CN103289101B - 一种基因转染载体及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种如式(1)所示的基因转染载体，其包括树形高分子骨架和二氨基三嗪功能基团；所述二氨基三嗪基团共价连接在所述树形高分子骨架表面；其中，所述树形高分子包括聚酰胺-胺树形高分子和聚丙烯亚胺树形高分子；所述树形高分子表面为伯胺基团。本发明还提供所述基因转染载体的制备方法以及在体外或体内作为核酸分子输送载体的应用。本发明还提供包括所述基因转染载体的复合物。本发明合成成本低廉，细胞毒性小，能够有效且安全地将基因分子输送到细胞中，可作为一种兼具高效、低毒、低成本等优点的基因转染载体。
Description
技术领域
本发明涉及高分子化学、有机合成以及生物材料技术领域，具体涉及一种新型的基因转染载体及其制备方法和应用。
背景技术
基因转染是指将外源基因导入细胞，从而获得新的遗传性状的过程。基因转染载体是基因转染技术的核心，理想的基因转染载体应具备如下特点：高转染效率，低细胞毒性，生物安全性好，价格低廉等。当前使用的基因转染载体主要包括病毒类载体和非病毒类载体。主要的应用研究仍采用转染效率高的病毒类载体，但病毒类载体存在携带基因能力有限以及安全性隐患等问题。
含有氨基的聚合物已被广泛地应用于基因运输方面，其所携带的氨基具有质子化的性能，使它能容易结合基因分子形成复合物，并通过胞吞方式将其运输到细胞内，随后通过质子海绵效应保护基因分子免于在内涵体中降解，进一步从中逃逸并将基因分子释放进入细胞质，细胞核进行基因的转录，翻译等过程，实现有效的基因输送。另外，含有氨基的聚合物的化学组成为非免疫原型的单体化合物，作为基因转染载体时减少了病毒类和蛋白类基因转染载体的安全隐患。因此，高效安全的特点使得含有氨基的聚合物成为病毒、脂质体以及聚电解质类基因载体的潜在替代品。
但是，以含有氨基的聚合物为基础的基因转染载体普遍面临的高的材料成本、复杂的合成步骤、聚合物的化学组成不稳定性、转染效果不稳定、需要多重修饰来提高基因转染效率、以及高基因转染效率伴随而来的高细胞毒性等一系列问题，始终没有得到改善、解决。
发明内容
本发明克服现有的普遍的含有氨基的聚合物基因转染材料的不足，创新地提出了一种新的基于树形高分子和二氨基三嗪功能基团的基因转染载体，是由二氨基三嗪基团共价连接到树形高分子表面制备而成的基因转染材料，所述树形高分子的伯胺基团与二氨基三嗪衍生物通过化学反应相连，可作为易于合成、转染效果稳定、高效、安全、价格低廉的基因转染载体进行应用。本发明基因转染载体的制备方法利用一系列树形高分子作为骨架，然后二氨基三嗪衍生物共价连接到树形高分子表面制备而成的基因转染载体，获得同时具备合成简易、高转染效率、低毒、低成本的基因转染载体。
本发明提供一种如式(1)所示的基因转染载体，其包括树形高分子骨架和二氨基三嗪功能基团；所述二氨基三嗪基团共价连接在所述树形高分子骨架表面；其中，所述树形高分子包括聚酰胺-胺树形高分子(polyamidoamine，PAMAM)和聚丙烯亚胺树形高分子(poly(propyleneimine)，PPI)；所述树形高分子表面为伯胺基团；
式(1)中，R为如式(2)所示的聚酰胺-胺树形高分子或如式(3)所示的聚丙烯亚胺树形高分子；Y为NH、O、S、或CH2基团；x为树形高分子表面连接的二氨基三嗪的数量，x为1-1024的整数；
式(2)和(3)中，M是树形高分子的核心，其组成包括氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、癸二胺、或1，12-十二烷二胺；n是1-10的整数；m是2-4的整数。
本发明还提出了一种基因转染载体的制备方法，通过反应将二氨基三嗪基团共价连接到树形高分子表面，制备得到所述基因转染载体，即式(1)所示的基因转染载体。具体地，将二氨基三嗪衍生物及树形高分子溶解于水或有机溶剂，加入一定量的碱，在一定温度下搅拌后冷却，除去未反应的二氨基三嗪衍生物以及相关溶剂，即得到所述的基因转染材料。
本发明制备方法中，所述树形高分子如式(2)所示的聚酰胺-胺树形高分子或如式(3)所示的聚丙烯亚胺树形高分子。所述二氨基三嗪衍生物为2-氟-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪，2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪，2-溴-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪，2-碘-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪。
本发明制备方法中，所述有机溶剂包括甲醇，乙醇，二甲亚砜，N，N-二甲基甲酰胺，或四氢呋喃。所述碱为碳酸氢钠，三乙胺，N，N-二异丙基乙胺。
本发明制备方法中，所述反应时间为1小时至120小时。所述反应温度为0摄氏度到150摄氏度。
本发明还提出了如式(1)所示的基因转染载体在体外或体内作为核酸分子的输送载体的应用。
本发明应用中，所述核酸包括DNA、siRNA、shRNA、或经修饰后的核酸等。
本发明还提出了一种复合物，其包括含有如式(1)所示的基于树形高分子和二氨基三嗪功能基团的基因转染载体和核酸，由所述基因转染载体携带所述核酸。
现有众多的基因转染材料大多合成工艺复杂，组成不可控，基因转染效果不佳，毒性较高。与现有技术及市场上的基因转染材料产品比较，本发明如式(1)所示的基于树形高分子和二氨基三嗪功能基团的基因转染材料能够有效且安全地将基因分子输送到细胞中。本发明兼具合成工艺简单、材料组成可控、成本低廉、转染效率高、毒性低等优点。
以绿色荧光蛋白基因和荧光素酶基因作为报告基因，利用本发明转染载体输送质粒，实验表明本发明具有以下优点：本发明在保持高的基因转染效率的同时，保持较好的生物相容性。通过基因转染实验发现，对于不同的细胞系，并且在优化的氮磷比条件下，转染绿色荧光蛋白和荧光素酶的效率与lipofectamine 2000相当，远远高于第5代聚酰胺-胺树形高分子和bPEI 25 kD的转染效率。通过MTT细胞毒性检测实验发现，本发明转染基因载体的细胞毒性较小，在较高转染效率的前提下，呈现出较低的细胞毒性。
附图说明
图1为实施例1中制备基因转染载体G5-DAT66的合成路线及基因载体结构图；
图2为实施例1中所得的基因转染载体G5-DAT66的核磁共振图谱；
图3为实施例1中所得的基因转染载体G5-DAT66与DNA形成的复合物的琼脂糖凝胶电泳图；
图4为实施例1中所得的基因转染载体G5-DAT66与DNA形成的复合物的动态光散射图；
图5为实施例1中所得的基因转染载体G5-DAT66与DNA形成的复合物的zeta电势图；
图6为实施例1中所得的基因转染载体G5-DAT66在293T细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图7为实施例1中所得的基因转染载体G5-DAT66在HeLa细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图8为实施例1中所得的基因转染载体G5-DAT66在MCF-7细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图9为实施例1中所得的基因转染载体G5-DAT66在HepG2细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图10为实施例1中所得的基因转染载体G5-DAT66在COS-7细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图11为实施例1中所得的基因转染载体G5-DAT66在CHO细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图12为实施例1中所得的基因转染载体G5-DAT66在A549细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图13为实施例17中制备基因转染载体G5-DAT55的合成路线及基因载体结构图；
图14为实施例17中所得的基因转染载体G5-DAT55的核磁共振图谱；
图15为实施例17中所得的基因转染载体G5-DAT55与DNA形成的复合物的琼脂糖凝胶电泳图；
图16为实施例17中所得的基因转染载体G5-DAT55与DNA形成的复合物的动态光散射图；
图17为实施例17中所得的基因转染载体G5-DAT55与DNA形成的复合物的zeta电势图；
图18为实施例17中所得的基因转染载体G5-DAT55在293T细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图19为实施例17中所得的基因转染载体G5-DAT55在HeLa细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图20为实施例17中所得的基因转染载体G5-DAT55在MCF-7细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图21为实施例17中所得的基因转染载体G5-DAT55在HepG2细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图22为实施例17中所得的基因转染载体G5-DAT55在COS-7细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图23为实施例17中所得的基因转染载体G5-DAT55在CHO细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图24为实施例17中所得的基因转染载体G5-DAT55在A549细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图25为实施例33中制备基因转染载体G5-DAT46的合成路线及基因载体结构图；
图26为实施例33中所得的基因转染载体G5-DAT46的核磁共振图谱；
图27为实施例33中所得的基因转染载体G5-DAT46与DNA形成的复合物的琼脂糖凝胶电泳图；
图28为实施例33中所得的基因转染载体G5-DAT46与DNA形成的复合物的动态光散射图；
图29为实施例33中所得的基因转染载体G5-DAT46与DNA形成的复合物的zeta电势图；
图30为实施例33中所得的基因转染载体G5-DAT46在293T细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图31为实施例33中所得的基因转染载体G5-DAT46在HeLa细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图32为实施例33中所得的基因转染载体G5-DAT46在MCF-7细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图33为实施例33中所得的基因转染载体G5-DAT46在HepG2细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图34为实施例33中所得的基因转染载体G5-DAT46在COS-7细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图35为实施例33中所得的基因转染载体G5-DAT46在CHO细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图36为实施例33中所得的基因转染载体G5-DAT46在A549细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图37为实施例49中制备基因转染载体G5-DAT29的合成路线及基因载体结构图；
图38为实施例49中所得的基因转染载体G5-DAT29的核磁共振图谱；
图39为实施例49中所得的基因转染载体G5-DAT29在293T细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图40为实施例49中所得的基因转染载体G5-DAT29在HeLa细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图41为实施例49中所得的基因转染载体G5-DAT29在MCF-7细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图42为实施例49中所得的基因转染载体G5-DAT29在HepG2细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图43为实施例49中所得的基因转染载体G5-DAT29在COS-7细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图44为实施例49中所得的基因转染载体G5-DAT29在CHO细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图45为实施例49中所得的基因转染载体G5-DAT29在A549细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图46为实施例57中制备基因转染载体G4-DAT28的合成路线及基因载体结构图；
图47为实施例57中所得的基因转染载体G4-DAT28的核磁共振图谱；
图48为实施例57中所得的基因转染载体G4-DAT28在293T细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图49为实施例57中所得的基因转染载体G4-DAT28在HeLa细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图50为实施例60中制备基因转染载体G3-DAT13的合成路线及基因载体结构图；
图51为实施例60中所得的基因转染载体G3-DAT13的核磁共振图谱；
图52为实施例60中所得的基因转染载体G3-DAT13在293T细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图53为实施例60中所得的基因转染载体G3-DAT13在HeLa细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图54为实施例63中制备基因转染载体G5-PPI-DAT12的合成路线及基因载体结构图；
图55为实施例63中所得的基因转染载体G5-PPI-DAT12的核磁共振图谱；
图56为实施例63中所得的基因转染载体G5-PPI-DAT12在293T细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图57为实施例65中制备基因转染载体G5-PPI-DAT33的合成路线及基因载体结构图；
图58为实施例65中所得的基因转染载体G5-PPI-DAT33的核磁共振图谱；
图59为实施例65中所得的基因转染载体G5-PPI-DAT33在293T细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图；
图60(a)、图60(b)为实施例17中所得的基因转染载体G5-DAT55、Lipofectamine 2000在由MG63细胞形成的体外多细胞瘤上的基因转染效果图；
图61(a)、图60(b)为实施例17中所得的基因转染载体G5-DAT55、Lipofectamine 2000在KM小鼠体内的肌肉基因转染效果图；
图62为实施例1、17、33中所得的基因转染载体的的转染效果示意图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和有线都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、试验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1：基于树形高分子和二氨基三嗪功能基团的基因转染材料G5-DAT66的制备及表征
以基于树形高分子和二氨基三嗪功能基团的基因转染材料G5-DAT66为例，如图1所示，其中G5为第5代聚酰胺-胺树形高分子，中心核为乙二胺，末端基团为伯胺基团，n为6，m为2；DAT为2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪；66为2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪共价连接到第5代聚酰胺-胺树形高分子表面的数量，其结构式为：
式(4)中，R是第5代聚酰胺-胺树形高分子G5；其结构如式(5)所示：
式(5)中，M是第5代聚酰胺-胺树形高分子G5的中心核：乙二胺。
本发明各具体实施例中，M还可以是氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、癸二胺、或1，12-十二烷二胺。
制备合成方法：取63.8毫克的第5代聚酰胺-胺树形高分子溶于8毫升水和无水乙醇1∶1混溶的溶剂中，再加入24.74毫克2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪与14.28毫克碳酸氢钠，将该反应容易在80摄氏度下搅拌反应24小时，然后冷冻干燥，即可得到外观为白色粉末的基因转染材料G5-DAT66。
对按上述步骤制备得到的基因转染材料G5-DAT66进行核磁共振分析，如图2所示：2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪共价连接到第5代聚酰胺-胺树形高分子表面，数量为66个。
实施例2：基因转染材料G5-DAT66与DNA的结合与表征。
(1)用琼脂糖凝胶电泳检测基因转染材料G5-DAT66与DNA结合形成复合物
将实施例1中所制备的基因转染试剂G5-DAT66和绿色荧光蛋白质粒DNA(pEGFP-1)在室温下形成复合物，通过琼脂糖凝胶电泳检测基因转染材料G5-DAT66复合DNA的能力。
具体方法为：将基因转染材料G5-DAT66与绿色荧光蛋白质粒DNA(pEGFP-1)按不同的氮磷比(分别为0∶1，0.5∶1，1∶1，2∶1，4∶1，8∶1)室温下混合，孵育30分钟，然后用DNA上样缓冲液稀释，最后将样品在90伏特电压下进行琼脂糖凝胶电泳实验，实验时间为50分钟，琼脂糖凝胶溶度为1％。所述的氮磷比中，氮为树形大分子表面的伯胺基团数量，为128个；磷为DNA分子中磷酸根基团数量，大约1微克DNA含有3纳摩尔的磷酸根基团。氮磷比即树形大分子表面伯胺基团与DNA分子中磷酸根基团的摩尔比。
实验结果：如图3所示的基因转染材料G5-DAT66与DNA形成的复合物的琼脂糖凝胶电泳图，其中N/P为氮磷比。图3表明基因转染材料G5-DAT66与DNA在2∶1以上的氮磷比混合时形成稳定的复合物。
(2)用动态光散射和zeta电势表征基因转染材料G5-DAT66与DNA(pEGFP-1)复合物
实验方法：将基因转染材料G5-DAT66与1.6微克绿色荧光蛋白质粒DNA(pEGFP-1)按不同的氮磷比(分别为1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，6∶1)室温下混合，稀释至1毫升，孵育30分钟，用纳米粒度仪进行检测。
实验结果：如图4与图5分别所示的基因转染材料G5-DAT66与DNA(pEGFP-1)形成的复合物动态光散射和zeta电势结果，其中N/P为氮磷比。图4与图5表明基因转染材料G5-DAT66与DNA在16∶1以上的氮磷比混合时，所形成的的复合物直径小于200纳米，电势大于30毫伏。
实施例3：基因转染材料G5-DAT66在293T细胞上的的基因转染实验
将实施例1中所制备的基因转染材料G5-DAT66和绿色荧光蛋白质粒或荧光素酶质粒在室温下形成复合物，然后在293T细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白或荧光素酶的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将293T细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白或荧光素酶质粒与G5-DAT66以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。荧光素酶表达量的检测方法参照出厂商(Promega公司)提供的使用说明，Lipofectamine 2000作为阳性对照。
实验结果：(1)如图6所示的基因转染材料G5-DAT66与其他转染材料在293T细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为16，用流式细胞仪定量分析，绿色荧光蛋白基因转染效率达到68％。
(2)同样，基因转染材料G5-DAT66在293T细胞上转染荧光素酶基因，转染氮磷比为16。以Lipofectamine 2000作为阳性对照，用量为2微升。转染结果表明G5-DAT66在293T细胞上，对于荧光素酶基因具有较高的转染效率，高于已经商业化的转染试剂Lipofectamine2000，是其转染效率的2.87倍。
实施例4：基因转染材料G5-DAT66在293T细胞上的细胞毒性
研究实施例1中的基因转染材料G5-DAT66的细胞毒性，具体实验方法是：在96孔板中孵育293T细胞，细胞密度为104细胞/孔，培养12小时候将培养基移出，加入100微升含一定量G5-DAT66的新鲜培养基(含10％血清)，其浓度为转染浓度，培养48小时。通过MTT法检测细胞毒性。
实验结果：通过检测基因转染材料G5-DAT66在293T细胞上的细胞毒性，293T细胞的存活率达到91％，表明基因转染材料G5-DAT66对于293T细胞具有较低的细胞毒性。
实施例5：基因转染材料G5-DAT66在HeLa细胞上的的基因转染实验
将实施例1中所制备的基因转染材料G5-DAT66和绿色荧光蛋白质粒或荧光素酶质粒在室温下形成复合物，然后在HeLa细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白或荧光素酶的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将HeLa细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白或荧光素酶质粒与G5-DAT66以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。荧光素酶表达量的检测方法参照出厂商(Promega公司)提供的使用说明，Lipofectamine 2000作为阳性对照。
实验结果：(1)如图7所示的基因转染材料G5-DAT66与其他转染材料在HeLa细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为32，用流式细胞仪定量分析，绿色荧光蛋白基因转染效率达到62％。
(2)同样，基因转染材料G5-DAT66在HeLa细胞上转染荧光素酶基因，转染氮磷比为32。以Lipofectamine 2000作为阳性对照，用量为2微升。转染结果表明G5-DAT66在HeLa细胞上，对于荧光素酶基因具有较高的转染效率，高于已经商业化的转染试剂Lipofectamine2000，是其转染效率的3.47倍。
实施例6：基因转染材料G5-DAT66在HeLa细胞上的细胞毒性
研究实施例1中的基因转染材料G5-DAT66的细胞毒性，具体实验方法是：在96孔板中孵育HeLa细胞，细胞密度为104细胞/孔，培养12小时候将培养基移出，加入100微升含一定量G5-DAT66的新鲜培养基(含10％血清)，其浓度为转染浓度，培养48小时。通过MTT法检测细胞毒性。
实验结果：通过检测基因转染材料G5-DAT66在HeLa细胞上的细胞毒性，HeLa细胞的存活率达到93％，表明基因转染材料G5-DAT66对于HeLa细胞具有较低的细胞毒性。
实施例7：基因转染材料G5-DAT66在MCF-7细胞上的的基因转染实验
将实施例1中所制备的基因转染材料G5-DAT66和绿色荧光蛋白质粒在室温下形成复合物，然后在MCF-7细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将MCF-7细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白质粒与G5-DAT66以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。
实验结果：如图8所示的基因转染材料G5-DAT66与其他转染材料在MCF-7细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为64，用流式细胞仪定量分析，绿色荧光蛋白基因转染效率达到21％。
实施例8：基因转染材料G5-DAT66在MCF-7细胞上的细胞毒性
研究实施例1中的基因转染材料G5-DAT66的细胞毒性，具体实验方法是：在96孔板中孵育MCF-7细胞，细胞密度为104细胞/孔，培养12小时候将培养基移出，加入100微升含一定量G5-DAT66的新鲜培养基(含10％血清)，其浓度为转染浓度，培养48小时。通过MTT法检测细胞毒性。
实验结果：通过检测基因转染材料G5-DAT66在MCF-7细胞上的细胞毒性，MCF-7细胞的存活率达到80％，表明基因转染材料G5-DAT66对于MCF-7细胞具有较低的细胞毒性。
实施例9：基因转染材料G5-DAT66在HepG2细胞上的的基因转染实验
将实施例1中所制备的基因转染材料G5-DAT66和绿色荧光蛋白质粒在室温下形成复合物，然后在HepG2细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将HepG2细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白质粒与G5-DAT66以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。
实验结果：如图9所示的基因转染材料G5-DAT66与其他转染材料在HepG2细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为32，用流式细胞仪定量分析，绿色荧光蛋白基因转染效率达到5.3％。
实施例10：基因转染材料G5-DAT66在HepG2细胞上的细胞毒性
研究实施例1中的基因转染材料G5-DAT66的细胞毒性，具体实验方法是：在96孔板中孵育HepG2细胞，细胞密度为104细胞/孔，培养12小时候将培养基移出，加入100微升含一定量G5-DAT66的新鲜培养基(含10％血清)，其浓度为转染浓度，培养48小时。通过MTT法检测细胞毒性。
实验结果：通过检测基因转染材料G5-DAT66在HepG2细胞上的细胞毒性，HepG2细胞的存活率达到92％，表明基因转染材料G5-DAT66对于HepG2细胞具有较低的细胞毒性。
实施例11：基因转染材料G5-DAT66在COS-7细胞上的的基因转染实验
将实施例1中所制备的基因转染材料G5-DAT66和绿色荧光蛋白质粒或荧光素酶质粒在室温下形成复合物，然后在COS-7细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白或荧光素酶的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将COS-7细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白或荧光素酶质粒与G5-DAT66以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。荧光素酶表达量的检测方法参照出厂商(Promega公司)提供的使用说明，Lipofectamine 2000作为阳性对照。
实验结果：(1)如图10所示的基因转染材料G5-DAT66与其他转染材料在COS-7细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为32，用流式细胞仪定量分析，绿色荧光蛋白基因转染效率达到43％。
(2)同样，基因转染材料G5-DAT66在COS-7细胞上转染荧光素酶基因，转染氮磷比为32。以Lipofectamine 2000作为阳性对照，用量为1微升。转染结果表明G5-DAT66在COS-7细胞上，对于荧光素酶基因具有较高的转染效率，高于已经商业化的转染试剂Lipofectamine2000，是其转染效率的7.18倍。
实施例12：基因转染材料G5-DAT66在COS-7细胞上的细胞毒性
研究实施例1中的基因转染材料G5-DAT66的细胞毒性，具体实验方法是：在96孔板中孵育COS-7细胞，细胞密度为104细胞/孔，培养12小时候将培养基移出，加入100微升含一定量G5-DAT66的新鲜培养基(含10％血清)，其浓度为转染浓度，培养48小时。通过MTT法检测细胞毒性。
实验结果：通过检测基因转染材料G5-DAT66在COS-7细胞上的细胞毒性，COS-7细胞的存活率达到97％，表明基因转染材料G5-DAT66对于COS-7细胞具有较低的细胞毒性。
实施例13：基因转染材料G5-DAT66在CHO细胞上的的基因转染实验
将实施例1中所制备的基因转染材料G5-DAT66和绿色荧光蛋白质粒在室温下形成复合物，然后在CHO细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将CHO细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白质粒与G5-DAT66以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。
实验结果：如图11所示的基因转染材料G5-DAT66与其他转染材料在CHO细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为48，用流式细胞仪定量分析，绿色荧光蛋白基因转染效率达到56％。
实施例14：基因转染材料G5-DAT66在CHO细胞上的细胞毒性
研究实施例1中的基因转染材料G5-DAT66的细胞毒性，具体实验方法是：在96孔板中孵育CHO细胞，细胞密度为104细胞/孔，培养12小时候将培养基移出，加入100微升含一定量G5-DAT66的新鲜培养基(含10％血清)，其浓度为转染浓度，培养48小时。通过MTT法检测细胞毒性。
实验结果：通过检测基因转染材料G5-DAT66在CHO细胞上的细胞毒性，CHO细胞的存活率达到89％，表明基因转染材料G5-DAT66对于CHO细胞具有较低的细胞毒性。
实施例15：基因转染材料G5-DAT66在A549细胞上的的基因转染实验
将实施例1中所制备的基因转染材料G5-DAT66和绿色荧光蛋白质粒在室温下形成复合物，然后在A549细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将A549细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白或荧光素酶质粒与G5-DAT66以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。
实验结果：如图12所示的基因转染材料G5-DAT66与其他转染材料在A549细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为48，用流式细胞仪定量分析，绿色荧光蛋白基因转染效率达到24％。
实施例16：基因转染材料G5-DAT66在A549细胞上的细胞毒性
研究实施例1中的基因转染材料G5-DAT66的细胞毒性，具体实验方法是：在96孔板中孵育A549细胞，细胞密度为104细胞/孔，培养12小时候将培养基移出，加入100微升含一定量G5-DAT66的新鲜培养基(含10％血清)，其浓度为转染浓度，培养48小时。通过MTT法检测细胞毒性。
实验结果：通过检测基因转染材料G5-DAT66在A549细胞上的细胞毒性，A549细胞的存活率达到100％，表明基因转染材料G5-DAT66对于A549细胞具有较低的细胞毒性。
实施例17：基于树形高分子和二氨基三嗪功能基团的基因转染材料G5-DAT55的制备及表征
以基于树形高分子和二氨基三嗪功能基团的基因转染材料G5-DAT55为例，如图13所示，其中G5为第5代聚酰胺-胺树形高分子，中心核为乙二胺，末端基团为伯胺基团，n为6，m为2；DAT为2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪；55为2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪共价连接到第5代聚酰胺-胺树形高分子表面的数量，其结构式为：
式(6)中，R是第5代聚酰胺-胺树形高分子G5；其结构如式(5)所示：
式(5)中，M是第5代聚酰胺-胺树形高分子G5的中心核：乙二胺。
本发明具体实施中，M还可以是氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、癸二胺、或1，12-十二烷二胺。
制备合成方法：取43毫克的第5代聚酰胺-胺树形高分子溶于6毫升水和无水乙醇1∶1混溶的溶剂中，再加入13.9毫克2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪与8毫克碳酸氢钠，将该反应容易在80摄氏度下搅拌反应24小时，然后冷冻干燥，即可得到外观为白色粉末的基因转染材料G5-DAT55。
对按上述步骤制备得到的基因转染材料G5-DAT55进行核磁共振分析，如图14所示：2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪共价连接到第5代聚酰胺-胺树形高分子表面，数量为55个。
实施例18：基因转染材料G5-DAT55与DNA的结合与表征。
(1)用琼脂糖凝胶电泳检测基因转染材料G5-DAT55与DNA结合形成复合物
将实施例17中所制备的基因转染试剂G5-DAT55和绿色荧光蛋白质粒DNA(pEGFP-1)在室温下形成复合物，通过琼脂糖凝胶电泳检测基因转染材料G5-DAT55复合DNA的能力。
具体方法为：将基因转染材料G5-DAT55与绿色荧光蛋白质粒DNA(pEGFP-1)按不同的氮磷比(分别为0∶1，0.5∶1，1∶1，2∶1，4∶1，8∶1)室温下混合，孵育30分钟，然后用DNA上样缓冲液稀释，最后将样品在90伏特电压下进行琼脂糖凝胶电泳实验，实验时间为50分钟，琼脂糖凝胶溶度为1％。所述的氮磷比中，氮为树形大分子表面的伯胺基团数量，为128个；磷为DNA分子中磷酸根基团数量，大约1微克DNA含有3纳摩尔的磷酸根基团。氮磷比即树形大分子表面伯胺基团与DNA分子中磷酸根基团的摩尔比。
实验结果：如图15所示的基因转染材料G5-DAT55与DNA形成的复合物的琼脂糖凝胶电泳图，其中N/P为氮磷比。图15表明基因转染材料G5-DAT55与DNA在2∶1以上的氮磷比混合时形成稳定的复合物。
(2)用动态光散射和zeta电势表征基因转染材料G5-DAT55与DNA(pEGFP-1)复合物
实验方法：将基因转染材料G5-DAT55与1.6微克绿色荧光蛋白质粒DNA(pEGFP-1)按不同的氮磷比(分别为1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，6∶1)室温下混合，稀释至1毫升，孵育30分钟，用纳米粒度仪进行检测。
实验结果：如图16与图17分别所示的基因转染材料G5-DAT55与DNA(pEGFP-1)形成的复合物动态光散射图和zeta电势图，其中N/P为氮磷比。图16和图17表明基因转染材料G5-DAT55与DNA在16∶1以上的氮磷比混合时，所形成的的复合物直径小于200纳米，电势大于40毫伏。
实施例19：基因转染材料G5-DAT55在293T细胞上的的基因转染实验
将实施例17中所制备的基因转染材料G5-DAT55和绿色荧光蛋白质粒或荧光素酶质粒在室温下形成复合物，然后在293T细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白或荧光素酶的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将293T细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白或荧光素酶质粒与G5-DAT55以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。荧光素酶表达量的检测方法参照出厂商(Promega公司)提供的使用说明，Lipofectamine 2000作为阳性对照。
实验结果：(1)如图18所示的基因转染材料G5-DAT55与其他转染材料在293T细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为16，用流式细胞仪定量分析，绿色荧光蛋白基因转染效率达到75％。
(2)同样，基因转染材料G5-DAT55在293T细胞上转染荧光素酶基因，转染氮磷比为16。以Lipofectamine 2000作为阳性对照，用量为2微升。转染结果表明G5-DAT55在293T细胞上，对于荧光素酶基因具有较高的转染效率，高于已经商业化的转染试剂Lipofectamine2000，是其转染效率的7.74倍。
实施例20：基因转染材料G5-DAT55在293T细胞上的细胞毒性
研究实施例17中的基因转染材料G5-DAT55的细胞毒性，具体实验方法是：在96孔板中孵育293T细胞，细胞密度为104细胞/孔，培养12小时候将培养基移出，加入100微升含一定量G5-DAT55的新鲜培养基(含10％血清)，其浓度为转染浓度，培养48小时。通过MTT法检测细胞毒性。
实验结果：通过检测基因转染材料G5-DAT55在293T细胞上的细胞毒性，293T细胞的存活率达到81％，表明基因转染材料G5-DAT55对于293T细胞具有较低的细胞毒性。
实施例21：基因转染材料G5-DAT55在HeLa细胞上的的基因转染实验
将实施例17中所制备的基因转染材料G5-DAT55和绿色荧光蛋白质粒或荧光素酶质粒在室温下形成复合物，然后在HeLa细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白或荧光素酶的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将HeLa细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白或荧光素酶质粒与G5-DAT55以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。荧光素酶表达量的检测方法参照出厂商(Promega公司)提供的使用说明，Lipofectamine 2000作为阳性对照。
实验结果：(1)如图19所示的基因转染材料G5-DAT55与其他转染材料在HeLa细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为24，用流式细胞仪定量分析，绿色荧光蛋白基因转染效率达到62％。
(2)同样，基因转染材料G5-DAT55在HeLa细胞上转染荧光素酶基因，转染氮磷比为24。以Lipofectamine 2000作为阳性对照，用量为2微升。转染结果表明G5-DAT55在HeLa细胞上，对于荧光素酶基因具有较高的转染效率，高于已经商业化的转染试剂Lipofectamine2000，是其转染效率的5.70倍。
实施例22：基因转染材料G5-DAT55在HeLa细胞上的细胞毒性
研究实施例17中的基因转染材料G5-DAT55的细胞毒性，具体实验方法是：在96孔板中孵育HeLa细胞，细胞密度为104细胞/孔，培养12小时候将培养基移出，加入100微升含一定量G5-DAT55的新鲜培养基(含10％血清)，其浓度为转染浓度，培养48小时。通过MTT法检测细胞毒性。
实验结果：通过检测基因转染材料G5-DAT55在HeLa细胞上的细胞毒性，HeLa细胞的存活率达到96％，表明基因转染材料G5-DAT55对于HeLa细胞具有较低的细胞毒性。
实施例23：基因转染材料G5-DAT55在MCF-7细胞上的的基因转染实验
将实施例17中所制备的基因转染材料G5-DAT55和绿色荧光蛋白质粒在室温下形成复合物，然后在MCF-7细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将MCF-7细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白质粒与G5-DAT55以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。
实验结果：(1)如图20所示的基因转染材料G5-DAT66与其他转染材料在MCF-7细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为32，用流式细胞仪定量分析，绿色荧光蛋白基因转染效率达到25％。
实施例24：基因转染材料G5-DAT55在MCF-7细胞上的细胞毒性
研究实施例17中的基因转染材料G5-DAT55的细胞毒性，具体实验方法是：在96孔板中孵育MCF-7细胞，细胞密度为104细胞/孔，培养12小时候将培养基移出，加入100微升含一定量G5-DAT55的新鲜培养基(含10％血清)，其浓度为转染浓度，培养48小时。通过MTT法检测细胞毒性。
实验结果：通过检测基因转染材料G5-DAT55在MCF-7细胞上的细胞毒性，MCF-7细胞的存活率达到76％，表明基因转染材料G5-DAT55对于MCF-7细胞具有较低的细胞毒性。
实施例25：基因转染材料G5-DAT55在HepG2细胞上的的基因转染实验
将实施例17中所制备的基因转染材料G5-DAT55和绿色荧光蛋白质粒在室温下形成复合物，然后在HepG2细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将HepG2细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白质粒与G5-DAT55以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。
实验结果：(1)如图21所示的基因转染材料G5-DAT55与其他转染材料在HepG2细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为32，用流式细胞仪定量分析，绿色荧光蛋白基因转染效率达到14％。
实施例26：基因转染材料G5-DAT55在HepG2细胞上的细胞毒性
研究实施例17中的基因转染材料G5-DAT55的细胞毒性，具体实验方法是：在96孔板中孵育HepG2细胞，细胞密度为104细胞/孔，培养12小时候将培养基移出，加入100微升含一定量G5-DAT55的新鲜培养基(含10％血清)，其浓度为转染浓度，培养48小时。通过MTT法检测细胞毒性。
实验结果：通过检测基因转染材料G5-DAT55在HepG2细胞上的细胞毒性，HepG2细胞的存活率达到86％，表明基因转染材料G5-DAT55对于HepG2细胞具有较低的细胞毒性。
实施例27：基因转染材料G5-DAT55在COS-7细胞上的的基因转染实验
将实施例17中所制备的基因转染材料G5-DAT55和绿色荧光蛋白质粒或荧光素酶质粒在室温下形成复合物，然后在COS-7细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白或荧光素酶的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将COS-7细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白或荧光素酶质粒与G5-DAT55以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。荧光素酶表达量的检测方法参照出厂商(Promega公司)提供的使用说明，Lipofectamine 2000作为阳性对照。
实验结果：(1)如图22所示的基因转染材料G5-DAT55与其他转染材料在COS-7细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为16，用流式细胞仪定量分析，绿色荧光蛋白基因转染效率达到47％。
(2)同样，基因转染材料G5-DAT556在COS-7细胞上转染荧光素酶基因，转染氮磷比为16。以Lipofectamine 2000作为阳性对照，用量为1微升。转染结果表明G5-DAT55在COS-7细胞上，对于荧光素酶基因具有较高的转染效率，高于已经商业化的转染试剂Lipofectamine2000，是其转染效率的8.25倍。
实施例28：基因转染材料G5-DAT55在COS-7细胞上的细胞毒性
研究实施例17中的基因转染材料G5-DAT55的细胞毒性，具体实验方法是：在96孔板中孵育COS-7细胞，细胞密度为104细胞/孔，培养12小时候将培养基移出，加入100微升含一定量G5-DAT55的新鲜培养基(含10％血清)，其浓度为转染浓度，培养48小时。通过MTT法检测细胞毒性。
实验结果：通过检测基因转染材料G5-DAT55在COS-7细胞上的细胞毒性，COS-7细胞的存活率达到92％，表明基因转染材料G5-DAT55对于COS-7细胞具有较低的细胞毒性。
实施例29：基因转染材料G5-DAT55在CHO细胞上的的基因转染实验
将实施例17中所制备的基因转染材料G5-DAT55和绿色荧光蛋白质粒在室温下形成复合物，然后在CHO细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将CHO细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白质粒与G5-DAT55以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。
实验结果：(1)如图23所示的基因转染材料G5-DAT55与其他转染材料在CHO细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为32，用流式细胞仪定量分析，绿色荧光蛋白基因转染效率达到76％。
实施例30：基因转染材料G5-DAT55在CHO细胞上的细胞毒性
研究实施例1中的基因转染材料G5-DAT55的细胞毒性，具体实验方法是：在96孔板中孵育CHO细胞，细胞密度为104细胞/孔，培养12小时候将培养基移出，加入100微升含一定量G5-DAT55的新鲜培养基(含10％血清)，其浓度为转染浓度，培养48小时。通过MTT法检测细胞毒性。
实验结果：通过检测基因转染材料G5-DAT55在CHO细胞上的细胞毒性，CHO细胞的存活率达到83％，表明基因转染材料G5-DAT55对于CHO细胞具有较低的细胞毒性。
实施例31：基因转染材料G5-DAT55在A549细胞上的的基因转染实验
将实施例1中所制备的基因转染材料G5-DAT55和绿色荧光蛋白质粒在室温下形成复合物，然后在A549细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将A549细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白质粒与G5-DAT55以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。
实验结果：如图24所示的基因转染材料G5-DAT55与其他转染材料在A549细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为32，用流式细胞仪定量分析，绿色荧光蛋白基因转染效率达到25％。
实施例32：基因转染材料G5-DAT55在A549细胞上的细胞毒性
研究实施例1中的基因转染材料G5-DAT55的细胞毒性，具体实验方法是：在96孔板中孵育A549细胞，细胞密度为104细胞/孔，培养12小时候将培养基移出，加入100微升含一定量G5-DAT55的新鲜培养基(含10％血清)，其浓度为转染浓度，培养48小时。通过MTT法检测细胞毒性。
实验结果：通过检测基因转染材料G5-DAT55在A549细胞上的细胞毒性，A549细胞的存活率达到99％，表明基因转染材料G5-DAT55对于A549细胞具有较低的细胞毒性。
实施例33：基于树形高分子和二氨基三嗪功能基团的基因转染材料G5-DAT46的制备及表征
以基于树形高分子和二氨基三嗪功能基团的基因转染材料G5-DAT46为例，如图25所示，其中G5为第5代聚酰胺-胺树形高分子，中心核为乙二胺，末端基团为伯胺基团，n为6，m为2；DAT为2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪；46为2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪共价连接到第5代聚酰胺-胺树形高分子表面的数量，其结构式为：
式(7)中，R是第5代聚酰胺-胺树形高分子G5；其结构如式(5)所示：
式(5)中，M是第5代聚酰胺-胺树形高分子G5的中心核：乙二胺。
本发明具体实施中，M还可以是氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、癸二胺、或1，12-十二烷二胺。
制备合成方法：取74.9毫克的第5代聚酰胺-胺树形高分子溶于8毫升水和无水乙醇1：1混溶的溶剂中，再加入19.36毫克2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪与11.17毫克碳酸氢钠，将该反应容易在80摄氏度下搅拌反应24小时，然后冷冻干燥，即可得到外观为白色粉末的基因转染材料G5-DAT46。
对按上述步骤制备得到的基因转染材料G5-DAT46进行核磁共振分析，如图26所示：2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪共价连接到第5代聚酰胺-胺树形高分子表面，数量为46个。
实施例34：基因转染材料G5-DAT46与DNA的结合与表征。
(1)用琼脂糖凝胶电泳检测基因转染材料G5-DAT46与DNA结合形成复合物
将实施例1中所制备的基因转染试剂G5-DAT46和绿色荧光蛋白质粒DNA(pEGFP-1)在室温下形成复合物，通过琼脂糖凝胶电泳检测基因转染材料G5-DAT46复合DNA的能力。
具体方法为：将基因转染材料G5-DAT46与绿色荧光蛋白质粒DNA(pEGFP-1)按不同的氮磷比(分别为0∶1，0.5∶1，1∶1，2∶1，4∶1，8∶1)室温下混合，孵育30分钟，然后用DNA上样缓冲液稀释，最后将样品在90伏特电压下进行琼脂糖凝胶电泳实验，实验时间为50分钟，琼脂糖凝胶溶度为1％。所述的氮磷比中，氮为树形大分子表面的伯胺基团数量，为128个；磷为DNA分子中磷酸根基团数量，大约1微克DNA含有3纳摩尔的磷酸根基团。氮磷比即树形大分子表面伯胺基团与DNA分子中磷酸根基团的摩尔比。
实验结果：如图27所示的基因转染材料G5-DAT46与DNA形成的复合物的琼脂糖凝胶电泳图，其中N/P为氮磷比。图27表明基因转染材料G5-DAT46与DNA在2∶1以上的氮磷比混合时形成稳定的复合物。
(2)用动态光散射和zeta电势表征基因转染材料G5-DAT46与DNA(pEGFP-1)复合物
实验方法：将基因转染材料G5-DAT46与1.6微克绿色荧光蛋白质粒DNA(pEGFP-1)按不同的氮磷比(分别为1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，6∶1)室温下混合，稀释至1毫升，孵育30分钟，用纳米粒度仪进行检测。
实验结果：如图28和图29分别所示的基因转染材料G5-DAT46与DNA(pEGFP-1)形成的复合物动态光散射和zeta电势结果，其中N/P为氮磷比。图28和图29表明基因转染材料G5-DAT46与DNA在16∶1以上的氮磷比混合时，所形成的的复合物直径小于200纳米，电势大于40毫伏。
实施例35：基因转染材料G5-DAT46在293T细胞上的的基因转染实验
将实施例33中所制备的基因转染材料G5-DAT46和绿色荧光蛋白质粒或荧光素酶质粒在室温下形成复合物，然后在293T细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白或荧光素酶的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将293T细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白或荧光素酶质粒与G5-DAT46以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。荧光素酶表达量的检测方法参照出厂商(Promega公司)提供的使用说明，Lipofectamine 2000作为阳性对照。
实验结果：(1)如图30所示的基因转染材料G5-DAT46与其他转染材料在293T细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为16，用流式细胞仪定量分析，绿色荧光蛋白基因转染效率达到63％。
(2)同样，基因转染材料G5-DAT46在293T细胞上转染荧光素酶基因，转染氮磷比为16。以Lipofectamine 2000作为阳性对照，用量为2微升。转染结果表明G5-DAT46在293T细胞上，对于荧光素酶基因具有较高的转染效率，高于已经商业化的转染试剂Lipofectamine2000，是其转染效率的4.92倍。
实施例36：基因转染材料G5-DAT46在293T细胞上的细胞毒性
研究实施例33中的基因转染材料G5-DAT46的细胞毒性，具体实验方法是：在96孔板中孵育293T细胞，细胞密度为104细胞/孔，培养12小时候将培养基移出，加入100微升含一定量G5-DAT46的新鲜培养基(含10％血清)，其浓度为转染浓度，培养48小时。通过MTT法检测细胞毒性。
实验结果：通过检测基因转染材料G5-DAT46在293T细胞上的细胞毒性，293T细胞的存活率达到70％，表明基因转染材料G5-DAT46对于293T细胞具有较低的细胞毒性。
实施例37：基因转染材料G5-DAT46在HeLa细胞上的的基因转染实验
将实施例33中所制备的基因转染材料G5-DAT46和绿色荧光蛋白质粒或荧光素酶质粒在室温下形成复合物，然后在HeLa细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白或荧光素酶的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将HeLa细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白或荧光素酶质粒与G5-DAT46以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。荧光素酶表达量的检测方法参照出厂商(Promega公司)提供的使用说明，Lipofectamine 2000作为阳性对照。
实验结果：(1)如图31所示的基因转染材料G5-DAT46与其他转染材料在HeLa细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为16，用流式细胞仪定量分析，绿色荧光蛋白基因转染效率达到63％。
(2)同样，基因转染材料G5-DAT46在HeLa细胞上转染荧光素酶基因，转染氮磷比为16。以Lipofectamine 2000作为阳性对照，用量为2微升。转染结果表明G5-DAT46在HeLa细胞上，对于荧光素酶基因具有较高的转染效率，高于已经商业化的转染试剂Lipofectamine2000，是其转染效率的7.73倍。
实施例38：基因转染材料G5-DAT46在HeLa细胞上的细胞毒性
研究实施例33中的基因转染材料G5-DAT46的细胞毒性，具体实验方法是：在96孔板中孵育HeLa细胞，细胞密度为104细胞/孔，培养12小时候将培养基移出，加入100微升含一定量G5-DAT46的新鲜培养基(含10％血清)，其浓度为转染浓度，培养48小时。通过MTT法检测细胞毒性。
实验结果：通过检测基因转染材料G5-DAT46在HeLa细胞上的细胞毒性，HeLa细胞的存活率达到98％，表明基因转染材料G5-DAT46对于HeLa细胞具有较低的细胞毒性。
实施例39：基因转染材料G5-DAT46在MCF-7细胞上的的基因转染实验
将实施例33中所制备的基因转染材料G5-DAT46和绿色荧光蛋白质粒在室温下形成复合物，然后在MCF-7细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将MCF-7细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白质粒与G5-DAT46以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。
实验结果：如图32所示的基因转染材料G5-DAT66与其他转染材料在MCF-7细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为16，用流式细胞仪定量分析，绿色荧光蛋白基因转染效率达到28％。
实施例40：基因转染材料G5-DAT46在MCF-7细胞上的细胞毒性
研究实施例33中的基因转染材料G5-DAT46的细胞毒性，具体实验方法是：在96孔板中孵育MCF-7细胞，细胞密度为104细胞/孔，培养12小时候将培养基移出，加入100微升含一定量G5-DAT46的新鲜培养基(含10％血清)，其浓度为转染浓度，培养48小时。通过MTT法检测细胞毒性。
实验结果：通过检测基因转染材料G5-DAT46在MCF-7细胞上的细胞毒性，MCF-7细胞的存活率达到80％，表明基因转染材料G5-DAT46对于MCF-7细胞具有较低的细胞毒性。
实施例41：基因转染材料G5-DAT46在HepG2细胞上的的基因转染实验
将实施例33中所制备的基因转染材料G5-DAT46和绿色荧光蛋白质粒在室温下形成复合物，然后在HepG2细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将HepG2细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白质粒与G5-DAT46以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。
实验结果：如图33所示的基因转染材料G5-DAT46与其他转染材料在HepG2细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为32，用流式细胞仪定量分析，绿色荧光蛋白基因转染效率达到14％。
实施例42：基因转染材料G5-DAT46在HepG2细胞上的细胞毒性
研究实施例33中的基因转染材料G5-DAT46的细胞毒性，具体实验方法是：在96孔板中孵育HepG2细胞，细胞密度为104细胞/孔，培养12小时候将培养基移出，加入100微升含一定量G5-DAT46的新鲜培养基(含10％血清)，其浓度为转染浓度，培养48小时。通过MTT法检测细胞毒性。
实验结果：通过检测基因转染材料G5-DAT46在HepG2细胞上的细胞毒性，HepG2细胞的存活率达到86％，表明基因转染材料G5-DAT46对于HepG2细胞具有较低的细胞毒性。
实施例43：基因转染材料G5-DAT46在COS-7细胞上的的基因转染实验
将实施例33中所制备的基因转染材料G5-DAT46和绿色荧光蛋白质粒或荧光素酶质粒在室温下形成复合物，然后在COS-7细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白或荧光素酶的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将COS-7细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白或荧光素酶质粒与G5-DAT46以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。荧光素酶表达量的检测方法参照出厂商(Promega公司)提供的使用说明，Lipofectamine 2000作为阳性对照。
实验结果：(1)如图34所示的基因转染材料G5-DAT46与其他转染材料在COS-7细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为16，用流式细胞仪定量分析，绿色荧光蛋白基因转染效率达到47％。
(2)同样，基因转染材料G5-DAT46在COS-7细胞上转染荧光素酶基因，转染氮磷比为16。以Lipofectamine 2000作为阳性对照，用量为1微升。转染结果表明G5-DAT46在COS-7细胞上，对于荧光素酶基因具有较高的转染效率，高于已经商业化的转染试剂Lipofectamine2000，是其转染效率的3.47倍。
实施例44：基因转染材料G5-DAT46在COS-7细胞上的细胞毒性
研究实施例33中的基因转染材料G5-DAT46的细胞毒性，具体实验方法是：在96孔板中孵育COS-7细胞，细胞密度为104细胞/孔，培养12小时候将培养基移出，加入100微升含一定量G5-DAT46的新鲜培养基(含10％血清)，其浓度为转染浓度，培养48小时。通过MTT法检测细胞毒性。
实验结果：通过检测基因转染材料G5-DAT46在COS-7细胞上的细胞毒性，COS-7细胞的存活率达到96％，表明基因转染材料G5-DAT46对于COS-7细胞具有较低的细胞毒性。
实施例45：基因转染材料G5-DAT46在CHO细胞上的的基因转染实验
将实施例33中所制备的基因转染材料G5-DAT46和绿色荧光蛋白质粒在室温下形成复合物，然后在CHO细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将CHO细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白质粒与G5-DAT46以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。
实验结果：如图35所示的基因转染材料G5-DAT46与其他转染材料在CHO细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为32，用流式细胞仪定量分析，绿色荧光蛋白基因转染效率达到76％。
实施例46：基因转染材料G5-DAT46在CHO细胞上的细胞毒性
研究实施例33中的基因转染材料G5-DAT46的细胞毒性，具体实验方法是：在96孔板中孵育CHO细胞，细胞密度为104细胞/孔，培养12小时候将培养基移出，加入100微升含一定量G5-DAT46的新鲜培养基(含10％血清)，其浓度为转染浓度，培养48小时。通过MTT法检测细胞毒性。
实验结果：通过检测基因转染材料G5-DAT46在CHO细胞上的细胞毒性，CHO细胞的存活率达到72％，表明基因转染材料G5-DAT46对于CHO细胞具有较低的细胞毒性。
实施例47：基因转染材料G5-DAT46在A549细胞上的的基因转染实验
将实施例1中所制备的基因转染材料G5-DAT46和绿色荧光蛋白质粒在室温下形成复合物，然后在A549细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将A549细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白质粒与G5-DAT46以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。
实验结果：(1)如图36所示的基因转染材料G5-DAT46与其他转染材料在A549细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为32，用流式细胞仪定量分析，绿色荧光蛋白基因转染效率达到25％。
实施例48：基因转染材料G5-DAT46在A549细胞上的细胞毒性
研究实施例33中的基因转染材料G5-DAT46的细胞毒性，具体实验方法是：在96孔板中孵育A549细胞，细胞密度为104细胞/孔，培养12小时候将培养基移出，加入100微升含一定量G5-DAT46的新鲜培养基(含10％血清)，其浓度为转染浓度，培养48小时。通过MTT法检测细胞毒性。
实验结果：通过检测基因转染材料G5-DAT46在A549细胞上的细胞毒性，A549细胞的存活率达到95％，表明基因转染材料G5-DAT46对于A549细胞具有较低的细胞毒性。
实施例49：基于树形高分子和二氨基三嗪功能基团的基因转染材料G5-DAT29的制备及表征
以基于树形高分子和二氨基三嗪功能基团的基因转染材料G5-DAT29为例，如图37所示，其中G5为第5代聚酰胺-胺树形高分子，中心核为乙二胺，末端基团为伯胺基团，n为6，m为2；DAT为2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪；29为2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪共价连接到第5代聚酰胺-胺树形高分子表面的数量，其结构式为：
式(8)中，R是第5代聚酰胺-胺树形高分子G5；其结构如式(5)所示：
式(5)中，M是第5代聚酰胺-胺树形高分子G5的中心核：乙二胺。
本发明具体实施中，M还可以是氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、癸二胺、或1，12-十二烷二胺。
制备合成方法：取41.9毫克的第5代聚酰胺-胺树形高分子溶于6毫升水和无水乙醇1∶1混溶的溶剂中，再加入6.8毫克2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪与3.9毫克碳酸氢钠，将该反应容易在80摄氏度下搅拌反应24小时，然后冷冻干燥，即可得到外观为白色粉末的基因转染材料G5-DAT29。
对按上述步骤制备得到的基因转染材料G5-DAT29进行核磁共振分析，如图38所示：2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪共价连接到第5代聚酰胺-胺树形高分子表面，数量为29个。
实施例50：基因转染材料G5-DAT29在293T细胞上的的基因转染实验
将实施例49中所制备的基因转染材料G5-DAT29和绿色荧光蛋白质粒在室温下形成复合物，然后在293T细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将293T细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白质粒与G5-DAT29以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。
实验结果：如图39所示的基因转染材料G5-DAT29与其他转染材料在293T细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为8，用流式细胞仪定量分析，绿色荧光蛋白基因转染效率达到61％。
实施例51：基因转染材料G5-DAT29在HeLa细胞上的的基因转染实验
将实施例49中所制备的基因转染材料G5-DAT29和绿色荧光蛋白质粒在室温下形成复合物，然后在HeLa细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将HeLa细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白质粒与G5-DAT29以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。
实验结果：如图40所示的基因转染材料G5-DAT29与其他转染材料在HeLa细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为16，用流式细胞仪定量分析，绿色荧光蛋白基因转染效率达到33％。
实施例52：基因转染材料G5-DAT29在MCF-7细胞上的的基因转染实验
将实施例49中所制备的基因转染材料G5-DAT29和绿色荧光蛋白质粒在室温下形成复合物，然后在MCF-7细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将MCF-7细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白质粒与G5-DAT29以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。
实验结果：如图41所示的基因转染材料G5-DAT29与其他转染材料在MCF-7细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为16，用流式细胞仪定量分析，绿色荧光蛋白基因转染效率达到8％。
实施例53：基因转染材料G5-DAT29在HepG2细胞上的的基因转染实验
将实施例49中所制备的基因转染材料G5-DAT29和绿色荧光蛋白质粒在室温下形成复合物，然后在HepG2细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将HepG2细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白质粒与G5-DAT29以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。
实验结果：如图42所示的基因转染材料G5-DAT29与其他转染材料在HepG2细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为16，用流式细胞仪定量分析，绿色荧光蛋白基因转染效率达到10％。
实施例54：基因转染材料G5-DAT29在COS-7细胞上的的基因转染实验
将实施例49中所制备的基因转染材料G5-DAT29和绿色荧光蛋白质粒在室温下形成复合物，然后在COS-7细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将COS-7细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白质粒与G5-DAT29以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。
实验结果：如图43所示的基因转染材料G5-DAT29与其他转染材料在COS-7细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为8，用流式细胞仪定量分析，绿色荧光蛋白基因转染效率达到31％。
实施例55：基因转染材料G5-DAT29在CHO细胞上的的基因转染实验
将实施例49中所制备的基因转染材料G5-DAT29和绿色荧光蛋白质粒在室温下形成复合物，然后在CHO细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将CHO细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白质粒与G5-DAT29以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。
实验结果：如图44所示的基因转染材料G5-DAT29与其他转染材料在CHO细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为16，用流式细胞仪定量分析，绿色荧光蛋白基因转染效率达到34％。
实施例56：基因转染材料G5-DAT29在A549细胞上的的基因转染实验
将实施例49中所制备的基因转染材料G5-DAT29和绿色荧光蛋白质粒在室温下形成复合物，然后在A549细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将A549细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白质粒与G5-DAT29以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。
实验结果：如图45所示的基因转染材料G5-DAT29与其他转染材料在A549细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为32，用流式细胞仪定量分析，绿色荧光蛋白基因转染效率达到28％。
实施例57：基于树形高分子和二氨基三嗪功能基团的基因转染材料G4-DAT28的制备及表征
以基于树形高分子和二氨基三嗪功能基团的基因转染材料G4-DAT28为例，如图46所示，其中G4为第4代聚酰胺-胺树形高分子，中心核为乙二胺，末端基团为伯胺基团，n为5，m为2；DAT为2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪；28为2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪共价连接到第4代聚酰胺-胺树形高分子表面的数量，其结构式为：
式(9)中，R是第4代聚酰胺-胺树形高分子G4；其结构如式(10)所示：
式(10)中，M是第4代聚酰胺-胺树形高分子G4的中心核：乙二胺。
本发明具体实施中，M还可以是氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、癸二胺、或1，12-十二烷二胺。
制备合成方法：取70毫克的第4代聚酰胺-胺树形高分子溶于8毫升水和无水乙醇1∶1混溶的溶剂中，再加入22.94毫克2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪与13.24毫克碳酸氢钠，将该反应容易在80摄氏度下搅拌反应24小时，然后冷冻干燥，即可得到外观为白色粉末的基因转染材料G4-DAT28。
对按上述步骤制备得到的基因转染材料G4-DAT28进行核磁共振分析，如图47所示：2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪共价连接到第4代聚酰胺-胺树形高分子表面，数量为28个。
实施例58：基因转染材料G4-DAT28在293T细胞上的的基因转染实验
将实施例57中所制备的基因转染材料G4-DAT28和绿色荧光蛋白质粒在室温下形成复合物，然后在293T细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将293T细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白质粒与G4-DAT28以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。
实验结果：如图48所示的基因转染材料G4-DAT28与其他转染材料在293T细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为64，用流式细胞仪定量分析，绿色荧光蛋白基因转染效率达到53％。
实施例59：基因转染材料G4-DAT28在HeLa细胞上的的基因转染实验
将实施例57中所制备的基因转染材料G4-DAT28和绿色荧光蛋白质粒在室温下形成复合物，然后在HeLa细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将HeLa细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白质粒与G4-DAT28以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。
实验结果：如图49所示的基因转染材料G4-DAT28与其他转染材料在HeLa细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为64，用流式细胞仪定量分析，绿色荧光蛋白基因转染效率达到20％。
实施例60：基于树形高分子和二氨基三嗪功能基团的基因转染材料G3-DAT13的制备及表征
以基于树形高分子和二氨基三嗪功能基团的基因转染材料G3-DAT13为例，如图50所示，其中G3为第3代聚酰胺-胺树形高分子，中心核为乙二胺，末端基团为伯胺基团，n为4，m为2；DAT为2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪；13为2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪共价连接到第3代聚酰胺-胺树形高分子表面的数量，其结构式为：
式(11)中，R是第3代聚酰胺-胺树形高分子G3；其结构如式(12)所示：
式(12)中，M是第3代聚酰胺-胺树形高分子G3的中心核：乙二胺。
本发明具体实施中，M还可以是氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、癸二胺、或1，12-十二烷二胺。
制备合成方法：取69.6毫克的第3代聚酰胺-胺树形高分子溶于8毫升水和无水乙醇1：1混溶的溶剂中，再加入23.46毫克2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪与13.54毫克碳酸氢钠，将该反应容易在80摄氏度下搅拌反应24小时，然后冷冻干燥，即可得到外观为白色粉末的基因转染材料G3-DAT13。
对按上述步骤制备得到的基因转染材料G3-DAT13进行核磁共振分析，如图51所示：2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪共价连接到第3代聚酰胺-胺树形高分子表面，数量为13个。
实施例61：基因转染材料G3-DAT13在293T细胞上的的基因转染实验
将实施例60中所制备的基因转染材料G3-DAT13和绿色荧光蛋白质粒在室温下形成复合物，然后在293T细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将293T细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白质粒与G3-DAT13以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。
实验结果：如图52所示的基因转染材料G3-DAT13与其他转染材料在293T细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为64。
实施例62：基因转染材料G3-DAT13在HeLa细胞上的的基因转染实验
将实施例60中所制备的基因转染材料G3-DAT13和绿色荧光蛋白质粒在室温下形成复合物，然后在HeLa细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将HeLa细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白质粒与G3-DAT13以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。
实验结果：如图53所示的基因转染材料G3-DAT13与其他转染材料在HeLa细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为64。
实施例63：基于树形高分子和二氨基三嗪功能基团的基因转染材料G5-PPI-DAT12的制备及表征
以基于树形高分子和二氨基三嗪功能基团的基因转染材料G5-PPI-DAT12为例，如图54所示，其中G5为第5代聚丙烯亚胺树形高分子，中心核为丁二胺，末端基团为伯胺基团，n为5，m为2；DAT为2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪；12为2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪共价连接到第5代聚丙烯亚胺树形高分子表面的数量，其结构式为：
式(13)中，R是第5代聚丙烯亚胺树形高分子G5；其结构如式(14)所示：
式(14)中，M是第5代聚丙烯亚胺树形高分子G5的中心核：丁二胺。
本发明具体实施中，M还可以是氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、癸二胺、或1，12-十二烷二胺。
制备合成方法：取46.1毫克的第5代聚丙烯亚胺树形高分子溶于8毫升水和无水乙醇1∶1混溶的溶剂中，再加入15毫克2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪与8.64毫克碳酸氢钠，将该反应容易在80摄氏度下搅拌反应24小时，然后冷冻干燥，即可得到外观为白色粉末的基因转染材料G5-PPI-DAT12。
对按上述步骤制备得到的基因转染材料G5-PPI-DAT12进行核磁共振分析，如图55所示：2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪共价连接到第5代聚聚丙烯亚胺树形高分子表面，数量为12个。
实施例64：基因转染材料G5-PPI-DAT12在293T细胞上的的基因转染实验
将实施例63中所制备的基因转染材料G5-PPI-DAT12和绿色荧光蛋白质粒在室温下形成复合物，然后在293T细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将293T细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白质粒与G5-PPI-DAT12以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。
实验结果：如图56所示的基因转染材料G5-PPI-DAT12与其他转染材料在293T细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为14。
实施例65：基于树形高分子和二氨基三嗪功能基团的基因转染材料G5-PPI-DAT33的制备及表征
以基于树形高分子和二氨基三嗪功能基团的基因转染材料G5-PPI-DAT33为例，如图57所示，其中G5为第5代聚丙烯亚胺树形高分子，中心核为丁二胺，末端基团为伯胺基团，n为5，m为2；DAT为2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪；33为2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪共价连接到第5代聚丙烯亚胺树形高分子表面的数量，其结构式为：
式(15)中，R是第5代聚丙烯亚胺树形高分子G5；其结构如式(16)所示：
式(16)中，M是第5代聚丙烯亚胺树形高分子G5的中心核：丁二胺。
本发明具体实施中，M还可以是氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、癸二胺、或1，12-十二烷二胺。
制备合成方法：取57.1毫克的第5代聚丙烯亚胺树形高分子溶于8毫升水和无水乙醇1∶1混溶的溶剂中，再加入37.1毫克2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪与21.4毫克碳酸氢钠，将该反应容易在80摄氏度下搅拌反应24小时，然后冷冻干燥，即可得到外观为白色粉末的基因转染材料G5-PPI-DAT33。
对按上述步骤制备得到的基因转染材料G5-PPI-DAT33进行核磁共振分析，如图58所示：2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪共价连接到第5代聚聚丙烯亚胺树形高分子表面，数量为33个。
实施例66：基因转染材料G5-PPI-DAT33在293T细胞上的的基因转染实验
将实施例65中所制备的基因转染材料G5-PPI-DAT33和绿色荧光蛋白质粒在室温下形成复合物，然后在293T细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将293T细胞培养在24孔板中孵育24小时，将1.6微克绿色荧光蛋白质粒与G5-PPI-DAT33以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后处理细胞。绿色荧光蛋白表达量用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率，具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。
实验结果：如图59所示的基因转染材料G5-PPI-DAT33与其他转染材料在293T细胞上转染绿色荧光蛋白基因的转染效果图，氮磷比为16。
实施例67：基因转染材料G5-DAT55在由MG63细胞形成的体外多细胞瘤上的基因转染实验
将实施例17中所制备的基因转染材料G5-DAT55和绿色荧光蛋白质粒在室温下形成复合物，然后在由MG63细胞形成的体外多细胞瘤上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将MG63细胞用胰蛋白酶消化，用离心机以600转/分钟的速度离心4分钟，再用培养基重悬至400000个细胞/毫升，吸取25微升上述液体，滴于培养皿盖上，使液滴倒置悬挂，将培养皿置于细胞培养箱中。24小时之后，显微镜下观察悬挂液滴中多细胞瘤形成，用吸管吸取该多细胞瘤置于先用琼脂糖铺底的96孔板中，每孔置入一个MTS，并加入培养基100微升。将96孔板继续放置于细胞培养箱中72小时。将1微克绿色荧光蛋白质粒与G5-DAT55以氮磷比32混合，加入100微升培养基。将该培养基混合物加入96孔板中，48小时后显微镜下拍照观察。以Lipofectamine 2000作为阳性对照，用量为2.5微升。
实验结果：如图60(a)、(b)所示的，基因转染材料G5-DAT55与Lipofectamine 2000在由MG63细胞形成的体外多细胞瘤上转染绿色荧光蛋白基因效果图，可见G5-DAT55比Lipofectamine 2000的转染亮度更亮，转染效果更好。
实施例68：基因转染材料G5-DAT55在KM小鼠体内的肌肉基因转染实验
将实施例17中所制备的基因转染材料G5-DAT55和绿色荧光蛋白在室温下形成复合物，然后在DM小鼠体内的肌肉进行基因转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量评估材料的基因转染效率。具体方法为：将9.6微克绿色荧光蛋白质粒与G5-DAT55以氮磷比32复合，在4周龄的雄性KM小鼠右腿内侧肌肉注射，5天后取肌肉组着，用冷的pH为7.4的磷酸缓冲液清洗后，用冷冻包埋剂包埋。包埋后的组织用冷冻切片机切片，组织荧光成像用激光共聚焦显微镜拍摄。以Lipofectamine 2000作为阳性对照，用量为12微升。
实验结果：如图61(a)、(b)所示的基因转染材料G5-DAT55与Lipofectamine 2000在KM小鼠体内的肌肉转染绿色荧光蛋白基因效果图，可见G5-DAT55与Lipofectamine 2000具有相似的转染能力。
以上实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效的变化和修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种如式(1)所示的基因转染载体，其特征在于，其包括树形高分子骨架和二氨基三嗪功能基团；所述二氨基三嗪基团共价连接在所述树形高分子骨架表面；其中，所述树形高分子包括聚酰胺-胺树形高分子和聚丙烯亚胺树形高分子；所述树形高分子表面为伯胺基团；
式(1)中，R为如式(2)所示的聚酰胺-胺树形高分子或如式(3)所示的聚丙烯亚胺树形高分子；Y为NH、O、S、或CH2基团；x为树形高分子表面连接的二氨基三嗪的数量，x为1-1024的整数；
式(2)和(3)中，M是树形高分子的核心，其组成包括氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、癸二胺、或1，12-十二烷二胺；n是1-10的整数；m是2-4的整数。
2.一种基因转染载体的制备方法，其特征在于，将二氨基三嗪衍生物及树形高分子溶解于水或有机溶剂，加入碱，搅拌后冷却，通过反应将二氨基三嗪基团共价连接到树形高分子表面，得到如权利要求1所述的基因转染载体。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述二氨基三嗪衍生物为2-氟-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪、2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪、2-溴-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪、2-碘-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、或四氢呋喃。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述碱为碳酸氢钠、三乙胺、N，N-二异丙基乙胺。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述反应时间为1小时至120小时。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述反应温度为0摄氏度到150摄氏度。
8.如权利要求1所述的式(1)所示的基因转染载体在体外或体内作为核酸分子的输送载体的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述核酸是DNA、siRNA、shRNA、或修饰的核酸。
10.一种复合物，其特征在于，包括如权利要求1所述的式(1)所示的基因转染载体和核酸，由所述基因转染载体携带所述核酸。
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