CN104910387B - 聚乙二醇(peg)化小分子量pei衍生物、制备方法、用途及其复合物 - Google Patents
聚乙二醇(peg)化小分子量pei衍生物、制备方法、用途及其复合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种PEG化的聚乙烯亚胺衍生物、制备方法、用途及复合物。与现有技术相比,本发明制备的PEG化的PEI衍生物具有高的转染活性和较小的细胞毒性,在不同的细胞中均具有较好的生物活性,是高效、低毒的基因物质载体,用于输送基因物质。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,尤其涉及一种聚乙二醇(PEG)化PEI衍生物、制备方法、用途及其复合物。
背景技术
基因治疗,是将外源性基因物质(DNA或RNA)导入细胞,促成或者抑制特定蛋白的表达,或者取代、修复有问题的基因,从而达到疾病治疗的目的。在体内DNA、RNA可被DNA酶、RNA酶迅速降解通过肾脏排出;并且DNA、RNA分子量大,带有负电荷,裸DNA、RNA不能穿过细胞膜进入细胞内。因此基因疗法应用于人体的关键在于寻找安全有效的基因载体。
常用的基因输送载体可以分为重组病毒载体及非病毒载体。在临床应用中,病毒载体的安全性问题一直备受质疑;非病毒载体在安全性上优于病毒载体。与病毒载体相比,非病毒载体有其特有的优势:易于合成、可以运载大量基因、免疫反应弱等优势。
研究者选用不同非病毒载体运载质粒,例如:PLGA、PLL、PAGA等。但这些材料在基因输送方面存在一定的局限性。目前,研究较多的非病毒载体材料为聚乙烯亚胺(PEI)。
PEI分子包括伯胺、叔胺、季胺,通过质子海绵效应与DNA及RNA结合。不同类型的PEI(分支、线性),不同分子量PEI(25KDa、10KDa、800Da)体内及体外均以被研究。研究表明:PEI衍生物的毒性与相对分子量息息相关,相对分子量越大,转染效率越高但细胞毒性也越大。因此,迫切需要在降低载体的毒性的基础上能够提高其转染效率的新型载体。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足,提供一种PEG化的PEI衍生物、制备方法、用途及其复合物。本发明制备的PEG化的PEI衍生物具有高的转染活性和较小的细胞毒性,在不同的细胞中均具有较好的生物活性,是高效、低毒的基因物质载体,用于输送基因物质。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
本发明的第一方面提供了一种PEG化的PEI衍生物,其结构式为:
优选的,所述PEG化的PEI衍生物的基本构建单元为小分子量PEI,所述小分子量PEI的分子量为800Da。
本发明的第二方面提供一种制备前述PEG化的PEI衍生物的方法,具体包括以下步骤:
(a)将单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(mPEG-Sc)与PEI-Et按比例加入碳酸氢钠水溶液中;
(b)搅拌、摇动或震荡步骤(a)所得反应体系,使之发生缩合反应,即得PEG化的PEI衍生物。
优选的,步骤(a)中,单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(mPEG-Sc)与PEI-Et的摩尔比为1:2~2:1,更优选为1:1。
优选的,步骤(a)中,碳酸氢钠水溶液的浓度为0.1~1M,更优选为0.1M。
优选的,步骤(a)中,所述PEI-Et是指氨酯键小分子量PEI交联衍生物,其结构式为:
x为1~20,y为1~20。
所述PEI-Et为现有技术,所述PEI-Et已经在申请日为2011年10月25日提交的申请号为ZL201110327129.X的专利申请中请求保护。所述PEI-Et的具体制备方法为:将小分子量PEI与乙二醇二氯甲酸酯按摩尔比为3:2的比例加入三乙胺-氯仿体系中;搅拌、摇动或震荡反应体系,使之发生缩合反应,即得所述小分子量PEI交联衍生物。
优选的,所述方法还包括分离纯化的步骤:将所述PEG化的PEI衍生物用超纯水溶解后,置于透析袋中透析;透析结束后,用微孔滤膜过滤,冻干。
优选的,所述透析袋的截留分子量为3500Da。
优选的,所述透析时采用的透析液选自超纯水、纯净水中的任意一种。
优选的,所述透析的时间24~48小时。更优选为48小时。
优选的,所述微孔滤膜的孔径为0.22~0.45μm。更优选为0.45μm。
本发明的第三方面还提供了一种上述的PEG化的PEI衍生物在制备用于输送基因物质载体中的用途。
本发明的第四方面提供了一种复合物,所述复合物包括上述PEG化的PEI衍生物。
优选的,所述复合物包括上述PEG化的PEI衍生物和质粒。
优选的,所述复合物中,上述PEG化的PEI衍生物和质粒的质量比为1:1~50:1。
优选的,所述质粒选自DNA质粒、荧光酶蛋白质粒或GFP质粒中的任意一种。
本发明的第五方面提供了前述复合的制备方法:将上述PEG化的PEI衍生物溶液加入到质粒溶液中,混合均匀,孵育,即得。
优选的,所述孵育具体为室温下,孵育30~60min。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
(1)本发明制备的含有PEG化的PEI衍生物结构简单、易于合成;
(2)本发明制备的含有PEG化的PEI衍生物具有高的转染活性和较小的细胞毒性,与现有的PEI-Et相比,表面电荷密度低。
(3)本发明制备的含有聚乙二醇结构的可降解PEI衍生物在不同的细胞株中均表现出较高的转染活性(与PEI 25KDa相比),同时比PEI-Et有更低的细胞毒性。
附图说明
图1为PEG化的PEI衍生物的制备方法的合成路线示意图;
图2为PEG化的PEI衍生物的核磁共振图谱;
图3为实施例2中PEG-Et 1:1与质粒质量比不同时合成的复合物的粒径图;
图4为实施例2中PEG-Et 1:1与质粒质量比不同时合成的复合物的电势图;
图5为实施例2中PEG-Et 1:1与DNA质粒质量比为10时合成的复合物的透射电子显微镜图;
图6为实施例3中PEG-Et 1:1与质粒质量比不同时合成的复合物的MCF-7细胞转染活性示意图;
图7为实施例3中PEG-Et 1:1与质粒质量比不同时合成的复合物的CT-26细胞转染活性示意图;
图8为实施例3中PEG-Et 1:1与质粒质量比不同时合成的复合物的HeLa细胞转染活性示意图;
图9为实施例4中不用浓度PEG-Et 1:1与PEI-Et、PEI 25KDa的MCF-7细胞毒性比较示意图;
图10为实施例4中不同浓度PEG-Et 1:1与PEI-Et、PEI 25KDa的CT-26细胞毒性比较示意图;
图11为实施例4中不同浓度PEG-Et 1:1与PEI-Et、PEI 25KDa的HeLa细胞毒性比较示意图;
图12为实施例5中不同比例PEG-Et与质粒质量比不同时合成的复合物的MCF-7细胞转染活性示意图;
图13为实施例5中不同比例PEG-Et与质粒质量比不同时合成的复合物的CT-26细胞转染活性示意图;
图14为实施例5中不同比例PEG-Et与质粒质量比不同时合成的复合物的HeLa细胞转染活性示意图;
图15为实施例6中不同比例、不用浓度PEG-Et在MCF-7细胞毒性比较示意图;
图16为实施例6中不同比例、不同浓度PEG-Et在CT-26细胞毒性比较示意图;
图17为实施例6中不同比例、不同浓度PEG-Et在HeLa细胞毒性比较示意图。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法,通 常按照常规条件,或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明,本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明,具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring HarborLaboratory Press,1989 and Third edition,2001;Ausubel等,CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY,John Wiley & Sons,New York,1987 and periodic updates;theseries METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego;Wolffe,CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998;METHODS INENZYMOLOGY,Vol.304,Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe,eds.),AcademicPress,San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.119,ChromatinProtocols(P.B.Becker,ed.)Humana Press,Totowa,1999等。
实施例1.聚乙二醇(PEG)化聚乙烯亚胺(PEI)衍生物(PEG-Et 1:1)的制备
如图1所示,本发明PEG化的聚乙烯亚胺(PEI)衍生物的制备合成路线示意图,包括如下步骤:
(a)用碳酸氢钠分别溶解PEI-Et和mPEG-SC,二者分别配成2mL和5ml的溶液;将PEI-Et与单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(mPEG-SC)按摩尔比为1:1的比例加入0.1M的碳酸氢钠溶液中。
(b)室温条件下,将单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯的碳酸氢钠溶液逐滴加入到PEI-Et碳酸氢钠反应体系中,搅拌反应4小时;
(c)分离纯化,产品置于截留分子量为3500Da的透析袋中透析48小时(可以是24~48小时中的任意值),透析结束后,产品用0.45μm(可以是0.22~0.45μm中的任意值)的微孔滤膜过滤,然后分别转移到预先准备好的西林瓶中,产品在-20℃冰箱预冻过夜后用冷冻干燥机冻干,24h后停止冻干,得到产品高分子PEG-Et 1:1。
测定高分子PEG-Et 1:1分子量
测定方法为凝胶渗透色谱(GPC)法,聚乙二醇(PEG)标准品以及实施例制备的PEG-Et 1:1为样品,分别用纯水溶解得到10mg/ml的溶液,摇匀静置,用0.45μm的微孔滤膜过滤,取续滤液,进样20μl,记录色谱图。
将PEG标准品的重均分子量的对数值lgMw与相应的保留时间(tR)进行线性回归,得回归方程。Et样品通过该回归方程的公式计算分子量和分布:
Mn=ΣRIi/Σ(RIi/Mi);
Mw=Σ(RIi Mi)/ΣRIi;
D=Mw/Mn;
上式中Mn、Mw分别为数均分子量和重均分子量;D指分布系数;RIi为供试品在保留时间i时的峰高;Mi为供试品在保留时间i时的分子量。
计算得:PEI-Et的分子量Mn=2010,Mw=4121。
高分子量PEG-Et 1:1的核磁共振
使用氘代水作为溶剂完全溶解PEI-Et 1:1,将约0.5ml的样品溶液加入核磁管内,进行检测。由图2所示,PEG连接到PEI-Et上,形成了PEG-Et 1:1复合物。
实施例2、PEG-Et 1:1与质粒合成的复合物(Polyplex)的制备
称取定量的高分子(PEG-Et 1:1)聚合物,加超纯水配置成2mg/mL的溶液,然后用0.45μm的无菌滤头过滤,质粒的浓度稀释成20μg/mL;
配置不同质量比的复合物溶液,保持质粒溶液的浓度不变,然后按照不同的PEG-Et 1:1与质粒的质量比稀释高分子溶液的浓度,保持稀释后的高分子溶液和质粒溶液的体积相等,最后将高分子溶液快速加入到质粒溶液中混合,室温下孵育30~60min,这样就得到一系列质量比的复合物,可用作进一步的物化性质测定。
PEG-Et 1:1与质粒合成的复合物(Polyplex)粒径测定
复合物粒径的测定的样品量为1.6mL,Luciferase(荧光酶蛋白)质粒和高分子溶液的体积各为800μL,质粒的浓度均为20μg/mL,依据质量比对高分子溶液(原始浓度为2mg/mL)进行稀释,所需测定复合物中高分子材料与Luciferase质粒的质量比分别为1,3,5,10,20,30,50。
混合时,将高分子溶液加入质粒溶液中,吹打均匀,室温孵育30min。检测采用Brookhaven Instruments公司的粒径仪,每个样品测定3次,取平均值作图;如图3所示,经检测,Polyplex可形成纳米颗粒用于基因输送。
PEG-Et 1:1与质粒合成的复合物(Polyplex)Zeta电位测定
复合物Zeta电位的测定的样品量为1.6mL,Luciferase质粒和高分子溶液的体积各为800μL,质粒的浓度均为20μg/mL,依据质量比对高分子溶液(原始浓度为2mg/mL)进行稀释,所需测定复合物中高分子材料与Luciferase质粒的质量比分别为1,3,5,10,20,30,50。
混合时,将高分子溶液加入质粒溶液中,吹打均匀,室温孵育30min,然后检测。检测采用Brookhaven Instruments公司的粒径仪,每个样品测定3次,取平均值作图;如图4所示,实验证明,Polyplex的Zeta电势为正,可包裹带负电荷的DNA。
PEG-Et 1:1与质粒合成的复合物(Polyplex)的透射电子显微镜表征
依据测量粒径的结果,选取质量比为10的复合物,通过透射电子显微镜(TecnaiG2 Spirit Biotwin)来观察该复合物的形态。
首先PEG-Et 1:1与Luciferase质粒配制成复合物溶液,然后用移液枪将约10μL的复合物溶液小心翼翼的滴加在100目的铜网上。铜网置于室温和干燥的环境中晾干。待进行透射电子显微镜的测试时,在500nm比例下捕捉复合物颗粒的图片,如图5所示,Polyplex可形成纳米颗粒。
实施例3PEG-Et 1:1与质粒合成的复合物(Polyplex)的细胞转染实验
在48孔细胞培养板中,加入500μL的细胞悬液(MCF-7,CT-26或者HeLa),密度是5.0~10×104/mL,培养过夜。48孔板转染时,将聚合物配置成2mg/mL的溶液,并用0.45μm的滤膜无菌过滤,按照设置的待测样品与质粒的质量比,稀释成所需的比例,然后把聚合物溶液加入到质粒的溶液当中去,快速混匀,孵育30min。这样加入每孔的复合物的体积为50μL,为总体积(500μL)的十分之一,符合规定。每个质量比做3个复孔。阳性对照组PEI 25kDa,以其最佳质量比2的结果各做3个对照孔,在孵育的这段时间里,从培养箱中拿出细胞,除去有血清的培养基,再用200μL的PBS溶液洗一遍,培养基换成250μL的无血清的培养基,然后将孵育好的复合物按顺序加入到细胞中去。
4小时后,除去无血清的培养基,每孔加入500μL含10%胎牛血清的完全培养基,再培养48小时,检测其在MCF-7,CT-26,HeLa细胞中的转染结果,分别如图6、7、8所示,结果显示,PEG-Et 1:1在不同细胞中均具有担载基因物质的能力,在三种细胞株中基因转染效率均超过了阳性对照PEI 25kDa(P<0.01)。
实施例4PEG-Et 1:1的细胞毒性实验
接种细胞(MCF-7,CT-26,HeLa),将细胞消化,稀释成密度为5~10×103/mL的细胞悬液,96孔板中每孔加入100μL,培养过夜。
将2mg/mL的高分子材料用无酚红DMEM溶液稀释成不同的浓度梯度,终体积为100μL,阳性对照组PEI 25KDa也稀释为与待测样品组一致的浓度梯度。
取出细胞后,移除有血清的培养基,用100μL的PBS缓冲液洗一遍,直接把配制好的高分子材料无酚红DMEM溶液加到各个细胞孔中,阴性对照组中加入100μL无血清无酚红DMEM。4小时之后,除去培养液和高分子溶液,每孔加入100μL的无血清无酚红培养基,避光条件下再加入25μL的MTT溶液(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐溶液溶液,该溶液用PBS缓冲液配制成5mg/mL),置于细胞培养箱中培养6小时。
显微镜下观察活细胞的结晶情况,如果还没有完全结晶,可适当延长放置时间。如果完全结晶,小心翼翼的倒出96孔板中的液体,然后在每孔中各加入150μL的DMSO(二甲亚砜),轻微摇晃96孔板使甲臢晶体充分溶解。由于加入DMSO后溶液颜色会随时间变化,因此最好酶标仪的检测在20min内进行,检测波长为570nm,通过样品组的在此波长的吸收值和空白对照组做比值,从而得到细胞的成活率。不同浓度的PEG-Et 1:1、PEI-Et、PEI 25kDa的MCF-7,CT-26,HeLa细胞的毒性比较图分别如图9、10、11所示,细胞活力测试表明:PEG-Et1:1的细胞毒性远小于阳性对照PEI 25kDa;并且比PEI-Et有更低的细胞毒性。
实施例5(mPEG-Sc)与PEI-Et按其他摩尔比制备获得的PEI衍生物及其细胞转染活性考察
采用实施例1中的制备方法,单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(mPEG-Sc)与PEI-Et的摩尔比为1:2和2:1,制备获得其他PEI衍生物PEG-Et 1:2、PEG-Et 2:1,并考察其细胞转染活性。
在48孔细胞培养板中,加入500μL的细胞悬液(MCF-7,CT-26或者HeLa),密度是5.0~10×104/mL,培养过夜。48孔板转染时,将聚合物配置成2mg/mL的溶液,并用0.45μm的 滤膜无菌过滤,按照设置的待测样品与质粒的质量比,稀释成所需的比例,然后把聚合物溶液加入到质粒的溶液当中去,快速混匀,孵育30min。这样加入每孔的复合物的体积为50μL,为总体积(500μL)的十分之一,符合规定。每个质量比做3个复孔。阳性对照组PEG-Et 1:1各做3个对照孔,在孵育的这段时间里,从培养箱中拿出细胞,除去有血清的培养基,再用200μL的PBS溶液洗一遍,培养基换成250μL的无血清的培养基,然后将孵育好的复合物按顺序加入到细胞中去。
4小时后,除去无血清的培养基,每孔加入500μL含10%胎牛血清的完全培养基,再培养48小时,检测其在MCF-7,CT-26,HeLa细胞中的转染结果,分别如图12、13、14所示,结果显示,三种比例的PEG-Et在不同细胞中均具有担载基因物质的能力,PEG-Et 1:1在三种细胞株中基因转染效率均超过了其他两种比例的转染效率。
实施例6(mPEG-Sc)与PEI-Et按其他摩尔比制备获得的PEI衍生物及其细胞毒性考察
采用实施例1中的制备方法,单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(mPEG-Sc)与PEI-Et的摩尔比为1:2和2:1,制备获得其他PEI衍生物PEG-Et 1:2、PEG-Et 2:1,并考察其细胞毒性。
接种细胞(MCF-7,CT-26,HeLa),将细胞消化,稀释成密度为5~10×103/mL的细胞悬液,96孔板中每孔加入100μL,培养过夜。
将2mg/mL的高分子材料用无酚红DMEM溶液稀释成不同的浓度梯度,终体积为100μL,阳性对照组PEG-Et 1:1也稀释为与待测样品组一致的浓度梯度。
取出细胞后,移除有血清的培养基,用100μL的PBS缓冲液洗一遍,直接把配制好的高分子材料无酚红DMEM溶液加到各个细胞孔中,阴性对照组中加入100μL无血清无酚红DMEM。4小时之后,除去培养液和高分子溶液,每孔加入100μL的无血清无酚红培养基,避光条件下再加入25μL的MTT溶液(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐溶液溶液,该溶液用PBS缓冲液配制成5mg/mL),置于细胞培养箱中培养6小时。
显微镜下观察活细胞的结晶情况,如果还没有完全结晶,可适当延长放置时间。如果完全结晶,小心翼翼的倒出96孔板中的液体,然后在每孔中各加入150μL的DMSO(二甲亚砜),轻微摇晃96孔板使甲臢晶体充分溶解。由于加入DMSO后溶液颜色会随时间变化,因此最好酶标仪的检测在20min内进行,检测波长为570nm,通过样品组的在此波长的吸收值和空 白对照组做比值,从而得到细胞的成活率。不同浓度的PEG-Et 1:1、PEG-Et 1:2、PEG-Et2:1的MCF-7,CT-26,HeLa细胞的毒性比较图分别如图15、16、17所示,细胞活力测试表明:PEG-Et 1:1的细胞毒性较PEG-Et 2:1小,与PEG-Et 1:2的细胞毒性相似。
综上所述,本发明制备的PEG化的聚乙烯亚胺(PEI)衍生物结构简单、易于合成;衍生物具有高的转染活性和较小的细胞毒性;本发明制备的PEG化的可降解PEI衍生物PEG-Et1:1具有较好的生物活性。
以上所述,仅为本发明的较佳实施例,并非对本发明任何形式上和实质上的限制,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还将可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明的精神和范围的情况下,当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化,均为本发明的等效实施例;同时,凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变,均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (8)
1.一种PEG化的PEI衍生物,其特征在于,所述衍生物的结构式为:
所述PEG化的PEI衍生物的基本构建单元为小分子量PEI,所述小分子量PEI的分子量为800Da,所述衍生物由单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯与PEI-Et以1:1的摩尔比发生缩合反应获得。
2.一种制备如权利要求1所述的PEG化的PEI衍生物的方法,具体包括以下步骤:
(a)将单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(mPEG-Sc)与PEI-Et按摩尔比例1:1加入碳酸氢钠水溶液中;
(b)搅拌、摇动或震荡步骤(a)所得反应体系,使之发生缩合反应,即得PEG化的PEI衍生物。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,还包括分离纯化的步骤:将所述PEG化的PEI衍生物用超纯水溶解后,置于透析袋中透析;透析结束后,用微孔滤膜过滤,冻干。
4.根据权利要求1所述的PEG化的PEI衍生物在制备用于输送基因物质载体中的用途。
5.一种复合物,其特征在于,所述复合物包括如权利要求1所述的PEG化的PEI衍生物。
6.根据权利要求5所述的复合物,其特征在于,所述复合物还包括质粒。
7.根据权利要求6所述的复合物,其特征在于,所述复合物中,所述的PEG化的PEI衍生物与质粒之间的质量比为1:1~50:1。
8.一种制备如权利要求5~7任一权利要求所述复合物的方法,其特征在于,所述方法为将上述PEG化的PEI衍生物溶液加入到质粒溶液中,混合均匀,孵育,即得。
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- 2014-12-25 CN CN201410842808.4A patent/CN104910387B/zh active Active
Patent Citations (2)
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CN102504250A (zh) * | 2011-10-25 | 2012-06-20 | 上海交通大学 | 氨酯键小分子量pei交联衍生物、制备方法、用途及其复合物 |
CN103275329A (zh) * | 2013-06-18 | 2013-09-04 | 上海交通大学医学院附属新华医院 | 一种聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺衍生物及其制备方法 |
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