CN103360552B - 一种用作非病毒基因载体的两亲性梳状sma-pei接枝共聚物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用作非病毒基因载体的两亲性梳状聚苯乙烯马来酸酐-聚乙烯亚胺接枝共聚物及其制备方法和用途。所述两亲性梳状聚苯乙烯马来酸酐-聚乙烯亚胺接枝共聚物由分子量为0.2-10KDa的低分子量聚乙烯亚胺的伯胺对分子量为2-1000KDa的聚苯乙烯马来酸酐的酸酐进行胺解所形成。所述两亲性梳状聚苯乙烯马来酸酐-聚乙烯亚胺接枝共聚物可将核酸分子输送至细胞中，并使其在细胞中表达基因编码产物或沉默靶基因表达。本发明的两亲性梳状共聚物非病毒基因载体具有反应条件温和、材料廉价易得、合成和后处理方法简单、回收率高、复合物制备方法简单、携带核酸的转染效率高、生物毒性低等特点。

Description

一种用作非病毒基因载体的两亲性梳状SMA-PEI接枝共聚物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及一种用作非病毒基因载体的两亲性梳状聚苯乙烯马来酸酐-聚乙烯亚胺(SMA-PEI)接枝共聚物及其制备方法和用途，所述聚苯乙烯马来酸酐-聚乙烯亚胺接枝共聚物可将核酸分子输送至细胞中，并使其在细胞中表达基因编码产物或沉默靶基因表达。

背景技术

基因治疗是通过合适的载体将目的基因运送到特定的组织细胞内并使其在细胞内表达治疗蛋白或取代、修复缺陷基因，进而达到治疗疾病的目的，已成为目前最活跃的生物技术领域之一。裸核酸分子进入体液后会在血清中核酶的作用下迅速降解，从而难以在体液中稳定存在。而且，裸核酸分子的分子量大并带有大量负电，导致其难以有效地被细胞摄取。因此，寻求能够实现广泛基因表达的基因载体成为基因治疗在大规模临床应用中的关键问题。

病毒载体虽然具有较高的转染效率，但其潜在的毒性、免疫原性、插入突变、包装容量有限和难以大规模生产等问题限制了其在临床治疗中的应用。非病毒载体由于具有安全性高、免疫原性低、可携带大容量外源基因和具有大规模生产潜力等优点而受到越来越多的关注。目前非病毒载体主要包括阳离子脂质体和阳离子聚合物等。阳离子脂质体稳定性较差，在血清存在的条件下转染效率很低。阳离子聚合物能够通过正负电荷相互作用与核酸分子结合，并将其压缩为纳米级大小的粒子，同时由于阳离子聚合物中和了核酸分子的负电并具有“质子海绵”效应，因此为核酸分子的细胞摄取和内涵体逃逸提供了条件。目前，新型阳离子聚合物基因输送系统已成为非病毒基因载体选择开发的主要方向。

聚乙烯亚胺(PEI)是一种典型的阳离子聚合物，其在体内体外实验中均表现出很高的基因转染效率。PEI的分子量、表面电荷和缓冲能力是影响其基因转染效率和细胞毒性最重要的参数。高分子量PEI(如25kDa，PEI25k)表现出较高的转染效率，但同时也产生了显著的细胞毒性。相反，低分子量PEI(如≤2kDa)毒性较低，但转染效率同样很低，不能单独作为基因载体。为了克服这一问题，一种方法是将低分子量PEI通过生物可降解的或环境响应性的材料连接在一起，形成较高分子量的PEI。另一种方法是将低分子量PEI连接到聚合物链上。这些由低分子量PEI形成的具有较高分子量的PEI接枝聚合物的转染效率相当高，且细胞毒性降低。

聚苯乙烯马来酸酐(SMA)是一种两亲性高分子，已被证明具有良好的生物安全性，及赋予宿主动物免疫强化的作用。目前，SMA已被用于化学制剂和聚合前药，从而提高药物的溶解度和稳定性，延长血浆半衰期，提高药物药动学和药效学参数，显示出很高的临床应用潜力，目前尚未见SMA用于基因输送的报道。因而，本发明人将SMA与低分子量PEI共价结合在一起，以期望在提高转染效率的同时降低毒性。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种两亲性梳状聚苯乙烯马来酸酐-聚乙烯亚胺接枝共聚物，其通过将聚乙烯亚胺接枝到聚苯乙烯马来酸酐主链上而形成。所述两亲性梳状共聚物可用作非病毒基因载体。

本发明的另一个目的是提供一种上述聚苯乙烯马来酸酐-聚乙烯亚胺接枝共聚物的制备方法。

本发明的又一个目的是提供一种上述聚苯乙烯马来酸酐-聚乙烯亚胺接枝共聚物的用途。

本发明的还一个目的是提供一种复合物，所述复合物包括核酸和上述聚苯乙烯马来酸酐-聚乙烯亚胺接枝共聚物。

本发明的再一个目的是提供一种上述复合物的制备方法。

本发明的另一个目的是提供一种将核酸输送至靶细胞中的方法。

根据第一个方面，本发明提供了一种两亲性梳状聚苯乙烯马来酸酐-聚乙烯亚胺接枝共聚物，其由分子量为0.2-10KDa的低分子量聚乙烯亚胺的伯胺对分子量为2-1000KDa的聚苯乙烯马来酸酐的酸酐进行胺解所形成。

本发明中，优选地，所述聚苯乙烯马来酸酐的分子量可为5-50KDa。

本发明中，优选地，所述聚苯乙烯马来酸酐中苯乙烯单元与马来酸酐单元的摩尔比可为3∶1-1∶3，更优选为2∶1-1∶2。

本发明中，优选地，所述聚乙烯亚胺的分子量可为0.4-2KDa。

本发明中，优选地，SMA-PEI的接枝度(即：与PEI反应的马来酸酐单元与总的马来酸酐单元的摩尔比)可为30％-80％，更优选为50％-80％。

根据第二个方面，本发明提供了一种两亲性梳状聚苯乙烯马来酸酐-聚乙烯亚胺接枝共聚物的制备方法，所述方法包括：使聚乙烯亚胺和聚苯乙烯马来酸酐反应制得两亲性梳状聚苯乙烯马来酸酐-聚乙烯亚胺接枝共聚物，其中，聚乙烯亚胺与聚苯乙烯马来酸酐中的马来酸酐单元的摩尔比为1∶1-5∶1。

例如，所述的两亲性梳状聚苯乙烯马来酸酐-聚乙烯亚胺接枝共聚物的制备方法具体如下：

将聚乙烯亚胺和聚苯乙烯马来酸酐(聚乙烯亚胺与马来酸酐单元的摩尔比为1∶1-5∶1)分别溶于二甲亚砜中，在搅拌条件下，将聚苯乙烯马来酸酐溶液缓慢滴加至聚乙烯亚胺溶液中，速度每秒1-2滴。当聚苯乙烯马来酸酐滴加完毕后，反应混合物在室温条件下继续搅拌12-48h。反应结束后，将反应液转入透析袋中，用水透析3-5天，以除去二甲亚砜及未反应的聚乙烯亚胺。然后减压条件下除去大部分水分，真空干燥，即得两亲性梳状共聚物。

根据第三个方面，本发明提供了一种两亲性梳状聚苯乙烯马来酸酐-聚乙烯亚胺接枝共聚物用作非病毒基因载体的用途。

上述两亲性梳状共聚物非病毒基因载体可用作核酸的输送载体，所述的核酸包括DNA、RNA、寡聚核苷酸和/或修饰的核酸。

本发明以SMA为骨架，连接低分子量的聚乙烯亚胺，形成分子量大及缓冲能力强的基因载体。连接的PEI可与DNA通过正负电荷相互作用，起到压缩DNA的作用，此外，SMA骨架上的羧基、酰胺基团及苯环还可通过氢键或π-π堆积作用与DNA相互作用，进一步压缩DNA。SMA骨架用于控制PEI连接的数量，使转染效率与毒性保持在最佳的平衡位置，并且，SMA的两亲性还有助于DNA分子的细胞摄取。

根据第四个方面，本发明还提供了一种含有核酸和上述两亲性梳状共聚物非病毒基因载体的复合物。

本发明中，优选地，所述核酸可以包括DNA、RNA、寡聚核苷酸和/或修饰的核酸。

根据第五个方面，本发明还提供了一种上述复合物的制备方法，所述方法包括：将上述两亲性梳状聚苯乙烯马来酸酐-聚乙烯亚胺接枝共聚物和核酸充分混合至复合物形成。例如，该复合物的制备方法具体为：将一定量的上述两亲性梳状聚苯乙烯马来酸酐-聚乙烯亚胺接枝共聚物和核酸分别溶于纯水或缓冲液中，边涡旋边将核酸的溶液加入到所述共聚物的溶液中，或将所述共聚物的溶液加入到核酸溶液中，所得混合溶液涡旋20-30秒，室温下放置一段时间(例如20-200分钟)至复合物形成。

根据第六个方面，本发明还提供了一种将核酸输送至靶细胞中的方法，其中，使上述两亲性梳状共聚物和核酸的复合物与靶细胞接触以使所述复合物被摄取到细胞中。

本发明中，优选地，所述细胞可为体外细胞或者体内细胞。

该方法进一步包括使上述两亲性梳状共聚物和核酸的复合物被靶细胞所摄取的以下步骤：

a)培养靶细胞；

b)制备上述两亲性梳状共聚物和核酸的复合物；和

c)使步骤b)中的所述复合物与靶细胞接触。

例如，所述使上述两亲性梳状共聚物和核酸的复合物被靶细胞所摄取的步骤具体为：将细胞培养在特定的培养基中，放置在37℃，5％CO₂的培养箱中生长，取处于对数生长期的细胞，用含0.02％EDTA和0.25％胰蛋白酶的消化液消化后，按每孔3×10⁴-2×10⁵个细胞接种于24孔板，每孔含培养基0.5mL，放在培养箱内培养至细胞贴壁；按一定的N/P比(两亲性梳状共聚物中可质子化氮原子个数与核酸分子中磷原子个数的比值，具体范围为3-50)制备两亲性梳状共聚物和核酸的复合物，将其分散在20-50μL纯水或缓冲液中；将所得到的复合物溶液用450-480μL培养基稀释，混合均匀；将24孔板内原有的培养基吸走，将按上述方法配制的含有上述复合物的培养基加入到孔板内；至少设3种N/P比，每种N/P比设3-6个平行孔，37℃下孵育12-72小时。

本发明的两亲性梳状共聚物非病毒基因载体具有反应条件温和、材料廉价易得、合成和后处理方法简单、回收率高、复合物制备方法简单、携带核酸的转染效率高、生物毒性低等特点。

附图说明

图1A和图1B分别表示实施例2中测得的SMA-PEI800的1H-NMR图谱和FT-IR图谱。

图2表示实施例4中测定的SMA-PEI800的缓冲能力的图。

图3A表示实施例5中制得的包含SMA-PEI800的复合物的琼脂糖凝胶电泳示意图。

图3B表示实施例5中制得的包含SMA-PEI800的复合物的平均粒径和表面zeta电位。

图4表示实施例6中测定的SMA-PEI800对DNA的保护作用(LPCs、SPCs、HPCs分别表示PEI800/pEGFP复合物、SMA-PEI800/pEGFP复合物和PEI25k/pEGFP复合物)。

图5A和图5B分别表示实施例7中测定的SMA-PEI800与PEI25k对MCF-7及MCF-7/ADR细胞的毒性对比。

图6A和图6B是实施例8中考察的SMA-PEI800/pEGFP复合物和PEI25k/pEGFP复合物(均在其最优N/P比的条件下)对MCF-7及MCF-7/ADR细胞转染48小时后的荧光照片。

图7A和图7B表示实施例8中用流式细胞仪分析的不同N/P比的SMA-PEI800/pEGFP复合物和N/P比为10的PEI25k/pEGFP复合物在MCF-7及MCF-7/ADR细胞中的转染效率(HPCs代表PEI25k/pEGFP复合物)。

图8表示实施例9中考察的SMA-PEI800/pEGFP复合物和PEI25k/pEGFP复合物(均在其最优N/P比的条件下)在MCF-7及MCF-7/ADR细胞中的摄取情况。

具体实施方式

现在对本发明进行一般性的示范性描述，结合下面的实施例可以更容易地理解本发明，这些实施方式和实施例只是用来理解本发明的特定方面和实施方案，而不是对本发明的实质和范围进行任何意义地限定，本发明的保护范围由所附权利要求及其等同物来限定。

试剂

聚乙烯亚胺(Aldrich)；聚苯乙烯马来酸酐(广州沙多玛有限公司)；DNaseI(碧云天生物技术研究所)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)，溴乙锭，台盼蓝(Sigma)；胰蛋白酶-EDTA，琼脂糖(Gibco)；YOYO-1，Hoechst33342，LysoTranckerRedKit(MolecularPro-bes)；肝素(阿拉丁)；培养基，胎牛血清(Gibco)；链霉素，氨苄青霉素(生工生物工程有限公司)；其他试剂均为分析级(国药集团化学试剂有限公司)。

生物材料

报告质粒pEGFP-N1(Clontech)；MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞(AmericanTypeCultureCollection，ATCC)；细胞培养皿，24孔、96孔细胞培养板(Corning)。

仪器

傅里叶变换红外光谱仪(EQUINOX55，Bruker)；核磁共振光谱仪(Varian，USA)；凝胶渗透色谱仪(Waters)；pH计(StatoriusBP-10)；涡旋仪(ScientificIndustries)；凝胶电泳仪(上海万达科技器材服务部)；凝胶成像系统(UVP，USA)；zeta电位/粒径测定仪(Nicomp380/ZLS)；流式细胞仪(BD)。

实施例1聚苯乙烯马来酸酐(SMA，分子量为5500Da，苯乙烯单元与马来酸酐单元的摩尔比为1∶1)-聚乙烯亚胺(分子量为800Da，PEI800)接枝共聚物非病毒基因载体的合成

称取792mgPEI800，溶于20mL二甲亚砜中，在搅拌条件下，缓慢滴加SMA的二甲亚砜溶液(100mg，20mL)，速度每秒1～2滴。当SMA滴加完毕后，反应混合物在室温条件下继续搅拌12h。反应结束后，将反应液转入透析袋中，用水透析5天，以除去二甲亚砜及未反应的PEI。然后减压条件下除去大部分水分，真空干燥，即得两亲性梳状聚苯乙烯马来酸酐-聚乙烯亚胺接枝共聚物(SMA-PEI800)。

实施例2SMA-PEI800的结构确证

1)1H-NMR

将8mg的实施例1制备的SMA-PEI800溶于500μL的重水和氘代甲醇的混合溶液(重水与氘代甲醇的体积比为1∶1)中，在400MHz测定其1H-NMR图谱，并进行解析。结果如图1A所示，1H-NMR图谱解析结果与其结构相符。

2)FT-IR

将实施例1制备的SMA-PEI800粉末与kBr压片，采用傅里叶变换红外光谱仪测定其红外光谱(FT-IR)，并进行解析。结果如图1B所示，FT-IR图谱解析结果与其结构相符。

实施例3SMA-PEI800的分子量测定

将分子量4400-401000Da的葡聚糖溶于含0.2M醋酸/醋酸钠和0.1％叠氮化钠的水溶液，配制成1mg/mL的溶液，作为标准品，以含0.2M醋酸/醋酸钠和0.1％叠氮化钠的水溶液为流动相，在凝胶渗透色谱仪上通过示差折光检测器建立标准曲线。将实施例1制备的SMA-PEI800溶于流动相溶液中，配制成2mg/mL的溶液，以含0.2M醋酸/醋酸钠和0.1％叠氮化钠的水溶液为流动相，在凝胶渗透色谱仪上通过示差折光检测器测定分子量。结果下表1所示：

表1：实施例3中测得的SMA-PEI800的重均分子量(Mw)和分散度(Mw/Mn)

实施例4SMA-PEI800缓冲能力的测定

将一定量(相当于0.25mmol可质子化氨基)的实施例1制备的SMA-PEI800和PEI25k(分子量为25kDa的聚乙烯亚胺)分别溶于5mL150mM的NaCl溶液中，用0.1MNaOH将溶液pH值调节到10.0，然后，用0.1MHCl进行滴定，记录HCl滴定体积及溶液的pH。结果如图2所示，SMA-PEI800具有与PEI25k相近的缓冲能力。

实施例5由SMA-PEI800与pEGFP组成的复合物的制备和表征

1)制备复合物

配制编码绿色荧光蛋白的质粒DNA(pEGFP)的水溶液30μL(浓度为0.2mg/mL)，配制实施例1所制备的SMA-PEI800的水溶液120μL(浓度分别为0.34mg/mL、0.66mg/mL、5mg/mL、13.3mg/mL)，将所配的SMA-PEI800溶液(120μL)与pEGFP溶液(30μL)混合，涡旋30秒后，室温下放置1小时，由此制得N/P比分别为5、10、15、20的由SMA-PEI800与pEGFP组成的复合物。

2)凝胶电泳阻滞试验

按照步骤1)制备复合物溶液。取一系列N/P比(0.5，1，2，3，5，10，20)的SMA-PEI800与pEGFP的复合物溶液各10μL，分别与2μLDNA加样缓冲液混合，加样到0.8％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭)中，以TAE为缓冲液，电压5V/cm进行电泳试验。结果如图3A所示，表明所合成的聚合物SMA-PEI800有结合DNA的能力，其中第1道：裸pDNA；第2-8道：聚合物与DNA的N/P比分别为0.5(第2道)，1(第3道)，2(第4道)，3(第5道)，5(第6道)，10(第7道)，20(第8道)。

3)复合物的粒径和表面电位测定

按照步骤1)制备复合物溶液。采用Nicomp380/ZLSzeta电位/粒径测定仪，在25℃条件下测定表面电位和利用光散射法测定平均粒径。结果如图3B所示，表明所制备的复合物的粒径均在135-200nm之间，表面zeta电位均在13-30mV以上。

实施例6SMA-PEI800对DNA的保护作用

将实施例4制备的复合物溶液中加入DNaseI(1U/μgDNA)，37℃孵育30min。然后加入EDTA至终浓度为2.5mM，加热至65℃孵育10min，以使DNaseI失活。最后加入肝素(100units/μgDNA)，37℃孵育30min，使DNA分子从复合物中释放出来，经0.8％琼脂糖凝胶电泳分析DNA分子的完整性。结果如图4所示，SMA-PEI800可保护DNA使其免受DNaseI的降解。

实施例7SMA-PEI800对MCF-7及MCF-7/ADR细胞的体外毒性试验

1)细胞培养

将MCF-7和MCF-7/ADR细胞培养在含10％胎牛血清的RPMI1640培养基(含100U/mL氨苄青霉素和100μg/mL链霉素)中，放置在37℃，5％CO₂的培养箱中生长。取处于对数生长期的细胞，用含0.02％EDTA和0.25％胰蛋白酶的消化液消化后，按每孔1×10⁴个细胞接种于96孔板，每孔含培养基0.2mL，放在培养箱内培养12小时。

2)细胞毒性试验

将不同量的实施例1制备的SMA-PEI800和PEI25k溶于含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，配制一定浓度的溶液各0.2mL。将96孔板内原有的培养基吸走，将按上述方法配制的含有聚合物的培养基分别加入孔板中。共设1000、100、10、1、0.1μg/mL五个浓度梯度，每个浓度设3个平行孔。37℃下孵育48小时，除去培养基，每孔加入含0.5mg/mLMTT的新鲜培养基0.2mL，37℃下孵育4小时。小心吸去孔内培养基，每孔加入150μL二甲亚砜，37℃下摇床振摇10分钟(100rpm)，通过酶标仪测定各孔在570nm的光吸收值。结果如图5A和5B所示，表明所述的SMA-PEI800对MCF-7及MCF-7/ADR细胞的体外毒性均明显低于PEI25k。

实施例8SMA-PEI800/pEGFP复合物的体外MCF-7及MCF-7/ADR细胞转染试验

1)细胞培养

将MCF-7及MCF-7/ADR细胞培养在含10％胎牛血清的RPMI1640培养基(含100U/mL氨苄青霉素和100μg/mL链霉素)中，放置在37℃，5％CO₂的培养箱中生长。取处于对数生长期的细胞，用含0.02％EDTA和0.25％胰蛋白酶的消化液消化后，按每孔1×10⁵个细胞接种于24孔板，每孔含培养基0.5mL，放在培养箱内培养12小时。

2)细胞转染

配制pEGFP的水溶液10μL(浓度为0.2mg/mL)，配制实施例1制备的SMA-PEI800的水溶液10μL(浓度分别为0.34mg/mL、0.66mg/mL和5mg/mL)，将所配制SMA-PEI800溶液(10μL)与pEGFP溶液混合(10μL)，涡旋30秒后，室温下放置1小时得到N/P比分别为5、10、15的复合物溶液，将所得到的复合物溶液用480μL含10％胎牛血清的RPMI1640培养基稀释，混合均匀。按同样方法制备含有PEI25k/pEGFP复合物(N/P比为10)的培养基0.5mL。将24孔板内原有的培养基吸走，将按上述方法配制的含有上述复合物的培养基加入到孔板内。每种N/P比设三个平行孔。37℃下孵育48小时，在荧光显微镜下观察并拍照。结果如图6A和图6B所示，表明所述合成的两亲性梳状共聚物SMA-PEI800对MCF-7及MCF-7/ADR细胞的转染效率均要显著高于PEI25k。

3)用流式细胞仪分析EGFP表达率

用胰蛋白酶将24孔板内细胞消化，并用RPMI1640培养基重悬细胞，2000×g离心5分钟，吸去上清，用PBS重悬沉淀的细胞。再次2000×g离心5分钟，吸去上清，用PBS重悬细胞，利用流式细胞仪分析所得细胞悬液，测定EGFP的荧光强度，并与未加复合物培养的细胞比较，计算EGFP表达率。结果如图7A和7B所示，表明SMA-PEI800/pEGFP复合物对MCF-7及MCF-7/ADR细胞均有较高的转染效率，且高于PEI25k/pEGFP复合物。

实施例9SMA-PEI800/pEGFP复合物的体外MCF-7及MCF-7/ADR细胞摄取试验

1)细胞培养

将MCF-7及MCF-7/ADR细胞培养在含10％胎牛血清的RPMI1640培养基(含100U/mL氨苄青霉素和100μg/mL链霉素)中，放置在37℃，5％CO₂的培养箱中生长。取处于对数生长期的细胞，用含0.02％EDTA和0.25％胰蛋白酶的消化液消化后，按每孔1×10⁵个细胞接种于铺有10mm²盖玻片的24孔板，每孔含培养基0.5mL，放在培养箱内培养12小时。

pEGFP用YOYO-1进行荧光标记后按实施例8分别制备与SMA-PEI800及PEI25k的复合物，并与480μL含10％胎牛血清的RPMI1640培养基稀释，混合均匀。将24孔板内原有的培养基吸走，将按上述方法配制的含有上述复合物的培养基加入到孔板内。37℃下孵育1.5h后，加入Hoechst33342和LysoTrackerRed，继续37℃孵育30min。接着加入0.4％的台盼蓝以焠灭细胞外的荧光。将24孔板内原有的培养基吸走，细胞用PBS洗三次后，用4％多聚甲醛暗处固定30min。最后将载有细胞的盖玻片取出并固定于载玻片上，在共聚焦显微镜下观察并拍照。结果如图8A和图8B所示，表明含有所述两亲性梳状共聚物SMA-PEI800和核酸的复合物在MCF-7及MCF-7/ADR细胞中的摄取要显著高于PEI25k和核酸的复合物。

尽管已经对本发明的具体实施方式进行了描述，但对本领域普通技术人员来说，显然在不脱离由如下权利要求所限定的本发明实质和范围的情况下，可对本发明进行各种变通和改进。

Claims (12)

1.一种两亲性梳状聚苯乙烯马来酸酐-聚乙烯亚胺接枝共聚物，其由分子量为0.2-10KDa的低分子量聚乙烯亚胺的伯胺对分子量为2-1000KDa的聚苯乙烯马来酸酐的酸酐进行胺解所形成。

2.根据权利要求1所述的两亲性梳状聚苯乙烯马来酸酐-聚乙烯亚胺接枝共聚物，其中，所述聚苯乙烯马来酸酐的分子量为5-50KDa；和/或，所述聚乙烯亚胺的分子量为0.4-2KDa。

3.根据权利要求1或2所述的两亲性梳状聚苯乙烯马来酸酐-聚乙烯亚胺接枝共聚物，其中，所述聚苯乙烯马来酸酐中苯乙烯单元与马来酸酐单元的摩尔比为3:1-1:3；和/或，所述聚苯乙烯马来酸酐-聚乙烯亚胺的接枝度为30％-80％。

4.根据权利要求1或2所述的两亲性梳状聚苯乙烯马来酸酐-聚乙烯亚胺接枝共聚物，其中，所述聚苯乙烯马来酸酐中苯乙烯单元与马来酸酐单元的摩尔比为2:1-1:2；和/或，所述聚苯乙烯马来酸酐-聚乙烯亚胺的接枝度为50％-80％。

5.权利要求1～4中任一项所述的两亲性梳状聚苯乙烯马来酸酐-聚乙烯亚胺接枝共聚物的制备方法，所述方法包括：

使聚乙烯亚胺和聚苯乙烯马来酸酐反应制得两亲性梳状聚苯乙烯马来酸酐-聚乙烯亚胺接枝共聚物，其中，聚乙烯亚胺与聚苯乙烯马来酸酐中的马来酸酐单元的摩尔比为1:1-5:1。

6.权利要求1～4中任一项所述的两亲性梳状聚苯乙烯马来酸酐-聚乙烯亚胺接枝共聚物用作非病毒基因载体的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述用途为用作核酸的输送载体，所述核酸包括DNA、RNA、寡聚核苷酸和/或修饰的核酸。

8.一种含有核酸和权利要求1～4中任一项所述的两亲性梳状聚苯乙烯马来酸酐-聚乙烯亚胺接枝共聚物的复合物。

9.根据权利要求8所述的复合物，其中，所述核酸包括DNA、RNA、寡聚核苷酸和/或修饰的核酸。

10.权利要求8所述的复合物的制备方法，所述方法包括：

将权利要求1～4中任一项所述的两亲性梳状聚苯乙烯马来酸酐-聚乙烯亚胺接枝共聚物和核酸充分混合至复合物形成。

11.一种将核酸输送至靶细胞中的方法，其中，使权利要求8所述的两亲性梳状聚苯乙烯马来酸酐-聚乙烯亚胺接枝共聚物和核酸的复合物与靶细胞接触以使所述复合物被摄取到细胞中，其中，所述靶细胞为体外细胞。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，该方法进一步包括使所述两亲性梳状聚苯乙烯马来酸酐-聚乙烯亚胺接枝共聚物和核酸的复合物被靶细胞所摄取的以下步骤：

a)培养靶细胞；

b)制备权利要求8所述的两亲性梳状聚苯乙烯马来酸酐-聚乙烯亚胺接枝共聚物和核酸的复合物；和

c)使步骤b)中的所述复合物与靶细胞接触。