CN108503845A - 带有儿茶酚配体的两亲性接枝聚合物及其合成方法和应用 - Google Patents

带有儿茶酚配体的两亲性接枝聚合物及其合成方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了带有儿茶酚配体的两亲性接枝聚合物及其合成方法和应用，本发明是基于带有儿茶酚配体的两亲性接枝聚合物为载体而构建的传递系统。将聚乙二醇接枝到聚（胱胺双丙烯酰胺‑乙二胺）上，再用3,4‑二羟基苯乙酸修饰，合成聚乙二醇‑接枝‑聚（胱胺双丙烯酰胺‑乙二胺）‑3,4‑二羟基苯乙酸（mPEG‑g‑PCD‑DA）。随后包裹阿霉素形成载药纳米胶束，再加入铁离子形成核交联的载阿霉素纳米胶束（DOX‑CCLMs/SS）。该发明的传递系统在血液环境中能够保持稳定，在肿瘤微环境下能实现电荷反转增强细胞内吞，在肿瘤细胞内可以实现还原敏感和pH敏感的药物释放。

Description

带有儿茶酚配体的两亲性接枝聚合物及其合成方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术、纳米医药及新材料领域，具体涉及以带有儿茶酚配体的两亲性接枝聚合物的合成以及应用于在肿瘤微环境下的控制药物释放并增强细胞摄取的智能纳米胶束载体。
背景技术
在肿瘤的化疗中，小分子抗癌药取得了巨大的成功，但也伴随着一些副作用，如选择性差导致全身的毒副作用，限制了其进一步的疗效。纳米药物传递系统为实现化疗药物在肿瘤组织内的定点和控制释放，从而减少对正常组织器官的损伤提供了一个有效途径。智能纳米药物传递系统主要是基于肿瘤组织与人体正常组织的微环境差异，如肿瘤组织具有乏氧、酸性pH值、温度稍高、有大量生长因子及水解蛋白酶以及肿瘤细胞内外理化性质的差异等特点。利用实体瘤的高渗透和长滞留效应(EPR效应)，可使纳米载体药物在肿瘤组织富集，在肿瘤微环境作用下放出抗肿瘤药物“杀死”肿瘤细胞。
载药纳米胶束在血液中长循环时，受到血液的高剪切力和稀释作用，这就会破坏胶束的结构从而使被包裹的药物提前泄露出来，产生毒副作用，降低治疗效果。因此，对于壳-核结构的纳米胶束进行核交联，可以实现在血液中长循环时保持结构稳定。儿茶酚与铁离子的配合物作为一种新的交联方式，正得到越来越多的关注。该配合物在不同pH环境下呈现不同的络合状态：pH>9.1时为六配体；5.6<pH<9.1时为四配体；pH<5.6时为二配体(Biomacromolecules,2015,16,807-814)。这种络合状态的变化正符合从正常血液环境到肿瘤细胞核内体/溶酶体的pH值变化。
发明内容
本发明的目的是为了实现药物的控制释放而提出了一种带有儿茶酚配体的两亲性接枝聚合物，以该接枝聚合物构筑的载药胶束在体内长效循环时可以保留绝大多数小分子药物以减少药物泄露，到达肿瘤组织后发生电荷反转增加细胞摄取，到达肿瘤细胞内实现可控的药物释放。因此，本发明制备的接枝聚合物可以用于构筑纳米胶束，具有较低的细胞毒性，良好的细胞吞噬性和可控的释药性质。
本发明的目的是这样实现的：
一种带有儿茶酚配体的两亲性接枝聚合物，该聚合物具有式(I)结构：
式(I)中，q＝40-120；x/y＝3/7～2/8。
其中，mPEG的结构式如式(i)所示：
其中，PCD的结构式如式(2)所示：
其中，DA的结构式如式(3)所示：
本发明还提出了一种带有儿茶酚配体的两亲性接枝聚合物的合成方法，该方法包括以下步骤：
步骤1：N-叔丁氧羰基乙二胺(1当量)和N,N'-双(丙稀酰)胱胺(1当量)溶解在甲醇/水(9/1～8/2，v/v)的混合溶剂中。反应避光且氮气保护，在60-70℃下反应4-6天。随后加入过量10％-20％的N-叔丁氧羰基乙二胺继续反应2-24h以消耗未反应的碳碳双键；反应结束，减压除去溶剂，加入DCM/TFA(1/1～1/2,v/v)混合溶液，室温搅拌2-4h以脱去保护基；反应液滴加到过量的乙醚中，重复3-5次；过滤得到的固体用去离子水溶解，去离子水透析24h(MWCO:1000)，冻干得白色固体。
步骤2：聚(N,N'-双(丙稀酰)胱胺-乙二胺)(1当量胺基)和聚乙二醇单甲醚活化酯(0.125倍当量)溶解在DMF，再加入2当量DIPEA；室温搅拌，反应过夜；3，4-二羟基苯乙酸(2当量)，DCC(3当量)和NHS(2.4倍当量)溶解在DMF中，氮气保护，避光室温反应1-4h；随后，将该反应液加入到聚(N,N'-双(丙稀酰)胱胺-乙二胺)和聚乙二醇单甲醚活化酯的反应中，室温继续反应12-24h。反应液过滤，除去白色固体。滤液浓缩，乙醚沉淀3-5次；随后，用去离子水透析(MWCO:3500)48h；冷冻干燥得棕色固体。
本发明还提出了根据上述方法制备的带有儿茶酚配体的两亲性接枝聚合物，所述接枝聚合物结构如式(I)所示。
本发明进一步提出了将所述带有儿茶酚配体的两亲性接枝聚合物用于制备药物载体的应用。
其中，所述药物为脂溶性药物。优选地，所述脂溶性药物包括阿霉素、吉西他滨、SN38或紫杉醇。
其中，所述载体为核交联纳米胶束载体，优选地，所述核交联纳米胶束载体为还原敏感和pH敏感型。
其中，所述核交联纳米胶束载体用于在肿瘤细胞内的控制药物释放。
其中，所述肿瘤细胞为肺癌细胞。
其中，所述核交联纳米胶束载体的结构示意图如图1所示。
本发明利用二硫键对谷胱甘肽(GSH)的还原敏感性和儿茶酚配体与铁离子络合的pH响应性，构建还原敏感和pH响应的核交联载阿霉素胶束药物(DOX-CCLMs/SS)。研究DOX-CCLMs/SS对肿瘤微环境响应行为及可控的释药过程，评价其体外毒性及抗肿瘤活性。该过程具体可描述为：DOX-CCLMs/SS经长效循环充分实现EPR效应后富集于肿瘤组织；由三级胺引起的电荷反转促进肿瘤细胞摄取载药纳米胶束；进入核内体/溶酶体后，在低pH和高浓度GSH下，胶束快速解体释放出被包裹的药物。
本发明所涉及的带有儿茶酚配体的两亲性接枝聚合物的结构及核交联载阿霉素纳米胶束DOX-CCLMs/SS示意图如图1所示，实施步骤如下：
第一步：带有儿茶酚配体的两亲性接枝聚合物的合成
步骤1：N-叔丁氧羰基乙二胺(1当量)和N,N'-双(丙稀酰)胱胺(1当量)溶解在甲醇/水(9/1～8/2，v/v)的混合溶剂中。反应避光且氮气保护，在60-70℃下反应4-6天。随后加入过量10％-20％的N-叔丁氧羰基乙二胺继续反应2-24h以消耗未反应的碳碳双键；反应结束，减压除去溶剂，加入DCM/TFA(1/1～1/2,v/v)混合溶液，室温搅拌2-4h以脱去保护基。反应液滴加到过量的乙醚中，重复3-5次。过滤得到的固体用去离子水溶解，去离子水透析24h(MWCO:1000)，冻干得白色固体。
步骤2：聚(N,N'-双(丙稀酰)胱胺-乙二胺)(1当量胺基)和聚乙二醇单甲醚活化酯(0.125倍当量)溶解在DMF，再加入2当量DIPEA。室温搅拌，反应过夜；3，4-二羟基苯乙酸(2当量)，DCC(3当量)和NHS(2.4倍当量)溶解在DMF中，氮气保护，避光室温反应1-4h。随后，将该反应液加入到聚(N,N'-双(丙稀酰)胱胺-乙二胺)和聚乙二醇单甲醚活化酯的反应中，室温继续反应12-24h。反应液过滤，除去白色固体。滤液浓缩，乙醚沉淀3-5次。随后，用去离子水透析(MWCO:3500)48h。冷冻干燥得棕色固体。
第二步：双敏感核交联纳米胶束系统的构筑及表征
用纳米沉淀法制备CCLMs/SS胶束及核交联载阿霉素胶束DOX-CCLMs/SS，测定其临界胶束浓度；用透射电镜(TEM)观测其形貌，用动态光散射仪(DLS)测定粒径大小及分布；用紫外吸收法测定载药胶束的包封率和载药量。
第三步：CCLMs/SS纳米胶束的还原降解性和pH响应性能
用DLS测定CCLMs/SS在模拟正常血液环(pH 7.4，20μM DTT)境和肿瘤微环境(pH6.0，20μM DTT；pH 5.0，2mM DTT)下的散射光强度和粒径变化，动态地检测其降解情况。在pH 7.4，6.0和5.0条件下，用紫外分光光度计测定其在400-700nm的吸收。
第四步：DOX-CCLMs/SS释药性能
测定载药胶束DOX-CCLMs/SS的释药性能。
第五步：DOX-CCLMs/SS纳米胶束的细胞吞噬
研究DOX-CCLMs/SS对肺癌细胞的吞噬行为，在模拟肿瘤组织微环境条件下培养2h后，用流式细胞仪测量细胞吞噬DOX的荧光值。
第六步：DOX-CCLMs/SS的细胞毒性研究
噻唑蓝(MTT)比色法检测含二硫键和不含二硫键的核交联载阿霉素胶束药物，在含有或不含有40mM NH4Cl的培养条件下对A549细胞毒性。
本发明的有益效果：提供了一种还原敏感和pH响应的核交联载阿霉素胶束药物，实现了在血液环境中稳定存在且有效保护所载药物，可以在肿瘤组织细胞外环境增强细胞内吞，到达肿瘤细胞核内体/溶酶体环境可以实现还原和pH触发释药，从而实现对肿瘤细胞的杀伤作用。
附图说明
图1为载阿霉素核交联纳米胶束DOX-CCLMs/SS示意图；
图2为mPEG-g-PCD-DA的1H NMR谱图；
图3为CCLMs/SS纳米胶束的粒径分布(DLS图)及形貌图(TEM图)；
图4为mPEG-g-PCD-DA纳米胶束在不同环境中的还原降解的散射光强(SLI)变化图(A)；在pH 5.0，2mM DTT环境下的粒径分布变化图(B)；
图5为CCLMs/SS纳米胶束在不同pH下的紫外吸收谱图；
图6为CCLMs/SS纳米胶束在不同条件下的释药图；
图7为A549细胞在不同pH条件下对载药胶束的吞噬行为的DOX荧光强度
与pH 7.4条件下荧光强度比值统计图；
图8为空白胶束载体对A549细胞毒性(A)；DOX-CCLMs/SS对A549细胞毒性(B)。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1
mPEG-g-PCD-DA的合成
步骤1：N-叔丁氧羰基乙二胺(3.2g,0.02mol)和N,N'-双(丙稀酰)胱胺(5.2g,0.02mol)溶解在20mL甲醇/水(9/1，v/v)的混合溶剂中。反应避光且氮气保护，在60℃下反应4天。随后加入过量10％的N-叔丁氧羰基乙二胺继续反应1天以消耗未反应的碳碳双键；反应结束，减压除去溶剂，加入16mL DCM/TFA(1/1,v/v)混合溶液，室温搅拌2h以脱去保护基。反应液滴加到过量的乙醚中，重复3次。过滤得到的固体用去离子水溶解，去离子水透析24h(MWCO:1000)，冻干得白色固体。所述聚(N,N'-双(丙稀酰)胱胺-乙二胺)的结构式如式(2)所示；
步骤2：聚(N,N'-双(丙稀酰)胱胺-乙二胺)(1.0g,3mmol-NH2)和聚乙二醇单甲醚活化酯(0.81g,0.375mmol)溶解在20mL DMF，再加入1mL DIPEA。室温搅拌，反应过夜；3，4-二羟基苯乙酸(1.01g，6mmol)，DCC(1.85g，9mmol)和NHS(0.83g，7.2mmol)溶解在10mL DMF中，氮气保护，避光室温反应4h。随后，将该反应液加入到聚(N,N'-双(丙稀酰)胱胺-乙二胺)和聚乙二醇单甲醚活化酯的反应中，室温继续反应过夜；反应液过滤，除去白色固体。滤液浓缩，乙醚沉淀3次。随后，用去离子水透析(MWCO:3500)48h。冷冻干燥得棕色固体。所述mPEG-g-PCD-DA的结构式如式(I)所示；
如图2所示,峰a代表儿茶酚结构的特征峰，峰b代表PEG，峰c代表聚(N,N'-双(丙稀酰)胱胺-乙二胺)的特征峰。通过对特征峰的积分得出PEG与儿茶酚的比例为3:7。
实施例3
对照聚合物mPEG-g-PHD-DA的合成
除原料用1，6-己二胺外，其余合成步骤及反应物料配比同mPEG-g-PCD-DA的合成。
所述mPEG-g-PHD-DA的结构式如式(II)所示；
实施例4
CCLMs/SS胶束的组装
称取mPEG-g-PCD-DA固体20mg溶解在2mL DMSO中，搅拌下，用微量进样泵缓慢将其注入20mL去离子水中。随后用去离子水透析，除去DMSO。搅拌下，再以儿茶酚基团比铁离子的摩尔比为2:1的比例加入FeCl3溶液(40mM)。搅拌1h后，用0.25M NaOH溶液调节pH值到7.4。随后去离子水透析除去未络合的铁离子得CCLMs/SS溶液。如图3A所示，DLS测得其平均粒径约为121nm。如图3B所示，TEM观察其为球形形貌。
实施例5
DOX-CCLMs/SS的制备
取100mg mPEG-g-PCD-DA聚合物和20mg DOX·HCl溶于2mL的DMSO，加入40μL三乙胺，室温避光搅拌2h。然后，将DMSO溶液转移到MWCO 3500的透析袋中，避光，用去离子水透析24h除去DMSO和游离的DOX。接着用0.45μm的微孔滤膜过滤除去DOX聚集体。再加入40mMFeCl3溶液(儿茶酚基团：Fe3+＝2:1)，用1M NaOH溶液调节pH值至7.4。室温搅拌30min后，透析除去未络合的铁离子。得到核交联的载药胶束(DOX-CCLMs/SS)溶液，并定容储存于4℃冰箱中待用。取5mL未交联的载阿霉素胶束，冷冻干燥，用于测定其载药量(DLC)和包封率(DLE)。
芘荧光探针法测定其临界胶束浓度(CMC)，称取一定量芘溶解于乙醇中，室温下让乙醇挥发，配置上述胶束浓度范围从1.0×10-6到0.01mg/mL，分别加入含有芘的玻璃小瓶中，芘的浓度固定在6×10-7mg/mL，用荧光分光光度计测得各浓度下荧光值，计算出临界胶束浓度为0.08mg/L。
用紫外吸收法测定其载药量(DLC)和包封率(DLE)，将未交联的载阿霉素胶束粉末溶于DMSO中，测定其在480nm处的紫外吸收值，与DOX的标准工作曲线对照，计算得载药量和包封率分别为11％和62％。
载药量(DLC％)＝(胶束中DOX的质量/聚合物的质量)×100％
包封率(DLE％)＝(胶束中DOX的质量/DOX投料的质量)×100％。
所述核交联载阿霉素纳米胶束DOX-CCLMs/SS的示意图如图1所示。
实施例6
mPEG-g-PCD-DA接枝聚合物及mPEG-g-PCD-DA胶束的还原降解性能
用pH 7.4含20μM DTT的磷酸缓冲溶液，pH6.0含20μM DTT的磷酸缓冲溶液和pH5.0含2mM DTT的醋酸缓冲溶液分别模拟正常血液环境，肿瘤组织细胞外环境和肿瘤细胞内核内体/溶酶体环境，并用这三种缓冲液配置0.5mg/mL胶束溶液，37℃下震荡，并在不同的时间点分别用DLS测试样品的散射光强(SLI)和粒径分布。如图4A所示，模拟血液环境(pH7.4，20μM DTT)和模拟肿瘤组织微环境(pH 6.0，20μM DTT)中胶束散射光强度(SLI)变化较小；模拟肿瘤细胞核内体/溶酶体环境(pH 5.0，2mM DTT)中胶束SLI随着时间逐渐降低。如图4B所示，在模拟肿瘤细胞核内体/溶酶体环境中，胶束粒径分布随着时间逐渐变宽，最后变为一个4nm峰和一个450nm峰。
实施例7
核交联纳米胶束的pH响应性能
以儿茶酚基团比铁离子为2:1的比例，向mPEG-g-PCD-DA的胶束溶液中滴加40mM的铁离子溶液。搅拌30min后，用0.5M NaOH溶液调节溶液的pH值分别为5.0，7.4和10.0，用紫外分光光度计测试三个样品在400-700nm的吸收。如图5所示，其在pH5.0，7.4和10.0下的吸收峰分别为592nm，540nm和478nm。
实施例8
DOX-CCLMs/SS在不同条件下的释药行为
DOX-CCLMs/SS及不含二硫键的对照组DOX-CCLMs/CC(1mg/mL)各1mL分别装入透析袋(MWCO 1000)，并分别沉浸在模拟正常血液环境(pH 7.4，20μM DTT)，肿瘤细胞外环境(pH6.0，20μM DTT)和肿瘤细胞内核内体/溶酶体环境(pH 5.0，2mM DTT)中。在一定时间点取出透析液，用紫外分光光度计测定各组的吸光度，与标准曲线对照，并计算出各组释药量。如图6所示，在pH7.4，20μM DTT介质和pH 6.0，20μM DTT介质中，药物释放速度较慢，而在pH5.0，2mM DTT介质中，药物释放较快，42h累积释放量达到52.4％；对照组在pH 5.0，2mM DTT介质中42h累积释放量为32.9％。
实施例9
DOX-CCLMs/SS纳米胶束的细胞吞噬行为
将处于对数生长期的A549细胞接种在6孔板中(30×104细胞/孔)预培养12h后，吸去原培养基，加入pH分别7.4,6.5和6.0的含DOX-CCLMs的新培养基(DOX浓度10μg/mL)，继续培养2h。PBS(pH7.4)清洗数次，消化后离心收集，用流式细胞仪对各组细胞荧光强度进行测定。如图7所示，随着pH值变小，细胞的荧光强度逐渐增强。
实施例10
DOX-CCLMs/SS的细胞毒性研究
为研究DOX-CCLMs/SS的体外细胞毒性，无二硫键的载药胶束DOX-CCLMs/CC被用做对照实验。细胞培养方法为：将处于对数生长期的A549细胞接种在96孔板中，每孔180μL(3×103细胞/孔)，在37℃，含5％CO2的培养箱中培养12h。细胞贴壁后，吸去原培养基，分别加入180μL含有或不含有40mM NH4Cl的培养基，继续培养2h。按照是否加入NH4Cl，将培养板分成两组，分别加入20μL含有不同浓度DOX的DOX-CCLMs/SS或DOX-CCLMs/CC培养基。继续培养72h后，培养板每孔吸去80μL培养基，加入10μL MTT溶液(5mg/mL)继续培养4h。吸去培养基加入100μL DMSO溶解甲瓒晶体，用酶标仪于570nm波长处测定吸光度(OD值)。测定mPEG-g-PCD-DA核交联胶束和mPEG-g-PHD-DA核交联胶束对A549细胞的毒性的方法同上。细胞存活率计算公式如下：
细胞存活率(％)＝(OD实验组-OD空白组/OD对照组-OD空白组)×100％
如图8A所示，CCLMs/SS和CCLMs/CC都表现出低毒性。如图8B所示，与有NH4Cl培养和DOX-CCLMs/CC相比较，DOX-CCLMs/SS在无NH4Cl条件下细胞毒性明显增高且呈现浓度依赖关系。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims (8)

1.一种带有儿茶酚配体的两亲性接枝聚合物，其特征在于，该聚合物具有式(I)所示结构：
其中：
q＝40～120；
x/y＝3/7～2/8。
2.一种权利要求1所述带有儿茶酚配体的两亲性接枝聚合物的合成方法，其特征在于，该方法包括以下具体步骤：
步骤1：将1当量的N-叔丁氧羰基乙二胺和1当量的N,N'-双(丙稀酰)胱胺溶解在甲醇/水为9～8/1～2，v/v的混合溶剂中；反应避光且氮气保护，在60-70℃下反应4-6天；随后加入过量10％-20％的N-叔丁氧羰基乙二胺继续反应2-24h以消耗未反应的碳碳双键；反应结束，减压除去溶剂，加入DCM/TFA为1/1～2，v/v混合溶液，室温搅拌2-4h以脱去保护基；反应液滴加到过量的乙醚中，重复3-5次；过滤得到的固体用去离子水溶解，去离子水透析24h，冻干得白色固体；
步骤2：将1当量胺基的聚(N,N'-双(丙稀酰)胱胺-乙二胺)和0.125倍当量的聚乙二醇单甲醚活化酯溶解在DMF，再加入2当量DIPEA；室温搅拌，反应过夜；2当量的3，4-二羟基苯乙酸、3当量的DCC和2.4倍当量的NHS溶解在DMF中，氮气保护，避光室温反应1-4h；随后，将该反应液加入到聚(N,N'-双(丙稀酰)胱胺-乙二胺)和聚乙二醇单甲醚活化酯的反应中，室温继续反应12-24h；反应液过滤，除去白色固体；滤液浓缩，乙醚沉淀3-5次；随后，用去离子水透析48h；冷冻干燥得棕色固体即为所述带有儿茶酚配体的两亲性接枝聚合物；具有式(I)结构：
其中：
q＝40～120；
x/y＝3/7～2/8。
3.一种权利要求1所述带有儿茶酚配体的两亲性接枝聚合物用于制备核交联药物载体的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物为脂溶性药物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述脂溶性药物为阿霉素、吉西他滨、SN38或紫杉醇。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物载体为核交联纳米胶束载体。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述核交联纳米胶束载体为还原和pH双酸敏感型。
8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述核交联纳米胶束载体用于可控药物释放。
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