CN108478802B - 一种用于癌症治疗的高稳定性的联合给药体系及构建方法 - Google Patents

一种用于癌症治疗的高稳定性的联合给药体系及构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及纳米医药技术领域，具体涉及一种用于癌症治疗的高稳定性的联合给药体系及构建方法，联合给药体系以氧化石墨烯为载体，在氧化石墨烯的表面或边缘通过双硫键连接细胞凋亡肽，通过π‑π共轭作用以及静电作用连接阿霉素、盐酸阿霉素、喜树碱或伊达比星等抗癌药物，在外侧包覆牛血清蛋白。构建过程中，先将氧化石墨烯的表面进行巯基修饰、双硫化修饰，然后在双硫键上接炔基，通过炔基与叠氮基团的点击化学反应通过双硫键连接细胞凋亡肽，然后负载抗癌药物，并在外侧包覆牛血清蛋白。细胞凋亡肽与抗癌药物共同作用，对癌细胞靶向作用强，对正常细胞副作用低，而且稳定性、分散性和生物相容性好，可在水中保持稳定分散8天以上。

Description

一种用于癌症治疗的高稳定性的联合给药体系及构建方法
技术领域
本发明涉及纳米医药技术领域，具体涉及一种用于癌症治疗的高稳定性的联合给药体系及构建方法。
背景技术
恶性肿瘤被认为是威胁人类健康的三大杀手之一，人类因恶性肿瘤而引起的死亡率居所有疾病死亡率的第二位，仅次于心脑血管疾病。化疗是临床上治疗肿瘤的主要手段，但因化疗药物随血液分布于全身，造成其缺乏选择性，对肿瘤细胞和正常的体细胞都具有杀伤效应，同时治疗过程给予病人的药物剂量通常较大，对正常组织和细胞造成严重损伤。因此在药物输送过程中如何降低药物对身体的副作用，又同时增加药物的药效是癌症治疗领域的一个关键点。另外，在当前抗肿瘤研究的领域里，单一的治疗手段往往已经无法达到与满足治疗需求。而且传统的放、化疗的治疗手段也对正常组织产生很大的毒性与伤害。因此，运用多种新颖的治疗手段(如光热疗法，光动力学疗法等)，结合靶向性与敏感释放性能的药物载体，改变药物的给药方式，延缓机体耐药性的产生，并降低抗癌药物对正常组织的毒性，提高药物的稳定性和生物利用度的协同治疗方式，已经成为当前研究的一大热点。据报道同时装载两种或以上抗癌药物的载体系统相比于单独药物成分，多药载药系统的治疗效率可以得到显著提高。但是目前已开发的靶向给药系统仍存在稳定性差、生物相容性和生物可降解性不理想等问题，同时装载的抗癌药物之间如何有效的发挥协同作用，并充分在体内释放并发挥药效，以及降低副作用还有待进一步的研究。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种用于癌症治疗的高稳定性的联合给药体系，具有良好的稳定性、生物相容性，对癌细胞的靶向作用强，对正常体细胞的副作用低，而且同时负载的药物可以有序在体内充分释放发挥药效，起到协同治疗癌症的作用，提高肿瘤治疗效果。
本发明的另一目的在于提供该癌症治疗的高稳定性的联合给药体系的构建方法。
本发明提供如下的技术方案：
一种用于癌症治疗的高稳定性的联合给药体系，联合给药体系以氧化石墨烯为载体，在氧化石墨烯上负载抗癌药物与细胞凋亡肽，在氧化石墨烯外包覆牛血清蛋白。
作为本发明的一种改进，细胞凋亡肽通过双硫键连接到氧化石墨烯的表面或边缘。
作为本发明的一种改进，抗癌药物为阿霉素、盐酸阿霉素、喜树碱或伊达比星。
本发明的联合给药体系以氧化石墨烯GO为载体，在GO上负载细胞凋亡肽和抗癌药物。氧化石墨烯具有较高的比表面积，可以实现药物的高效负载，而且还可以通过共价键作用连接药物分子提高载药量。细胞凋亡肽KLA是一种两亲α螺旋促凋亡肽，其氨基酸序列为(KLAKLAK)2，它可以破坏线粒体膜和诱导依赖线粒体的细胞凋亡，而在细胞外保持相对无毒。细胞凋亡肽经双硫键连接到氧化石墨烯的表面或者边缘，双硫键具有还原敏感性，在谷胱甘肽的作用下可以分解断裂。而癌细胞体内含较多的谷胱甘肽，因此当到达癌细胞时，在谷胱甘肽的作用下双硫键断裂使细胞凋亡肽脱落，并释放到癌细胞内破坏线粒体膜和并诱导癌细胞的凋亡，起到对癌细胞的靶向作用，而在未达到癌细胞时具有良好的化学稳定性，因此对体内正常细胞的副作用小。而所选用的抗癌药物如阿霉素、盐酸阿霉素、喜树碱或伊达比星等，具有苯环结构，通过π-π共轭作用以及静电作用连接到氧化石墨烯的表面，可以实现在肿瘤细胞内的还原环境及内涵体低pH值环境下分别释放KLA及抗癌药物的效果，同时将氧化石墨烯外侧包覆牛血清蛋白，提高了载体的生物相容性和分散性，从而使本发明的联合给药体系可以在癌细胞内部充分发挥药效，细胞凋亡肽和抗癌药物共传递协同抗癌，抗癌效果好，副作用低，并具有良好的生物稳定性，可在水中保持稳定分散8天以上。
上述联合给药体系的构建方法，包括以下步骤：
(1)制备表面双硫化的氧化石墨烯：将氧化石墨烯GO加入去离子水中得GO分散液，调节pH值为9～10，向GO分散液中加入3-巯基丙基三甲氧基硅烷室温反应得到巯基修饰的氧化石墨烯GO-SH，离心干燥后将GO-SH分散到甲醇中得GO-SH分散液，加入S-(2-氨基乙硫基)-2-硫代吡啶盐酸盐室温搅拌反应，离心干燥得表面连有双硫键的氧化石墨烯GO-SS-NH2；
(2)制备氧化石墨烯中间体：将GO-SS-NH2分散在甲醇中得到GO-SS-NH2分散液，滴加溴代丙炔与三乙胺室温搅拌反应，使炔基替代氨基连接到双硫键上，得炔基修饰双硫键的氧化石墨烯GO-SS-alkyne；
(3)负载细胞凋亡肽：将GO-SS-alkyne分散到甲醇中，依次加入端部有叠氮基团的细胞凋亡肽N3-KLA、CuSO4·5H2O和抗坏血酸钠，氮气氛围下反应，使细胞凋亡肽通过双硫键连接到氧化石墨烯的表面或边缘，得到负载细胞凋亡肽的氧化石墨烯GO-SS-KLA；
(4)负载抗癌药物：将GO-SS-KLA与抗癌药物按质量比1:0.25～0.5室温分散到去离子水中混合，搅拌后透析得到负载抗癌药物与胞凋亡肽的载体复合物分散液；
(5)包覆牛血清蛋白：将载体复合物分散液分散到去离子水中，滴加牛血清蛋白溶液BSA，室温搅拌过夜，得到联合给药体系。
作为本发明方法的一种改进，步骤(1)中GO经由以下过程制备：将去离子水与98％浓硫酸按体积比1:3.8～4.5混合后置于冰水浴中，然后加入纳米石墨，并缓慢加入KMnO4，去离子水、纳米石墨与KMnO4的质量比为12:1:3～3.6，然后升温至40℃并搅拌2～3h，再置于冰水浴中搅拌滴加30％H2O2，去离子水与30％H2O2体积比为12:5～6，静置过夜后抽滤，用5％的盐酸多次洗涤后透析、冻干得到氧化石墨烯。
作为本发明方法的一种改进，步骤(1)中GO、去离子水和3-巯基丙基三甲氧基硅烷的质量比为1:300～400:4～5；GO-SH、甲醇和S-(2-氨基乙硫基)-2-硫代吡啶盐酸盐的质量比为1:150～200:1。
作为本发明方法的一种改进，步骤(2)中GO-SS-NH2、甲醇、溴代丙炔和三乙胺的质量比为1:150～250:10～20:0.4～1.4。
作为本发明方法的一种改进，步骤(3)中GO-SS-alkyne、甲醇、N3-KLA、CuSO4·5H2O和抗坏血酸钠的质量比为1:200～300:1:0.5～1:0.8～1.5。
作为本发明方法的一种改进，载体复合物分散液、去离子水和牛血清蛋白BSA的质量比为1:10000:1～1.2。
作为本发明方法的一种改进，还包括在GO-SS-KLA上引入异硫氰酸荧光素：避光条件下，将步骤(3)中制备的GO-SS-KLA分散到pH值为7.4的PBS缓冲溶液中，然后将异硫氰酸荧光素FITC的水溶液室温滴加到PBS缓冲液中，搅拌反应4h，然后将得到的溶液产物透析，得到GO-SS-KLA/FITC复合物分散液，然后负载抗癌药物。
在本发明的联合给药体系的构建过程中，首先将氧化石墨烯通过3-巯基丙基三甲氧基硅烷改性在表面引入巯基-SH，然后再与S-(2-氨基乙硫基)-2-硫代吡啶盐酸盐在甲醇中混合反应，氧化石墨烯表面的巯基将S-(2-氨基乙硫基)-2-硫代吡啶盐酸盐的双硫键打断，和S-(2-氨基乙硫基)-2-硫代吡啶盐酸盐的一部分结合形成新的双硫键，S-(2-氨基乙硫基)-2-硫代吡啶盐酸盐中含吡啶环的一半结构脱去，使氧化石墨烯的表面双硫化，连接氨基修饰的双硫键-SS-NH2，然后通过丙炔基取代氨基-NH2，在氧化石墨烯的表面形成炔基修饰的双硫键-SS-alkyne，再与端部有叠氮基团的细胞凋亡肽进行反应，在抗坏血酸钠与CuSO4·5H2O的作用下，炔基与叠氮基团发生点击化学反应，进行叠氮-炔基的Husigen环加成反应，从而使细胞凋亡肽连接到双硫键上，然后再进行抗癌药物的负载，并在最后在介孔硅表面包覆牛血清蛋白，提高联合给药体系的稳定性和分散性。通过表面修饰的氧化石墨烯的生物相容性和稳定性得到提高。同时所用的氧化石墨烯是以纳米石墨粉为原料，通过双氧水、KMnO4作用得到，表面的羟基含量多，具有较高的羟基比，有利于表面修饰的完成。在GO-SS-KLA上引入异硫氰酸荧光素，异硫氰酸荧光素与KLA形成共价键，使DOX@GO-SS-KLA/BSA具有荧光示踪功能。通过上述过程构建的联合给药体系具有较高的药物负载率、生物介质稳定性，而且对癌细胞的靶向作用强，对正常细胞的副作用小。
本发明的有益效果如下：
本发明的联合给药体系首先以多羟基比的氧化石墨烯为载体，通过还原敏感的双硫键连接细胞凋亡肽，通过π-π共轭作用以及静电作用连接盐酸阿霉素等抗癌药物，细胞凋亡肽与抗癌药物共同作用，对癌细胞的靶向作用强，对正常细胞的副作用低。最后通过牛血清蛋白包覆后具有良好的稳定性、分散性和生物相容性，可在水中保持稳定分散8天以上。
附图说明
图1是实施例1的GO、GO-SH、GO-SS-NH2、GO-SS-alkyne、GO-SS-KLA的傅里叶变换红外光谱图。
图2是实施例1的DOX@GO-SS-KLA在不同酸度环境下的DOX释药曲线。
图3是实施例1的GO-SS-KLA/FITC在不同DTT含量下的KLA释药曲线。
图4是实施例1的DOX@GO-SS-KLA/BSA与HeLa细胞共培养48h的细胞毒性图。
图5是实施例1的DOX@GO-SS-KLA与DOX@GO-SS-KLA/BSA在水中稳定性示图。
图1中，A1为GO，B1为GO-SH，C1为GO-SH-NH2，D1为GO-SS-alkyne，E1为GO-SS-KLA。
图5中，A为DOX@GO-SS-KLA，B为DOX@GO-SS-KLA/BSA。
具体实施方式
下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。
如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。
实施例1
一种用于癌症治疗的高稳定性的联合给药体系，以氧化石墨烯为载体，在氧化石墨烯上负载抗癌药物与细胞凋亡肽，在氧化石墨烯外包覆牛血清蛋白，其中细胞凋亡肽通过双硫键连接到氧化石墨烯的表面或边缘，抗癌药物为盐酸阿霉素DOX·HCl，通过π-π共轭作用以及静电作用连接到氧化石墨烯的表面。
上述联合给药体系的构建方法，包括以下步骤：
(1)制备多羟基比的氧化石墨烯GO：将去离子水与98％浓硫酸按体积比1:3.8混合置于冰水浴中，然后加入纳米石墨粉，缓慢加入KMnO4，去离子水、纳米石墨与KMnO4的质量比为12:1:3，然后升温至40℃并搅拌2h，再置于冰水浴中搅拌滴加30％H2O2，去离子水与30％H2O2体积比为12:5，静置过夜后抽滤，用5％的盐酸多次洗涤后透析、冻干得到氧化石墨烯；
(2)制备表面双硫化的氧化石墨烯：称取120mg的步骤(1)的GO超声分散到36mL去离子水中形成GO分散液，用0.1M的NaOH溶液调节pH至9～10，然后加入500μL的3-巯基丙基三甲氧基硅烷，反应24h，然后离心洗涤后真空干燥得到巯基修饰的氧化石墨烯GO-SH，然后将100mg GO-SH超声分散到20mL的甲醇中，加入100mg的S-(2-氨基乙硫基)-2-硫代吡啶盐酸盐，剧烈搅拌24h，离心洗涤后真空干燥得氨基修饰的氧化石墨烯GO-SS-NH2；
(3)制备氧化石墨烯中间体：称取80mg的GO-SS-NH2超声分散到20mL甲醇中，随后滴加1mL的溴代丙炔和1滴三乙胺，剧烈搅拌24h，使炔基替代氨基连接到双硫键上，然后离心、洗涤后真空干燥得到炔基修饰的氧化石墨烯GO-SS-alkyne；
(4)负载细胞凋亡肽：称取100mg的GO-SS-alkyne分散在30mL去离子水中，依次加入100mg的N3-KLA、50mg的CuSO4·5H2O与80mg的抗坏血酸钠，N2氛围下室温反应3天，得到负载细胞凋亡肽的氧化石墨烯GO-SS-KLA；
其中，端部有叠氮基团的细胞凋亡肽N3-KLA的一种制备方法如下：称取0.7g的2-氯-三苯甲基氯树脂，加入到10mL的DMF中搅拌15min，随后溶胀30min，然后将树脂转移到多肽合成管中抽滤移除DMF，然后加入Fmoc-D-Lys(Boc)-OH的DMF溶液(即：1.01gFmoc-Lys(Boc)-OH，8mL DMF，2.5mL DIEA)室温缩合反应2h，然后用6～8mL DMF洗涤3次，并用DMF:MeOH:DIEA＝6:3:1的混合液封闭未反应的活性氯基团，再用6～8mL DMF洗涤3次，用20mL的哌啶/DMF(1/4)溶液洗涤2次、每次20min脱除肽链末端氨基上的Fmoc保护基团，然后用DMF洗涤3次。此后在连接氨基酸残基延长肽链时，均采用4当量Fmoc保护的氨基酸即Fmoc-D-Leu-OH为0.766g，Fmoc-D-Ala-OH为0.6708g，并用4当量HBTU即0.822g及6当量DIEA即1.5mL溶解于8mL DMF中活化羧基，然后加入到上述连接有肽链并已脱除Fmoc保护的树脂中，进行缩合反应，反应时间为4h。反应完毕，用10mg/mL的茚三酮的甲醇溶液验证氨基是否缩合完全，若溶液发紫或发红表示缩合不完全，需重复缩合步骤，若溶液未变色，表示此步缩合反应完成，继续脱除Fmoc保护基，按氨基酸序列延长肽链。待所有氨基酸合成结束后，继续脱除Fmoc保护基，然后加入0.657g叠氮乙酸，2.466g HBTU，2mLDIEA，12mLDMF反应4h，待颜色通过后，依次用DMF、DCM、甲醇洗涤树脂，次数分别为3次，3次，4次，之后用含有95wt％TFA、2.5wt％TIS与2.5wt％水的切落剂进行切落，1g树脂对应15mL切落剂，将多肽从树脂上切落，同时切落侧基保护基，切落时间为2h，在切落1h的时候停止搅拌，静置可以看到分层的现象，上层为黑色黏状物，下层为淡黄色液体。将切落后的多肽溶液通过旋蒸浓缩，然后用冰乙醚沉淀，反复洗涤沉淀3次，过滤收集，真空干燥，然后通过冷冻干燥的方法除去小分子杂质，得到最终产品N3-KLA；
(5)负载抗癌药物：称取100mg的GO-SS-KLA分散到pH值为7.4的30mL的PBS缓冲液中得到GO-SS-KLA分散液，再称取30mg的盐酸阿霉素DOX·HCl搅拌溶于30mL去离子水中，缓慢滴加到上述GO-SS-KLA分散液中，室温搅拌反应12h，得到的溶液产物放入截留分子量为3500的透析袋中对去离子水透析一天，得DOX@GO-SS-KLA的复合物分散液；
(6)包覆牛血清蛋白：将10mg DOX@GO-SS-KLA溶于10mL去离子水中，滴加浓度1mg/mL的牛血清蛋白溶液BSA10mL，室温搅拌过夜，经过离心、洗涤得到DOX@GO-SS-KLA/BSA。
实施例2
一种用于癌症治疗的高稳定性的联合给药体系，以氧化石墨烯为载体，在氧化石墨烯上负载抗癌药物与细胞凋亡肽，在氧化石墨烯外包覆牛血清蛋白，其中细胞凋亡肽通过双硫键连接到氧化石墨烯的表面或边缘，抗癌药物为盐酸阿霉素DOX·HCl，通过π-π共轭作用以及静电作用连接到氧化石墨烯的表面。
其构建方法与实施例1的不同之处在于，
步骤(1)中，将去离子水与98％浓硫酸按体积比1:4混合后置于冰水浴中，然后加入纳米石墨，并缓慢加入KMnO4，去离子水、纳米石墨与KMnO4的质量比为12:1:3.3，然后升温至40℃并搅拌2.5h，再置于冰水浴中搅拌滴加30％H2O2，去离子水与30％H2O2体积比为12:5.5，静置过夜后抽滤，用5％的盐酸多次洗涤后透析、冻干、得到氧化石墨烯；
步骤(2)中，将GO超声分散到42mL去离子水中形成GO分散液，调节pH至9.5，然后加入480μL的3-巯基丙基三甲氧基硅烷；将GO-SH超声分散到18mL的甲醇中；
步骤(3)中，将GO-SS-NH2超声分散到15mL甲醇中，随后滴加0.6mL的溴代丙炔和2滴三乙胺；
步骤(4)中，将GO-SS-alkyne分散在20mL去离子水中，加入的的CuSO4·5H2O质量为75mg，加入的抗坏血酸钠的质量为100mg；
步骤(6)中，滴加浓度1mg/mL的BSA的体积为11mL。
实施例3
一种用于癌症治疗的高稳定性的联合给药体系，以氧化石墨烯为载体，在氧化石墨烯上负载抗癌药物与细胞凋亡肽，在氧化石墨烯外包覆牛血清蛋白，其中细胞凋亡肽通过双硫键连接到氧化石墨烯的表面或边缘，抗癌药物为盐酸阿霉素DOX·HCl，通过π-π共轭作用以及静电作用连接到氧化石墨烯的表面。
其构建方法与实施例1的不同之处在于，
步骤(1)中，将去离子水与98％浓硫酸按体积比1:4.5混合后置于冰水浴中，然后加入纳米石墨，并缓慢加入KMnO4，去离子水、纳米石墨与KMnO4的质量比为12:1:3.6，然后升温至40℃并搅拌2～3h，再置于冰水浴中搅拌滴加30％H2O2，去离子水与30％H2O2体积比为12:6，静置过夜后抽滤，用5％的盐酸多次洗涤后透析、冻干，得到氧化石墨烯；
步骤(2)中，将GO超声分散到48mL去离子水中形成GO分散液，调节pH至10，然后加入600μL的3-巯基丙基三甲氧基硅烷；将GO-SH超声分散到25mL的甲醇中；
步骤(3)中，将GO-SS-NH2超声分散到25mL甲醇中，随后滴加1.2mL的溴代丙炔和3滴三乙胺；
步骤(4)中，将GO-SS-alkyne分散在25mL去离子水中，加入的的CuSO4·5H2O质量为100mg，加入的抗坏血酸钠的质量为150mg；
步骤(6)中，滴加浓度1mg/mL的BSA的体积为12mL。
实施例4
一种用于癌症治疗的高稳定性的联合给药体系，其构建方法与实施例1的不同之处在于，步骤(4)得到负载细胞凋亡肽的氧化石墨烯GO-SS-KLA先负载异硫氰酸荧光素FITC，然后再负载抗癌药物。FITC的负载过程如下：避光条件下，称取50mgGO-SS-KLA分散在pH值为7.4的PBS缓冲液20mL中得到GO-SS-KLA分散液，再称取2.5mg的FITC溶于5mL去离子水中，并缓慢滴加到上述GO-SS-KLA分散液中，室温条件下搅拌反应4h，得到的溶液产物放入截留分子量为3500的透析袋中对去离子水透析一天，得FITC修饰的GO-SS-KLA复合物分散液GO-SS-KLA/FITC；
步骤(5)中负载抗癌药物时，称取100mg的负载了FITC的GO-SS-KLA/FITC分散液分散到pH值为7.4的30mL的PBS缓冲液中得到GO-SS-KLA分散液，再负载抗癌药物。
性能测试
1、用激光粒度分析仪测试不同氧化石墨烯复合物的Zeta电位，见下表1。
表1
Figure GDA0002327902660000071
Figure GDA0002327902660000081
2、对实施例1所得的GO、GO-SH、GO-SH-NH2、GO-SS-alkyne与GO-SS-KLA分别进行傅里叶变换红外测试，得到如图1所示的傅里叶变换红外光谱图，其中A1为GO，B1为GO-SH，C1为GO-SH-NH2，D1为GO-SS-alkyne，E1为GO-SS-KLA。
从图1可知，与氧化石墨烯GO相比，GO-SH在2550cm-1处出现的特征峰证明了氧化石墨烯表面巯基的存在。从表1可知，原始的石墨C电位为-18.3mV；氧化石墨烯GO上带有大量的带负电的羟基，电位为-27.41mV；表面引入巯基后，由于巯基带负电，GO-SH的电位值将至-59.05mV；修饰了带正电的氨基后，电位值由-59.05mV变为-7.62mV；炔基呈现电中性，覆盖了原本呈正电的氨基，导致Zeta电位下降至-19.21mV；多肽KLA结构中存在部分氨基，因此修饰细胞凋亡肽后的GO材料的电位升为-10.87mV；最后材料包覆了带负电的BSA，Zeta电位值下降至-19.33mV。结合表1与图1的结果可知，最终在氧化石墨烯上连接的DOX和细胞凋亡肽，并在外侧包覆了牛血清蛋白。
3、体外释药实验
(1)不同酸度环境的影响
取实施例1所得的DOX@GO-SS-KLA/BSA 25mg超声分散到3mL去离子水，平均分成三组并分别装入分子截留量3500的透析袋中，再分别加入300μL的胰蛋白酶。然后将透析袋浸泡在10mL的0.1M的PBS缓冲液中，pH值依次为5.5、6.8和7.4，再置于摇床中37℃释药。按照设定的时间间隔更换透析液，通过荧光分光光度计RF-5301PC测定DOX在波长为592nm处的荧光强度计算其释放量，其中累积药物释放量％＝(Mt/M∞)×100％，其中Mt是t时间内DOX的释放量，M∞是氧化石墨烯材料包裹的DOX总量，结果如图2所示。
从图2中可知，在开始的几个小时里，DOX@GO-SS-KLA/BSA在不同pH值环境下药物的释放速度几乎一样，大约6小时后，在pH值＝7.4环境下的DOX@GO-SS-KLA/BSA药物释放速度开始缓慢减弱，而在pH值＝5.5环境下的DOX@GO-SS-KLA/BSA药物释放速度明显高于另外两个环境中的药物释放速度。这是因为DOX通过π-π作用和静电作用的共同作用负载到氧化石墨烯上，pH值越小，静电作用也越弱，导致DOX释放的速度加快。72h后，不同pH值环境下的药物释放量趋于稳定，在pH值＝5.5下的DOX@GO-SS-KLA/BSA的累积药物释放量为85.88％，pH值＝6.8下的DOX@GO-SS-KLA/BSA的累积药物释放量为44.94％，在pH值＝7.4下的DOX@GO-SS-KLA/BSA的累积药物释放量为33.88％，表明DOX@GO-SS-KLA/BSA在酸性环境的释药性好，而癌细胞的酸性环境内则有利于释药，但是在人体正常组织内的释放量并不大，因此副作用小，靶向性强。
(2)还原敏感性
避光条件下，称取实施例1所得的GO-SS-KLA50mg分散在pH值为7.4的PBS缓冲液20mL中，再称取2.5mg异硫氰酸荧光素FITC溶于5mL去离子水中，并缓慢滴加到上述GO-SS-KLA分散液中，室温条件下搅拌反应4h，得到的溶液产物放入截留分子量为3500的透析袋中对去离子水透析一天，得到FITC修饰的GO-SS-KLA复合物分散液GO-SS-KLA/FITC；然后取25mg/mL的GO-SS-KLA/FITC溶液分散于3mL去离子水中，超声使其分散均匀，然后分成三组，分别装入分子截留量3500的透析袋中，再分别浸于5mL的浓度为0mM、0.5mM和5mM的二硫苏糖醇DTT缓冲液中，并置于摇床中于37℃释药。按照设定时间间隔更换透析液，通过荧光分光光度计RF-5301PC测定FITC在波长为516nm处的荧光强度，由于FITC与KLA之间存在共价键作用，测得的FITC的浓度即为KLA的浓度，从而计算KLA的释放量，累积药物释放量％＝(Mt/M∞)×100％，其中Mt是t时间内KLA的释放量，M∞是氧化石墨烯材料中KLA的总量，结果如图3所示。
从图3可知，在实验范围内，GO-SS-KLA/FITC随着DTT浓度的增加，同一时间KLA的释放的量也增加。这主要是因为DTT具有还原作用，可以使双硫键断裂，促进KLA的释放，亦即可以表明DOX@GO-SS-KLA/BSA也具有较强的还原敏感性，而癌细胞内含有的较多的谷胱甘肽与DTT具有相近的还原作用，并且其浓度远高于正常的体细胞，因此在癌细胞的还原环境内会促进KLA的释放，而在人体正常组织内的释放量并不大，对人体的副作用小。
4、体外细胞毒性实验
将HeLa细胞分别以6×103个/孔的密度接种于96孔细胞培养板中，每孔加入100μL含有10％FBS和1％链-青霉素的DMEM培养基，然后将其放在含5％CO2的培养箱中于37℃下培养24h。然后分别在每孔中加入设定浓度梯度不同的氧化石墨烯材料(GO/BSA、GO-SS-KLA/NSA、DOX@GO-SS-KLA/BSA)、纯的KLA和盐酸阿霉素Free DOX，在上述培养基中继续培养48h。培养结束后移除孔中所有的溶液，加入200μL新鲜培养基和20μLMTT溶液，在培养箱中继续培养4h。小心移除孔中的溶液，并补入100μL DMSO溶解生成的紫色晶体，摇晃混匀后，在酶标仪DG5033A上记录每个孔在490nm处的吸光度，计算细胞的相对存活率，结果见图4。
细胞的相对存活率由公式算出：
细胞相对存活率％＝(OD490(sample)/OD490(control))×100；
其中，OD490(control)是未加入介孔硅材料时测定的吸光值，OD490(sample)是加入介孔硅材料后测得的吸光值。OD值的测定基于4个独立平行样取平均值，结果表示为平均值±标准偏差。
从图4可知，GO/BSA基本没有细胞毒性，GO-SS-KLA/BSA只有较小的细胞毒性，结合图2，在pH值为7.4时的释药量为20％左右，即DOX@GO-SS-KLA/BSA中DOX浓度为1μg/mL时，其实际释放的浓度为0.2μg/mL，对比0.2μg/mL的Free DOX以及相对应浓度的GO-SS-KLA/BSA的细胞存活率：Free DOX的细胞存活率为57.4％，GO-SS-KLA/BSA的细胞存活率为84.2％，DOX@GO-SS-KLA/BSA的细胞存活率为29.2％。以上结果说明DOX@GO-SS-KLA/BSA有较好的毒性，证明了DOX/KLA的协调作用大大提高了治疗效果。
5、分散稳定性
将实施例1所得的DOX@GO-SS-KLA与DOX@GO-SS-KLA/BSA分别超声分散在去离子水中，浓度为2mg/mL，各取3mL置于试样瓶内，然后放置在37℃恒温箱内，每隔一定的时间拍照，观察材料的稳定性，结果见图5，A为DOX@GO-SS-KLA，B为DOX@GO-SS-KLA/BSA。从图5可知，DOX@GO-SS-KLA/BSA在水中可保持稳定分散8天以上，分散稳定性好。
需要说明的是，在上述实施例且不限于上述实施例中，可用阿霉素、喜树碱或伊达比星替代盐酸阿霉素与细胞凋亡肽共同负载到氧化石墨烯中。另外，依据本发明的构建方法所得的DOX@GO-SS-KLA/BSA以及取代盐酸阿霉素负载其他抗癌药并同时负载细胞凋亡肽所得的联合给药体系，包括实施例2和实施例3且不限于上述实施例，具有与实施例1相近的上述各项性能。

Claims (10)

1.一种用于癌症治疗的高稳定性的联合给药体系，其特征在于，联合给药体系以氧化石墨烯为载体，在氧化石墨烯上负载抗癌药物与细胞凋亡肽，在氧化石墨烯外包覆牛血清蛋白；
在氧化石墨烯上负载细胞凋亡肽的方法为：
将氧化石墨烯与3-巯基丙基三甲氧基硅烷反应得到巯基修饰的氧化石墨烯GO-SH，然后与S-(2-氨基乙硫基)-2-硫代吡啶盐酸盐反应得到表面连有双硫键的氧化石墨烯GO-SS-NH2，将GO-SS-NH2与溴代丙炔与三乙胺反应得到炔基修饰双硫键的氧化石墨烯GO-SS-alkyne；然后将GO-SS-alkyne与端部有叠氮基团的细胞凋亡肽N3-KLA、CuSO4·5H2O和抗坏血酸钠反应；在氧化石墨烯外包覆牛血清蛋白的方法为：向氧化石墨烯负载抗癌药物和细胞凋亡肽后的水分散液中滴加牛血清蛋白溶液BSA。
2.根据权利要求1所述的联合给药体系，其特征在于，细胞凋亡肽通过双硫键连接到氧化石墨烯的表面或边缘。
3.根据权利要求1所述的联合给药体系，其特征在于，抗癌药物为阿霉素、盐酸阿霉素、喜树碱或伊达比星。
4.如权利要求1至3任一所述的联合给药体系的构建方法，包括以下步骤：
(1)制备表面双硫化的氧化石墨烯：将氧化石墨烯GO加入去离子水中得GO分散液，调节pH值为9～10，向GO分散液中加入3-巯基丙基三甲氧基硅烷室温反应得到巯基修饰的氧化石墨烯GO-SH，离心干燥后将GO-SH分散到甲醇中得GO-SH分散液，加入S-(2-氨基乙硫基)-2-硫代吡啶盐酸盐室温搅拌反应，离心干燥得表面连有双硫键的氧化石墨烯GO-SS-NH2；
(2)制备氧化石墨烯中间体：将GO-SS-NH2分散在甲醇中得到GO-SS-NH2分散液，滴加溴代丙炔与三乙胺室温搅拌反应，使炔基替代氨基连接到双硫键上，得炔基修饰双硫键的氧化石墨烯GO-SS-alkyne；
(3)负载细胞凋亡肽：将GO-SS-alkyne分散到甲醇中，依次加入端部有叠氮基团的细胞凋亡肽N3-KLA、CuSO4·5H2O和抗坏血酸钠，氮气氛围下反应，使细胞凋亡肽通过双硫键连接到氧化石墨烯的表面或边缘，得到负载细胞凋亡肽的氧化石墨烯GO-SS-KLA；
(4)负载抗癌药物：将GO-SS-KLA与抗癌药物按质量比1:0.25～0.5室温分散到去离子水中混合，搅拌后透析得到负载抗癌药物与胞凋亡肽的载体复合物分散液；
(5)包覆牛血清蛋白：将载体复合物分散液分散到去离子水中，滴加牛血清蛋白溶液BSA，室温搅拌过夜，得到联合给药体系。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中GO经由以下过程制备：将去离子水与98％浓硫酸按体积比1:3.8～4.5混合后置于冰水浴中，然后加入纳米石墨，并缓慢加入KMnO4，去离子水、纳米石墨与KMnO4的质量比为12:1:3～3.6，然后升温至40℃并搅拌2～3h，再置于冰水浴中搅拌滴加30％H2O2，去离子水与30％H2O2体积比为12:5～6，静置过夜后抽滤，用5％的盐酸多次洗涤后透析、冻干得到氧化石墨烯。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中GO、去离子水和3-巯基丙基三甲氧基硅烷的质量比为1:300～400:4～5；GO-SH、甲醇和S-(2-氨基乙硫基)-2-硫代吡啶盐酸盐的质量比为1:150～200:1。
7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中GO-SS-NH2、甲醇、溴代丙炔和三乙胺的质量比为1:150～250:10～20:0.4～1.4。
8.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中GO-SS-alkyne、甲醇、N3-KLA、CuSO4·5H2O和抗坏血酸钠的质量比为1:200～300:1:0.5～1:0.8～1.5。
9.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，载体复合物分散液、去离子水和牛血清蛋白BSA的质量比为1:10000:1～1.2。
10.根据权利要求4至9任一所述的构建方法，其特征在于，还包括在GO-SS-KLA上引入异硫氰酸荧光素：避光条件下，将步骤(3)中制备的GO-SS-KLA分散到pH值为7.4的PBS缓冲溶液中，然后将异硫氰酸荧光素FITC的水溶液室温滴加到PBS缓冲液中，搅拌反应4h，然后将得到的溶液产物透析，得到GO-SS-KLA/FITC复合物分散液，然后负载抗癌药物。
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