CN112080458A - 一种用于蛋白质胞内递送的方法 - Google Patents

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张智雄
马锡琦
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Abstract

本发明公开了一种用于蛋白质胞内递送的方法，包括以下步骤：(1)配制一定浓度的蛋白质溶液及卤化硼簇溶液；(2)卤化硼簇溶液缓慢加入到蛋白质溶液中，快速混合均匀，静置一段时间；(3)标准的完全培养基中加入卤化硼簇与蛋白质混合液，与待转运细胞共培养一段时间。卤化硼簇不需要通过化学键的修饰便可用于跨生物膜递送蛋白质。该转运蛋白质的方法能够避免被内体捕获，简单易行，成本低且转运效率较高，是一种具有广阔前景的蛋白质转运载体。

Description

一种用于蛋白质胞内递送的方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种用于蛋白质胞内递送的方法。
背景技术
蛋白质是生命的物质基础之一，是生命活动的主要承担者。现阶段研究发现许多疾病都与细胞内正常蛋白质的缺失有关。跨细胞膜转运蛋白质可以将遗传缺陷造成的缺失蛋白和治疗性蛋白质引入细胞，用于治疗某些疾病，如呼吸道疾病、癌症、关节炎等等。蛋白质药物具有毒性低、特异性强、功能明确等优点，但其存在稳定性差、清除率高、跨膜能力差等缺点，对蛋白质的临床应用造成了极大障碍。
为了提高蛋白质的生物利用度与治疗效果，人们构建了一系列蛋白质胞内递送的载体，如细胞穿膜肽、无机纳米载体及有机纳米载体等。细胞穿透肽(cell-penetratingpeptides，CPPs)由于独特的结构可应用于跨细胞膜转运蛋白质。然而，CPPs的半衰期较短，容易被清除(D.Sarko,B.Beijer,R.Garcia Boy,et al.The Pharmacokinetics of Cell-Penetrating Peptides[J].Molecular Pharmaceutics,2010,7(6):2224-2231.)。同时，相当比例的CPPs内化后会包裹在内体中，直接导致其携带的蛋白质无法发挥功能，而且长期被束缚在内涵体中，内涵体与溶酶体结合后的酸性环境及其各种酶会进一步使蛋白质降解(J.C.LeCher,S.J.Nowak,J.L.McMurry.Breaking in and busting out:cell-penetrating peptides and the endosomal escape problem[J].Biomolecularconcepts,2017,8(3-4):131-141.)。
无机纳米颗粒具有毒性低、尺寸易调控、细胞摄取率高及靶向能力强等优异特性。介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN)可以通过静电或疏水作用将蛋白质保留在其纳米孔径中，也可通过调整MSN结构和孔径装载各种大小和不同电荷的蛋白质(J.Tu,A.L.Boyle,H.Friedrich,et al.Mesoporous Silica Nanoparticles with Large Pores for theEncapsulation and Release of Proteins[J].ACS Applied Materials&Interfaces,2016,8(47):32211-32219.)。装载蛋白的MSN通过吞噬作用被细胞摄取，然后通过内吞作用释放蛋白质。通过较为复杂的化学修饰，成功实现了蛋白质的胞内递送。
关于蛋白质递送的国内专利大多数为有机纳米载体。中国专利201310451917.9号，公开了一种用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统及制备方法，应用两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物负载蛋白质药物形成仿生系统。中国专利200580044939.7号，公开了一种用于蛋白质药物递送的毫微粒，该由壳聚糖/聚γ谷氨酸与蛋白质药物组成。这些有机纳米载体粒径较大，组装过程较为复杂，可以被进一步优化。
近年来，阴离子小分子递送蛋白质的研究被逐渐开展。卤化硼簇(Halogenatedboron cluster)是硼簇大家庭的一种，其通式为[BnXm]y-(n，m≥10；X为卤素，部分X可被非卤素取代；y为电荷数，1～4)。卤化硼簇具有空间笼状结构，笼状结构是由B-B-B多中心电子缺失形成的。在这种键类型中，一个电子对被三个原子中心共享，这导致分子的总电荷在空间笼状结构上高度离域。卤化硼簇具有离液效应(Chaotropic effect)，通过弱的分子间作用与蛋白质外表面缔合，可与蛋白质的空腔结合，且不会引起蛋白质二级结构的明显改变(M.V.Kuperman,M.Y.Losytskyy,A.Y.Bykov,et al.Effective binding ofperhalogenated closo-borates to serum albumins revealed by spectroscopic andITC studies[J].Journal of Molecular Structure,2017,1141:75-80.)。另外，卤化硼簇能够引起脂质体形态的变化，可诱导药物的释放(D.Awad,M.Bartok,F.Mostaghimi,etal.Halogenated Dodecaborate Clusters as Agents to Trigger Release ofLiposomal Contents[J].ChemPlusChem,2015,80(4):656-664.)。卤化硼簇不需要通过化学键的修饰便可用于跨生物膜递送蛋白质且可以避免被内体捕获。因此，这种方法可以克服蛋白质载体现有技术的不足，实现蛋白质的高效化胞内递送。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于蛋白质胞内递送的方法。
为了实现上述目的，发明一种用于蛋白质胞内递送的方法，由下列部分组成：负电卤化硼簇和碱性蛋白质。
优选的，所述的卤化硼簇通式为[BnXm]y-(n，m≥10；X为卤素，部分X可被非卤素取代；y为电荷数，1～4)。
优选的，所述的一种用于蛋白质胞内递送的方法，具体包括下列步骤：
(1)配制一定浓度的蛋白质溶液及卤化硼簇溶液；
(2)步骤(1)中的卤化硼簇溶液缓慢加入到蛋白质溶液中，快速混合均匀，静置一段时间；
(3)将步骤(2)中得到的混合溶液与待转运细胞共培养一段时间。
与现有技术相比，本发明的优势是：该方法利用小分子卤化硼簇进行跨细胞膜递送蛋白质，卤化硼簇与生物膜和蛋白质具有出色的生物相容性，且能够避免被内体捕获。此外，该方法避免复杂的化学键修饰，操作步骤简单。
附图说明
图1为流式细胞仪表征卤化硼簇(Na2B12Br12)递送细胞色素C进入NIH-3T3细胞的效率。
图2为卤化硼簇(Na2B12Br12)递送的细胞色素C在NIH-3T3细胞内的激光扫描共聚焦显微镜表征结果。
图3为卤化硼簇(Cs2B10Br10)递送的细胞色素C在NIH-3T3细胞内的激光扫描共聚焦显微镜表征结果。
图4为卤化硼簇(Na2B12Br12)和卤化硼簇(Cs2B10Br10)的结构图。
(注：附图中的细胞色素C均被异硫氰酸荧光素(FITC)标记)
具体实施方式
下面结合试验阶段，最佳混合时间、最佳孵育时间，最佳浓度及相应硼簇列出不同实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
实施例一
(1)取质量比约为(1～5):1的卤化硼簇(Na2B12Br12)与标记的细胞色素C配成溶液，溶剂为1×PBS，总体积100μL，充分混合10min，0.22μm微孔滤膜过滤除菌；
(2)取300μL DMEM加入到培育着NIH-3T3细胞的24孔板中，并加入100μL的步骤(1)混合液，孵育6小时，卤化硼簇(Na2B12Br12)终浓度为150μM，标记的细胞色素C浓度为2.5μM，5.0μM和10.0μM；
(3)将步骤(2)的24孔板中的混合液吸出，1×PBS冲洗三次，将细胞染色，固定；
(4)使用共聚焦显微镜对细胞进行共聚焦成像，观察标记的细胞色素C在细胞内的分布，在500-530nm标记的细胞色素C的荧光通道可以看到细胞中蛋白质的分布，从图2中观察到卤化硼簇(Na2B12Br12)能够有效地将标记的细胞色素C递送进细胞。流式细胞仪检测标记的细胞色素C进细胞效率，从图1可看出卤化硼簇(Na2B12Br12)递送的细胞色素C在细胞内荧光强度高于单独的细胞色素C的荧光强度(CC-FITC为FITC标记的细胞色素C,蛋白质浓度为2.5μM，卤化硼簇(Na2B12Br12)浓度为150μM)。
实施例二
(1)质量比约为(1～5):1的卤化硼簇(Cs2B10Br10)与标记的细胞色素C配成溶液，溶剂为1×PBS，总体积100μL，充分混合10min，0.22μm微孔滤膜过滤除菌；
(2)取300μL DMEM加入到培育着NIH-3T3细胞的24孔板中，并加入100μL的步骤(1)混合液，孵育6小时，卤化硼簇(Cs2B10Br10)终浓度为150μM，标记的细胞色素C浓度为2.5μM，5.0μM和10.0μM；
(3)将步骤(2)的24孔板中的混合液吸出，1×PBS冲洗三次，将细胞染色，固定；
(4)使用共聚焦显微镜对细胞进行共聚焦成像，观察标记的细胞色素C在细胞内的分布，在500-530nm标记的细胞色素C的荧光通道可以看到细胞中蛋白质的分布，从图3中观察到卤化硼簇(Cs2B10Br10)能够有效地将标记的细胞色素C递送进细胞。(CC-FITC为FITC标记的细胞色素C)。
实施例三
(1)取质量比约为18:1的卤化硼簇(Na2B12Br12)与标记的细胞色素C配成溶液，溶剂为1×PBS，总体积100μL，充分混合20min，0.22μm微孔滤膜过滤除菌；
(2)取300μL DMEM加入到培育着HeLa细胞的24孔板中，并加入100μL的步骤(1)混合液，孵育6小时，卤化硼簇(Na2B12Br12)终浓度为200μM，标记的细胞色素C浓度为1.0μM；
(3)将步骤(2)的24孔板中的混合液吸出，1×PBS冲洗三次，将细胞染色，固定；
(4)使用共聚焦显微镜对细胞进行共聚焦成像，观察标记的细胞色素C在细胞内的分布，在630-670nm标记的细胞色素C的荧光通道可以看到细胞中蛋白质的分布，流式细胞仪检测标记的细胞色素C进细胞效率(Cy5标记的细胞色素C)。
实施例四
(1)取质量比约为9:1的卤化硼簇(Cs2B10Br10)与标记的溶菌酶配成溶液，溶剂为1×PBS，总体积100μL，充分混合20min，0.22μm微孔滤膜过滤除菌；
(2)取300μL DMEM加入到培育着HeLa细胞的24孔板中，并加入100μL的步骤(1)混合液，孵育12小时，卤化硼簇(Cs2B10Br10)终浓度为100μM，标记的溶菌酶浓度为1.0μM；
(3)将步骤(2)的24孔板中的混合液吸出，1×PBS冲洗三次，将细胞染色，固定；
(4)使用共聚焦显微镜对细胞进行共聚焦成像，观察标记的溶菌酶在细胞内的分布，在500-530nm标记的溶菌酶的荧光通道可以看到细胞中蛋白质的分布。流式细胞仪检测标记的溶菌酶进细胞效率(FITC标记的溶菌酶)。

Claims (3)

1.一种用于蛋白质胞内递送的方法，其特征在于：包括负电卤化硼簇和碱性蛋白质。
2.根据权利要求1所述的一种用于蛋白质胞内递送的方法，所述的卤化硼簇通式为[BnXm]y-(n，m≥10；X为卤素，部分X可被非卤素取代；y为电荷数，1～4)。
3.根据权利要求1～2所述的一种用于蛋白质胞内递送的方法，具体包括下列步骤：
(1)配制一定浓度的蛋白质溶液及卤化硼簇溶液；
(2)步骤(1)中的卤化硼簇溶液缓慢加入到蛋白质溶液中，快速混合均匀，静置一段时间；
(3)将步骤(2)中得到的混合溶液与待转运细胞共培养一段时间。
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