设计的两亲性多肽P13在酸性环境中具有较好的缓冲能力，即在人体微环境中，P13肽对于溶酶体等吞噬小泡的捕获具有较好的逃逸能力。与空白组相比，P10-L3和DGRLLLAAAA具有明显的缓冲能力(例如在盐酸加入300微升时，空白组的pH已经下降到3，但是P10-L3和 DGRLLLAAAA都还保持在10左右)，而丙氨酸是疏水性最小的氨基酸，通常认为是没有活性的氨基酸，所以通过空白组、P10-L3和DGRLLLAAAA三组的实验数据比较分析，我们认为亮氨酸L具有良好的质子缓冲能力，这也是本发明设计的两亲性多肽P13具有更优越性能的原因之一，本发明的两亲性多肽P13具有较强的缓冲能力，不会被溶酶体等酸性环境捕获消噬，其具有较强的逃逸能力，更适合于作为药物传递载体。

按照实施例4和5相同的方法对实施例2-3的产物进行检测，检测结果基本与实施例1 的产物的检测结果基本一致。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (9)

1.一种两亲性多肽P13，其特征在于：所述的两亲性多肽P13的氨基酸序列中包括亲水段DGRHHH和疏水段，疏水段由L和A氨基酸组成，其氨基酸序列为AAAALLLHHHRGD，分子结构式如下所示：

2.权利要求1中所述的两亲性多肽P13的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将基体树脂浸泡于溶剂中，接着加入N,N-二异丙基乙胺DIEA、天冬氨酸Fmoc-Asp(OtBu)-OH进行接触反应，然后洗涤、封头处理、脱保护，最后洗涤直至茚三酮检测为蓝色以得到二级树脂；

2)将所述二级树脂依次与多种化合物进行多次改性处理得到三级树脂；每次所述改性处理为：将二级树脂与所述化合物在1-羟基苯并三氮唑HoBt、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐HBTU的存在下进行接触反应，然后经过脱保护、洗涤直至茚三酮检测为蓝色以得到三级树脂；单次改性处理中的化合物依次独立为Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-His(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH；

3)将所述三级树脂洗涤、干燥，然后与切割液进行切割反应以制得所述两亲性多肽P13。

3.根据权利要求2所述的两亲性多肽P13的制备方法，其特征在于，在步骤1)中，所述浸泡至少满足以下条件：浸泡温度为15-30℃，浸泡时间为10-30min；

所述接触反应至少满足以下条件：反应温度为15-30℃，反应时间为0.5-2h。

4.根据权利要求2所述的两亲性多肽P13的制备方法，其特征在于，在步骤1)中，相对于0.25g的所述基体树脂，所述DIEA的用量为0.3-0.8mL，所述Fmoc-Asp(OtBu)-OH的用量为0.08-0.49g；

在步骤1)中，所述封头处理采用二氯甲烷DCM、甲醇和DIEA加入体系中进行；相对于0.25g的所述基体树脂，所述DCM的用量为5-20mL，所述甲醇的用量为0.3-0.8mL，所述DIEA的用量为0.3-0.8mL；

步骤1)中所述溶剂选自DCM、DMF中的至少一者，所述基体树脂选自2-氯三苯甲基氯树脂、Wang树脂、MBHA树脂和Rink树脂中的至少一者。

5.根据权利要求2所述的两亲性多肽P13的制备方法，其特征在于，在步骤2)中，所述接触反应至少满足以下条件：反应温度为15-30℃，反应时间为0.5-2h；

在单次改性处理中，相对于0.25g所述基体树脂，所述HoBt的用量为0.2-0.3g，所述HBTU的用量为0.2-0.5g，所述化合物的用量依次为：所述Fmoc-Gly-OH的用量为0.2-0.6g、Fmoc-Arg(pbf)-OH的用量为0.5-0.8g、Fmoc-His(OtBu)-OH的用量为0.5-0.8g、Fmoc-Gly-OH的用量为0.2-0.6g、Fmoc-Ala-OH的用量为0.2-0.6g。

6.根据权利要求2所述的两亲性多肽P13的制备方法，其特征在于，在步骤3)中，所述切割液由三氟乙酸TFA、三异丙基硅烷TIS、1,2-乙二硫醇EDT和水组成；所述TFA、TIS、EDT和水的体积比为95：(1.5-2.5)：(1.5-2)：(1-2)；相对于0.25g的所述基体树脂，所述切割液的用量为10-15mL：

在步骤3)中，所述切割反应满足以下条件：切割温度为15-30℃，切割时间为1.5-3h；

在步骤3)中，所述干燥满足以下条件：干燥温度为30-35℃，干燥时间为1-2h。

7.根据权利要求2-6中任一项所述的两亲性多肽P13的制备方法，其特征在于，在步骤1)-3)中，所述添料采用过量添加的方式进行，即最大可能的保证反应的充分性，并且多量的试剂不会残留在反应体系内。

8.根据权利要求2-6中任一项所述的两亲性多肽P13的制备方法，其特征在于，在步骤1)-3)中，所述脱保护的脱保护试剂由哌啶PIP、DMF组成，所述PIP、DMF的体积比为1：3-5。

9.根据权利要求2-6中任一项所述的两亲性多肽P13的制备方法，其特征在于，在所述切割反应之后，所述制备方法还包括提纯：首先采用冰甲基叔丁醚离心沉降得到粗品，经滤膜过滤后，接着通过色谱柱梯度洗脱法进行二次提纯；其中，梯度洗脱法中洗脱液A：0.1％TFA/H₂O，洗脱液B：0.1％TFA/80％乙腈-H₂O(V/V)；

在所述二次提纯过程中，滤膜孔径为0.25-0.45μm，洗脱时间为0-30min，检测波长为214nm，柱温为20-32℃，流动相流速1.0-1.4mL/min，进样量3-5mL；

在30min内，梯度洗脱20％B→80％B；

色谱柱选择C18柱，规格可选择10μm，30mm×250mm、3.5μm，4.6mm×250mm、5μm，4.6mm×150mm。

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