CN111135187B - 一种多肽-顺铂前药复合物、其自组装纳米递送体系及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种多肽‑顺铂前药复合物、其自组装纳米递送体系及其制备方法和应用，所述多肽‑顺铂前药复合物包括顺铂分子、阳离子多肽和疏水性分子，顺铂分子和疏水性分子连接在阳离子多肽上；所述自组装纳米递送体系包括所述多肽‑顺铂前药复合物、载体以及包载于体系中的siRNA；本发明构建的自组装纳米递送体系通过对顺铂分子和siRNA分子的共递送，实现了自噬调节剂和化疗药物对肿瘤的联合治疗，尤其实现了对顺铂耐药性肿瘤的联合治疗。

Description

一种多肽-顺铂前药复合物、其自组装纳米递送体系及其制备 方法和应用
技术领域
本发明属于纳米材料技术领域，涉及一种多肽-顺铂前药复合物、其自组装纳米递送体系及其制备方法和应用。
背景技术
铂类药物是一种常规的临床使用的化疗药物，然而，获得性耐药的发生以及铂类药物对机体的毒副作用对其临床的广泛应用提出了重大挑战。为解决这一问题，策略之一是将活性Pt(II)分子制备成前药复合物，使该复合物仅在肿瘤微环境中释放活性Pt(II)分子，从而避免其与血液蛋白及其他生物分子相互作用从而显示出较低的毒性。化疗耐药是由多种机制引起的，包括增加药物外排、肿瘤异质性、应激诱导的表观遗传或遗传改变等等。其中，肿瘤细胞自身对顺铂的反应作用可能是其化疗耐药的重要原因。研究表明，自噬激活和胞内还原分子过度表达是一些肿瘤细胞对顺铂抗性的常见表现。
细胞自噬是维持体内平衡，蛋白质降解的重要的细胞代谢过程，化疗过程中对肿瘤细胞的自噬调节将是降低肿瘤耐药性和提高肿瘤治疗效率的有效且普遍的方法。鉴于此，将自噬调节剂和化疗药物结合起来进行癌症治疗引起了越来越多的关注，但多种药物的共负载效率的不足以及从纳米颗粒中缓慢释放不能达到有效药物浓度往往导致治疗失败。
纳米技术在药物输送和缓控释放中发挥了巨大的作用，目前，人们已经开发了众多智能响应性纳米结构来递送顺铂分子，以此来改善Pt药物的生物安全性和功效，减少副反应，并延长血液循环时间。
CN100355418C公开了一种具有磁靶向性的载顺铂磁性纳米球及其制备方法，是在羧基多糖存在下采用化学共沉淀法制备羧基多糖改性纳米四氧化三铁颗粒，然后通过纳米四氧化三铁颗粒表面羧基多糖中自由羧基与铂原子形成配位作用，实现顺铂与纳米四氧化三铁颗粒的耦联，得到载顺铂磁性纳米球。所制备得到的载顺铂磁性纳米球平均直径小于100nm，磁响应性较强，可在血清中稳定分散，并实现恶性肿瘤的磁靶向化疗。
CN103520207A公开了一种靶向性顺铂纳米海藻酸钠脂质体，所述靶向性顺铂纳米海藻酸钠脂质体的靶向性体现在靶向分子对脂质体的修饰，脂质体的粒径在100nm左右，其构成为：卵磷脂，胆固醇，海藻酸钠，抗肿瘤药物顺铂以及靶向分子。该脂质体系统的顺铂载药率和包封率高，可与肿瘤细胞表面的靶向分子发生特异性结合，从而实现减毒增效，尤其对卵巢癌具有更优异的抗肿瘤活性。
CN107303301A公开了一种以纳米金刚石为载体负载顺铂的靶向给药体系，该靶向给药体系包括纳米金刚石、表皮生长因子EGF和药物顺铂，其以纳米金刚石为载体，纳米金刚石与表皮生长因子EGF通过共价方式结合形成EGF-纳米金刚石复合物，EGF-纳米金刚石复合物通过非共价方式负载药物顺铂，该靶向给药体系的合成方法简单方便，可以用于靶向杀伤肿瘤细胞。
CN107684626A公开了一种纳米级别的介孔二氧化硅-6巯基嘌呤/顺铂的纳米递送体系及其制备方法，即在介孔二氧化硅上修饰巯基，通过二硫键连接6巯基嘌呤形成连接6巯基嘌呤的介孔二氧化硅纳米粒，在孔道内载入顺铂，形成连接6巯基嘌呤、装载顺铂的介孔二氧化硅纳米粒，与常规6巯基嘌呤和顺铂的联合应用相比，该纳米递送体系显著延长了肿瘤模型小鼠的生存时间，提高了疗效并降低了全身毒性反应。
尽管这些纳米粒子显示出一定的抗肿瘤作用，但对顺铂耐药性肿瘤的治疗效果并不令人满意。因此，开发出一种生物相容性好、靶向性强的抗肿瘤纳米递送体系，尤其是一种抗顺铂耐药性肿瘤的纳米递送体系是非常重要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多肽-顺铂前药复合物、其自组装纳米递送体系及其制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种多肽-顺铂前药复合物，所述多肽-顺铂前药复合物包括顺铂分子、阳离子多肽和疏水性分子，顺铂分子和疏水性分子连接在阳离子多肽上。
在本发明中，所述顺铂分子与所述阳离子多肽通过酰胺键连接，所述疏水分子与所述阳离子多肽通过酰胺键连接。
优选地，所述顺铂分子与所述阳离子多肽的羧基端氨基酸的支链氨基通过酰胺键连接。
优选地，所述疏水分子与所述阳离子多肽的氨基端通过酰胺键连接。
优选地，所述顺铂分子为四价顺铂-丁二酸衍生物，是由二价顺铂分子经过双氧水处理后与丁二酸酐反应生成的。
因为二价顺铂分子对机体有一定的毒副作用，此处将活性的二价顺铂分子设计成四价顺铂前药复合物，使得该复合物仅在肿瘤微环境中释放活性顺铂分子，从而避免了其与血液蛋白及其他生物分子相互作用从而显示出较低的毒性。
优选地，所述疏水分子为疏水性长链分子和/或含苯环类分子，优选疏水性长链分子为棕榈酸或饱和脂肪酸，优选含苯环类分子为双芘类化合物、四苯乙烯类化合物或卟啉类化合物中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选双芘类化合物。
优选地，所述阳离子多肽为由9-20个氨基酸残基组成的多肽，优选由13个氨基酸残基组成的多肽，所述阳离子多肽的氨基酸残疾数量可以为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
优选地，所述阳离子多肽从氨基端到羧基端的序列为Gly-Arg-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg-Gly-Thr-Lys。
第二方面，本发明还提供一种如上所述多肽-顺铂前药复合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)采用wang树脂作为载体树脂，末端氨基由Fmoc保护的氨基酸为原料，通过固相合成法，合成带保护基的阳离子多肽；所述wang树脂上修饰有赖氨酸，其侧链氨基由Dde保护，末端氨基由Fmoc保护；
(2)将疏水性分子和顺铂分子分别与步骤(1)得到的阳离子多肽进行连接，从载体树脂上脱除，并脱除其他氨基酸的侧链保护基团，得到所述多肽-顺铂前药复合物；
优选地，所述步骤(1)的具体步骤为：采用末端氨基均由Fmoc保护、侧链氨基由Boc或TBU保护的氨基酸为原料，根据所要合成的阳离子多肽的氨基酸顺序，将氨基酸与载体树脂连接，脱去树脂氨基酸上的Fmoc保护基，以此结合在载体树脂上的氨基酸作为氨基组分，同含活化羧基的下一个氨基酸反应，重复上述操作，直到完成所有氨基酸的缩合，得到所述阳离子多肽；
优选地，所述载体树脂修饰有赖氨酸的修饰密度为0.3-0.5mM，例如0.3mM、0.31mM、0.33mM、0.35mM、0.36mM、0.38mM、0.4mM、0.43mM、0.45mM、0.48mM、0.5mM等，优选0.33mM；
优选地，所述Fmoc脱保护在含20％六氢吡啶的DMF溶液中进行；
优选地，所述脱保护的时间为10-15min，例如10min、11min、12min、13min、14min或15min等。
优选地，所述含活化羧基的下一个氨基酸是指将氨基酸在含0.4M的4-甲基吗啉和0.4M的苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的DMF溶液中进行羧基活化后得到的氨基酸。
优选地，偶联时间为1-3h，例如1h、1.5h、2h、2.5h或3h等，进一步优选为1h。
在本发明中，步骤(2)所述将疏水性分子和顺铂分子分别与步骤(1)得到的阳离子多肽进行连接的方法为：
将疏水性分子的羧基活化，使其与步骤(1)得到的带保护基的阳离子多肽的氨基端偶联；而后将所述阳离子多肽羧基端氨基酸的支链氨基活化，使顺铂分子羧基端与其偶联。
优选地，所述将疏水分子的羧基活化在含0.4M的4-甲基吗啉和0.4M的苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的DMF溶液中进行羧基活化后得到的分子。
优选地，所述将疏水分子与多肽的偶联时间为5-10h，例如5h、6h、7h、8h、9h或10h等，优选10h。
优选地，所述支链氨基活化在含2％水合肼的DMF溶液中进行。
优选地，所述顺铂分子与多肽的偶联时间为1-10h，例如1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h或10h等，优选5h。
优选地，步骤(2)所述从载体树脂上脱除利用的试剂为含2.5％水和2.5％三异丙基硅烷的三氟乙酸溶液。
第三方面，本发明提供一种顺铂前药自组装纳米递送体系，所述顺铂前药自组装纳米递送体系包括如上所述的多肽-顺铂前药复合物以及载体。
优选地，所述载体为含有靶向基团的载体和/或不含有靶向基团的载体。
优选地，所述靶向基团包括靶向肽基团，优选cRGD基团。
优选地，所述载体为靶向肽-DSPE-PEG和DSPE-PEG的组合。
优选地，所述多肽-顺铂前药复合物、靶向肽-DSPE-PEG和DSPE-PEG的摩尔比为(0.5-1.5):(0.2-0.8):(0.2-0.8)，例如0.5:0.2:0.2、1:0.5:0.5、1.5:0.8:0.8、1:0.8:0.2、0.5:0.2:0.8、1:0.2:0.8、0.5:0.8:0.2、1.5:0.6:0.8或1:0.8:0.6等，优选1:0.5:0.5。
第四方面，本发明还提供一种如上所述的顺铂前药自组装纳米递送体系的制备方法，包括以下步骤：
将多肽-顺铂前药复合物和所述载体在有机溶剂中得到混合溶液，而后将其加入水中进行自组装，得到所述顺铂前药自组装纳米递送体系。
优选地，所述有机溶剂为DMSO。
优选地，所述有机溶剂与水的质量比为1:(10-50)，例如1:10、1:20、1:30、1:40或1:50等，优选1:20。
第五方面，本发明提供一种基因药物自组装纳米递送体系，所述基因药物自组装纳米递送体系包括如上所述的顺铂前药自组装纳米递送体系和siRNA分子。
优选地，所述siRNA分子为Beclin1siRNA。
优选地，所述siRNA与顺铂前药自组装纳米递送体系的质量比为20-70％，例如20％、30％、40％、50％、60％或70％等，优选60％。
本发明构建的基因药物自组装纳米递送体系在肿瘤微环境还原型谷胱甘肽的作用下，偶联在纳米颗粒上的四价顺铂分子共价键发生断裂从而释放出活性顺铂分子，并将携载的siRNA分子释放到胞质中，消耗体内还原型谷胱甘肽，实现了自噬调节剂和化疗药物对肿瘤的联合治疗，尤其实现了对顺铂耐药性肿瘤的联合治疗，具有广阔的应用前景。
第六方面，本发明还提供一种如上所述的基因药物自组装纳米递送体系的制备方法，所述制备方法为：
将所述多肽-顺铂前药复合物和所述载体在有机溶剂中溶解得到有机混合液，然后将siRNA分子加入到有机混合液中，最后将其加入水中进行自组装，得到所述基因药物自组装纳米递送体系。
优选地，所述有机溶剂为DMSO。
优选地，所述有机混合液与水的质量比为1:(10-50)，例如1:10、1:20、1:30、1:40或1:50等，优选1:20。
作为本发明的优选技术方案，所述基因药物自组装纳米递送体系的制备方法包括以下步骤：
(1)采用末端氨基均由Fmoc保护、侧链氨基均由Boc或TBU保护的氨基酸为原料，根据所要合成的阳离子多肽的氨基酸顺序，将氨基酸与修饰有修饰密度为0.3-0.5mM的侧链氨基被Dde保护的赖氨酸的Wang树脂连接在含20％六氢吡啶的DMF溶液中脱去树脂氨基酸上的Fmoc保护基，脱保护时间为10-15min，以此结合在树脂上的氨基酸作为氨基组分，同含活化羧基的下一个氨基酸反应，所述活化羧基是在含0.4M的4-甲基吗啉和0.4M的苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的DMF溶液中对羧基进行活化后得到的，重复上述操作，直到完成所有氨基酸的缩合，得到所述阳离子多肽；
(2)将疏水性分子的羧基在0.4M的4-甲基吗啉和0.4M的苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的DMF溶液，使其与步骤(1)得到的带保护基的阳离子多肽的氨基端偶联；而后将所述阳离子多肽羧基端氨基酸的支链氨基在含2％水合肼的DMF溶液中活化15min，使顺铂分子羧基端与其偶联；从载体树脂上脱除，此脱除过程利用的试剂为含2.5％水和2.5％三异丙基硅烷的三氟乙酸溶液，并脱除其他氨基酸的侧链保护基团，得到所述多肽-顺铂前药复合物；
(3)将多肽-顺铂前药复合物、载体和siRNA溶解在有机溶剂中得到混合溶液，而后加入水中，进行自组装，得到所述基因药物自组装纳米递送体系。
第七方面，本发明提供一种如上所述的顺铂前药自组装纳米递送体系在制备抗肿瘤药物中的应用。
第八方面，本发明还提供一种如上所述的基因药物自组装纳米递送体系在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选地，所述抗肿瘤药物为抗顺铂耐药性的抗肿瘤药物。
附图说明
图1是实施例1制得的多肽-顺铂前药复合物的核磁氢谱图；
图2是实施例1制得的多肽-顺铂前药复合物的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱光谱图；
图3是实施例2制得的cRGD-DSPE-PEG的核磁氢谱图；
图4是实施例4制得的基因药物自组装纳米递送体系的TEM图；
图5是实施例4制得的基因药物自组装纳米递送体系的RNA凝胶图；
图6是实施例4制得的基因药物自组装纳米递送体系在谷胱甘肽作用下的铂分子释放曲线图；
图7A是实施例4制得的基因药物自组装纳米递送体系抑制A549正常肿瘤细胞自噬功能的蛋白免疫印迹图；
图7B是实施例4制得的基因药物自组装纳米递送体系抑制耐顺铂的A549肿瘤细胞自噬功能的蛋白免疫印迹图；
图8A是实施例4制得的基因药物自组装纳米递送体系消耗A549正常肿瘤细胞内GSH的统计图；
图8B是实施例4制得的基因药物自组装纳米递送体系消耗耐顺铂的A549肿瘤细胞内GSH的统计图；
图9A是实施例4制得的基因药物自组装纳米递送体系抑制A549正常肿瘤细胞增殖作用的统计图；
图9B是实施例4制得的基因药物自组装纳米递送体系抑制耐顺铂的A549肿瘤细胞增殖作用的统计图；
图10A是实施例4制得的基因药物自组装纳米递送体系在活体水平上抑制正常肿瘤生长情况的统计图；
图10B是实施例4制得的基因药物自组装纳米递送体系在活体水平上抑制耐顺铂肿瘤生长情况的统计图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
多肽-顺铂前药复合物的制备
本实施例提供了一种多肽-顺铂前药复合物，所述多肽-顺铂前药复合物包括顺铂分子、阳离子多肽和疏水性分子，顺铂分子和疏水性分子连接在阳离子多肽上。其制备方法包括如下步骤：
采用末端氨基均由Fmoc保护、侧链氨基均由Boc或TBU保护的氨基酸为原料，根据Gly-Arg-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg-Gly-Thr-Lys的氨基酸顺序，将氨基酸与修饰密度为0.33mM的Wang树脂连接，在含20％六氢吡啶的DMF溶液中脱去赖氨酸上的Fmoc保护基，脱保护时间15min；以此结合在载体树脂上的赖氨酸作为氨基组分，同含活化羧基的下一个氨基酸反应，所述活化羧基是在含0.4M的4-甲基吗啉和0.4M的苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的DMF溶液中对羧基进行活化得到的，直到完成所有氨基酸的缩合，得到阳离子多肽；将双芘分子的羧基在0.4M的4-甲基吗啉和0.4M的苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的DMF溶液中活化，使其与上述得到的带保护基的阳离子多肽的氨基端连接；而后将所述阳离子多肽赖氨酸的支链氨基在含2％水合肼的DMF溶液中脱除Dde 15min，使顺铂分子羧基端与其连接；从载体树脂上脱除，此脱除过程利用的试剂为含2.5％水和2.5％三异丙基硅烷的三氟乙酸溶液，并脱除其他氨基酸的侧链保护基团，得到所述多肽-顺铂前药复合物，其化学结构如下：
Figure BDA0001830584150000101
采用核磁共振技术对制备得到的多肽-顺铂前药复合物进行表征(所用仪器型号为Bruker ARX 400MHz)，得到的核磁共振氢谱图如图1(Bis(pyrene)代表双芘基团)所示，由图中结果可知，所述多肽-顺铂前药复合物成功合成。
采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱光谱技术对制备得到的多肽-顺铂前药复合物进行表征(所用仪器型号为Bruker Daltonics)，得到的谱图如图2所示，由图中结果可知，所述多肽-顺铂前药复合物的荷质比为2782.7，与理论值相符(理论值：2782.3)。
实施例2
cRGD-DSPE-PEG分子的制备及表征实验：
其制备方法包括如下步骤：
采用末端氨基均由Fmoc保护、侧链氨基均由Boc或TBU保护的氨基酸为原料，根据Arg-Gly-Asp-Phe(D型)-Lys的氨基酸顺序，将氨基酸与修饰密度为0.33mM的赖氨酸Wang树脂连接，在含20％六氢吡啶的DMF溶液中脱去赖氨酸上的Fmoc保护基，脱保护时间15min；以此结合在载体树脂上的赖氨酸作为氨基组分，同含活化羧基的下一个氨基酸反应，所述活化羧基是在含0.4M的4-甲基吗啉和0.4M的苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的DMF溶液中对羧基进行活化得到的，直到完成所有氨基酸的缩合，得到靶向多肽cRGD；而后将所述靶向多肽赖氨酸的支链氨基在含2％水合肼的DMF溶液中脱除Dde 15min，将DSPE-PEG(分子量为2000)分子的羧基在0.4M的4-甲基吗啉和0.4M的苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的DMF溶液中活化，使其与上述得到的靶向多肽的氨基端连接；最后从载体树脂上脱除，此脱除过程利用的试剂为含2.5％水和2.5％三异丙基硅烷的三氟乙酸溶液，并脱除其他氨基酸的侧链保护基团，得到所述cRGD-DSPE-PEG复合物，其化学结构如下：
Figure BDA0001830584150000111
采用核磁共振技术对制备得到的cRGD-DSPE-PEG分子进行表征(所用仪器型号为Bruker ARX 400MHz)，得到的核磁共振氢谱图如图3所示，由图中结果可知，cRGD-DSPE-PEG分子成功合成。
实施例3
顺铂前药自组装纳米递送体系的制备
本实施例提供了一种顺铂前药自组装纳米递送体系，所述顺铂前药自组装纳米递送体系包括实施例1制得的多肽-顺铂前药复合物、cRGD-DSPE-PEG分子和DSPE-PEG分子。其制备方法包括如下步骤：
将多肽-顺铂前药复合物、靶向肽-DSPE-PEG分子和DSPE-PEG分子按1:0.5:0.5的摩尔比溶解在有机溶剂中得到混合溶液，而后向混合溶液中加入水，进行自组装，得到所述顺铂前药自组装纳米递送体系。
实施例4
基因药物自组装纳米递送体系的制备
本实施例提供了一种基因药物自组装纳米递送体系，所述基因药物自组装纳米递送体系包括实施例1制得的多肽-顺铂前药复合物、cRGD-DSPE-PEG分子、DSPE-PEG分子和Beclin1siRNA分子。其中，含磷酸基团的Beclin1siRNA分子带负电，其通过静电吸附作用与带正电的阳离子多肽序列结合并被包裹在纳米递送体系内部。其制备方法包括如下步骤：
将多肽-顺铂前药复合物、靶向肽-DSPE-PEG分子、DSPE-PEG分子按1:0.5:0.5的摩尔比溶解在有机溶剂中得到混合溶液，再向混合溶液中加入siRNA，而后将混合溶液加入水中(1:20,v/v)，进行自组装，得到所述基因药物自组装纳米递送体系。
利用透射电子显微镜(型号为Tecnai G2 20S-TWIN)测定本实施例制得的基因药物自组装纳米递送体系的粒径，结果如图4所示，该基因药物自组装纳米递送体系为粒径40nm左右的纳米颗粒状结构。
采用RNA琼脂糖凝胶电泳方法测定本实施例制得的基因药物自组装纳米递送体系中Beclin1siRNA的负载率，结果如图5所示，该基因药物自组装纳米递送体系具有较高的负载率，在RNA/聚合物质量比达70时仍然有效将RNA包裹在纳米颗粒空腔内。
实施例5
在本实施例中，测定了实施例3制得的基因药物自组装纳米递送体系在谷胱甘肽作用下的顺铂释放情况。
结果如图6所示，该纳米递送体系在谷胱甘肽作用下1h内可以释放出大量的顺铂分子。
实施例6
细胞自噬抑制实验：
本实施例选取A549正常肿瘤细胞和耐顺铂的A549肿瘤细胞作为模型细胞，将1×106个细胞接种在含10％FBS的DMEM培养基中，并在37℃以及5％CO2的条件下，孵育15h。然后向其中分别加入PBS溶液，四价顺铂-丁二酸，实施例3制得的顺铂前药自组装纳米递送体系溶液和实施例4制得的基因药物自组装纳米递送体系溶液(在后述内容中分别简写为Pt(IV)，PPN和siBec1@PPN)，再孵育48h。然后收集培养基，并用100μL裂解缓冲液重悬(50mMTris-HCl(pH 8.0)，150mM NaCl，1％(v/v)Triton-X 100和蛋白酶抑制剂)。将60μg的每个样品进行SDS-PAGE，然后转移至硝酸纤维素膜印迹。使用封闭缓冲液(5％(wt/v)脱脂乳，0.1％(v/v)Tween 20在0.01M TBS中)来阻断硝酸纤维素膜印迹，然后在4℃下与一抗孵育，过夜，用HRP的二抗在室温下孵育2h。最后，通过Typhoon Trio Variable Mode Imager仪器检测硝酸纤维素膜印迹，用NIH ImageJ软件分析蛋白质的条带密度，其结果如所图7A和7B所示，说明siBec1@PPN相比于Pt(IV)和PPN能够更佳有效地抑制细胞自噬活性。
实施例7
细胞水平GSH检测实验：
本实施例选取A549正常肿瘤细胞和耐顺铂的A549肿瘤细胞作为模型细胞，将1×106个细胞接种在含10％FBS的DMEM培养基中，并在37℃以及5％CO2的条件下，孵育15h。然后向培养基中分别加入PBS溶液，Pt(IV)，PPN和siBec1@PPN，再孵育48h。然后收集培养基，并用还原型谷胱甘肽检测试剂盒对每个样品进行处理后检测细胞内的谷胱甘肽含量，其结果如图8A和8B所示，说明siBec1@PPN相比于Pt(IV)和PPN能更多地降低细胞内还原型谷胱甘肽。
实施例8
细胞水平细胞增殖实验：
本实施例选取A549正常肿瘤细胞和耐顺铂的A549肿瘤细胞作为模型细胞，将1×106个细胞接种在含10％FBS的DMEM培养基中，并在37℃以及5％CO2的条件下，孵育16h。此后，向培养基中分别加入不同浓度的PBS溶液，Pt(IV)，PPN和siBec1@PPN，再孵育48h。然后收集培养基，并利用CCK-8试剂盒来评估它们的细胞毒性。在545nm波长下测量所有样品的紫外吸光度值。细胞活力的计算公式如下所示：
细胞活力(％)＝(Asample-Ablank)/(Acontrol-Ablank)×100％
其中，Asample、Acontrol、Ablank分别表示样品处理组、PBS组和空白对照组测得的吸光度值。
其结果如图9A和9B所示，说明siBec1@PPN相比于Pt(IV)和PPN能够更大程度地诱导正常A549的死亡，并且更大程度地诱导顺铂耐药性A549的死亡。
实施例9
活体水平抗肿瘤实验：
本实施例选取6-7周的BALB/c裸鼠，在后腿部肌肉注射1×107个A549正常肿瘤细胞和顺铂抗性A549细胞分别建立两种小鼠后腿部肿瘤模型。通过尾静脉分别注入PBS溶液，PPN和siBec1@PPN，保证每kg小鼠静脉内注射3mg铂，每两天注射一次并测量肿瘤体积大小。
肿瘤体积的计算公式为：
V＝a2×b×(1/2)
其中，a和b分别为肿瘤的最短和最长直径。
其结果如图10A和10B所示，说明siBec1@PPN相比于PPN能够更大程度地抑制正常A549肿瘤的生长，并且能够更大程度地抑制顺铂耐药性A549肿瘤的生长。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的多肽-顺铂前药复合物、其自组装纳米递送体系及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (42)

1.一种多肽-顺铂前药复合物，其特征在于，所述多肽-顺铂前药复合物包括顺铂分子、阳离子多肽和疏水性分子，顺铂分子和疏水性分子连接在阳离子多肽上；
所述顺铂分子与所述阳离子多肽通过酰胺键连接，所述疏水性分子与所述阳离子多肽通过酰胺键连接；
所述疏水性分子为棕榈酸、饱和脂肪酸、双芘类化合物、四苯乙烯类化合物或卟啉类化合物中的任意一种或至少两种的组合；
所述阳离子多肽从氨基端到羧基端的序列为Gly-Arg-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg-Gly-Thr-Lys。
2.如权利要求1所述的多肽-顺铂前药复合物，其特征在于，所述顺铂分子与所述阳离子多肽的羧基端氨基酸的支链氨基通过酰胺键连接。
3.如权利要求1所述的多肽-顺铂前药复合物，其特征在于，所述疏水性分子与所述阳离子多肽的氨基端通过酰胺键连接。
4.如权利要求1所述的多肽-顺铂前药复合物，其特征在于，所述顺铂分子为四价顺铂-丁二酸衍生物。
5.如权利要求1-4中任一项所述的多肽-顺铂前药复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用wang树脂作为载体树脂，末端氨基由Fmoc保护的氨基酸为原料，通过固相合成法，合成带保护基的阳离子多肽；所述wang树脂上修饰有赖氨酸，其侧链氨基由Dde保护、末端氨基由Fmoc保护；
(2)将疏水性分子和顺铂分子分别与步骤(1)得到的阳离子多肽进行连接，从载体树脂上脱除，并脱除其他氨基酸的侧链保护基团，得到所述多肽-顺铂前药复合物。
6.如权利要求5所述的多肽-顺铂前药复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体步骤为：采用末端氨基均由Fmoc保护、侧链氨基由Boc或TBU保护的氨基酸为原料，根据所要合成的阳离子多肽的氨基酸顺序，将氨基酸与载体树脂连接，脱去树脂氨基酸上的Fmoc保护基，以此结合在载体树脂上的氨基酸作为氨基组分，同含活化羧基的下一个氨基酸反应，重复上述操作，直到完成所有氨基酸的缩合，得到所述阳离子多肽。
7.如权利要求6所述的多肽-顺铂前药复合物的制备方法，其特征在于，所述载体树脂修饰有赖氨酸的修饰密度为0.3-0.5mM。
8.如权利要求6所述的多肽-顺铂前药复合物的制备方法，其特征在于，所述载体树脂修饰有赖氨酸的修饰密度为0.33mM。
9.如权利要求6所述的多肽-顺铂前药复合物的制备方法，其特征在于，所述Fmoc脱保护在含20％六氢吡啶的DMF溶液中进行。
10.如权利要求9所述的多肽-顺铂前药复合物的制备方法，其特征在于，所述脱保护的时间为10-15min。
11.如权利要求6所述的多肽-顺铂前药复合物的制备方法，其特征在于，所述含活化羧基的下一个氨基酸是指将氨基酸在含0.4M的4-甲基吗啉和0.4M的苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的DMF溶液中进行羧基活化后得到的氨基酸。
12.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述将疏水性分子和顺铂分子分别与步骤(1)得到的阳离子多肽进行连接的方法为：
将疏水性分子的羧基活化，使其与步骤(1)得到的带保护基的阳离子多肽的氨基端偶联；而后将所述阳离子多肽羧基端氨基酸的支链氨基活化，使顺铂分子羧基端与其偶联。
13.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述将疏水性分子的羧基活化在含0.4M的4-甲基吗啉和0.4M的苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的DMF溶液中进行羧基活化后得到的分子。
14.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述将疏水性分子与多肽的偶联时间为5-10h。
15.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述将疏水性分子与多肽的偶联时间为10h。
16.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述支链氨基活化在含2％水合肼的DMF溶液中进行。
17.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述顺铂分子与多肽的偶联时间为1-10h。
18.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述顺铂分子与多肽的偶联时间为5h。
19.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述从载体树脂上脱除利用的试剂为含2.5％水和2.5％三异丙基硅烷的三氟乙酸溶液。
20.一种顺铂前药自组装纳米递送体系，其特征在于，所述顺铂前药自组装纳米递送体系包括如权利要求1所述的多肽-顺铂前药复合物以及载体。
21.如权利要求20所述的顺铂前药自组装纳米递送体系，其特征在于，所述载体为含有靶向基团的载体和/或不含有靶向基团的载体。
22.如权利要求21所述的顺铂前药自组装纳米递送体系，其特征在于，所述靶向基团包括靶向肽基团。
23.如权利要求21所述的顺铂前药自组装纳米递送体系，其特征在于，所述靶向基团为cRGD基团。
24.如权利要求20所述的顺铂前药自组装纳米递送体系，其特征在于，所述载体为靶向肽-DSPE-PEG和DSPE-PEG的组合。
25.如权利要求24所述的顺铂前药自组装纳米递送体系，其特征在于，所述多肽-顺铂前药复合物、靶向肽-DSPE-PEG和DSPE-PEG的摩尔比为(0.5-1.5):(0.2-0.8):(0.2-0.8)。
26.如权利要求24所述的顺铂前药自组装纳米递送体系，其特征在于，所述多肽-顺铂前药复合物、靶向肽-DSPE-PEG和DSPE-PEG的摩尔比为1:0.5:0.5。
27.如权利要求20所述的顺铂前药自组装纳米递送体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将多肽-顺铂前药复合物和所述载体在有机溶剂中得到混合溶液，而后将其加入水中进行自组装，得到所述顺铂前药自组装纳米递送体系。
28.如权利要求27所述的顺铂前药自组装纳米递送体系的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为DMSO。
29.如权利要求27所述的顺铂前药自组装纳米递送体系的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂与水的质量比为1:(10-50)。
30.如权利要求27所述的顺铂前药自组装纳米递送体系的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂与水的质量比为1:20。
31.一种基因药物自组装纳米递送体系，其特征在于，所述基因药物自组装纳米递送体系包括如权利要求20所述的顺铂前药自组装纳米递送体系和siRNA分子。
32.如权利要求31所述的基因药物自组装纳米递送体系，其特征在于，所述siRNA分子为Beclin1 siRNA。
33.如权利要求31所述的基因药物自组装纳米递送体系，其特征在于，所述siRNA与顺铂前药自组装纳米递送体系的质量比为20-70％。
34.如权利要求31所述的基因药物自组装纳米递送体系，其特征在于，所述siRNA与顺铂前药自组装纳米递送体系的质量比为60％。
35.如权利要求31所述的基因药物自组装纳米递送体系的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：
将所述多肽-顺铂前药复合物和所述载体在有机溶剂中溶解得到有机混合液，然后将siRNA分子加入到有机混合液中，最后将其加入水中进行自组装，得到所述基因药物自组装纳米递送体系。
36.如权利要求35所述的基因药物自组装纳米递送体系的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为DMSO。
37.如权利要求35所述的基因药物自组装纳米递送体系的制备方法，其特征在于，所述有机混合液与水的质量比为1:(10-50)。
38.如权利要求35所述的基因药物自组装纳米递送体系的制备方法，其特征在于，所述有机混合液与水的质量比为1:20。
39.如权利要求35所述的基因药物自组装纳米递送体系的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)采用末端氨基均由Fmoc保护、侧链氨基均由Boc或TBU保护的氨基酸为原料，根据所要合成的阳离子多肽的氨基酸顺序，将氨基酸与修饰有修饰密度为0.3-0.5mM的侧链氨基被Dde保护的赖氨酸的Wang树脂连接，在含20％六氢吡啶的DMF溶液中脱去树脂氨基酸上的Fmoc保护基，脱保护时间为10-15min，以此结合在树脂上的氨基酸作为氨基组分，同含活化羧基的下一个氨基酸反应，所述活化羧基是在含0.4M的4-甲基吗啉和0.4M的苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的DMF溶液中对羧基进行活化后得到的，重复上述操作，直到完成所有氨基酸的缩合，得到所述阳离子多肽；
(2)将疏水性分子的羧基在0.4M的4-甲基吗啉和0.4M的苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的DMF溶液，使其与步骤(1)得到的带保护基的阳离子多肽的氨基端偶联；而后将所述阳离子多肽羧基端氨基酸的支链氨基在含2％水合肼的DMF溶液中活化15min，使顺铂分子羧基端与其偶联；从载体树脂上脱除，此脱除过程利用的试剂为含2.5％水和2.5％三异丙基硅烷的三氟乙酸溶液，并脱除其他氨基酸的侧链保护基团，得到所述多肽-顺铂前药复合物；
(3)将多肽-顺铂前药复合物、载体和siRNA溶解在有机溶剂中得到混合溶液，而后加入水中，进行自组装，得到所述基因药物自组装纳米递送体系。
40.如权利要求20所述的顺铂前药自组装纳米递送体系在制备抗肿瘤药物中的应用。
41.如权利要求31所述的基因药物自组装纳米递送体系在制备抗肿瘤药物中的应用。
42.如权利要求41所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为抗顺铂耐药性的抗肿瘤药物。
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