CN111848975A

CN111848975A - 磷酸化蛋白质、基于磷酸化蛋白质的胞内递送体系及制备方法与应用

Info

Publication number: CN111848975A
Application number: CN202010596468.7A
Authority: CN
Inventors: 殷黎晨; 刘勇; 吴宇辰
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2020-06-27
Filing date: 2020-06-27
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2040-06-27
Also published as: CN111848975B

Abstract

本发明公开了磷酸化蛋白质、基于磷酸化蛋白质的胞内递送体系及制备方法与应用；提供了一种蛋白质磷酸化修饰方法，所述磷酸化蛋白质具有蛋白质结构、通过氨基接于所述蛋白质表面的苯硼酸基团和通过硼酸与邻二醇反应接于所述蛋白质表面的三磷酸腺苷；将阳离子多肽溶液和磷酸化蛋白质在碱液中混合，震荡后静置，得到基于磷酸化蛋白质的胞内递送体系。在肿瘤细胞内低pH值和高浓度的活性氧环境下，苯硼酸和三磷酸腺苷从蛋白质表面脱落，蛋白质与阳离子聚多肽的作用力减弱，从复合物中释放出来，同时恢复活性，杀死肿瘤细胞。

Description

磷酸化蛋白质、基于磷酸化蛋白质的胞内递送体系及制备方法与应用

技术领域

本申请涉及磷酸化蛋白质，更具体涉及用于蛋白质胞内递送体系的磷酸化蛋白质。

背景技术

目前市场上所有蛋白药物都是基于细胞外靶点开发的，如细胞膜蛋白（程序性细胞死亡受体1，PD-1；人表皮生长因子受体2，HER2；胰岛素受体等）和分泌蛋白（肿瘤坏死因子α，TNFα；白介素12，IL12；血管内皮生长因子，VEGF等）。这主要是因为蛋白质的大分子性质和亲水性使它不具备渗透细胞膜的能力。然而，约有70%以上的基因组编码蛋白位于细胞内。由于无法渗透细胞膜，这些蛋白很难被“药物化”。因此，近年来人们越来越重视开发简便、高效的胞内蛋白递送体系。

将具有穿膜功能的组分与蛋白共价结合是一种常见的蛋白胞内递送方式。常见的具有穿膜功能的组分包括蛋白质转导结构域、细胞渗透肽、阳离子聚合物以及一些两亲性小分子。功能化修饰后的蛋白具有更优异的穿膜能力，但这样的化学改性策略很难将具有穿膜功能的化学物质修饰到蛋白的特定位点上，改性后蛋白的生物活性可能会不可逆转地降低或改变。因此，人们用各种动态共价键连接蛋白与功能基团。通过动态共价键修饰的蛋白能够在内源或外源性的刺激下释放载荷蛋白，发挥功效。另一种常用的蛋白胞内递送策略是使用递送载体，如脂质体、细胞衍生小泡、无机纳米颗粒、纳米凝胶和聚合物。这些载体一般通过非共价相互作用与蛋白结合。蛋白质是一类电荷性质不确定、体积较大的生物分子，蛋白质表面可与载体结合的位点数量有限。此外，不同蛋白之间等电点、亲疏水性等性质差异很大，因此很难设计具有通用性的蛋白递送体系。

发明内容

本发明通过对蛋白质进行特定的磷酸化修饰，并通过阳离子聚多肽辅助，解决上述问题，可有效穿透细胞膜，且获得的纳米药物粒径小。

本发明采用如下技术方案：

磷酸化蛋白质，由蛋白质、苯硼酸分子、磷酸腺苷制备得到。

基于磷酸化蛋白质的胞内递送体系，包括上述磷酸化蛋白质与阳离子多肽。

本发明中，蛋白质上的胺基、苯硼酸分子、磷酸腺苷的摩尔比为1∶（1.3～1.8）∶（1.2～1.8），得到的磷酸化蛋白质与阳离子多肽复合后，得到的纳米药物粒径小且稳定性好。

本发明中，磷酸化蛋白质与阳离子多肽的质量比为1∶（0.5～10）。

本发明中，苯硼酸分子为4-羟甲基苯硼酸频那醇羰基咪唑；磷酸腺苷为三磷酸腺苷。

本发明中，阳离子多肽具有如下化学结构式：

本发明磷酸化蛋白质的制备方法为，将苯硼酸分子溶液加入蛋白质磷酸盐缓冲液中，反应得到R-PBA溶液；然后加入磷酸腺苷溶液，反应得到磷酸化蛋白质。

上述技术方案中，反应为室温反应。

本发明基于磷酸化蛋白质的胞内递送体系的制备方法为，将阳离子多肽溶液和磷酸化蛋白质在碱液中混合，震荡后静置，得到基于磷酸化蛋白质的胞内递送体系。碱液为碳酸氢钠水溶液。

本发明进一步公开了所述磷酸化蛋白质或者基于磷酸化蛋白质的胞内递送体系在制备纳米药物，尤其是抗肿瘤蛋白药物中的应用。

基于上述发现，本发明提供了一种基于蛋白质磷酸化修饰，阳离子聚多肽辅助的蛋白质胞内递送体系；所述磷酸化蛋白质具有蛋白质结构、通过氨基接于所述蛋白质表面的苯硼酸基团和通过硼酸与邻二醇反应接于所述蛋白质表面的三磷酸腺苷。

本发明的优势在于，该磷酸化蛋白质具有更高的负电荷密度，使得修饰后的蛋白质与阳离子聚多肽静电结合力增强，形成稳定的纳米复合物。同时磷酸基团与胍基之间的盐桥作用也有助于增强阳离子聚多肽与磷酸化蛋白质的相互作用力，进一步稳定纳米复合物。在肿瘤细胞内低pH值和高浓度的活性氧环境下，苯硼酸和三磷酸腺苷从蛋白质表面脱落，蛋白质与阳离子聚多肽的作用力减弱，从复合物中释放出来，同时恢复活性，杀死肿瘤细胞。

附图说明

图1为实施例1中RNase A磷酸化修饰前后的大分子质谱；

图2为实施例2中LPP的细胞毒性；（a）MCF-7、（b）B16F10、（c）HeLa细胞与不同浓度LPP孵育10小时并在新鲜培养基中继续孵育38小时后的相对存活率（n = 3）；

图3为实施例2中磷酸化蛋白质及纳米复合物的细胞摄取情况，MCF-7细胞与FITC标记的游离RNase A、游离R-P-ATP以及LPP/R-P-ATP复合物在无血清条件下共孵育4小时后的CLSM图片，细胞核与溶酶体分别用Hoechst和Lysotracker Deep Red (LDR)染色，标尺为100 µm；

图4为实施例2中磷酸化蛋白质及纳米复合物的细胞摄取情况，MCF-7细胞与游离RNaseA、游离R-P-ATP以及LPP/R-P-ATP复合物在无血清条件下共孵育4小时后的流式细胞分析图谱以及根据谱图计算的MCF-7细胞的平均荧光强度（n = 3）；

图5为实施例2中纳米复合物的细胞摄取机制；

图6为实施例2中纳米复合物的体外抑瘤效果；

图7为实施例2中纳米复合物的体内抑瘤效果；（a）12天观察期内小鼠肿瘤生长曲线（n= 10），箭头表示瘤内注射不同药物剂型：PBS、游离RNase A（1 mg/kg RNase A）、LPP/B-P-ATP（1 mg/kg BSA）、LPP/R-P-ATP（1 mg/kg RNase A）；（b）荷瘤小鼠在12天观察期内的体重变化（n = 10），（c）存活率；

图8为LPP在TFA-d中的¹H NMR图谱；

图9为未修饰的RNase A和R-P-ATP的表征，（a）RNase A、R-P-ATP及酸和H₂O₂处理后的R-P-ATP的MALDI-TOF图谱；RNase A和R-P-ATP的粒径（b）和zeta电位（c）；

图10为LPP/RNase A纳米复合物在PBS中的粒径变化。

图11为LPP/R-P-ATP纳米复合物的表征。在不同LPP/R-P-ATP质量比时制备的复合物的粒径（a）、zeta电位（b）以及在PBS中的粒径变化（c）；

图12为通过EtBr法对不同蛋白质或纳米复合物在不同条件下的酶活性测定。（a）RNA-EtBr络合物在不同蛋白质或纳米复合物处理下的荧光强度变化；（b）RNase A、R-P-ATP、LPP/R-P-ATP复合物以及酸和H₂O₂处理后的LPP/R-P-ATP复合物的相对酶活性（n = 3）；

图13为BSA和Cyt C的磷酸化修饰及与LPP复合后的细胞内吞研究。（a）LPP/BSA-P-ATP和（b）LPP/Cyt C-P-ATP的粒径、电位；（c）LPP/FITC-BSA-P-ATP和（d）LPP/FITC-Cyt C-P-ATP复合物在MCF-7细胞上的摄取情况，标尺为100 µm。

具体实施方式

本发明提供了一种蛋白质磷酸化修饰方法，由蛋白质、苯硼酸分子、三磷酸腺苷制备得到磷酸化蛋白质，示意如下：

本发明所述的磷酸化蛋白质可以和阳离子聚多肽通过电荷相互作用复合形成纳米复合物。因此，本发明另一方面提供了一种基于磷酸化蛋白质的胞内递送体系由磷酸化蛋白质和阳离子聚多肽组成，其制备方法为，将本发明所述水溶性磷酸化蛋白质溶于碳酸氢钠缓冲液中形成溶液，然后与阳离子聚多肽溶液混合，得到基于磷酸化蛋白质的胞内递送体系，为纳米药物。

实施例

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

RNase A购买于Sigma公司（美国）。

三磷酸腺苷（ATP）、4-羟甲基苯硼酸频那醇酯、羰基二咪唑（CDI）、二甲基氨基吡啶（DMAP）、三光气（BTC）、N,N-二异丙基乙基胺（DIEA）购买于上海安耐吉化学公司（上海，中国）。

六甲基二硅氮烷（HMDS）和β-环糊精（mβCD）购买于J&K（北京，中国）。

五甲基二乙烯三胺（PMDETA）购买于百灵威公司（上海，中国）。

Hoechst33342、Lysotracker Deep Red（LDR）和3-（4,5-二甲基-2-噻唑）-2,5-二苯基溴化四氮唑（MTT）购买于Invitrogen（卡尔斯巴达，美国）。

异硫氰酸荧光素（FITC）购买于麦克林（上海，中国）。氯丙嗪（CPZ）和染料木黄酮（GNT）购买于TCI（上海，中国）。

渥曼青霉素（WTM）购买于阿拉丁（上海，中国）。

所有使用玻璃仪器购买于欣维尔。

分析天平购买于Sartorius（型号：BSA224S）。

离心机购买于Thermo SCIENTIFIC（型号：MULTIFUGE X1R）。

磁力搅拌器购买于IKA（型号：RH digital）。

旋转蒸发仪购买于IKA（型号：RV10）。

磁力加热搅拌器（IKA，德国）；BS124S电子天平（Sartorius，德国）；FDU-2100 冷冻干燥机（EYELA，日本）；手套箱（米开罗那，中国）；400 M Hz核磁共振谱仪（Agilent，美国）；A-2082多功能酶标仪（Thermo，美国）；Micro 21R离心机（Thermo，美国）；TCS SP5共聚焦显微镜（CLSM，Lecia，德国）；倒置显微镜（Olympus，日本）；CO₂培养箱（Thermo，美国）；ZEN3690动态光散射仪（DLS，Malvern，英国）。

人乳腺癌细胞（MCF-7）、小鼠黑色素瘤细胞（B16F10）和人宫颈癌细胞（HeLa）购自ATCC细胞库（Rockville, MD, USA），在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中培养。

雌性C57BL/6小鼠来自上海斯莱克实验动物有限公司(上海，中国)，饲养于SPF级动物房。所有动物实验均按照美国国立卫生研究院的《实验室动物护理和使用指南》（NIH1985年修订版第85-23号出版物）进行，并获得苏州大学动物伦理委员会的批准。

实验至少独立进行3次，数据均以平均数±标准差（standard deviations, SDs）表示。采用Student’s t-test进行统计学分析。实验分组之间的差异定义为：*p < 0.05表示具有差异；**p < 0.01及***p < 0.001表示具有显著性差异。

实施例1

以RNase A为例两步法修饰蛋白质。预先合成小分子4-（羟甲基）苯硼酸频哪醇羰基咪唑（PBA-CDI）备用：将4-（羟甲基）苯基硼酸频哪醇酯（7.37 g，31.5 mmol）溶于无水DCM（50mL）中，加入羰基二咪唑（10.2 g, 62.9 mmol），室温搅拌过夜。向所得溶液中加入乙酸乙酯（200 mL），用去离子水（100 mL × 3）洗涤，无水MgSO₄干燥，过滤，旋蒸除去溶剂得到最终产物PBA-CDI。首先将RNase A（2 mg，0.146 µmol，1.603 µmol -NH₂）溶解于磷酸盐缓冲液（PB，921 µL，10 mM，pH = 7.4），搅拌下加入PBA-CDI的DMSO溶液（79 µL，10 mg/mL，2.409 µmol），室温反应20小时；反应结束后，将反应溶液转移至超滤管中（MWCO = 10000 Da），用0.1 M NaHCO₃（pH = 9.5）溶液洗去多余PBA-CDI（4000 ×g，4 °C，10 min，共5次），得到R-PBA溶液；随后将R-PBA溶液用NaHCO₃溶液（0.5 mL，0.1 M，pH = 9.5）稀释，搅拌下加入ATP的NaHCO₃溶液（122 µL，10 mg/mL，2.409 µmol），室温继续反应2小时。反应结束后，将反应溶液转移至超滤管中（MWCO = 10000 Da），用0.1 M NaHCO₃（pH = 9.5）溶液洗去多余ATP（4000 ×g，4 °C，10 min，共5次），得到R-P-ATP溶液，为磷酸化蛋白质。通过MALDI-TOF MS对修饰前后蛋白质分子量进行表征，见图1，平均每个RNase A蛋白分子约共价连接5个苯硼酸和2个ATP。作为对比，PBA-CDI用量为1.763µmol，其余不变时，通过MALDI-TOF MS对修饰前后蛋白质分子量进行表征，平均每个RNase A蛋白分子最多共价连接1个苯硼酸和ATP。

另外，通过相同的方法对Cyt C和BSA进行修饰，得到C-P-ATP和B-P-ATP。

实施例2

为研究游离蛋白质和LPP/蛋白质复合物的细胞摄取，用FITC标记蛋白质。首先将RNaseA（2 mg，0.146 µmol，1.603 µmol -NH₂）充分溶于NaHCO₃溶液（750 µL，0.1 M，pH = 9.5），随后加入新配置的FITC的DMSO溶液（250 µL，4 mg/mL）。室温避光反应2小时，反应结束后，将反应溶液转移至超滤管中（MWCO = 10000 Da），用0.1 M NaHCO₃（pH = 9.5）溶液洗去多余FITC（4000 × g，4 °C，10 min，共5次），至超滤管外溶液无色，得到FITC-RNase A溶液，-20°C避光保存，用于后续反应；根据实施例1的方法制备FITC-R-P-ATP。

通过相同的方法对Cyt C和BSA进行荧光标记，得到FITC-C和FITC-B。

以实施例1的水溶性磷酸化蛋白质R-P-ATP分别同阳离子聚多肽LPP复合，制备纳米药物。配制浓度为40 μg/mL的磷酸化蛋白质碳酸氢钠水溶液（0.01 M）和浓度为40 μg/mL的LPP的PB（10 mM，pH = 5.0）溶液，将两者按照质量比（1:1）混合后，涡旋15s，室温孵育30分钟后得到纳米复合物LPP/R-P-ATP复合物。

将R-P-ATP更换为FITC-R-P-ATP，其余同上，制备LPP/FITC-R-P-ATP复合物。未修饰蛋白质、C-P-ATP和B-P-ATP通过相同方法与LPP进行组装，制备纳米复合物并表征其结构。

首先，将MCF-7、HeLa和B16F10细胞分别以0.3×10⁴细胞/孔的密度接种到96孔板内，37 °C培养过夜。随后将培养基换成含不同浓度LPP的新鲜无血清培养基，孵育10小时后将培养基移去，加入含10%血清的新鲜培养基，继续孵育38小时，用MTT测定法测定细胞的活力，以无任何处理的细胞作为参照，结果表示为对照细胞的百分比。结果见图2。三种肿瘤细胞（MCF-7、B16F10、HeLa）与不同浓度LPP（最大浓度5 µg/mL）共孵育后存活率均高于85%，表明阳离子聚多肽LPP在一定浓度范围下细胞毒性较低。

将MCF-7细胞以1×10⁴细胞/孔的密度接种在铺有玻璃小圆片的24孔板中，在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养过夜。随后将培养基换成含有不同蛋白质或LPP/蛋白质纳米复合物（FITC-RNase A、FITC-R-P-ATP、以及LPP/FITC-R-P-ATP复合物；浓度为2 μg/mLRNase A，500 μL/孔）的新鲜培养基，继续孵育4小时。移去培养基，PBS洗三次。用Lysotracker Deep Red（LDR）染溶酶体（50 nM，1 h），接着再用PBS洗三次。4%多聚甲醛溶液固定细胞，Hoechst 33342染细胞核（1 μg/mL，15 min），再用PBS洗三次，将玻璃小圆片置于加有抗荧光淬灭剂的载玻片上，CLSM观察细胞。通过相同的方法研究Cyt C和BSA的细胞摄取。结果见图3。与游离FITC-RNase A和游离FITC-R-P-ATP相比，LPP/FITC-R-P-ATP复合物的细胞摄取效率显著提高。

此外，通过流式定量分析LPP/蛋白质复合物的细胞摄取情况。首先，将MCF-7细胞以1×10⁵细胞/孔的密度种在24孔板中，在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中孵育，37 °C培养过夜。随后将培养基换成含有不同蛋白质或LPP/蛋白质纳米复合物（FITC-RNase A、FITC-R-P-ATP、以及LPP/FITC-R-P-ATP复合物；浓度为2 μg/mL RNase A，500 μL/孔）的新鲜培养基，继续孵育4小时。移去培养基，用PBS洗三次，胰酶消化细胞，用PBS将细胞悬浮后流式细胞术分析细胞内荧光含量。结果见图4。与游离FITC-RNase A和游离FITC-R-P-ATP相比，LPP/FITC-R-P-ATP复合物的细胞摄取效率显著提高。细胞平均荧光强度分析数据进一步表明，LPP/FITC-R-P-ATP复合物的细胞摄取率比游离FITC-R-P-ATP提高约59倍。

为探究LPP/蛋白质复合物的进胞机制，在4 °C环境下，或用不同的内吞抑制剂预处理细胞后研究LPP/FITC-R-P-ATP复合物的细胞摄取情况。首先，将MCF-7细胞以1×104细胞/孔的密度接种在96孔板上，在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中孵育，37 °C培养过夜，将培养基换成不含血清的新鲜培养基，加入抑制剂CPZ（10 μg/mL）、GNT（100 μg/mL）、mβCD（5 mM）、或WTM（10 μg/mL），孵育30分钟。随后加入LPP/FITC-R-P-ATP复合物（0.1 μg/孔RNase A），继续孵育4小时。含肝素钠（20 U/mL）的PBS洗3次，加入RIPA裂解液（100 μL/孔）裂解细胞。酶标仪（λ _ex = 488 nm，λ _em= 525 nm）测定裂解液中FITC-RNase A的含量，BCA试剂盒测定裂解液中的蛋白含量。细胞摄取效率用μg FITC-RNase A/mg protein表示。结果见图5，表明该复合物通过内吞作用进入细胞。

将MCF-7、HeLa和B16F10细胞分别以0.3×10⁴细胞/孔的密度接种到96孔板内，37°C培养过夜。随后将培养基换成含不同浓度的蛋白质或LPP/蛋白质纳米复合物的新鲜无血清培养基（游离RNase A、游离R-P-ATP和LPP/R-P-ATP纳米复合物；LPP/RNase A=1/1，w/w），培养10小时后移去培养基，加入含10%血清的培养基，继续孵育38小时，以无任何处理的细胞作为参照，结果表示为对照细胞的百分比。结果见图6。游离的R-P-ATP由于无法被细胞摄取，因此浓度达到5 µg/mL RNase A时仍没有明显的细胞毒性。相反地，LPP/R-P-ATP复合物具有剂量依赖性的抗肿瘤效果，在MCF-7、B16F10和HeLa三种肿瘤细胞株上RNase A的IC50值分别为1.07、1.40和3.69 µg/mL，表明LPP/R-P-ATP复合物可通过高效地递送蛋白质进入细胞来发挥抗肿瘤作用。

实施例3

将含有5×10⁵个B16F10细胞的PBS（50 µL）注射到C57BL/6小鼠的右侧背部皮下，建立移植瘤模型。当肿瘤体积达到60 mm³时，将小鼠随机分为4组（每组10只），第1、3、5天分别瘤内注射PBS、游离RNase A（1 mg /kg RNase A）、LPP/B-P-ATP纳米复合物（1 mg/kg BSA）、LPP/R-P-ATP纳米复合物（1 mg/kg RNase A）。在12天的观察期内，每隔一天测定肿瘤体积和小鼠体重。结果见图7。游离的RNase A无任何抗肿瘤活性，肿瘤生长与PBS组相似，表明游离的RNase A难以被肿瘤细胞摄取、发挥细胞杀伤效果。LPP/R-P-ATP复合物在12天的观察期内可明显抑制肿瘤的生长，表现出最佳的肿瘤抑制效率。同时，本文对治疗过程中小鼠的体重进行监测。在12天的观察期内小鼠体重没有出现明显下降，表明瘤内注射不同药物剂型不会在小鼠体内产生明显毒副作用。

本发明涉及的阳离子多肽LPP制备如下：

POB-_L-Glu-NCA。首先合成炔丙氧基苄醇，将碳酸钾（15.2 g，0.110 mol）和对羟基苯甲醇（9.3 g，0.075 mol）溶于丙酮（150 mL），随后向溶液中加入溴丙炔（6.75 mL，0.09 mol）和18-冠醚-6（10 mg，0.038 mmol），75 °C回流反应12小时。反应结束后旋蒸除去丙酮。将粗产物溶于超纯水（200 mL），用二氯甲烷（DCM，30 mL × 3）萃取。有机相合并后用15%氢氧化钠（200 mL × 3）和超纯水（200 mL × 3）依次洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤，旋蒸除去DCM得到产物炔丙氧基苄醇（无色液体，产率76.5%），¹H NMR（CDCl₃）表征产物结构。

炔丙氧基苄基氯的合成。将炔丙氧基苄醇（8.5 g，52 mmol）溶于DCM（40 mL），冰浴下滴加亚硫酰氯（5 mL，68 mmol）。加完后升至室温，反应3.5小时。反应完成后加入超纯水（100 mL）淬灭，分液。有机相用超纯水（50 mL × 3）洗涤，无水MgSO₄干燥，过滤，旋蒸除去DCM得到产物炔丙氧基苄基氯（无色液体，产率86.1%）。¹H NMR（CDCl₃）表征产物结构。

γ-（4-炔丙氧基苄基）-_L-谷氨酸（POB-_L-Glu）的合成。将_L-谷氨酸-铜（II）络合物（3.29 g，6.7 mmol）和_L-谷氨酸（1.99 g，13.4 mmol）溶于二甲基甲酰胺（DMF，12 mL）和超纯水（2 mL）的混合溶剂，加入1,1,3,3-四甲基胍（3.4 mL，27 mmol），40 °C搅拌2小时直至固体溶解。随后加入炔丙氧基苄基氯（6.5 g，36 mmol）的DMF溶液（10mL），室温反应48小时。反应结束后加入丙酮（200 mL），搅拌，直至产生细小沉淀。离心后得到粗产物，依次用丙酮（150 mL × 4）和超纯水（150 mL × 3）洗涤，最后用新配制的EDTA-Na₂溶液（60 mL × 2）洗涤。抽滤，真空干燥，得到白色固体。将产物加入至异丙醇和水的混合溶液（异丙醇/水 =2/1，v/v），加热至80 °C使粗产物溶解，热过滤，冷却结晶后得到终产物（白色固体，产率41.2%）。¹H NMR（DMSO-d ₆/D₂O = 9/1，v/v）表征产物结构。

POB-_L-Glu-NCA的合成。将γ-（4-炔丙氧基苄基）-_L-谷氨酸（POB-_L-Glu，1.15 g，4.0 mmol）溶于无水四氢呋喃（THF，25 mL），加入三光气（0.52 g，1.75 mmol），50 °C反应2小时。反应结束后，旋蒸除去溶剂，得到白色固体。粗产物用乙酸乙酯/正己烷（v/v = 1/10）重结晶3次，随后以乙酸乙酯为流动相，硅胶为固定相，进行柱层析色谱分离。旋蒸除去溶剂后得到终产物POB-_L-Glu-NCA（白色固体，产率80.3%）。¹H NMR（CDCl₃）表征产物结构。

胍基小分子N₃-6-g。首先合成N₃-6-N₃。1,6-二溴己烷（1.26 mL, 8 mmol）和叠氮化钠（1.6 g, 24 mmol）溶于DMF（19 mL），60 °C反应24小时。反应完全后加入150 mL超纯水，乙醚（20 mL × 3）萃取，无水Na₂SO₄干燥，过滤，旋蒸除去溶剂后得到产物N₃-6-N₃（白色油状物，产率62.5%）。¹H NMR（CDCl₃）表征产物结构。

N₃-6-NH₂的合成。将N₃-6-N₃（3.33 g, 20 mmol）溶于含有5% HCl（30 mL）的乙醚（15 mL）和乙酸乙酯（15 mL）混合溶剂，冰浴下加入三苯基磷（5.51 g，22 mmol），冰水浴反应1小时后，常温继续反应24小时。反应完全后，加入1 M HCl（30 mL）淬灭反应，分液，收集下层水相，DCM（20 mL × 3）萃取，接着用NaOH调节水相pH至12，DCM（20 mL × 3）萃取，收集下层有机相，无水Na₂SO₄干燥，过滤，旋蒸除去溶剂得到产物N₃-6-NH₂（白色油状物，产率79.0%）。¹H NMR（CDCl₃）表征产物结构。

N3-6-g的合成。将N₃-6-NH₂（1.42 g，10 mmol）、1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐（1.47 g，10mmol）和N,N-二异丙基乙基胺（DIEA，1.74 mL, 10 mmol）溶于无水DMF（15 mL），室温反应24小时。反应结束后加入乙醚（150 mL）使产物沉降，离心收集沉淀，乙醚（50 mL × 3）洗涤，真空干燥，得到产物N₃-6-g（白色固体，产率60.0%）。¹H NMR（CDCl₃）表征产物结构。

聚多肽PPOBLG的合成。在手套箱中，将POB-_L-Glu-NCA（50 mg，0.16 mmol）溶于无水DMF（1 mL），随后加入六甲基二硅氮烷（HMDS）的DMF溶液（32 µL，0.1 M，[M]/[I] = 50），室温反应48小时，傅里叶变换红外光谱（FTIR）监测反应。聚合完成后，将溶液滴入冰乙醚（50 mL）中沉降，离心收集沉淀，真空干燥，得到聚合物PPOBLG（白色固体，产率84.7%）。¹HNMR（CDCl₃）表征产物结构。

阳离子聚多肽LPP的合成。在手套箱中，将PPOBLG（20 mg，0.073 mmol炔基）溶于无水DMF（1 mL），依次加入N₃-6-g（14.8 mg，0.081 mmol）、PMDETA（30 μL）以及CuBr（20.8mg），室温反应24小时。反应结束后，将反应瓶从手套箱中移出，敞口放置，搅拌使过量的CuBr全部氧化，加入1 M HCl（1 mL），继续搅拌至反应溶液呈淡棕色。超纯水中透析3天（MWCO = 3500 Da），冻干，得到终产物LPP（白色固体，产率91.0%）。¹H NMR（TFA-d）表征产物结构，见图8。

LPP/蛋白质纳米复合物的稳定性研究

将LPP溶于PB缓冲液（10 mM，pH = 5.0），制成浓度为1 mg/mL的溶液备用。按照不同的LPP/蛋白质质量比，将LPP和R-P-ATP在NaHCO₃溶液（0.01 M）中混合，充分震荡后静置0.5小时，得到不同比例的LPP/R-P-ATP纳米复合物溶液（蛋白质终浓度为20 µg/mL）。随后，向复合物溶液中加入高浓度盐溶液（含NaCl和KCl），震荡混合均匀，使溶液中盐离子终浓度为150 mM。不同时间点测定LPP/R-P-ATP复合物的粒径和zeta电位。

实施例1中，RNase A在10 mM PB中与PBA-CDI反应得到苯硼酸修饰的RNase A，接着在0.1 M NaHCO₃中与ATP反应得到终产物R-P-ATP，并通过超滤纯化蛋白质。利用基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）对修饰前后的RNase A进行表征，可知平均每个RNase A蛋白分子约共价连接5个苯硼酸和2个ATP。之后，通过MALDI-TOF MS研究R-P-ATP的酸及H₂O₂敏感性。如图9a所示，与未修饰的RNase A相比，修饰后的R-P-ATP质谱图主峰右移，表明PBA与ATP的共价修饰使RNase A分子量增加。经酸（pH = 6.5）和H₂O₂（100 µM）共同处理后，R-P-ATP的分子量恢复至与未修饰的RNase A相同，表明R-P-ATP具有酸及H₂O₂敏感性。如图9b和9c所示，磷酸化修饰后RNase A的在0.01 M NaHCO₃溶液中的粒径及zeta电位与未修饰时相比无明显变化。

将LPP和RNase A按照不同质量比在NaHCO₃溶液（0.01 M）中混合，震荡后静置0.5小时，得到不同质量比例的LPP/RNase A纳米复合物溶液。为研究LPP/RNase A复合物在生理环境下的稳定性，通过DLS监测不同比例的LPP/RNase A复合物在PBS中的粒径变化。如图10所示，将LPP/RNase A复合物置于PBS中6小时后，粒径出现明显增长。在12小时的观察时间内，不同比例下LPP/RNase A复合物的粒径增大至500-700 nm。由于RNase A表面负电基团较少，在中性条件下呈正电，由此结果可知LPP与RNase A无法在PBS中形成稳定的纳米复合物。

将LPP和R-P-ATP按照不同质量比在NaHCO₃溶液（0.01 M）中混合，震荡后静置0.5小时，得到不同比例的LPP/R-P-ATP纳米复合物溶液。通过DLS对LPP/R-P-ATP纳米复合物进行粒径和电位表征。如图11所示，在不同LPP/蛋白质质量比时，形成的纳米复合物平均粒径为100-260 nm。其中，当LPP/蛋白质质量比为1:1时，形成的LPP/R-P-ATP复合物粒径最小，为114.4 ± 11.6 nm， PDI为0.174。同时，所有比例下LPP/R-P-ATP复合物的zeta电位均为正电，且随着LPP/蛋白质比例增大，zeta电位逐渐升高。与R-P-ATP复合后，LPP/R-P-ATP复合物在溶液中整体呈正电状态，且粒径较小。为模拟研究LPP/R-P-ATP复合物在生理环境下的稳定性，通过DLS监测不同比例的LPP/R-P-ATP复合物在PBS中的粒径变化。如图11c所示，将LPP/R-P-ATP复合物置于PBS中约2小时后，粒径出现小幅增长。但在12小时的观察期内，复合物粒径不再继续增长，表明LPP/R-P-ATP纳米复合物在PBS中具有较好的稳定性。作为对比，用实施例1的R-PBA替换R-P-ATP，其余不变，制备LPP/R-PBA纳米复合物，粒径很大，超过700纳米，不适用。作为对比，实施例1的PBA-CDI用量为3.527µmol，其余不变时，同样方法制备的LPP/R-PBA纳米复合物，粒径偏大，为125纳米左右。

RNase A酶活性的研究

溴化乙锭（EtBr）法测定不同条件下RNase A的酶活性。以0.01 M NaHCO₃:0.01 M PB =1:1（v/v）为所有底物及蛋白质剂型的溶剂（记作buffer）。首先，向1.5 mL EP管中加入RNA溶液（1 µL，2 mg/mL）和996 µL buffer，随后加入EtBr溶液（1 µL，1 mg/mL），用移液器吹打混匀，向5个EP管中分别加入2 µL buffer、RNase A溶液、R-P-ATP溶液、LPP/R-P-ATP纳米复合物溶液，以及经过酸（pH = 6.5）和H₂O₂（100 µM）处理的LPP/R-P-ATP纳米复合物溶液，其中RNase A浓度为0.1 mg/mL。迅速取200 µL加入96孔黑板中，测定5分钟内荧光变化（λ _ex =510 nm，λ _em = 590 nm），每5秒测定一次。

由于对RNase A的共价修饰以及物理包封可能影响其酶活性，因此通过EtBr法研究R-P-ATP、LPP/R-P-ATP复合物、酸和H₂O₂处理后的LPP/R-P-ATP复合物的酶活性变化情况。如图12a所示，在不添加蛋白质的情况下，RNA底物与EtBr络合后产生的荧光强度（λ _ex = 510nm，λ _em = 590 nm）在5分钟的监测时间内不会发生明显减弱。在加入未经修饰的RNase A后，RNA-EtBr络合物的荧光强度在5分钟内急剧减弱，最终荧光强度约为起始时的33%。该结果表明RNase A可以快速降解底物RNA，使EtBr无法嵌入RNA片段中产生荧光。类似地，修饰后的R-P-ATP同样可以使体系荧光迅速减弱，最终荧光强度约为起始时的40%。该结果表明本文设计的体系中磷酸化共价修饰对RNase A的活性影响较小；当R-P-ATP与LPP形成纳米复合物后，体系的荧光强度衰减速度明显减缓，且最终荧光强度约为起始时的70%，表明与LPP复合后R-P-ATP的RNA降解能力显著减弱。由于R-P-ATP具有酸和H₂O₂敏感性，用同样的方法对经过酸和H₂O₂预处理的LPP/R-P-ATP复合物的酶活性进行测定。结果表明，经过酸和H₂O₂预处理后，LPP/R-P-ATP复合物降解RNA的能力恢复至与RNase A接近的水平，LPP/R-P-ATP复合物解离，RNase A从而能够与RNA底物充分接触，最终会导致酶活性的恢复。如图12b所示，将RNase A导致的RNA-EtBr络合物的荧光强度变化定义为100%的酶活性，即可直观地计算出R-P-ATP、LPP/R-P-ATP复合物以及酸和H₂O₂处理后的LPP/R-P-ATP复合物的相对酶活性。这一数据同样说明，磷酸化共价修饰几乎不会对RNase A的活性产生影响，同时R-P-ATP的酸和H₂O₂双重响应性能够使LPP/R-P-ATP复合物在类似肿瘤微环境的酸和H₂O₂条件下恢复酶活性。

进一步对细胞色素C（Cytochrome C, Cyt C）和牛血清白蛋白（bovine serumalbumin，BSA）进行磷酸化修饰，研究其与LPP复合后的细胞摄取情况。如图13a和13b所示，BSA和Cyt C具有不同的分子量及等电点，在磷酸化修饰及与LPP按LPP/Protein = 1:1（w/w）复合后，复合物粒径分别为164.2 nm（LPP/BSA-P-ATP）及122.4 nm（LPP/Cyt C-P-ATP），且zeta电位均为正电。同时，与游离蛋白质相比LPP/FITC-BSA-P-ATP和LPP/FITC-Cyt C-P-ATP复合物同样表现出较高的细胞摄取效率。此外，可以观察到细胞质中绿色荧光（FITC标记的蛋白质）与红色荧光（Lysotracker Deep Red染色的内涵体/溶酶体）出现明显分离，表明LPP与蛋白质的复合物能够实现高效的溶酶体逃逸。这些结果表明本文设计的磷酸化修饰以及阳离子聚多肽LPP递送蛋白质的体系可以应用于具有不同理化性质的蛋白质递送，是具有潜力的通用蛋白质递送体系。

本发明通过对蛋白质进行磷酸化共价修饰，增强蛋白质与阳离子聚合物之间的静电相互作用和盐桥作用，实现不同蛋白质的高效纳米包载和胞内递送。该纳米复合物具有良好的盐溶液稳定性、较小的粒径、均匀的粒径分布以及一定数量的表面正电荷，因此能够被肿瘤细胞高效摄取，并在肿瘤细胞内高浓度H₂O₂及酸性环境中实现蛋白质结构的复原，从而高效杀伤肿瘤细胞。这样一种具有一定通用性的、基于可逆磷酸化修饰的蛋白质跨膜递送体系在蛋白质胞内递送及抗肿瘤治疗领域具有广阔的潜力。

Claims

1.磷酸化蛋白质，由蛋白质、苯硼酸分子、磷酸腺苷制备得到。

2.根据权利要求1所述磷酸化蛋白质，其特征在于，蛋白质上的胺基、苯硼酸分子、磷酸腺苷的摩尔比为1∶（1.3～1.8）∶（1.2～1.8）。

3.根据权利要求1所述磷酸化蛋白质，其特征在于，苯硼酸分子为4-羟甲基苯硼酸频那醇羰基咪唑；磷酸腺苷为三磷酸腺苷。

4.根据权利要求1所述磷酸化蛋白质，其特征在于，将苯硼酸分子溶液加入蛋白质磷酸盐缓冲液中，反应得到R-PBA溶液；然后加入磷酸腺苷溶液，反应得到磷酸化蛋白质。

5.基于磷酸化蛋白质的胞内递送体系，包括权利要求1所述磷酸化蛋白质与阳离子多肽。

6.根据权利要求5所述基于磷酸化蛋白质的胞内递送体系，其特征在于，磷酸化蛋白质与阳离子多肽的质量比为1∶（0.5～10）；阳离子多肽具有如下化学结构式：

。

7.根据权利要求5所述基于磷酸化蛋白质的胞内递送体系，其特征在于，将阳离子多肽溶液和磷酸化蛋白质在碱液中混合，震荡后静置，得到基于磷酸化蛋白质的胞内递送体系。

8.根据权利要求7所述基于磷酸化蛋白质的胞内递送体系，其特征在于，碱液为碳酸氢钠水溶液。

9.权利要求5所述基于磷酸化蛋白质的胞内递送体系或者权利要求1所述磷酸化蛋白质在制备纳米药物中的应用。

10.权利要求1所述磷酸化蛋白质在制备权利要求5所述基于磷酸化蛋白质的胞内递送体系中的应用。