CN111116904A - 一种含苯硼酸修饰的含氟高分子材料及其在蛋白质胞内递送中的应用 - Google Patents

一种含苯硼酸修饰的含氟高分子材料及其在蛋白质胞内递送中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含苯硼酸修饰的含氟高分子材料及其在蛋白质胞内递送中的应用，所述含苯硼酸修饰的含氟高分子材料由树形高分子、含苯硼酸的功能基团以及含氟烷基链组成，所述含苯硼酸的功能基团共价连接在树形高分子上；所述含苯硼酸修饰的含氟高分子材料可以作为蛋白质胞内递送载体，将蛋白质分子由细胞外递送到细胞内。本发明提供的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料作为蛋白质胞内递送载体的方法可以实现对不同分子量和等电点的蛋白质的高效递送，并且可以保持被递送的蛋白质分子的生物活性，同时该材料对细胞的毒性较低，具有良好的生物相容性。

Description

一种含苯硼酸修饰的含氟高分子材料及其在蛋白质胞内递送 中的应用
技术领域
本发明属于生物技术、高分子化学、细胞生物学等领域，具体涉及含苯硼酸修饰的含氟高分子材料及其在蛋白质胞内递送中的应用。
背景技术
蛋白质治疗通过将正常的蛋白质导入到患者特定的组织或细胞中，替代低表达及功能失调或丢失的蛋白质从而达到治疗的目的。与传统的治疗方式相比具有活性高、选择性强、毒副作用低等优点。蛋白质治疗在癌症、炎症、糖尿病、脑损伤等慢性疾病以及功能缺失型遗传病中具有广泛的应用前景。由于体细胞存在较强的自我保护能力，外源的蛋白质很难进入细胞发挥其生物学功能，使得目前蛋白质治疗主要集中在作用靶点位于细胞外的蛋白质。基因组编码的蛋白质超过百分之七十都位于细胞内，这部分蛋白质具有巨大的研究价值和成药潜力。
目前蛋白质递送系统的匮乏很大程度上限制了蛋白质类药物的开发以及新蛋白质功能的研究，成为了蛋白质治疗发展的一个重要障碍。蛋白质分子量较大，三维结构复杂，带电性质不明确，表面电荷较低，这些性质使得蛋白质无法像核酸一样可以直接利用阳离子转染载体通过静电相互作用进行结合和递送。蛋白质递送首先要解决的关键科学问题就在于如何将蛋白质结合到载体上。目前这方面的研究大多数是基于对蛋白质进行生物或化学修饰，例如通过基因工程的方式在目标蛋白质分子上融合表达带负电的蛋白质或氨基酸序列，或在蛋白质表面通过化学反应修饰负电荷功能基团增加目标蛋白表面负电荷，进而通过静电相互作用与阳离子高分子结合，实现胞内递送。或者通过共价键将目标蛋白直接连接在穿膜肽、转导蛋白或脂质体等具有穿膜功能的载体上。上述方法虽然都可以在不同程度上将目标蛋白递送到细胞中，但其递送过程都需要对蛋白进行化学修饰或生物改造，合成成本高，并且可能会破坏蛋白质原有的生物活性，不便于普及和应用。如何使用蛋白质递送载体将未经任何修饰的蛋白质高效结合并递送到细胞中是该技术领域亟待解决的科学问题。想要开发通用的蛋白质载体就需要从蛋白质结构的共性出发，蛋白质是由氨基酸组成的生物大分子，其结构中既含有负电基团如羧基、磷酸根、羟基等，也含有生理条件下带正电的基团如氨基、咪唑基和胍基等。其结构中同时存在亲水和疏水区域，从而能够形成特定的构象发挥其生物学功能。
发明内容
为了解决现有技术中高分子载体不能很好地结合蛋白质进行胞内递送的问题，针对蛋白质的结构特点，本发明设计了一类可以同时与蛋白质结构中正电基团、负电基团和疏水基团同时发生相互作用的蛋白质胞内递送载体。该载体胞内递送效率高，对蛋白质的胞内递送具有谷胱甘肽刺激响应性，被递送到细胞内的蛋白质仍具有生物活性，同时材料自身及递送过程对细胞产生的毒性较小。
具体机理如下：含苯硼酸的功能基团可以通过氮-硼配位与蛋白质结构中的氨基、咪唑、胍基相互结合，其结构中的苯环可以与蛋白质分子中的胍基形成阳离子-π相互作用，含苯硼酸功能基团还可以与细胞膜表面的糖蛋白相互作用，引发细胞内吞。含氟烷基链赋予高分子载体自组装的性能，可以使得载体在组装的同时包裹蛋白质分子，提高转染复合物的稳定性，同时含氟烷基链可以促进转染复合物的细胞内吞和内涵体逃逸能力，提高其蛋白质转染效率。树形高分子一方面可以与蛋白质中的负电基团结合，另一方面作为骨架分子，赋予修饰基团多共价效应，放大修饰基团的功能，同时阳离子高分子也可以与细胞膜表面阴离子基团相互作用，促进转染复合物的细胞内吞，并通过“质子海绵”效应促进转染复合物的内含体逃逸。此外，该高分子载体中的氟烷基链通过二硫键与树形高分子相连接，二硫键可在谷胱甘肽存在的环境中断裂，而癌细胞中大多高表达还原性谷胱甘肽，因此该材料在癌细胞中具有更强的蛋白质释放能力，表现出对癌细胞更强的转染效率。
尽管含苯硼酸修饰的树形高分子已被报道应用于蛋白质胞内递送，但是同时具有含苯硼酸功能基团和含氟烷基链的具有刺激响应性能的树形高分子的结构及其在蛋白质胞内递送中的应用还未见报道，属于新合成的功能化修饰的树形高分子的新应用。
本发明提供了一类含苯硼酸修饰的含氟高分子材料，所述含苯硼酸修饰的含氟高分子材料包括树形高分子、含苯硼酸的功能基团以及含氟烷基链，所述含苯硼酸的功能基团通过共价键连接在树形高分子上，所述含氟烷基链通过二硫键连接在树形高分子的核心。
其中，所述含苯硼酸修饰的含氟高分子材料的结构如下式(1)-式(3)所示：
Figure BDA0002273104210000031
式(1)-式(3)中，
R1为含氟烷基链；
R2为含氟烷基链与树形高分子之间的连接键；
R3树形高分子；
R4为树形高分子与含苯硼酸的功能基团之间的连接键；
R5、R6、R7、R8为化学官能团，分别独立地选自H、卤素、C1-C5烷基、C1-C5烷氧基、硝基；优选地，为H和卤素。
X为含苯硼酸的功能基团的连接数，为1-128之间的整数；优选地，X为10-60之间的整数。
其中，R1包括但不限于如下式(4)所示的含氟烷基单链：
Figure BDA0002273104210000032
Figure BDA0002273104210000041
式(4)中，y为1-20之间的整数；优选地，y为5，7，9。
其中，所述含氟烷基链与树形高分子之间的连接键R2为-S-S-。
其中，R3为式(5)所示的聚酰胺-胺树形高分子：
Figure BDA0002273104210000042
式(5)中，
n为1-10之间的整数；优选地，n为3，4，5；
m为4；
M是聚酰胺-胺树形高分子的核心，其结构如式(6)所示：
Figure BDA0002273104210000043
其中，所述树形高分子与含苯硼酸的功能基团之间的连接键R4选自-NH-CH2-、-NH-、-NH-C(＝O)-、-NH-C(＝O)-O-、-NH-C(＝O)-NH-或-NH-C(＝S)-NH-。
本发明还提供了所述含苯硼酸修饰的含氟高分子材料在蛋白质胞内递送中的应用。
其中，所述含苯硼酸修饰的含氟高分子材料如式(1)-式(3)所示，其作为蛋白质胞内递送的载体。所述蛋白质胞内递送是将蛋白质由细胞外递送到细胞内。
其中，所述蛋白质包括但不限于牛血清白蛋白(BSA)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)、辣根过氧化物酶(HRP)、胰蛋白酶(Trypsin)、核糖核酸酶A(RNase A)和皂角素(saporin)等。
本发明还提供了一种蛋白质胞内递送载体，其化学结构为如式(1)-式(3)所示的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料。
本发明还提供一种新的复合物，其包括如式(1)-式(3)所示的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料和蛋白质；在该复合物中，由所述高分子材料携带所述蛋白质。
其中，所述蛋白质包括但不限于牛血清白蛋白(BSA)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)、辣根过氧化物酶(HRP)、胰蛋白酶(Trypsin)、核糖核酸酶A(RNase A)和皂角素(saporin)等。
本发明还提供所述复合物在蛋白质胞内递送中的应用。
本发明还提供所述复合物在蛋白质治疗中的应用。
其中，所述蛋白质包括但不限于牛血清白蛋白(BSA)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)、辣根过氧化物酶(HRP)、胰蛋白酶(Trypsin)、核糖核酸酶A(RNase A)和皂角素(saporin)等。
本发明的有益效果在于：本发明提出的蛋白质胞内递送方法具有较高的胞内递送效率，效率远高于商业化蛋白质转染试剂Pulsin；通过β-Gal、HRP、Trypsin和RNase A等酶类蛋白质的活性检测发现本发明递送到细胞内的蛋白质仍保持生物活性。通过RNase A、Trypsin和saporin等具有细胞毒性的蛋白质的递送，发现本发明将毒性蛋白质递送到HeLa或MDA-MB-231等癌细胞后具有明显的细胞毒性；通过细胞毒性实验发现本发明提供的含苯硼酸修饰的含氟高分子载体其本身具有低细胞毒性，在蛋白质递送的实验条件下细胞的存活率高于90％，具有良好的生物相容性。本发明提出的蛋白质胞内递送载体不需要对蛋白质分子进行任何生物或化学修饰，递送效率高，材料细胞毒性小，被递送蛋白质的生物学功能能够得到有效维持。
附图说明
图1为本发明实施例1中含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP向HeLa细胞内递送荧光素标记的牛血清白蛋白(BSA-FITC)的效率，及其与商品化试剂Pulsin以及未加材料的BSA-FITC的比较；其中，图1(a)为FDP/BSA-FITC复合物、pulsin/BSA-FITC复合物以及未加载体的BSA-FITC处理HeLa细胞4小时后的荧光照片；图1(b)为以上三组实验对应的细胞的流式统计结果。
图2为本发明实施例1中含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP与蛋白质形成复合物的透射电镜和动态光散射表征。
图3为本发明实施例1中含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP及与蛋白质的复合物在3T3细胞中的毒性检测；其中，图3(a)为FDP自身在不同浓度条件下的对HeLa细胞的毒性；图3(b)为FDP与BSA的复合物在不同的FDP浓度条件下对HeLa细胞的毒性。
图4为本发明实施例1中含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP向HeLa细胞内递送带正电荷的红色荧光标记的胰蛋白酶(Trypsin-RBITC)和绿色荧光标记的核糖核酸酶A(RNase A-FITC)的效果图。
图5为本发明实施例1中含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP向HeLa细胞内递送β-半乳糖苷酶(β-Gal)的效果图，其中，图5(a)为β-Gal染色试剂盒处理后的FDP/β-Gal复合物及β-Gal自身转染的HeLa细胞的照片；图5(b)为β-Gal定量检测试剂盒对HeLa细胞中β-Gal相对活性的检测结果。
图6为本发明实施例1中含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP向HeLa细胞内递送辣根过氧化物酶(HRP)的效果图。
图7为本发明实施例1中含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP向MDA-MB-231细胞内递送皂角素的细胞毒性图。
图8为本发明实施例1中含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP向HeLa细胞递送胰蛋白酶(图8a)和核糖核酸酶A(图8b)的细胞毒性图。
图9为本发明实施例1中含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP在HeLa细胞递送BSA-FITC对于谷胱甘肽的响应性，通过FDP在经过谷胱甘肽抑制剂或谷胱甘肽诱导剂处理的HeLa细胞中对于BSA-FITC的递送效率相对于未经诱导剂或抑制剂的HeLa细胞中BSA-FITC的递送效率的百分比来表示。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1：含苯硼酸修饰的含氟高分子材料的合成。
在一个具体的实施例中，含苯硼酸修饰的含氟高分子材料的制备方法为：将4-溴甲基苯硼酸与二硫键为核、氨基末端的第5代聚酰-胺胺树形高分子按照摩尔比128∶1加入二甲亚砜溶液中，70℃加热反应24小时，在去离子水中充分透析，真空干燥机冻干，得到苯硼酸修饰的树形高分子。通过1H NMR核磁共振表征苯硼酸在树形高分子表面的连接效率，根据树形高分子和苯硼酸的积分面积计算平均每一个树形高分子表面连接的苯硼酸的数量。根据计算结果，苯硼酸的平均连接条数为34(如式(7)所示)。
Figure BDA0002273104210000071
式(7)中，R3为第5代聚酰胺-胺树形高分子，其结构如式(8)所示：
Figure BDA0002273104210000072
式(9)中，M是树形高分子的核心，其结构如式(6)所示：
Figure BDA0002273104210000073
将上述苯硼酸修饰的树形高分子与TCEP(摩尔比1∶50)在PBS溶液中反应6小时，使树形高分子核心的二硫键充分还原，蒸馏水透析除去TCEP，得到苯硼酸修饰的dendron(如式(9)所示)，将其与巯基被保护的十七氟-1-癸硫醇(如式(11)所示)在乙腈∶水为1∶1的溶剂中反应24小时，旋转蒸发除去大部分溶剂，将样品冻干后用水溶解，二氯甲烷萃取三次除去未反应的含氟烷基链，将水相产物旋转蒸发除去大部分溶剂后冻干定量，得到目标产物，根据1H NMR核磁共振表征连接在树形高分子核心的含氟烷基链的数量，计算结果表明含氟烷基链与树形高分子之间的摩尔比为1∶1，将该含苯硼酸修饰的含氟高分子材料命名为FDP，其结构式如式(12)所示。
Figure BDA0002273104210000081
式(9)中，R3/2为核心部位二硫键被还原的第5代聚酰胺-胺树形高分子，其结构如式(10)所示：
Figure BDA0002273104210000082
实施例2：含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP对蛋白质的胞内递送效率。
以异硫氰酸荧光素(FITC)标记的牛血清白蛋白(BSA)作为模型蛋白(BSA-FITC)，在HeLa细胞上评估所制备的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料的递送效率。
具体方法如下：将HeLa细胞接种到48孔板中培养过夜，待细胞密度达到80％开始蛋白质递送实验。将模型蛋白BSA-FITC与本发明实施例1制备的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP充分混合后得到蛋白质复合物FDP/BSA-FITC，加入50μL无血清培养基，震荡混匀，室温孵育30分钟。向混合溶液中加入150μL无血清培养基，轻轻吹匀。取出48孔板，移除细胞培养基，用PBS清洗一次，加入含有蛋白质复合物FDP/BSA-FITC的培养基溶液，37℃培养箱孵育4小时。移除含有转染蛋白质复合物FDP/BSA-FITC的培养基，用PBS清洗细胞三次，使用激光共聚焦显微镜观察细胞内的荧光强度和分布，将PBS充分清洗过的细胞用胰酶消化后收集至离心管中，离心后用PBS重悬，使用流式细胞仪定量分析HeLa细胞内的绿色荧光强度。BSA-FITC的剂量为6μg，载体材料FDP的剂量为8μg。
实验结果：图1为本发明实施例1中所得材料FDP在HeLa细胞上递送BSA-FITC的荧光照片和流式细胞仪分析结果，从图1a中可以看出，BSA-FITC由于其自身无法进入细胞，其转染的细胞中几乎没有绿色荧光。而BSA-FITC与FDP的复合物能够有效进入细胞，被转染的细胞中可以观察到均匀的荧光。从图1b中可以看出，BSA-FITC与FDP复合物转染的HeLa细胞中绿色荧光强度显著高于商业化蛋白质转染试剂pulsin和为加任何载体的BSA-FITC。结果表明含苯硼酸修饰的含氟高分子材料能够有效将BSA-FITC递送到HeLa细胞中，其递送效率高于商业化的蛋白质转染试剂pulsin。
实施例3：制备含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP与蛋白质复合物，并利用透射电镜(TEM)和动态光散射(DLS)表征复合物的形貌、尺寸及表面电势。
具体操作方法如下：将含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP与牛血清白蛋白BSA溶液混合均匀得到蛋白质复合物FDP/BSA，室温孵育30分钟，加入去离子水稀释后，取0.7μL稀释液滴在碳膜上，将碳膜表面样品充分干燥，用投射电镜观察转染复合物的形貌；使用纳米粒度仪检测稀释后溶液中纳米颗粒的尺寸分布和表面电势。
实验结果：图2表示本发明实施例1制备的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP与牛血清白蛋白BSA形成的复合物(FDP/BSA)TEM表征的形貌和DLS表征的尺寸分布、表面电势。结果表明，本发明实施例1制备的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP能与蛋白质形成尺寸约为200nm的均匀的圆球形的纳米复合物，该复合物的表面电势为正。
实施例4：含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP及其与蛋白质复合物的细胞毒性评价。
利用MTT法检测本发明实施例1制备的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP及其与蛋白质复合物在不同材料浓度条件下对细胞产生的毒性。
具体操作方法如下：将3T3细胞接种到96孔板中培养过夜。待细胞密度达到80％，移除培养基，加入100μL含不同FDP浓度(10μg/mL-50μg/mL)的FDP/BSA复合物或单独的FDP的无血清培养基溶液，4小时后移除含有FDP/BSA复合物或FDP的培养基，更换含10％血清的新鲜培养基，继续培养20小时。按照标准的MTT法检测细胞的存活率。每组实验分别检测五个重复样品。
实验结果：如图3所示，本发明实施例1制备的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP及其与蛋白质复合物FDP/BSA处理的3T3细胞在递送实验浓度(40μg/mL)条件下的存活率都高于90％。表明本发明制备的苯硼酸修饰的含氟高分子材料对细胞的毒性较低，并且在蛋白质递送过程中也没有对细胞产生明显的毒性，说明本发明制备的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP具有较好的生物相容性。
实施例5：含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP向HeLa细胞内递送荧光标记的正电荷蛋白质。
胰蛋白酶(Trypsin，24.0kDa，等电点10.5)和核糖核酸酶A(RNase A，13.7kDa，等电点9.6)为生理条件下表面电势为正的蛋白质。在蛋白质表面分别标记红色荧光(RBITC)和绿色荧光(FITC)，通过观察蛋白质递送实验结束后细胞内的荧光，评估本发明制备的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP在HeLa细胞上的递送正电荷蛋白质的效率。
具体方法如下：将HeLa细胞接种到48孔板中培养过夜，待细胞密度达到80％开始蛋白质递送实验。将两种正电荷蛋白质Trypsin-RBITC和RNase A-FITC分别与FDP充分混合分别得到含有蛋白质复合物FDP/Trypsin-RBITC和FDP/RNase A-FITC，加入50μL无血清培养基，震荡混匀。Trypsin-RBITC和RNase A-FITC的剂量分别为每孔1μg和2μg，FDP的剂量为每孔8μg。室温孵育30分钟后，向混合溶液加入150μL无血清培养基。移除孔板中的细胞培养基，用PBS清洗一次后，分别加入上述250μL含有蛋白质复合物FDP/Trypsin-RBITC和FDP/RNase A-FITC的培养基溶液，37℃培养箱孵育4小时。使用激光共聚焦显微镜观察细胞内的荧光强度和分布。
实验结果：图4为本发明制备的材料FDP在HeLa细胞上递送两种荧光标记的正电荷蛋白质的激光共聚焦显微镜观察的细胞荧光图片，从图4中可以看出，经FDP/Trypsin-RBITC和FDP/RNase A-FITC复合物处理的HeLa细胞中分别观察到了均匀的荧光，表明本发明制备的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP可以高效的递送正电荷蛋白质。
实施例6：含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP向HeLa细胞内递送β-半乳糖苷酶(β-gal)。
β-半乳糖苷酶(β-gal，430kDa，等电点5.0))为分子量较大的酶。可以通过检测递送到细胞内的酶的活性评估材料递送蛋白质的效率。利用β-半乳糖苷酶原位染色试剂盒和酶活检测试剂盒评估本发明制备的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP在HeLa细胞上的递送β-gal的效率。
具体方法如下：将HeLa细胞接种到48孔细胞培养板中培养过夜，待密度达到80％开始蛋白质递送实验。将β-gal与FDP充分混合后得到含有蛋白质复合物FDP/β-gal，加入50μL无血清培养基，震荡混匀，室温孵育30分钟后，加入150μL无血清培养基轻轻吹匀。取出48孔板，移除细胞培养基，用PBS清洗一次后，加入上述250μL含有蛋白质复合物FDP/β-gal的培养基溶液，放入37℃培养箱培养。β-gal的剂量为每孔5μg，FDP的剂量为每孔8μg。4小时后移除培养基，将细胞用PBS清洗三次，使用β-gal原位染色试剂盒和酶活检测试剂盒，分别对细胞进行染色和检测细胞内的β-gal的酶活水平，评估FDP递送β-gal的效率，所有步骤按照试剂盒手册操作。使用光学显微镜观察细胞的染色，使用酶标仪检测细胞裂解液与β-gal底物反应后的溶液吸光度。
实验结果：如图5所示，使用β-gal原位染色试剂盒对HeLa细胞染色(5a)后可以看到FDP与β-gal复合物处理的HeLa细胞具有明显的深色沉淀，而单独的酶处理的细胞观察不到蓝色。酶活检测试剂盒检测细胞内β-gal的酶活结果(5b)表明，发明制备的材料FDP递送到细胞内的酶的活性保持在98％以上。以上结果表明本发明制备的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP可以高效的递送β-gal进入细胞，并且保持着酶的活性。
实施例7：含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP向HeLa细胞内递送辣根过氧化物酶(HRP)。
辣根过氧化物酶(HRP，40kDa，等电点7.2)为生理条件下表面电势接近中性的蛋白质。利用成熟的Amplex red底物染色法，评估本发明制备的材料FDP在HeLa细胞上的递送HRP的效率。
具体方法如下：将HeLa细胞接种到48孔细胞培养板中培养过夜，待细胞密度达到80％开始蛋白质递送实验。将HRP与FDP充分混合后得到含有蛋白质复合物FDP/HRP，加入50μL无血清培养基，震荡混匀，室温孵育30分钟后，加入150μL无血清培养基。取出48孔板，移除细胞培养基，用PBS清洗一次后，加入上述250μL含有蛋白质复合物FDP/HRP的培养基溶液，37℃培养箱培养。HRP的剂量为每孔6μg，FDP的剂量为每孔8μg。4个小时后移除培养基，用PBS清洗细胞三次，加入含有酶底物Amplex Red(50μM)和双氧水(500μM)的PBS溶液。室温孵育30分钟后，移除底物溶液，用PBS清洗细胞三次，使用激光共聚焦显微镜观察细胞内的荧光强度和分布。
实验结果：如图6所示的利用无色底物Amplex Red对递送了HRP的HeLa细胞原位染色观察细胞内的荧光。本发明制备的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP递送HRP的细胞具有明显的红色荧光。结果表明本发明制备的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP可以高效的递送HRP进入细胞，并且保持着酶的活性。
实施例8：含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP向MDA-MB-231细胞内递送毒性蛋白质皂角素(saporin)
皂角素(saporin，32.8kDa，等电点9.3)，进入细胞后能特异性的使核糖体失活，从而对细胞产生毒性。通过MTT法检测本发明制备的材料FDP递送saporin后的MDA-MB-231细胞的存活率，评估FDP对毒性蛋白质的细胞内递送效率。
具体方法如下：将MDA-MB-231细胞接种到96孔细胞培养板中过夜。将saporin与FDP充分混合后得到含有蛋白质复合物FDP/saporin，加入无血清培养基，震荡混匀。待室温孵育30分钟后，向混合溶液加入无血清培养基。取出96孔板，移除细胞培养基，用PBS清洗一次后，加入上述250μL含有蛋白质复合物FDP/saporin的培养基溶液，37℃培养箱孵育6小时。移除培养基，加入10％血清的培养基，继续培养42小时。最后使用标准的MTT法检测被处理后的细胞存活率。每组实验重复5个样品。
实验结果：如图7所示的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP在MDA-MB-231细胞上递送不同浓度saporin的细胞存活率。随着saporin浓度的提高，本发明制备的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP与saporin复合物处理的细胞存活率出现明显的下降，在0.5μg/mL的浓度时，细胞存活率接近20％。而相同实验条件下，单独saporin或单独的本发明制备的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP处理的细胞则检测不到明细的细胞毒性，细胞存活率接近100％。结果表明本发明制备的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP可以高效的递送saporin进入MDA-MB-231细胞，并且维持saporin的生物学活性。
实施例9：含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP向HeLa细胞内递送毒性蛋白质胰蛋白酶(Trypsin)和核糖核酸酶A(RNase A)。
胰蛋白酶(Trypsin，24.0kDa，等电点10.5)进入细胞后能降解细胞内的蛋白质，从而对细胞产生毒性。核糖核酸酶A(RNase A，13.7kDa，等电点8.6)进入细胞后能降解细胞内的核糖核酸，从而对细胞产生毒性。利用MTT法检测本发明制备的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP递送Trypsin和RNase A后的HeLa细胞的细胞存活率，评估毒性蛋白质的细胞内递送效率，证明毒性蛋白质在被递送过程中其生物活性的维持。
具体方法如下：将HeLa细胞接种到96孔细胞培养板中过夜。将Trypsin或RNase A与FDP充分混合后分别得到含有蛋白质复合物FDP/Trypsin和FDP/RNase A，加入无血清培养基震荡混匀。室温孵育30分钟后，向混合溶液中继续补加无血清培养基。取出96孔板，移除细胞培养基，用PBS清洗一次后，分别加入上述250μL含有蛋白质复合物FDP/Trypsin和FDP/RNase A的培养基溶液，37℃培养箱孵育6小时。移除培养基，加入含10％血清的新鲜培养基，继续培养42小时。使用标准的MTT法检测递送Trypsin或RNase A后的HeLa细胞的存活率。每组实验重复5个样品。
实验结果：图8a显示用本发明制备的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP与Trypsin的复合物处理的HeLa细胞48小时后，其存活率为38％。而相同实验条件下，单独Trypsin或单独的本发明制备的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP处理的细胞则没有明显的毒性，细胞存活率在90％以上。图8b显示用本发明制备的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP与RNase A的复合物处理的HeLa细胞的存活率接近50％。而相同实验条件下，单独RNase A或单独的FDP处理的细胞则检测不到明细的细胞毒性，细胞存活率接近100％。结果表明本发明制备的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP可以高效的递送Trypsin和RNase A进入细胞，并且在递送过程中Trypsin和RNase A保持了其生物学活性。
实施例10：含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP在蛋白质递送过程中对还原性谷胱甘肽(GSH)的响应性。
本发明制备的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP，其结构中的含氟烷基链通过二硫键连接在树形高分子的核心，二硫键在还原性谷胱甘肽存在的条件下易发生断裂，从而使得转染复合物的平衡被打破，复合物中蛋白质被释放出来。研究表明，大部分癌细胞高表达还原性谷胱甘肽，FDP的这一性质可以提高其在癌细胞中对于被递送的蛋白质分子的释放能力，从而提高其对于癌细胞的蛋白质递送效率。通过使用谷胱甘肽诱导剂和谷胱甘肽抑制剂对细胞进行预处理，分别提高和降低细胞中还原性谷胱甘肽的含量，检测材料对于蛋白质的胞内递送效率，评估所制备的材料FDP对于细胞内还原性谷胱甘肽的响应性。
具体方法如下：将HeLa细胞接种到48孔细胞培养板中培养过夜，待细胞密度达到80％开始蛋白质递送实验。于蛋白质递送实验前12小时，取出细胞培养板，将细胞用PBS清洗一次，加入谷胱甘肽抑制剂丁硫氨酸-亚砜亚胺(BSO)，于蛋白质递送实验前2小时，取出细胞培养板，用PBS清洗一次，加入谷胱甘肽诱导剂谷胱甘肽乙酯(GSH-OET)。将本发明实施例1制备的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP对未加任何抑制剂或诱导剂的细胞的蛋白质递送效率设为100％。
将BSA-FITC与本发明实施例1制备的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP充分混合后得到蛋白质复合物FDP/BSA-FITC，加入50μL无血清培养基，震荡混匀，室温孵育30分钟后，加入150μL无血清培养基。取出48孔板，移除细胞培养基，用PBS清洗一次后，加入含有蛋白质复合物FDP/BSA-FITC的培养基溶液，37℃培养箱培养。4个小时后移除培养基，用PBS清洗细胞三次，将细胞用胰酶消化后收集至离心管中，离心后用PBS重悬，使用流式细胞仪定量分析HeLa细胞内的绿色荧光强度。BSA-FITC的剂量为6μg，载体材料FDP的剂量为8μg。
实验结果：图9为本发明实施例1中所得材料FDP在经过BSO或GSH-OET处理过的HeLa细胞上递送BSA-FITC的流式细胞仪分析结果。结果表明，在谷胱甘肽含量较低的细胞中，本发明实施例1制备的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP对于蛋白质的胞内递送效率显著下降，而在谷胱甘肽含量较高的细胞中，本发明实施例1制备的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP对于蛋白质的胞内递送效率会得到明显提升。证明本发明所制备的苯硼酸修饰的含氟高分子材料FDP作为蛋白质胞内递送载体其对于蛋白质的递送过程具有谷胱甘肽响应性。
如上所述仅为本发明的几个具体实施例，并不用于限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，采用与其相同或相似方法所得到的可调控药物精准释放的基于介孔二氧化硅的药物递送系统用于癌症治疗，均在本发明保护范围内。

Claims (10)

1.一种含苯硼酸修饰的含氟高分子材料，其特征在于，包括树形高分子、含苯硼酸的功能基团和含氟烷基链，所述含苯硼酸的功能基团通过共价键连接在树形高分子表面；所述含氟烷基链通过二硫键连接在所述树形高分子核心；所述含苯硼酸修饰的含氟高分子的结构如式(1)-式(3)所示：
Figure FDA0002273104200000011
式(1)-式(3)中，
R1为所述含氟烷基链；
R2为所述含氟烷基链与所述树形高分子之间的连接键；
R3为所述树形高分子；
R4为所述树形高分子与所述含苯硼酸的功能基团之间的连接键；
R5、R6、R7、R8为化学官能团，分别独立地选自H、卤素、C1-C5烷基、C1-C5烷氧基、硝基；
X为含苯硼酸的功能基团的连接数，为1-128之间的整数。
2.如权利要求1所述的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料，其特征在于，所述含氟烷基链R1为如式(4)所示的含氟烷基单链：
Figure FDA0002273104200000021
其中，y为1-20之间的整数。
3.如权利要求1所述的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料，其特征在于，所述含氟烷基链与树形高分子之间的连接键R2为-S-S-。
4.如权利要求1所述的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料，其特征在于，所述树形高分子R3为如式(5)所示的聚酰胺-胺树形高分子：
Figure FDA0002273104200000022
式(5)中，
n为1-10之间的整数；
m为4；
M是所述聚酰胺-胺树形高分子的核心，其结构如式(6)所示：
Figure FDA0002273104200000023
5.如权利要求1所述的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料，其特征在于，所述树形高分子与所述含苯硼酸的功能基团之间的连接键R4选自-NH-CH2-、-NH-、-NH-C(＝O)-、-NH-C(＝O)-O-、-NH-C(＝O)-NH-或-NH-C(＝S)-NH-。
6.如权利要求1-5之任一项所述的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料在蛋白质胞内递送中的应用。
7.一种蛋白质胞内递送载体，其特征在于，其化学结构为如权利要求1-5之任一项中所述的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料。
8.一种复合物，其特征在于，其包括含有权利要求1-5之任一项所述的含苯硼酸修饰的含氟高分子材料以及蛋白质，由所述高分子材料携带所述蛋白质。
9.如权利要求8所述的复合物在蛋白质胞内递送和/或蛋白质治疗中的应用。
10.如权利要求8所述的复合物或如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述蛋白质包括牛血清白蛋白BSA、β-半乳糖苷酶β-Gal、辣根过氧化物酶HRP、胰蛋白酶Trypsin、核糖核酸酶A RNase A和皂角素saporin。
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