CN108611375B - 含氟高分子在蛋白质和小肽胞内递送中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种如式(1)所示的含氟高分子在蛋白质和小肽胞内递送中的应用，所述含氟高分子包括支化聚乙烯亚胺和含氟烷烃功能基团，所述含氟烷烃功能基团共价连接在支化聚乙烯亚胺上；所述的含氟高分子可以作为蛋白质和/或小肽的转染载体。本发明提供的含氟高分子作为蛋白质和小肽胞内递送载体的方法可以达到高转染效率，转染过程中对细胞产生的毒性小，转染后可以保持蛋白质和小肽的生物活性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术、高分子化学、细胞生物学等领域，具体涉及含氟高分子在蛋白质和小肽胞内递送中的应用。
背景技术
蛋白质转染是指将外源蛋白质、小肽等导入细胞，从而实现疾病治疗、生物学研究等目的。当前蛋白质转染的主要挑战在于缺乏高效、安全的转染技术。蛋白质、小肽等分子由于分子量较大、亲水等特点，基因组表达的蛋白质超过70％无法穿过细胞膜屏障，需要借助蛋白质转染技术来实现。现有的蛋白质转染方法主要包括(1)在蛋白质或小肽上修饰穿膜肽；(2)使用载体递送蛋白质或小肽。在蛋白质或小肽上修饰穿膜肽存在转染效率不高，合成方法复杂，化学修饰影响蛋白质/小肽生物活性等问题。另一方面，聚合物、脂质体、金属纳米颗粒等被用于蛋白质和小肽的胞内递送。但是，由于蛋白质、小肽的带电状态不明确，采用这些载体来递送蛋白质时缺乏普适的结合位点，往往仅能适用于特定蛋白质或小肽的胞内递送。如要获得普适的蛋白质载体，则需要对蛋白质或小肽进行化学修饰，如在蛋白质上引入大量负电基团、阴离子聚合物、核酸或其它官能团等。这些化学改性不仅合成复杂，而且往往会影响蛋白质的生物活性及安全性。如何设计高效、安全、无需化学修饰的通用蛋白质/小肽胞内递送方法是该领域亟待解决关键技术。
近年来，含氟高分子被广泛用作为核酸载体，核酸分子结构中带有大量负电荷，负电荷的量与核酸的分子量成线性关系。含氟阳离子高分子可以通过静电相互作用结合核酸。含氟功能基团可帮助阳离子高分子改善复合物稳定性、细胞内吞、内涵体逃逸、胞内核酸释放等多个环节，使得含氟高分子在基因递送过程中具备高效、低毒的特点。与核酸分子不同的是，蛋白质、小肽等分子带电状态不明确，与其自身的等电点以及溶液的酸碱度密切相关，所以含氟高分子能否用于蛋白质、小肽分子的胞内递送一直是一个悬而未决的问题。本发明中，我们通过材料库筛选的方法发现了一类可以用于高效胞内递送蛋白质和小肽的含氟高分子载体，含氟烷基链修饰的支化聚乙烯亚胺能够通过氢键、静电等方式结合蛋白质/小肽分子的肽链或负电区域，从而在溶液中自组装成具有规则尺寸的纳米颗粒。这种含氟高分子在胞内递送蛋白质、小肽时可实现高转染效率，低细胞毒性，并能维持蛋白质分子的结构和生物学活性。这类含氟高分子载体的蛋白质递送效率与含氟烷基链的长短以及接枝率密切相关，只有选择合适的技术参数才能够获得高转染效率。这一特点与含氟高分子作为基因载体时截然不同，含氟高分子基因载体的转染效率往往和含氟烷基链的长度以及接枝率成线性关系：含氟烷基链越长，接枝率越高，则相应材料的基因转染性能越好(J.Mater.Chem.B,2016,4,6468)。含氟高分子作为蛋白质载体时，蛋白递送效率与含氟烷基链的长度以及接枝率之间没有简单的线性关系，具体的规律与具体的含氟烷基链种类有关，需要对链长以及接枝率进行精心的筛选后才能获得高性能材料。更为重要的是，含氟高分子作为载体递送蛋白质和小肽的方式无需对蛋白质、小肽进行化学修饰，且能够对多种蛋白质、小肽分子适用，是一种具有普适性的高效蛋白质胞内递送方法。
发明内容
本发明克服现有技术中蛋白质、小肽转染技术的不足，创新地提供了一类含氟高分子作为蛋白质、小肽等分子胞内递送的载体，转染效率高，转染过程中对细胞产生的毒性小，转染后可以保持蛋白质和小肽等分子的生物活性。本发明还提供了一种高效、低毒性转染蛋白质、小肽等分子的方法。
本发明提供一类含氟高分子(也可称为氟化烷烃功能基团修饰的阳离子聚合物、含氟高分子材料、含氟高分子载体、蛋白质载体、蛋白质转染载体)用于蛋白质和小肽的胞内递送，含氟高分子的结构如式(1)所示，其包括支化聚乙烯亚胺和含氟烷烃功能基团；所述含氟烷烃的功能基团(氟化烷烃)共价连接在支化聚乙烯亚胺上。
式(1)中：
R为支化聚乙烯亚胺，其分子量为1000-50000道尔顿；优选地，为25000道尔顿；其结构式如式(4)所示：
式(4)中，m为2-106；优选地，为53。
X为支化聚乙烯亚胺上连接的含氟烷烃功能基团个数，其为1-200之间的整数；优选地，为0-51或54-102之间的整数。
n为2-7；优选地，为3、4、5或6；进一步优选地，为3或5。
其中，所述含氟烷烃功能基团优选为3-(全氟正丙基)-1,2-环氧丙烷，3-(全氟正丁基)-1,2-环氧丙烷或3-(全氟正己基)-1,2-环氧丙烷；进一步优选地，为3-(全氟正丁基)-1,2-环氧丙烷或3-(全氟正己基)-1,2-环氧丙烷。
本发明式(1)中，当n为3时，所述含氟高分子载体的结构如式(2)所示：
式(2)中：
R为支化聚乙烯亚胺，其分子量为1000-50000道尔顿；优选地，其分子量为25000道尔顿。
其中，支化聚乙烯亚胺的结构式如式(4)所示：
式(4)中，m为2-106。
X为支化聚乙烯亚胺上连接的含氟烷烃功能基团个数，其为1-200之间的整数；优选地，X为54-102之间的整数。
其中，所述含氟烷烃功能基团为3-(全氟正丁基)-1,2-环氧丙烷。
本发明式(1)中，当n为5时，所述含氟高分子载体的结构如式(3)所示：
式(3)中：
R为支化聚乙烯亚胺，其分子量为1000-50000道尔顿；优选地，其分子量为25000道尔顿。
其中，支化聚乙烯亚胺的结构式如式(4)所示：
式(4)中，m为2-106。
X为支化聚乙烯亚胺上连接的含氟烷烃功能基团个数，其为1-200之间的整数；优选地，为0-51之间的整数。
其中，所述含氟烷烃功能基团为3-(全氟正己基)-1,2-环氧丙烷。
本发明式(2)中，当m＝53，X＝76时，所述含氟高分子载体(实施例1中的F3-3)的结构如式(a)所示：
式(a)中，R为支化聚乙烯亚胺，其结构式如式(c)所示：
式(c)。
本发明式(3)中，当m＝53，X＝30时，所述含氟高分子载体(实施例1中的F4-1)的结构如式(b)所示：
式(b)中，R为支化聚乙烯亚胺，其结构式如式(c)所示：
本发明还提出了上述含氟高分子在胞内递送蛋白质或小肽的应用。通过将所述含氟高分子与蛋白质和小肽在室温孵育形成稳定的转染复合物，对细胞进行转染。
本发明还提出了一种新的复合物，其包括式(1)所示的含氟高分子以及蛋白质或小肽分子；其中，在该复合物中，由所述含氟高分子携带所述蛋白质或小肽分子。
本发明还提出了式(1)所示含氟高分子、所述复合物在细胞转染、药物筛选、蛋白质递送、生物治疗等领域中的应用。
本发明中，所述蛋白质包括但不限于是牛血清蛋白(BSA)，β-半乳糖苷酶(β-Gal)，皂角素(Saporin)等。所述小肽包括但不限于(GRKKRRQRRREKIKRPRSSNAETL)等。
利用本发明在HeLa，NIN3T3，HEK293等细胞系中转染牛血清蛋白(BSA)，β-半乳糖苷酶(β-Gal)，皂角素(Saporin)以及小肽(GRKKRRQRRREKIKRPRSSNAETL)等蛋白质和小肽分子。实验结果表明本发明具有以下优点：本发明提出的蛋白质递送方法具有高转染效率，转染效率远高于商业化转染试剂PulsinTM；通过β‐Gal蛋白质活性检测发现本发明可以保持蛋白质的生物活性，蛋白质在转染后活性可以维持90％以上；通过MTT实验发现本发明采用的含氟高分子载体具有低细胞毒性，在高转染效率的浓度下细胞存活率高于90％，具有良好的生物相容性。本发明提出的蛋白质转染载体在细胞转染过程中可以达到高效转染的效果，成本低，细胞毒性小，能够有效且安全地将蛋白质、小肽分子递送到细胞质中，而且不需要对蛋白质、小肽进行任何的化学修饰。输送到细胞中。
附图说明
图1为实施例1中所得的蛋白质转染载体转染效率的筛选。
图2为实施例1中所得蛋白质转染载体F4-1、F3-3与商业化转染试剂PulsinTM转染效率比较。
图3为实施例1中所得蛋白质转染载体F4-1、F3-3与蛋白质修饰穿膜肽(TAT)的方法转染效率的比较，其中，图3a为蛋白质转染载体F4-1、F3-3与蛋白质修饰穿膜肽(TAT)的荧光共聚焦显微相；图3b为转染10μg/mL的蛋白质的流式细胞仪定量结果；图3c为转染20μg/mL的蛋白质的流式细胞仪定量结果。
图4为实施例1中所得的蛋白质转染载体F4-1、F3-3在HeLa细胞中转染BSA-FITC蛋白质的转染效果图。
图5为实施例1中所得的蛋白质转染载体F4-1、F3-3在HIN3T3细胞中转染BSA-FITC蛋白质的转染效果图。
图6为实施例1中所得的蛋白质转染载体F4-1、F3-3在HEK293细胞中转染BSA-FITC蛋白质的转染效果图。
图7为实施例1中所得的蛋白质转染载体F4-1、F3-3在HeLa细胞中转染小肽(GRKKRRQRRREKIKRPRSSNAETL)的转染效果图。
图8为实施例1中所得的蛋白质转染载体F4-1、F3-3在HeLa细胞中转染β-Gal蛋白质的转染效果图。
图9为实施例1中所得蛋白质转染载体F4-1、F3-3在HeLa细胞中转染Saporin蛋白质的转染效果图。
图10为实施例1中所得的蛋白质转染载体F4-1、F3-3对HeLa细胞的毒性。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1：基于聚乙烯亚胺和氟化烷烃功能基团的蛋白质转染材料库的合成与制备
将三种氟化烷烃(分别为3-(全氟正丙基)-1,2-环氧丙烷；3-(全氟正丁基)-1,2-环氧丙烷；3-(全氟正己基)-1,2-环氧丙烷)按照不同投料比通过环氧开环反应接枝到支化聚乙烯亚胺上，得到12种氟化烷烃功能基团修饰的阳离子聚合物蛋白质转染复合物。
一个具体的实施例方式中，式(2)中所示蛋白质转染材料F3-3的制备方法为：将3-(全氟正丁基)-1,2-环氧丙烷按照投料比108:1加入甲醇溶解的25000道尔顿支化聚乙烯亚胺溶液中，室温搅拌反应48小时，分离提纯即可得到蛋白质转染材料F3‐3。
表1实施例1中制备的蛋白质转染材料库
实验结果：表1为蛋白质转染材料库的投料条数及经过核磁共振分析或氟元素质量分析后得到的实际接枝条数(即式(1)～(3)中的X)。得到12种蛋白质转染材料，及其命名。
实施例2：蛋白质转染材料库转染效率的筛选
将实施例1中所制备的蛋白质转染材料和BSA-FITC在室温下形成复合物，然后在HeLa细胞上进行转染，通过检测活细胞内绿色荧光水平评估材料的蛋白质转染效率。具体方法为：将HeLa细胞培养在48孔板中孵育24小时，将4微BSA-FITC分别与不同剂量的材料混合后加入50微升无血清培养基孵育30min。补加150微升无血清培养基后，与细胞一起孵育4小时小时后处理细胞。用流式细胞仪定量分析活细胞内绿色荧光水平评估转染BSA-FITC的效率。具体方法为：BSA-FITC蛋白质转染4小时后，用胰酶将细胞消化，并用200微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测活细胞内绿色荧光水平。
实验结果：图1为蛋白质转染材料转染效率的筛选结果，结果表明只有选择合适的含氟烷基链长度以及含氟烷基链条数X才能够获得高转染效率，这一特点与含氟高分子作为基因载体时截然不同。图2为效率最高的F4-1、F3-3与商业化转染材料PulsinTM转染效率的比较，其中F4-1约为PulsinTM转染效率的4倍，F3-3约为PulsinTM转染效率的3倍。表明本发明含氟高分子在蛋白质转染领域取得显著性突破。
实施例3：蛋白质转染材料F4-1、F3-3与蛋白质修饰穿膜肽(TAT)的方法转染效率的比较
将BSA蛋白质表面接枝不同比例的穿膜肽(TAT)(分别为2条，4条，6条)后与实施例1中的蛋白质转染材料F4-1、F3-3比较BSA-FITC转染效率。具体方法为：将实施例1中所制备的蛋白质转染材料F4-1、F3-3和BSA-FITC在室温下形成复合物，然后在HeLa细胞上进行转染，通过检测活细胞内绿色荧光水平评估材料的蛋白质转染效率。穿膜肽修饰的BSA-FITC作为对照。具体方法为：将HeLa细胞培养在48孔板中孵育24小时，将4微克BSA-FITC分别与不同剂量的材料混合后加入50微升无血清培养基孵育30min。补加150微升无血清培养基后，与细胞一起孵育4小时小时后处理细胞。4微克穿膜肽修饰的BSA-FITC则直接用200微升无血清培养基稀释并处理细胞。荧光共聚焦显微镜观测细胞内荧光水平，并用流式细胞仪定量分析活细胞内绿色荧光水平评估转染BSA-FITC的效率。具体方法为：BSA-FITC蛋白质转染4小时后，用胰酶将细胞消化，并用200微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测活细胞内绿色荧光水平。
实验结果：图3为蛋白质转染材料F4-1、F3-3与蛋白质修饰穿膜肽(TAT)的方法转染效率的比较。图3a的荧光共聚焦显微镜观测结果表明使用蛋白质转染材料F4-1及F3-3转染蛋白质BSA-FITC，转染效率明显高于穿膜肽修饰的BSA-FITC。图3b的流式细胞仪定量结果进一步证实此结果。结果表明此发明的蛋白质转染效率显著性高于已有技术手段。
实施例4：蛋白质转染材料F4-1与蛋白质复合物的表征
用动态光散射和Zeta电势表征蛋白质转染材料F4-1与蛋白质(BSA、β-Gal、Saporin)复合物。具体实验方法：将蛋白质转染材料F4-1与蛋白质(BSA、β-Gal、Saporin)按不同摩尔比室温下混合，稀释成500mL，孵育1小时，用纳米粒度仪进行检测。
实验结果：表2所示的蛋白质转染材料F4-1与蛋白质(BSA、β-Gal、Saporin)形成的复合物动态光散射和Zeta电势结果。结果表明，蛋白质转染材料F4-1与蛋白质(BSA、β-Gal、Saporin)在摩尔比0.1:1-3:1范围内形成尺寸约200纳米的复合物，电势为正；结果表明蛋白质转染材料F4-1可以与不同分子量、不同等电点的蛋白质在一定摩尔比范围内形成尺寸均一的复合物。
表2：蛋白质转染材料F4-1与蛋白质形成的复合物动态光散射和Zeta电势结果
表2
实施例5：蛋白质转染载体F4-1在HeLa细胞上的蛋白质(BSA-FITC)转染实验
将实施例1中所制备的蛋白质转染材料F4-1和BSA-FITC在室温下形成复合物，然后在HeLa细胞上进行转染，通过观察细胞内绿色荧光评估材料的蛋白质转染效率。具体方法为：将HeLa细胞培养在48孔板中孵育24小时，将4微克BSA-FITC与2微克F4-1混合后加入50微升无血清培养基孵育30min。补加150微升无血清培养基后，与细胞一起孵育4小时后处理细胞。用荧光共聚焦显微镜观察转染效果。
实验结果：图4所示的蛋白质转染材料F4-1在HeLa细胞上转染BSA-FITC蛋白质的转染效果图；结果表明，蛋白质转染材料F4-1在HeLa细胞上实现了高效的BSA蛋白质转染。
实施例6：蛋白质转染载体F4-1在HIN3T3细胞上的蛋白质(BSA-FITC)转染实验
将实施例1中所制备的蛋白质转染材料F4-1和BSA-FITC在室温下形成复合物，然后在HeLa细胞上进行转染，通过观察活细胞内绿色荧光评估材料的蛋白质转染效率。具体方法为：将HIN3T3细胞培养在48孔板中孵育24小时，将4微克BSA-FITC与F4-1混合后加入50微升无血清培养基孵育30min。补加150微升无血清培养基后，与细胞一起孵育4小时后处理细胞。用荧光共聚焦显微镜观察转染效果。
实验结果：图5所示的蛋白质转染材料F4-1在HIN3T3细胞上转染BSA-FITC蛋白质的转染效果图；结果表明，蛋白质转染材料F4-1在HIN3T3细胞上实现了高效的BSA蛋白质转染。
实施例7：蛋白质转染载体F4-1在HEK293细胞上的蛋白质(BSA-FITC)转染实验
将实施例1中所制备的蛋白质转染材料F4-1和BSA-FITC在室温下形成复合物，然后在HEK293细胞上进行转染，通过观察活细胞内绿色荧光评估材料的蛋白质转染效率。具体方法为：将HEK293细胞培养在48孔板中孵育24小时，将4微克BSA-FITC与F4-1混合后加入50微升无血清培养基孵育30min。补加150微升无血清培养基后，与细胞一起孵育4小时后处理细胞。用荧光共聚焦显微镜观察转染效果。
实验结果：图6所示的蛋白质转染材料F4-1在HEK293细胞上转染BSA-FITC蛋白质的转染效果图；结果表明，蛋白质转染材料F4-1在HEK293细胞上实现了高效的BSA蛋白质转染。
实施例8：蛋白质转染载体F4-1在HeLa细胞上的小肽(GRKKRRQRRREKIKRPRSSNAETL‐FITC)转染实验
将实施例1中所制备的蛋白质转染材料F4-1和小肽在室温下形成复合物，然后在HeLa细胞上进行转染，通过观察活细胞内绿色荧光评估材料的小肽转染效率。具体方法为：将HeLa细胞培养在48孔板中孵育24小时，将1微克小肽与2微克F4-1混合后加入50微升无血清培养基孵育30min。补加150微升无血清培养基后，与细胞一起孵育4小时小时后处理细胞。用荧光共聚焦显微镜观察转染效果。
实验结果：图7所示的蛋白质转染材料F4-1在HeLa细胞上转染小肽的转染效果图；结果表明，蛋白质转染材料F4-1在HeLa细胞上实现了高效的小肽转染。
实施例9：蛋白质转染载体F4-1在HeLa细胞上的β‐Gal蛋白质转染实验
将实施例1中所制备的蛋白质转染材料F4-1和β‐Gal蛋白质在室温下形成复合物，然后在HeLa细胞上进行转染，通过β‐Gal蛋白质催化底物X‐Gal染色评估材料的β‐Gal蛋白质转染效率。具体方法为：将HeLa细胞培养在48孔板中孵育24小时，将5微克β‐Gal蛋白质与2微克F4-1混合后加入50微升无血清培养基孵育30min。补加150微升无血清培养基后，与细胞一起孵育4小时小时后处理细胞。用5％的X-Gal染色液37℃处理过夜，在光学显微镜下观察转染效果。
实验结果：图8所示的蛋白质转染材料F4-1在HeLa细胞上转染β‐Gal蛋白质的转染效果图；结果表明，蛋白质转染材料F4-1在HeLa细胞上实现了高效的β‐Gal蛋白质转染。
实施例10：蛋白质转染材料F4-1在HeLa细胞上的Saporin蛋白质转染实验
将实施例1中所制备的蛋白质转染材料F4-1和Saporin蛋白质在室温下形成复合物，然后在HeLa细胞上进行转染，通过Saporin蛋白质对细胞的毒性检测蛋白质的转染效率。具体方法为：将HeLa细胞培养在96空板中孵育24小时，将不同浓度的Saporin蛋白质(分别为)与2微克F4-1混合后加入50微升无血清培养基中孵育30min，补加150微升无血清培养基后，与细胞一起孵育4小时。补加200微升含10％血清的培养基孵育20小时后处理细胞。用MTT实验检测细胞毒性评估Saporin蛋白质转染效率。
实验结果：图9所示的蛋白质转染材料F4-1在HeLa细胞上转染Saporin蛋白质的细胞毒性结果；结果表明，蛋白质转染材料F4-1在HeLa细胞上实现了高效的Saporin蛋白质转染。
实施例11：蛋白质转染载体F4-1对细胞活性的影响
研究蛋白质转染载体F4-1以及其与BSA蛋白质形成的复合物对细胞的活性影响。对照为与F4-1具有相同疏水性的烷烃功能基团修饰的阳离子聚合物A4-1，结构式如式(5)具体实验方法是：在96孔板中孵育HeLa细胞，细胞密度为104细胞/孔，培养24小时后将培养基移出，加入100微升含有不同浓度的蛋白质转染载体(分别为5μg/mL，7.5μg/mL，10μg/mL，12.5μg/mL，15μg/mL)F4-1或F4-1/BSA复合物的新鲜培养基(含10％血清)，培养24小时。通过MTT法检测细胞活性。
实验结果：图10所示的蛋白质转染材料F4-1或F4-1/BSA对细胞毒性的检测结果。结果表明本发明制备的氟化烷烃功能基团修饰的阳离子聚合物F4-1或F4-1/BSA毒性显著低于烷烃功能基团修饰的阳离子聚合物A4-1。
R为支化聚乙烯亚胺,分子量为25000道尔顿。
实施例12：蛋白质转染材料F3-3与蛋白质复合物的表征
用动态光散射和Zeta电势表征蛋白质转染材料F3-3蛋白质(BSA、β-Gal、Saporin)复合物。具体实验方法：将蛋白质转染材料F3-3与蛋白质(BSA、β-Gal、Saporin)按不同摩尔比室温下混合，稀释成500mL，孵育1小时，用纳米粒度仪进行检测。
实验结果：表3所示的蛋白质转染材料F3-3与蛋白质(BSA、β-Gal、Saporin)形成的复合物动态光散射和Zeta电势结果。结果表明，蛋白质转染材料F3-3与蛋白质(BSA、β-Gal、Saporin)在摩尔比0.1:1-3:1范围内形成尺寸约200纳米的复合物，电势为正；结果表明蛋白质转染材料F3-3可以与不同分子量、不同等电点的蛋白质在一定摩尔比范围内形成尺寸均一的复合物。
表3：蛋白质转染材料F3-3与蛋白质形成的复合物动态光散射和Zeta电势结果
实施例13：蛋白质转染载体F3-3在HeLa细胞上的蛋白质(BSA-FITC)转染实验
将实施例1中所制备的蛋白质转染材料F3-3和BSA-FITC在室温下形成复合物，然后在HeLa细胞上进行转染，通过观察活细胞内绿色荧光评估材料的蛋白质转染效率。具体方法为：将HeLa细胞培养在48孔板中孵育24小时，将4微克BSA-FITC与2.5微克F3-3混合后加入50微升无血清培养基孵育30min。补加150微升无血清培养基后，与细胞一起孵育4小时小时后处理细胞。用荧光显微镜观察转染效果。
实验结果：图4所示的蛋白质转染材料F3-3在HeLa细胞上转染BSA-FITC蛋白质的转染效果图；结果表明，蛋白质转染材料F3-3在HeLa细胞上实现了高效的BSA蛋白质转染。
实施例14：蛋白质转染载体F3-3在HIN3T3细胞上的蛋白质(BSA-FITC)转染实验
将实施例1中所制备的蛋白质转染材料F3-3和BSA-FITC在室温下形成复合物，然后在HIN3T3细胞上进行转染，通过检测活细胞内绿色荧光水平评估材料的蛋白质转染效率。具体方法为：将HIN3T3细胞培养在48孔板中孵育24小时，将4微克BSA-FITC与2.5微克F3-3混合后加入50微升无血清培养基孵育30min。补加150微升无血清培养基后，与细胞一起孵育4小时小时后处理细胞。用荧光共聚焦显微镜观察转染效果。
实验结果：图5所示的蛋白质转染材料F3-3在HIN3T3细胞上转染BSA-FITC蛋白质的转染效果图；结果表明，蛋白质转染材料F3-3在HIN3T3细胞上实现了高效的BSA蛋白质转染。
实施例15：蛋白质转染载体F3-3在HEK293细胞上的蛋白质(BSA-FITC)转染实验
将实施例1中所制备的蛋白质转染材料F3-3和BSA-FITC在室温下形成复合物，然后在HEK293细胞上进行转染，通过观察活细胞内绿色荧光评估材料的蛋白质转染效率。具体方法为：将HEK293细胞培养在48孔板中孵育24小时，将4微克BSA-FITC与F3-3混合后加入50微升无血清培养基孵育30min。补加150微升无血清培养基后，与细胞一起孵育4小时小时后处理细胞。用荧光显微镜观察转染效果。
实验结果：图6所示的蛋白质转染材料F3-3在HEK293细胞上转染BSA-FITC蛋白质的转染效果图；结果表明，蛋白质转染材料F3-3在HEK293细胞上实现了高效的BSA蛋白质转染。
实施例16：蛋白质转染载体F3-3在HeLa细胞上的小肽(GRKKRRQRRREKIKRPRSSNAETL‐FITC)转染实验
将实施例1中所制备的蛋白质转染材料F3-3和小肽在室温下形成复合物，然后在HeLa细胞上进行转染，通过观察活细胞内绿色荧光评估材料的小肽转染效率。具体方法为：将HeLa细胞培养在48孔板中孵育24小时，将1微克小肽与2.5微克F3-3混合后加入50微升无血清培养基孵育30min。补加150微升无血清培养基后，与细胞一起孵育4小时小时后处理细胞。用荧光共聚焦显微镜观察转染效果。
实验结果：图7所示的蛋白质转染材料F3-3在HeLa细胞上转染小肽的转染效果图；结果表明，蛋白质转染材料F3-3在HeLa细胞上实现了高效的小肽转染。
实施例17：蛋白质转染载体F3-3在HeLa细胞上的β‐Gal蛋白质转染实验
将实施例1中所制备的蛋白质转染材料F3-3和β‐Gal蛋白质在室温下形成复合物，然后在HeLa细胞上进行转染，通过β‐Gal蛋白质催化底物X‐Gal染色评估材料的β‐Gal蛋白质转染效率。具体方法为：将HeLa细胞培养在48孔板中孵育24小时，将5微克β‐Gal蛋白质与2.5微克F3-3混合后加入50微升无血清培养基孵育30min。补加150微升无血清培养基后，与细胞一起孵育4小时小时后处理细胞。用5％的X-Gal染色液37℃处理过夜，在光学显微镜下观察转染效果。
实验结果：图8所示的蛋白质转染材料F3-3在HeLa细胞上转染β‐Gal蛋白质的转染效果图；结果表明，蛋白质转染材料F3-3在HeLa细胞上实现了高效的β‐Gal蛋白质转染。
实施例18：蛋白质转染材料F3-3在HeLa细胞上的Saporin蛋白质转染实验
将实施例1中所制备的蛋白质转染材料F3-3和Saporin蛋白质在室温下形成复合物，然后在HeLa细胞上进行转染，通过Saporin蛋白质对细胞的毒性检测蛋白质的转染效率。具体方法为：将HeLa细胞培养在96空板中孵育24小时，将不同浓度的Saporin蛋白质(分别为)与2.5微克F3-3混合后加入50微升无血清培养基中孵育30min，补加150微升无血清培养基后，与细胞一起孵育4小时。补加200微升含10％血清的培养基孵育20小时后处理细胞。用MTT实验检测细胞毒性评估Saporin蛋白质转染效率。
实验结果：图9所示的蛋白质转染材料F3-3在HeLa细胞上转染Saporin蛋白质的细胞毒性结果；结果表明，蛋白质转染材料F3-3在HeLa细胞上实现了高效的Saporin蛋白质转染。
实施例19：蛋白质转染载体F3-3对细胞活性的影响
研究蛋白质转染载体F3-3以及其与BSA蛋白质形成的复合物对细胞的活性影响。对照为与F3-3具有相同疏水性的烷烃功能基团修饰的阳离子聚合物A3-3，结构式如式(6)具体实验方法是：在96孔板中孵育HeLa细胞，细胞密度为104细胞/孔，培养24小时后将培养基移出，加入100微升含有不同浓度(分别为5μg/mL，7.5μg/mL，10μg/mL，12.5μg/mL，15μg/mL)的蛋白质转染载体F3-3或F3-3/BSA复合物的新鲜培养基(含10％血清)，培养24小时。通过MTT法检测细胞活性。
实验结果：图10所示的蛋白质转染材料F3-3或F3-3/BSA对细胞毒性的检测结果。结果表明本发明制备的氟化烷烃功能基团修饰的阳离子聚合物F3-3或F3-3/BSA毒性显著低于烷烃功能基团修饰的阳离子聚合物A3-3。
R为支化聚乙烯亚胺,分子量为25000道尔顿。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
Claims (5)
1.一种含氟高分子在蛋白质或小肽胞内递送中的应用，其特征在于，所述含氟高分子包括支化聚乙烯亚胺和含氟烷烃功能基团；所述含氟烷烃的功能基团共价连接在支化聚乙烯亚胺上；其结构如式（1）所示：
式（1）；
式（1）中，R为支化聚乙烯亚胺，其分子量为25000道尔顿；
n为2时，X为支化聚乙烯亚胺上连接的含氟烷烃功能基团个数，其为52-98之间的整数；或，n为3时，X为支化聚乙烯亚胺上连接的含氟烷烃功能基团个数，其为28-76之间的整数；或，n为5时，X为支化聚乙烯亚胺上连接的含氟烷烃功能基团个数，其为30-76之间的整数；
其中，支化聚乙烯亚胺的结构式如式（4）所示：
式（4）；
式（4）中，m为53。
2.如权利要求1所述的含氟高分子在蛋白质或小肽胞内递送中的应用，其特征在于，所述含氟高分子结构如式（b）所示：
式（b）；
式（b）中，R为支化聚乙烯亚胺，其结构式如式（c）所示：
式（c）。
3.如权利要求1所述的含氟高分子在蛋白质或小肽胞内递送中的应用，其特征在于，所述含氟高分子结构如式（a）所示：
式（a）；
式（a）中，R为支化聚乙烯亚胺，其结构式如式（c）所示：
式（c）。
4.一种转染复合物，其特征在于，其包括如权利要求1-3之任一项中所述的含氟高分子和蛋白质或小肽，其中，由所述含氟高分子携带蛋白质或小肽。
5.一种蛋白质或小肽转染载体，其特征在于，其包括如权利要求1-3之任一项中所述的含氟高分子。
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| GR01 | Patent grant | ||
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