CN105418939B - 胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料、制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种如式(1)所示的胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料，其包括阳离子高分子骨架和胍基取代的芳香化合物功能基团，所述胍基取代的芳香化合物功能基团共价连接在阳离子高分子骨架的表面。本发明还提供所述高分子材料的制备方法及其作为核酸和蛋白分子输送载体的应用。本发明的合成方法成本低廉，合成方法简单。所合成的高分子材料细胞毒性小，是一种应用前景良好的高分子材料。

Description

胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料、制备方法和应用
技术领域
本发明涉及高分子化学、有机合成以及生物材料技术领域，具体涉及一种基于胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料及其制备方法和应用。
背景技术
基因转染是指将具有生物功能的核酸导入到细胞内并使核酸在细胞内表达其生物功能的过程。在这个过程中，高分子材料扮演了重要的角色。早期的转染方法是利用磷酸钙进行转染，然而这种方法的效率很低，且对很多种细胞无效，不能满足很多科研工作的要求。因此为了提高基因转染效率，开发了两大类的载体：病毒类载体和非病毒类载体。利用病毒转染方法可以获得高效基因转染效果，但病毒类载体存在细胞株适用性，携带基因能力有限，容易引起细胞免疫反应，存在安全隐患等问题。因此对非病毒类高分子材料—阳离子脂质体、阳离子聚合物以及其经过修饰所得到的载体进行了广泛的研究。
聚酰胺-胺树形高分子(polyamidoamine，PAMAM)是Tomalia D.A.于1985年首次报道的具有几何分支的椭圆形结构的树形大分子。其高效低毒安全的特点已经在基因转染中被广泛研究和应用，得到了人们的广泛关注。1993年，Meijer等用外向发散法合成聚丙烯亚胺(Polypropyleneimine，PPI)树形高分子，首次实现了大规模合成和商业化，为树形高分子的广泛研究和应用奠定了基础。树形高分子的特殊结构使其易于结合基因质粒片段，并且其内部三级胺结构可以起到“质子海绵”的作用，促进其在细胞内涵体的逃逸行为，有效地确保目的基因在细胞内的稳定性。近年来，将聚酰胺-胺、聚丙烯亚胺、聚赖氨酸树形高分子以及聚乙烯亚胺阳离子高分子表面氨基进行化学修饰成为主要修饰形式之一。例如在表面氨基上共价连接疏水基团、氨基酸，可以获得相对较好的基因转染效果。其中，在阳离子高分子表面氨基修饰疏水基团，例如修饰脂肪链可以有效地提高材料的抗血清能力，增强材料的膜融合能力、细胞摄入能力和细胞内的核酸释放能力。此外修饰了脂肪链的阳离子高分子还可以通过窖蛋白介导的内吞途径进入细胞。因此疏水修饰广泛应用于提高高分子材料的基因转染效果。阳离子高分子表面修饰氨基酸，例如精氨酸或赖氨酸，也能够有效地提高阳离子高分子的基因转染效果。精氨酸富含胍基基团，胍基基团能够和细胞膜相互作用，富含精氨酸的肽链可以直接作为基因转染载体。胍基基团能够通过静电力和氢键两种力的相互作用有效的结合磷酸根，从而提高树形高分子结合细胞膜的能力。但是通过在树形高分子表面氨基和胍基之间引入不同长度的连接键证明：连接键在胍基和细胞膜相互作用中具有重要作用，不同的连接键会导致树形高分子在细胞中的摄入能力不同。研究结果充分说明了胍基基团只有和恰当的连接键相连才能充分发挥其作用。以第五代聚酰胺胺树形高分子表面修饰精氨酸为例， 精氨酸能够有效的提高树形高分子的转染效率。但是精氨酸修饰对树形高分子的转染能力提高有限，无法和广泛使用的商业化试剂Lipofectamine2000(Lipo 2K)相比。研究结果表明精氨酸修饰中连接胍基和树形高分子表面氨基的连接键并不是最佳的连接方式。
苯基作为一种疏水基团连接在树形高分子表面的氨基上，能够增加树形高分子的疏水性，有利于树形高分子穿过细胞膜的疏水脂双层。但是由于树形高分子和细胞膜之间主要通过静电力相互作用，树形高分子表面氨基修饰苯甲酸后虽然增加了材料的疏水性，却也同时削弱了树形高分子表面的正电荷，因此树形高分子表面氨基修饰苯甲酸，不能有效的提高树形高分子的转染效率。因此在苯基上连接功能基团成为一种非常重要的提高树形高分子转染能力的方式。
已知的基于脂肪链或精氨酸修饰的高分子材料的较高的细胞毒性、较低的转染效果以及细胞株的选择性，是制约这些材料在生物医学领域广泛应用的主要因素。
发明内容
为了解决现有技术中的缺陷，获得具有更好的转染效果以及生物相容性的载体，本发明提出了一种胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料及其制备方法，即基于胍基取代的芳香化合物表面化学共价修饰的高分子材料及其制备方法。本发明的合成方法高效、安全，合成步骤简洁，获得的高分子材料细胞毒性较小，且能在多种难转染的细胞中具有高转染效率。并且所制备的高分子材料不论是DNA转染还是RNA转染都和商业化转染试Lipo2K相当甚至超越商业化转染试剂，更值得人注意的是在蛋白转染中，所制备的材料的转染效率远超过商业化转染试剂Lipo 2K。
本发明提供了一种胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料，即基于阳离子高分子和胍基取代的芳香化合物的高分子材料，包括阳离子高分子骨架和胍基取代的芳香化合物功能基团，所述胍基取代的芳香化合物功能基团共价连接在所述阳离子高分子骨架表面。
其中，所述胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料的结构如式(1)所示：
式(1)中：
R为阳离子高分子骨架；
Y为连接键；
x为1-1024的整数。
其中，所述R为如(8)所示的聚酰胺-胺树形高分子、如式(9)所示的聚丙烯亚胺树形 高分子、如式(10)所示的聚赖氨酸树形高分子、如式(11)所示的支化聚乙烯亚胺或如式(12)所示的线性聚乙烯亚胺；
其中，式(8)、式(9)、式(10)中：
M是阳离子高分子的核心，包括氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、葵二胺和1，12-十二烷二胺；
n是1-10的整数；
m是2-4的整数；
式(11)和式(12)中：
y和z是1-5117的整数。
其中，所述Y如式(13)、式(14)、式(15)、式(16)、式(17)或式(18)所示：
式(17)中：
k为1-20的整数。
本发明还提出了一种高分子材料，其结构如式(1)所示；其中，所述R为如式(8)所示的聚酰胺-胺树形高分子；所述Y为如式(13)所示的酰胺键；所述x为1-1024的整数倍；
式(8)：
M是聚酰胺-胺树形高分子的核心，包括氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、癸二胺 和1,12-十二烷二胺；
n是1-10的整数；
m是2-4的整数。
其中，所述高分子表面为伯胺基团或仲胺基团。
本发明还提出了一种胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料的制备方法，将胍基取代的芳香化合物和阳离子高分子溶解于有机溶剂中，加入一定量的催化剂和碱，在室温下搅拌充分反应，除去未反应的胍基取代的芳香化合物以及相关溶剂，即得到所述的胍基取代的芳香化合物修饰的的高分子材料，所述高分子材料结构如式(1)所示。本发明制备方法是通过将胍基取代的芳香化合物共价连接到阳离子高分子表面上，即阳离子高分子的伯胺基团或仲胺基团与胍基取代的芳香化合物通过化学反应相连，从而制备得到如式(1)所示的高分子材料。
其中，所述制备方法中，所述催化剂选自：二环己基碳二亚胺，N-羟基琥珀酰亚胺。
所述碱为三乙胺。
所述有机溶剂选自：二甲基亚砜，N,N-二甲基甲酰胺。
本发明还提出了胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料作为核酸或蛋白分子的输送载体的应用。其中胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料如式(1)所示，其在体外作为核酸或蛋白分子的输送载体。其中，所述核酸包括DNA、siRNA、shRNA、micoRNA或修饰的核酸；所述蛋白为肽、修饰的肽、蛋白或修饰的蛋白。
本发明还提出了一种新的复合物，其包括如式(1)所示的胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料、核酸或蛋白；其中，在该复合物中，由所述高分子材料携带所述核酸或蛋白。
在一个具体的实施例中，在室温下，将胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料和绿色荧光蛋白质粒或荧光素酶质粒或siRNA或蛋白形成复合物，在该复合物中，由所述高分子材料携带核酸或蛋白。
目前已知的基于阳离子高分子所合成的高分子材料解决了在一些细胞株上的转染问题，但是效果不尽如人意。与现有技术及市场上高代数同类产品比较，本发明所制备的胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料，如胍基取代的芳香化合物修饰的聚酰胺-胺、聚丙烯亚胺、聚赖氨酸树形高分子或聚乙烯亚胺阳离子高分子，能够高效且安全地将核酸或蛋白分子输送到多种难转染的细胞株中。胍基取代的芳香化合物修饰的阳离子高分子系统为阳离子系统用于与负电荷的核酸或蛋白形成络合物。此外，该功能基团使得该系统有助于其通过细胞膜运输。在多种难转染的细胞上有优异的表现。本发明所述高分子材料用于基因转染的优势在于合成周期短，制备方法简便，转染效率高，细胞毒性低。本发明的高分子材料可以作为一种 兼具高效、低毒、价格低廉、合成简易等优点的高分子材料。
附图说明
图1为实施例1中制备的高分子材料G5-GAHx的合成路线及结构图。
图2为实施例1中制备的高分子材料G5-GAHx的一维核磁共振图谱。
图3为实施例1中制备的高分子材料G5-GAH60的对照物G5-Arg64的结构图。
图4为实施例1中制备的高分子材料G5-GAH60的对照物G5-BA60的结构图。
图5为实施例1中制备的高分子材料G5-GAH60的对照物G5-AH60的结构图。
图6为实施例1中所得的高分子材料G5-GAHx，和商业化转染试剂Lipo 2K在HeLa细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果图。
图7为实施例1中所得的高分子材料G5-GAH60，和对照物G5-Arg64，G5-BA60，G5-AH60，以及商业化转染试剂Lipo 2K在HeLa细胞中转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果对比图。
图8为实施例1中所得的高分子材料G5-GAHx和商业化转染试剂Lipo 2K在稳定表达荧光素酶的HeLa细胞中转染荧光素酶siRNA的转染效果图。
图9为实施例1中所得的高分子材料G5-GAH60和对照物G5-Arg60，G5-BA60，G5-AH60，以及商业化转染试剂Lipo 2K在稳定表达荧光素酶的HeLa细胞中转染荧光素酶siRNA的转染效果对比图。
图10为实施例1中所得的高分子材料G5-GAH60和商业化转染试剂Lipo 2K在Hela细胞中转染Bcl-2 siRNA的转染效率对比图。
图11为实施例1中所得的高分子材料G5-GAH60和对照物G5-Arg64，G5-BA60，G5-AH60以及商业化转染试剂Lipo 2K在HeLa细胞上的运输蛋白的效率。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1：
本发明胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料(G5-GAHx)的制备及表征
如图1所示的基于树形高分子和胍基取代的芳香化合物的高分子材料G5-GAHx，其结构式如以下式(1A)所示：
其中，R＝G5，为第5代聚酰胺-胺树形高分子，中心核为乙二胺，末端基团为伯胺基团；
x表示对胍基苯甲酸共价连接到第5代聚酰胺-胺树形高分子表面的数量；
其中，G5的结构如式(8A)所示：
式(8A)中，
M是第5代聚酰胺-胺树形高分子G5的中心核：乙二胺。
式(1A)所示高分子材料G5-GAHx的制备合成方法：取一定量的对胍基苯甲酸盐酸盐溶于2毫升N，N-二甲基甲酰胺，加入二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，在室温下搅拌6小时进行反应后，加入三乙胺和30毫克溶于2毫升二甲亚砜溶剂的第5代聚酰胺-胺树形高分子，室温下搅拌反应148小时，然后透析冷冻干燥，即可得到外观为白色絮状的高分子材料G5-GAHx；其中所述第5代聚酰胺-胺树形高分子：二环己基碳二亚胺：N-羟基琥珀酰亚胺：三乙胺的摩尔比为1：1.3：1.2：1.5。
对按上述步骤制备得到的高分子材料G5-GAHx进行核磁共振分析，如图2所示为高分子材料的一维核磁共振图谱，对胍基苯甲酸共价连接到第5代聚酰胺-胺树形高分子表面，数量分别为31，40，60，76个。G5-GAH60的对照物分别为图3所示的高分子材料G5-Arg64，图4所示的高分子材料G5-BA60和图5所示的高分子材料G5-AH60以及商业化转染试剂Lipo2K。
实施例2：高分子材料G5-GAHx在HeLa细胞上的基因转染实验
将实施例1中制得的高分子材料G5-GAH-x和绿色荧光蛋白质粒在室温下形成复合物，然后在HeLa细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白表达量来评估材料的基因转染效率。具体实验方法：将HeLa细胞培养在24孔板中孵育24小时，将0.8微克绿色荧光蛋白质粒或荧光素酶质粒与G5-GAH-x以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，18小时后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达水平。
实验结果：
如图6所示的高分子材料G5-GAH-31、G5-GAH-40、G5-GAH-60和G5-GAH-76在HeLa细胞上转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果，经过实验筛选，G5-GAH-31、G5-GAH-40、G5-GAH-60和G5-GAH-76分别在10,10,8和6微克时转染效果最佳，表明G5-GAH-31、 G5-GAH-40、G5-GAH-60和G5-GAH-76作为基因输送载体可以有效地将绿色荧光蛋白质粒输送到细胞进行表达。
实施例3：高分子材料G5-GAH60和对照物G5-Arg64，G5-BA60，G5-AH60以及Lipo2K在HeLa细胞上的基因转染实验
将实施例1中制得的高分子材料G5-GAH60，G5-Arg64，G5-BA60，G5-AH60以及Lipo2K和绿色荧光蛋白质粒在室温下形成复合物，然后在HeLa细胞上进行转染，通过检测绿色荧光蛋白表达量来评估材料的基因转染效率。具体实验方法：将HeLa细胞培养在24孔板中孵育24小时，将0.8微克绿色荧光蛋白质粒或荧光素酶质粒与G5-GAH60，G5-Arg64，G5-BA60，G5-AH60以不同氮磷比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，18小时后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达水平。
实验结果：
如图7所示的高分子材料G5-GAH60，G5-Arg64，G5-BA60，G5-AH60以及Lipo2K在HeLa细胞上转染绿色荧光蛋白质粒的转染效果，经过实验筛选，当以对胍基苯甲酸为功能基团时，能显著提高高分子材料的基因转染效果，而不以苯甲酸为连接键的G5-Arg64，没有胍基只连接苯甲酸的G5-BA60，和没有连接键的只有胍基的G5-AH60的基因转染效果均显著低于G5-GAH60，并且G5-GAH60的基因转染效果和商业化转染试剂Lipo2K的基因转染效果相当。
实施例4：高分子材料G5-GAH-x在稳转荧光素酶的HeLa细胞上的敲除荧光素酶的效率
研究实施例1中的高分子材料G5-GAH-x在稳转荧光素酶的HeLa细胞上进行转染，通过检测荧光素酶的表达量来评估材料的基因转染效率。具体实验方法：将HeLa细胞培养在24孔板中孵育24小时，将0.05微克siRNA-FAM与G5-GAH-x以不同质量比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，18小时后检测荧光素酶表达量。荧光素酶表达量的检测方法参照出厂商(Promega公司)提供的使用说明。Lipofectamine 2000(Lipo 2000)作为阳性对照。
实验结果：如图8所示的高分子材料G5-GAH-x在稳转荧光素酶的HeLa细胞上转染荧光素酶siRNA的转染效果图，表明G5-GAH31、G5-GAH40、G5-GAH60和G5-GAH76的用量分别为2，4，6，8，10微克时可以有效地将siRNA输送到细胞进行表达，并且在siRNA用量很少的情况下(0.05微克)就可以有效地将目的基因沉默，材料的基因沉默效果超过商业化的转染试剂Lipo 2K。
实施例5：高分子材料G5-GAH60和对照物G5-Arg64，G5-BA60，G5-AH60以及Lipo2K在稳转荧光素酶的HeLa细胞上的敲除荧光素酶的效率
研究实施例1中的高分子材料G5-GAH60和对照物G5-Arg64，G5-BA60，G5-AH60以及Lipo2K在稳转荧光素酶的HeLa细胞上进行转染，通过检测荧光素酶的表达量来评估材料的基因转染效率。具体实验方法：将HeLa细胞培养在24孔板中孵育24小时，将0.05微克siRNA-FAM与G5-GAH60，G5-Arg64，G5-BA60，G5-AH60以不同质量比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，18小时后检测荧光素酶表达量。荧光素酶表达量的检测方法参照出厂商(Promega公司)提供的使用说明。以商业化的转染试剂Lipo 2K作为对照物。
实验结果：如图9所示的高分子材料G5-GAH60，G5-Arg64，G5-BA60，G5-AH60以及Lipo2K在稳转荧光素酶的HeLa细胞上转染荧光素酶siRNA的转染效果图，经过实验筛选，当以对胍基苯甲酸为功能基团时，并且在siRNA用量很少的情况下(0.05微克)就可以有效地将目的基因沉默。而不以苯甲酸为连接键的G5-Arg64，没有胍基只连接苯甲酸的G5-BA60，和没有连接键的只有胍基的G5-AH60在相同条件下均没有基因沉默效果，并且G5-GAH60的基因沉默效果超过商业化的转染试剂Lipo 2K。
实施例6：高分子材料G5-GAH-60在HeLa细胞上的敲除凋亡蛋白Bcl-2的效率
研究实施例1中的高分子材料G5-GAH-60在HeLa细胞上进行转染，通过检测Bcl-2的mRNA表达水平来评估材料的基因转染效率。具体实验方法：将HeLa细胞培养在24孔板中孵育24小时，将0.5微克siBcl-2或阴性对照siNC与G5-GAH-60以不同质量比混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升，42小时后用RT-PCR检测Bcl-2 mRNA的表达水平。以Lipo 2K作为阳性对照。
高分子材料G5-GAH-60与其它转染载体对HeLa细胞的基因敲除实验，实验结果如图5所示。图10表明在细胞转染条件下，G5-GAH-60的基因敲除效率远高于市场化的转染试剂Lipo 2K(Lipo2000)以及第五代聚酰胺-胺树形高分子。并且高分子材料G5-GAH-60与阴性对照siNC的复合物没有非特异的基因敲除，说明本发明高分子材料具有低毒性和较高的靶向性的特点。
实施例7：高分子材料G5-GAH60，G5-Arg64，G5-BA60，和G5-AH60在HeLa细胞上的运输蛋白的效率。
研究实施例1中的高分子材料G5-GAH76运输蛋白的效率，具体实验方法是：将HeLa细胞培养在48孔板中孵育24小时，将2微克连接了绿色荧光分子标记的牛血清白蛋白(FITC-BSA)和不同的质量的G5-GAH60，G5-Arg64，G5-BA60，G5-AH60混合后加入到培养基中，混匀；与细胞一起孵育6小时后用流式细胞仪检测细胞对蛋白的摄入情况。
高分子材料G5-GAH60运输蛋白的实验，实验结果如图11所示。图11表明在细胞转染 条件下，G5-GAH60具有很高的蛋白质转染效果，G5-GAH60的蛋白质转染效率显著高于不以苯甲酸为连接键的G5-Arg64，没有胍基只连接苯甲酸的G5-BA60，和没有连接键的只有胍基的G5-AH60，而商业化转染试剂Lipo 2K不具备转染蛋白的能力。说明本发明高分子材料能够有效地将蛋白运输到细胞内。
以上实施例只是为了说明本发明技术构思及特点，让本领域普通技术人员能够了解本发明内容并据以实施，并不能以此限制本发明保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作的等效变化和修饰，都应涵盖在本发明保护范围内。

Claims (7)

1.一种胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料，其特征在于，包括阳离子高分子骨架和胍基取代的芳香化合物功能基团，所述胍基取代的芳香化合物功能基团与所述阳离子高分子骨架表面共价连接；所述高分子材料的结构如式(1)所示：
式(1)中，
R为阳离子高分子骨架；
Y为连接键；
x为1-1024的整数；
所述R为如式(8)所示的聚酰胺-胺树形高分子；如式(10)所示的聚赖氨酸树形高分子、如式(11)所示的支化聚乙烯亚胺：
式(8)、式(10)中：
M是聚酰胺-胺树形高分子的核心，包括氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、癸二胺和1,12-十二烷二胺；
n是1-10的整数；
m是2-4的整数；
式(11)中：
y是1-5117的整数；
所述Y为如式(13)、式(14)、式(15)、式(16)所示；
2.一种如权利要求1所述的胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将胍基取代的芳香化合物和阳离子高分子溶解于有机溶剂中，加入催化剂和碱进行反应，将胍基取代的芳香化合物共价连接到阳离子高分子表面，得到如式(1)所示的胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述催化剂选自：二环己基碳二亚胺，N-羟基琥珀酰亚胺；所述碱为三乙胺；所述有机溶剂选自：二甲基亚砜，N,N-二甲基甲酰胺。
4.如权利要求1所述的胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料作为核酸或蛋白分子的输送载体的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述核酸是DNA、siRNA、shRNA、microRNA或修饰的核酸。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述蛋白是肽、修饰的肽或修饰的蛋白。
7.一种复合物，其特征在于，包括含有如权利要求1所述的胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料和核酸或蛋白，由所述高分子材料携带所述核酸或蛋白。
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