CN105254900B - 溴取代的芳香化合物修饰的高分子材料及制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种如式(1)所示的溴取代的芳香化合物修饰的阳离子高分子材料，其包括阳离子高分子骨架以及溴取代的芳香化合物功能基团，所述溴取代的芳香化合物功能基团共价连接在阳离子高分子表面；所述的阳离子高分子骨架包括聚酰胺‑胺树形高分子、聚丙烯亚胺树形高分子、线性聚乙烯亚胺阳离子高分子、支化聚乙烯亚胺阳离子高分子及其衍生物；所述高分子材料作为药物、核酸和蛋白质的载体。本发明提供的溴取代的芳香化合物修饰的高分子材料合成成本低，细胞毒性小，转染效率高，是一种具有良好应用前景的载体材料。
Description
技术领域
本发明涉及高分子化学，有机合成以及生物材料技术领域，具体涉及一种溴取代的芳香化合物修饰的阳离子高分子材料及其制备方法和应用。
背景技术
基因转染是分子生物学和基因治疗中一种非常重要的技术手段，它是指将外源基因导入细胞，从而获得新的遗传性状的过程。基因转染需要转染载体将带有目的基因的核酸片段运送到细胞内并保护它不被细胞内外存在的核酸酶所降解。目前使用的基因转染载体主要包括病毒类载体和非病毒类载体。在过去的200多年中，病毒类基因转染载体因为具有较高的基因转染效率受到了科学界广泛的关注。但病毒类载体存在携带基因能力有限、生产造价高以及存在安全性隐患等问题，这在很大程度上限制了病毒类基因转染载体的应用。随着科学界对更加安全、稳定的基因转染载体的需要，很多非病毒类基因转染载体应运而生了。
阳离子聚合物是一类广泛使用的非病毒类基因转染载体。它易于生产，可生物降解，结构灵活，易于对其表面进行多功能化的修饰，并且可以将大分子量的质粒转到活细胞中。聚酰胺-胺树形高分子和聚乙烯亚胺是两种典型的阳离子聚合物基因转染载体。由于表面大量的氨基基团的存在，他们可以将DNA浓缩成很小的纳米颗粒，不仅有利于将DNA导入细胞，而且能够保护DNA不被外部的核酸酶降解。其内部的三级胺结构可以起到“质子海绵”的作用，促进DNA复合物在细胞内涵体的逃逸，但是聚酰胺-胺树形高分子以及聚乙烯亚胺阳离子聚合物在基因转染过程中对常见常用细胞系(如HEK293、HeLa、COS-7细胞等)表现出的低的或者中等的基因转染效率，以及较高的细胞毒性限制了他们的临床应用。近年来，许多研究工作者在这两类阳离子聚合物表面连接了各种修饰基团，如氨基酸、脂质体、多肽、环糊精、寡氨、聚乙二醇、糖基等来增强其生物相容性和转染效果。目前，以聚酰胺-胺树形高分子和聚乙烯亚胺为基础的基因转染载体如SuperFect、Priofect、PolyFect，JetPEI等已经成功商业化。但是，现有技术中基于阳离子聚合物合成的基因转染载体有比较复杂的合成路线、高昂的材料成本，以及高的细胞毒性。这些缺陷在很大程度上制约了其在生物医学领域广泛应用。因此亟需通过新的修饰及改良方法合成具有较高的基因转染效率和良好生物相容性的转染载体。
发明内容
本发明克服现有阳离子高分子转染材料及其合成方法的不足，提出了一种基于溴取代的芳香环化合物修饰的阳离子高分子转染载体，可以高效、安全、低毒地转染核酸或蛋白质。本方法利用溴取代的芳香环化合物和阳离子高分子材料作为原料，反应高效、安全、合成成 本较低，得到的转染载体具备细胞毒性小、转染效率高等优点。
本发明提供了一种溴取代的芳香环化合物修饰的高分子材料，其结构如式(1)所示，包括阳离子高分子骨架以及溴取代的芳香环化合物功能基团，所述含溴芳香环化合物功能基团共价连接在阳离子高分子表面；所述阳离子高分子表面为伯胺基团；
R-(Y-S)x 式(1)，
式(1)中：
R为所述高分子骨架，所述高分子骨架为阳离子高分子骨架；
Y为连接基团；
S为溴取代的芳香化合物功能基团；
x为1-1024的整数。
其中，所述R为如式(2)所示的聚酰胺-胺树形高分子、如式(3)所示的聚丙烯亚胺树形高分子、如式(4)所示的聚赖氨酸阳离子高分子、如式(5)所示的线性聚乙烯亚胺阳离子高分子或如式(6)所示的支化聚乙烯亚胺阳离子高分子，
所述式(2)和式(3)中：
M是树形高分子的核心，包括氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、葵二胺和1,12-十二烷二胺；
n是1-10的整数；
m是2-4的整数；
所述式(4)中，q是1-1024的整数；
所述式(5)中，r是1-1024的整数；
所述式(6)中，x,y是1-1024的整数。
所述Y如式(7)、式(8)、式(9)、式(10)、式(11)或式(12)所示：
式(7)；式(8)；式(9)；式(10)；式(11)；式(12)；
所述S如式(13)、式(14)、式(15)、式(16)、式(17)或式(18)所示：
本发明溴取代的芳香环化合物修饰的阳离子高分子材料，包括阳离子高分子骨架以及溴取代的芳香环化合物功能基团，所述溴取代的芳香环化合物功能基团共价连接在阳离子高分子表面；所述阳离子高分子骨架包括聚酰胺-胺树形高分子，聚丙烯亚胺树形高分子、聚赖氨酸阳离子高分子、线性聚乙烯亚胺阳离子高分子或支化聚乙烯亚胺阳离子高分子，所述阳离子高分子表面的伯胺基团与所述溴取代的芳香环化合物的修饰基团进行取代、酰化、磺酸化等反应，以酰胺键、氨基磺酸键等化合键连接。
本发明还提出了一种式(1)所示阳离子高分子材料的制备方法，将溴取代的芳香环化合物及阳离子高分子溶解于水或有机溶剂，搅拌反应48-168小时，通过反应将含溴取代的芳香环化合物功能基团共价连接到阳离子聚合物表面，得到如式(1)所示的阳离子高分子材料。
具体地，溴取代的芳香环化合物修饰的阳离子高分子材料制备方法，以所述阳离子高分子和所述溴取代的芳香环化合物为原料，首先将溴取代的芳香环化合物溶于溶剂中，之后向溶剂中加入适量的活化剂进行活化，再按照一定的比例逐滴滴加所述阳离子高分子的水或有机溶液；一定的反应温度下搅拌反应，得到如式(1)所示的阳离子高分子材料。
本发明制备方法中，所述溶剂为有机溶剂或水；
其中，所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺和四氢呋喃等可溶解所述溴取代的芳香环化合物的有机溶剂。
本发明制备方法中所述溴取代的芳香环化合物包括4-溴苯甲酸、4-溴苯甲醛、4-溴苯异氰酸酯、3-溴苯甲酸、2-溴苯甲酸、3，5-二溴苯甲酸等含溴芳香环衍生物。
本发明制备方法中，所述反应时间为48-168小时；所述反应温度为0-37℃。
本发明还提出了式(1)所示的溴取代的芳香环化合物修饰的高分子材料作为核酸或蛋白质分子的输送载体的应用。
其中，所述核酸包括DNA、siRNA、shRNA、microRNA和修饰的核酸。
其中，所述蛋白是肽、修饰的肽、蛋白或修饰的蛋白。
本发明还提出了一种新的复合物，其包括含有如式(1)所示的溴取代的芳香环化合物修饰的高分子材料和核酸或蛋白质，由所述式(1)转染材料携带所述核酸或蛋白质。
在一个具体的实施例中，在室温下，将所述阳离子高分子材料和特异性敲除荧光素酶的siRNA形成复合物，在该复合物中，由所述阳离子高分子材料携带核酸。
阳离子高分子包括聚酰胺-胺树形高分子，聚丙烯亚胺树形高分子、聚赖氨酸阳离子高分子、线性聚乙烯亚胺阳离子高分子和支化聚乙烯亚胺阳离子高分子，其表面存在大量的氨基可以很好地结合和浓缩核酸或蛋白质，将核酸或蛋白质转入细胞内。其内部的三级胺结构可以通过“质子海绵”机制帮助核酸或蛋白质成功地从内含体逃逸。但是这些阳离子高分子聚合物一般只具有较低或中等的基因转染效率。本发明制备的如式(1)所示的溴取代的芳香环修饰的高分子材料作为转染载体能有效地提高原阳离子高分子转染核酸或蛋白质的效率,达到商业化lipofectamine 2000的级别，同时降低了细胞毒性。因此，本发明的溴取代的芳香环修饰的高分子材料的制备方法合成工艺简单、材料组成可控、成本低廉，制备的高分子材料能有效且安全地将核酸或蛋白质分子输送到细胞中，具有转染效率高和毒性低等优点。
附图说明
图1为实施例1中所制备的阳离子高分子材料G5-4-Bro-a,G5-N＝C-4-Bro-a,G5-NH-4-Bro-a,G5-2-Bro-a,G5--3-Bro-a,G5-3,5-Bro-a的一维核磁共振图谱。
图2为实施例1中所得的阳离子高分子材料G5-4-Bro-47和G5-3,5-Bro-30在Hela-luc细胞上对荧光素酶基因的敲除效率对比图。
图3为实施例2制备的阳离子高分子材料PEI-3,5-Bro-100、PEI和Lipofectamine2000在Hela-Luc细胞上对荧光素酶的敲除效率对比图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试 剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1：
本发明基于第五代聚酰胺-胺型树形高分子和溴取代的芳香环衍生物的阳离子高分子材料(G5-4-Bro-a，G5-N＝C-4-Bro-a，G5-NH-4-Bro-a，G5-2-Bro-a，G5--3-Bro-a，G5-3,5-Bro-a)的制备及表征
(1)如反应式(I)所示的基于第五代聚酰胺-胺型树形高分子和溴取代的芳香环衍生物的阳离子高分子材料G5-4-Bro-a，其结构式如以下式(1A)所示：
以下反应式(I)阳离子高分子材料G5-4-Bro-a,G5-N＝C-4-Bro-a,G5-NH-4-Bro-a,G5-2-Bro-a,G5--3-Bro-a,G5-3,5-Bro-a的合成路线及结构式：
其中，G5为第5代聚酰胺-胺树形高分子，中心核为乙二胺，末端基团为伯胺基团，式(2)中，n为6，m为2，其结构如式(3A)所示；
S＝4-Bro，为4-溴苯甲酸；
a表示4-溴苯甲酸共价连接到第5代聚酰胺-胺树形高分子表面的数量；
式(3A)中，M是第5代聚酰胺-胺树形高分子G5的中心核。
在本发明具体实施例中，M可以是氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、葵二胺或1,12-十二烷二胺。
式(1A)所示阳离子高分子材料G5-4-Bro-a的制备合成方法：取13.4毫克4-溴苯甲酸，将其溶于2毫升无水N,N-二甲基甲酰胺溶液，加入17.9毫克DCC，9.2毫克NHS，活化反应6小时后，取30毫克第五代聚酰胺-胺树形高分子溶于2毫升无水二甲亚砜。向上述活化反应体系中滴加13.9微升三乙胺，再将第五代聚酰胺-胺树形高分子的二甲亚砜溶液滴加至活化反应体系。滴加完成后将该反应溶液在室温下继续搅拌反应7天后，将所得样品用DMSO透析，再用水透析若干次。收集样品并冷冻干燥，即可得到外观为白色粉末的基于4-溴苯甲酸修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料，其结构如以上式(1A)所示。本实施例中，所用原料树形高分子与含溴芳香环化合物之比例为1:64。
以1H NMR法表征检测上述产物：具体方法为：取1毫克实施例(1)中合成的阳离子高分子材料，溶于0.5毫升氘代DMSO中，进行核磁共振分析。根据1H NMR图谱，如图1所示，计算树形高分子表面溴取代的芳香环化合物功能基团的连接效率。
实验结果：
根据计算对比，每个树形高分子表面连接了47个4-溴苯甲酸基团，即制得表面修饰了47个4-溴苯甲酸的第五代聚酰胺-胺树形高分子，命名为G5-4-Bro 47，其结构如式(1A)所示，其中，a为47。
(2)如反应式(I)所示的基于第五代聚酰胺-胺型树形高分子和溴取代的芳香环衍生物的阳离子高分子材料G5-N＝C-4-Bro-a，其结构式如以下式(1B)所示：
其中，G5为第5代聚酰胺-胺树形高分子，中心核为乙二胺，末端基团为伯胺基团。式(2)中，n为6，m为2，其结构如式(3A)所示；
Y＝(N＝C)-4-Bro，为4-溴苯甲醛；
a表示4-溴苯甲醛共价连接到第5代聚酰胺-胺树形高分子表面的数量；
式(3A)中，M是第5代聚酰胺-胺树形高分子G5的中心核。
在本发明具体实施例中，M可以是氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、葵二胺或1,12-十二烷二胺。
式(1B)所示基因转染材料G5-N＝C-4-Bro-a的制备合成方法：将12.3毫克4-溴苯甲醛和30毫克第五代聚酰胺-胺树形高分子分别溶于2毫升无水二甲亚砜(DMSO)，将两溶液混合；室温下搅拌反应48小时后，将所得样品用DMSO透析，再用水(PH＝7.4)透析若干次。收集样品并冷冻干燥，即可得到外观为白色粉末的基于4-溴苯甲醛修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料，其结构如以上式(1B)所示。本实施例中，所用原料树形高分子与含溴芳香环化合物摩尔比为1:64。
以1H NMR法表征检测上述产物：具体方法为：取1毫克实施例1(2)中合成的阳离子高分子材料，溶于0.5毫升氘代DMSO中，进行核磁共振分析。根据1H NMR图谱，如图1所示，计算树形高分子表面含溴功能基团连接效率。
实验结果：根据计算对比，每个树形高分子表面连接了9个4-溴苯甲醛基团，即制得表面修饰了9个4-溴苯甲醛的第五代聚酰胺-胺树形高分子并命名为G5-N＝C-4-Bro 9，其结构如式(1B)所示，其中，a为9。
(3)如反应式(I)所示的基于第五代聚酰胺-胺型树形高分子和溴取代的芳香环衍生物的阳离子高分子材料G5-NH-4-Bro-a，其结构式如以下式(1C)所示：
其中，G5为第5代聚酰胺-胺树形高分子，中心核为乙二胺，末端基团为伯胺基团，式 (2)中，n为6，m为2，其结构如式(3A)所示；
Y＝NH-4-Bro，为4-溴苯异氰酸酯；
a表示4-溴苯异氰酸酯共价连接到第5代聚酰胺-胺树形高分子表面的数量；
式(3A)中，M是第5代聚酰胺-胺树形高分子G5的中心核。
在本发明具体实施例中，M可以是氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、葵二胺或1,12-十二烷二胺。
式(1C)所示阳离子高分子材料G5-NH-4-Bro-a的制备合成方法：将6.6毫克4-溴苯异氰酸酯和30毫克第五代聚酰胺-胺树形高分子分别溶于2毫升无水二甲亚砜(DMSO)，将两溶液混合；室温下搅拌反应48小时后，将所得样品用DMSO透析，再用水透析若干次。收集样品并冷冻干燥，即可得到外观为白色粉末的基于4-溴苯异氰酸酯修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料，其结构如以上式(1C)所示。本实施例中，所用原料树形高分子与含溴芳香环化合物摩尔比为1:32。
以1H NMR法表征检测上述产物：具体方法为：取1毫克实施例1(3)中合成的基因转染载体，溶于0.5毫升氘代DMSO中，进行核磁共振分析。根据1H NMR图谱，如图1所示，计算树形高分子表面含溴功能基团连接效率。
实验结果：
根据计算对比，每个树形高分子表面连接了32个4-溴苯异氰酸酯，即制得表面修饰了32个4-溴苯异氰酸酯的第五代聚酰胺-胺树形高分子并命名为G5-NH-4-Bro-32，其结构如式(1C)所示，其中，a为32。
(4)如反应式(I)所示的基于第五代聚酰胺-胺型树形高分子和溴取代的芳香环衍生物的基因转染材料G5-2-Bro-a，其结构式如以下式(1D)所示：
其中，G5为第5代聚酰胺-胺树形高分子，中心核为乙二胺，末端基团为伯胺基团，式(2)中，n为6，m为2，其结构如式(3A)所示；
Y＝2-Bro，为2-溴苯甲酸；
a表示2-溴苯甲酸共价连接到第5代聚酰胺-胺树形高分子表面的数量；
式(3A)中，M是第5代聚酰胺-胺树形高分子G5的中心核。
在本发明具体实施例中，M可以是氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、葵二胺、或1,12-十二烷二胺。
式(1D)所示阳离子高分子材料G5-2-Bro-a的制备合成方法：取13.4毫克2-溴苯甲酸，将其溶于2毫升无水N,N-二甲基甲酰胺溶液，加入17.9毫克DCC，9.2毫克NHS，活化反应6小时后，取30毫克第五代聚酰胺-胺树形高分子溶于2毫升无水二甲亚砜。向上述活化反应体系中滴加13.9微升三乙胺，再将第五代聚酰胺-胺树形高分子的二甲亚砜溶液滴加至活化反应体系。滴加完成后将该反应溶液在室温下继续搅拌反应7天后，将所得样品用DMSO透析，再用水透析若干次。收集样品并冷冻干燥，即可得到外观为白色粉末的基于2-溴苯甲酸修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料，其结构如以上式(1D)所示。本实施例中，所用原料树形高分子与含溴芳香环化合物之比例为1:64。
以1H NMR法表征检测上述产物：具体方法为：取1毫克实施例1(4)中合成的基因转染载体，溶于0.5毫升氘代DMSO中，进行核磁共振分析。根据1H NMR图谱，如图1所示，计算树形高分子表面含溴功能基团连接效率。
实验结果：根据计算对比，每个树形高分子表面连接了46个2-溴苯甲酸基团，即制得表面修饰了46个2-溴苯甲酸的第五代聚酰胺-胺树形高分子并命名为G5-2-Bro-46，其结构如以上式(1D)所示，其中，a为46。
(5)如反应式(I)所示的基于第五代聚酰胺-胺型树形高分子和溴取代的芳香环衍生物的阳离子高分子材料G5-3-Bro-a，其结构式如以下式(1E)所示：
其中，G5为第5代聚酰胺-胺树形高分子，中心核为乙二胺，末端基团为伯胺基团，式(2)中n为6，m为2，其结构如式(3A)所示；
Y＝3-Bro，为3-溴苯甲酸；
a表示3-溴苯甲酸共价连接到第5代聚酰胺-胺树形高分子表面的数量；
式(3A)中，M是第5代聚酰胺-胺树形高分子G5的中心核。
在本发明具体实施例中，M可以是氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、葵二胺、或1,12-十二烷二胺。
式(1E)所示阳离子高分子材料G5-3-Bro-a的制备合成方法：取13.4毫克3-溴苯甲酸，将其溶于2毫升无水N,N-二甲基甲酰胺溶液，加入17.9毫克DCC，9.2毫克NHS，活化反应6小时后，取30毫克第五代聚酰胺-胺树形高分子溶于2毫升无水二甲亚砜。向上述活化反应体系中滴加13.9微升三乙胺，再将第五代聚酰胺-胺树形高分子的二甲亚砜溶液滴加至活化反应体系。滴加完成后将该反应溶液在室温下继续搅拌反应7天后，将所得样品用DMSO透析，再用水透析若干次。收集样品并冷冻干燥，即可得到外观为白色粉末的基于3-溴苯甲酸修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料，其结构如以上式(1E)所示。本实施例中，所用原料树形高分子与含溴芳香环化合物之比例为1:64。
以1H NMR法表征检测上述产物：具体方法为：取1毫克实施例1(5)中合成的基因转染载体，溶于0.5毫升氘代DMSO中，进行核磁共振分析。根据1H NMR图谱，如图1所示，计算树形高分子表面含溴功能基团连接效率。
实验结果：根据计算对比，每个树形高分子表面连接了40个3-溴苯甲酸基团，即制得表面修饰了40个3-溴苯甲酸的第五代聚酰胺-胺树形高分子并命名为G5-3-Bro 40，其结构如式(1E)所示，其中，a为40。
(6)如反应式(I)所示的基于第五代聚酰胺-胺型树形高分子和溴取代的芳香环衍生物的阳离子高分子材料G5-3,5-Bro-a，其结构式如以下式(1F)所示：
其中，G5为第5代聚酰胺-胺树形高分子，中心核为乙二胺，末端基团为伯胺基团，式 (2)中n为6，m为2，其结构如式(3A)所示。Y＝-3,5-Bro，为3，5-二溴苯甲酸；a表示3，5-二溴苯甲酸共价连接到第5代聚酰胺-胺树形高分子表面的数量；
式(3A)中，M是第5代聚酰胺-胺树形高分子G5的中心核。
在本发明具体实施例中，M可以是氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、葵二胺、或1,12-十二烷二胺。
式(1F)所示基因转染材料G5-3,5-Bro-a的制备合成方法制备合成方法：取18.6毫克3,5-二溴苯甲酸，将其溶于2毫升无水二甲基甲酰胺溶液，加入17.9毫克DCC，9.2毫克NHS，活化反应6小时后，取30毫克第五代聚酰胺-胺树形高分子溶于2毫升无水二甲亚砜。向上述活化反应体系中滴加13.9微升三乙胺，再将第五代聚酰胺-胺树形高分子的二甲亚砜溶液滴加至活化反应体系。滴加完成后将该反应溶液在室温下继续搅拌反应7天后，将所得样品用DMSO透析，再用水透析若干次。收集样品并冷冻干燥，即可得到外观为白色粉末的基于3,5-二溴苯甲酸修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料，其结构如式(1)所示。本实施例中，所用原料树形高分子与含溴芳香环化合物之比例为1:64。
以1H NMR法表征检测上述产物：具体方法为：取1毫克实施例1(6)中合成的基因转染载体，溶于0.5毫升氘代二甲亚砜溶液，进行核磁共振分析。根据1H NMR图谱，如图1所示，计算树形高分子表面含溴功能基团连接效率。
实验结果：
根据计算对比，每个树形高分子表面连接了30个3,5-二溴苯甲酸基团，即制得表面修饰了30个3,5-二溴苯甲酸的第五代聚酰胺-胺树形高分子并命名为G5-3，5-Bro 30，其结构如以上式(1F)所示，其中，a为30。
实施例2：
本发明基于聚乙烯亚胺阳离子聚合物和含溴芳香环衍生物的基因转染材料，即含溴芳香环衍生物修饰的聚乙烯亚胺阳离子聚合物高分子材料(PEI-2-Bro-a，PEI-3-Bro-a，PEI-3,5-Bro-a)的制备及表征。
(1)如反应式(II)所示为基于聚乙烯亚胺阳离子聚合物和含溴芳香环衍生物的基因转染材料，即含溴芳香环衍生物修饰的聚乙烯亚胺阳离子聚合物高分子材料PEI-2-Bro-a的反应方程，
即，式(1)中，R为25KD的支化聚乙烯亚胺(bPEI 25KD)时，所述高分子材料的结构式如以下式(2A)所示：
其中，
a表示2-溴苯甲酸共价连接到PEI表面伯胺基团上的数量；
x为bPEI 25KD分子中仲胺基团的数量；
y’为未连接含溴芳香环的包含伯胺的乙烯亚胺结构单元的数量；
其中2y’+a＝580。
式(2A)所示基因转染材料bPEI-2-Bro-a的制备合成方法：取35.1毫克3,5-二溴苯甲酸，将其溶于2毫升无水N,N-二甲基甲酰胺溶液，加入36.0毫克DCC，20.1毫克NHS，活化反应6小时后，取30毫克bPEI 25KD溶于2毫升无水二甲亚砜。向上述活化反应体系中滴加13.9微升三乙胺，再将bPEI25KD的二甲亚砜溶液滴加至活化反应体系。滴加完成后将该反 应溶液在室温下继续搅拌反应7天后，将所得样品用DMSO透析，再用水透析若干次。收集样品并冷冻干燥，即可得到外观为白色粉末的基于2-溴苯甲酸修饰的聚乙烯亚胺阳离子聚合物，其结构如式(2A)所示，将其命名为PEI-2-Bro100。本实施例中，所用聚乙烯亚胺高分子与含溴芳香环化合物之比例为1:145。
以1H NMR法表征检测上述产物：具体方法为：取1毫克实施例2(1)中合成的基因转染载体，溶于0.5毫升氘代氯仿，进行核磁共振分析。根据1H NMR图谱，计算聚乙烯亚胺聚合物表面含溴功能基团连接效率。
(2)如反应式(II)所示为基于聚乙烯亚胺阳离子聚合物和含溴芳香环衍生物的基因转染材料，即含溴芳香环衍生物修饰的聚乙烯亚胺阳离子聚合物高分子材料PEI-3-Bro-a的反应方程；
即，式(1)中，R为25KD的支化聚乙烯亚胺(bPEI 25KD)时，所述高分子材料的结构式如以下式(2B)所示：
其中，a表示3-溴苯甲酸共价连接到PEI表面伯胺基团上的数量；x为bPEI 25KD分子中仲胺基团的数量，y’为未连接含溴芳香环的包含伯胺的乙烯亚胺结构单元的数量，其中2y’+a＝580。
式(2B)所示基因转染材料bPEI-3-Bro-a的制备合成方法制备合成方法：取35.1毫克3-溴苯甲酸，将其溶于2毫升无水二甲基甲酰胺溶液，加入36.0毫克DCC，20.1毫克NHS，活化反应6小时后，取30毫克bPEI 25KD溶于2毫升无水二甲亚砜。向上述活化反应体系中滴加13.9微升三乙胺，再将bPEI的二甲亚砜溶液滴加至活化反应体系。滴加完成后将该反应溶液在室温下继续搅拌反应7天后，将所得样品用DMSO透析，再用水透析若干次。收集样品并冷冻干燥，即可得到外观为白色粉末的基于3-溴苯甲酸修饰的聚乙烯亚胺阳离子聚合物，其结构如式(2B)所示。将其命名为PEI-3-Bro100。本实施例中，所用聚乙烯亚胺高分子与含溴芳香环化合物之比例为1:145。
以1H NMR法表征检测上述产物：具体方法为：取1毫克实施例2(2)中合成的基因转染载体，溶于0.5毫升氘代氯仿，进行核磁共振分析。根据1H NMR图谱，计算聚乙烯亚胺聚合物表面含溴功能基团连接效率。
(3)如反应式(II)所示的基于聚乙烯亚胺阳离子聚合物和含溴芳香环衍生物的基因转染材料，即含溴芳香环衍生物修饰的聚乙烯亚胺阳离子聚合物高分子材料PEI-3,5-Bro-a的反应方程；
即，式(1)中，R为25KD的支化聚乙烯亚胺(bPEI 25KD)；时，所述高分子材料的结构式如以下式(2C)所示：
其中，
a表示3，5-二溴苯甲酸共价连接到PEI表面伯胺基团上的数量；
x为bPEI 25KD分子中仲胺基团的数量；
y’为未连接含溴芳香环的包含伯胺的乙烯亚胺结构单元的数量；
其中，2y’+a＝580。
式(2C)所示基因转染材料bPEI-3,5-Bro-a的制备合成方法制备合成方法：取48.8毫克3,5-二溴苯甲酸，将其溶于2毫升无水二甲基甲酰胺溶液，加入36.0毫克DCC，20.1毫克NHS，活化反应6小时后，取30毫克bPEI 25KD溶于2毫升无水二甲亚砜。向上述活化反应体系中滴加13.9微升三乙胺，再将bPEI25KD的二甲亚砜溶液滴加至活化反应体系。滴加完成后将该反应溶液在室温下继续搅拌反应7天后，将所得样品用DMSO透析，再用水透析若干次。收集样品并冷冻干燥，即可得到外观为白色粉末的基于3,5-二溴苯甲酸修饰的聚乙烯亚胺阳离子聚合物，其结构如式(2C)所示。将其命名为PEI-3，5-Bro100。本实施例中，所用聚乙烯亚胺高分子与含溴芳香环化合物之比例为1:145。
以1H NMR法表征检测上述产物：具体方法为：取1毫克实施例2(3)中合成的基因转染载体，溶于0.5毫升氘代氯仿，进行核磁共振分析。根据1H NMR图谱，计算聚乙烯亚胺聚合物表面含溴功能基团连接效率。
实施例3：基因转染材料G5-4-Bro-47和G5-3,5-Bro-30在HeLa-luc细胞中的基因敲除实 验
将实施例1中所制备的基因敲除试剂G5-4-Bro-47和G5-3,5-Bro-30分别与可以特异性敲除荧光素酶基因的siRNA(siLuc)在室温下形成复合物，然后在HeLa-luc细胞中进行基因敲除。通过检测荧光素酶的表达量来评估基因敲除效率，并以细胞总蛋白量作为评估材料毒性的一个指标。具体方法为：将HeLa-luc细胞在24孔板中培养24小时，将0.5ugsiLuc与G5-4-Bro-47或G5-3,5-Bro-30分别以不同质量比混匀(w/w＝1：1-20：1)，加入不含血清的培养基使其总体积为100ul，半小时后，加入150ul不含血清的培养基，将含有复合物的培养基加入到细胞中，孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，继续培养18小时后按照出厂商(Promega公司)提供的使用说明检测荧光素酶表达量，使用蛋白浓度测定试剂盒来检测每孔中细胞的总蛋白表达量。以实验组细胞的每毫克蛋白对应的荧光素酶光单元相对于未处理细胞的每毫克蛋白对应的荧光素酶光单元的百分比作为评价基因敲除效率的指标，以实验组细胞总蛋白量相对于对照组细胞的总蛋白量的百分比作为衡量材料细胞毒性的指标。第五代聚酰胺-胺树形高分子作为阴性对照，商业化试剂Lipofectamine 2000作为阳性对照。
基因转染材料G5-4-Bro-47和G5-3,5-Bro-30在HeLa-luc细胞中的基因敲除实验，实验结果如图2所示，G5-4-Bro-47和G5-3,5-Bro-30分别在质量比为8：1和20：1的条件下在Hela-Luc细胞上对荧光素酶的敲除效率达到最高(64.20％和78.18％)，远高于第5代聚酰胺-胺树形高分子在最佳质量比12：1时的敲除效率(14.64％)，其中G5-3,5-Bro-30接近商业化转染试剂Lipofectamine 2000在最佳质量比3：1时的敲除效率(83.9％)。从细胞蛋白百分比可以看出，所合成的所有材料在最佳转染条件下是无细胞毒性的。
实施例4：基因转染材料PEI-3,5-Bro-100在HeLa-luc细胞中的基因敲除实验。
将实施例2中所制备的基因敲除试剂PEI-3,5-Bro-100与可以特异性敲除荧光素酶基因的siRNA(siLuc)在室温下形成复合物，然后在HeLa-luc细胞中进行基因敲除。通过检测荧光素酶的表达量来评估基因敲除效率，并以细胞总蛋白量作为评估材料毒性的一个指标。具体方法为：将HeLa-luc细胞在24孔板中培养24小时，将0.5ugSiLuc与PEI-3,5-Bro-100以不同质量比混匀(w/w＝1：1-20：1)，加入不含血清的培养基使其总体积为100ul，半小时后，加入150ul不含血清的培养基，将含有复合物的培养基加入到细胞中，孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，继续培养18小时后按照出厂商(Promega公司)提供的使用说明检测荧光素酶表达量，使用蛋白浓度测定试剂盒来检测每孔中细胞的总蛋白表达量。以实验组细胞的每毫克蛋白对应的荧光素酶光单元相对于未处理细胞的每毫克蛋白对应的荧光素酶光单元的百分比作为评价基因敲除效率的指标，以实验组细胞总蛋白量相对于对照组细胞的总蛋白量的百分比作为衡量材料细胞毒性的指标。25KD的支化聚乙烯亚胺(PEI)作为阴性对 照，商业化试剂Lipofectamine 2000作为阳性对照。
实验结果：如图3所示的基因转染材料PEI-3,5-Bro-100在质量比分别为4：1的条件下在Hela-Luc细胞上对荧光素酶的敲除效率(82.35％)远高于未修饰的25KD的支化聚乙烯亚胺在最佳质量比12：1时的敲除效率(14.64％)，达到商业化转染试剂Lipofectamine2000在最佳质量比3：1时的敲除效率(80.21％)。从细胞蛋白百分比可以看出，所合成的所有材料在最佳转染条件下是无细胞毒性的。
以上实施例只是为了说明本发明技术构思及特点，让本领域普通技术人员能够了解本发明内容并据以实施，并不能以此限制本发明保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作的等效变化和修饰，都应涵盖在本发明保护范围内。
Claims (5)
1.一种溴取代的芳香化合物修饰的高分子材料，其特征在于，包括阳离子高分子骨架以及溴取代的芳香化合物功能基团；所述溴取代的芳香化合物功能基团共价连接在所述阳离子高分子骨架表面；所述阳离子高分子骨架表面为伯胺基团；其结构如式(1)所示：
R-(Y-S)x 式(1)，
式(1)中：
R为阳离子高分子骨架；
Y为连接基团；
S为溴取代的芳香化合物功能基团；
x为1-1024的整数；
当所述R如式(2)所示的聚酰胺-胺树形高分子时：
式(2)中：
M是树形高分子的核心，包括氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、葵二胺和1,12-十二烷二胺；
n是1-10的整数；
m是2-4的整数；
所述Y如式(7)所示：
所述S如式(13)、式(16)、式(17)或式(18)所示：
或，所述Y如式(9)所示：所述S如式(15)所示：
或，所述Y如式(11)所示：所述S如式(14)所示：
当所述R如式(6)所示的支化聚乙烯亚胺阳离子高分子时：
式(6)中，x,y分别是1-1024的整数；
所述Y如式(7)所示：
所述S如式(16)、式(17)或式(18)所示：
2.如权利要求1所述的高分子材料，其特征在于，所述溴取代的芳香化合物功能基团源自于化合物4-溴苯甲酸、4-溴苯甲醛、4-溴苯异氰酸酯、3-溴苯甲酸、2-溴苯甲酸和3，5-二溴苯甲酸。
3.如权利要求1所述的高分子材料作为核酸、蛋白质分子的输送载体的应用，其特征在于，将所述高分子材料与核酸或蛋白质在室温孵育形成稳定的转染复合物，对细胞进行转染。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述核酸是DNA、siRNA、shRNA、microRNA或修饰的核酸。
5.一种复合物，其特征在于，包括如权利要求1中式(1)所示的溴取代的芳香化合物修饰的高分子材料和核酸或蛋白质，其中，由所述高分子材料携带所述核酸或蛋白质。
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