CN110452374B - 具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽及其制备方法与应用 - Google Patents

具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种具有高效基因递送能力的三维星型α螺旋聚多肽及其制备方法与应用，以树枝状分子为引发剂，二氯甲烷为反应溶剂，引发不同类型的N‑羧酸酐单体的高速开环聚合，并通过点击化学反应在末端引入不同电性的基团。树枝状分子表面丰富的氨基提供了足够的聚合位点，使聚多肽形成了三维球形拓扑结构，同时拓扑结构为开环聚合反应初期的加速作用提供了契机。聚多肽侧链修饰的胍基/氨基等带来了较高的正电荷密度，可以通过正负电荷间的静电作用获得高效的基因负载能力，且增强了二级结构上的α螺旋刚性结构进而使聚多肽拥有更强的穿膜能力；该类聚多肽的这些性能使其在生物医用材料尤其是基因递送领域中具有巨大的开发前景。

Description

具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽及其 制备方法与应用
技术领域
本发明涉及基因负载和递送领域，具体涉及具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽及其制备方法与应用，可应用于乳腺癌的光热-基因联合治疗。
背景技术
基因递送载体是用于负载核酸分子，将其导入目标靶细胞并成功表达的必要的介质，主要分为病毒载体和非病毒载体两类。病毒载体由于转导效率和表达效率高的优势得到了广泛的利用，但其本身的抗原性，潜在的致瘤风险以及基因装载量不足的缺点严重制约了其发展。基于此，非病毒载体渐渐得到重视。常用的非病毒载体有脂质体、纳米颗粒、阳离子聚合物和多糖等。
α螺旋聚多肽，特别是阳离子型聚多肽作为一类新型、高效的基因递送载体，虽然归属于此类，但与传统的聚合物的内吞机制不同，这类聚多肽主要通过α 螺旋的刚性二级结构在生物膜上“打孔”的模式穿透细胞膜。但高剂量使用或与细胞长时程接触时，聚多肽会在生物膜上打出过多的孔道，造成显著的细胞毒性。
发明内容
本发明提供了一种三维拓扑结构的星型聚多肽，选用树枝状分子为引发剂，分别以二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺为反应溶剂，引发N-羧酸酐单体的开环聚合，并通过小分子修饰得到。树枝状分子表面丰富的氨基提供了足够的聚合位点，使聚多肽形成了三维球形拓扑结构，并且由于二氯甲烷的低介电常数的性质，开环聚合初期形成的拓扑结构促进了后期聚合的加速，大大缩短了聚合所需的时间，本发明阳离子聚多肽利用自身的正电荷通过正负电荷间的静电作用吸附并压缩核酸分子，同时主要利用聚合物同时主要利用聚合物的刚性的α螺旋结构在细胞膜表面打孔并进行穿膜，其中侧基为胍基的聚多肽的穿膜能力比 Arg9、HIV-Tat 等经典细胞穿膜肽提高了 1~2个数量级。如果将胍基等正电荷基团和芳香基团共同引入聚多肽侧链，可以通过疏水作用又能够提高聚多肽与siRNA的复合能力，从而提高聚多肽的基因沉默效率。若共同引入负电荷基团则能提高聚多肽的体内循环能力。另外α螺旋阳离子聚多肽也可以在溶酶体/内含体膜上“打孔”，因此可以高效地低能耗地递送核酸分子进胞并逃避内含体/溶酶体，实现高效的基因转染。
本发明采用如下技术方案：
一种具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽，具有式（I）所示的结构；
Figure 775535DEST_PATH_IMAGE001
式中，R1为树枝状分子聚丙烯酰胺单元，R2为N-羧酸酐单体单元，R3为电性小分子单元。
上述具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽的制备方法包括如下步骤，将树枝状分子聚丙烯酰胺引发N-羧酸酐化合物聚合得到中间体；然后将中间体与电性小分子反应，得到具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽。
上述三维球形α螺旋阳离子聚多肽的制备方法具体包括如下步骤：
（1）具有式（II），式（III），式（Ⅳ）或式（Ⅴ）结构的树枝状分子聚丙烯酰胺与N-羧酸酐化合物在有机溶剂中反应得到中间体；所述N-羧酸酐化合物为γ-(4-炔丙氧基苄基)-L-谷氨酸-N-羧酸酐、γ-炔丙基-L-谷氨酸盐-N-羧酸酐或者N,N-苄氧羰基-L-赖氨酸酸酐；
（2）将所述中间体与电性小分子通过点击化学反应得到式（I）具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽。
本发明公开了一种中间体，其制备方法具体包括如下步骤：
（1）具有式（II），式（III），式（Ⅳ）或式（Ⅴ）结构的树枝状分子聚丙烯酰胺与N-羧酸酐化合物在有机溶剂中反应得到中间体；所述N-羧酸酐化合物为γ-(4-炔丙氧基苄基)-L-谷氨酸-N-羧酸酐、γ-炔丙基-L-谷氨酸盐-N-羧酸酐或者N,N-苄氧羰基-L-赖氨酸酸酐。
本发明中，步骤（1）中，所述有机溶剂为二氯甲烷时，反应为室温下反应0.5～1 h；有机溶剂为N, N-二甲基甲酰胺时，反应为室温下反应72 h；步骤（2）中，点击化学反应以五甲基二乙烯三胺、溴化亚铜为催化体系，反应为室温反应24 h。
本发明公开了一种纳米药物，包括上述具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽与核酸分子；所述核酸药物包括DNA、RNA、低聚核苷酸或者多核苷酸。进一步的，所述纳米药物还包括其他药物，比如吲哚菁绿。
本发明还公开了一种纳米药物的制备方法，包括以下步骤，将上述具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽溶解于DEPC水中，然后与核酸溶液混合，再置于37℃水浴孵育30 min后得到纳米药物。核酸药物选自DNA、RNA、低聚核苷酸或者多核苷酸，具体的，所述DNA为质粒DNA，可以表达蛋白质或转录成小分子干扰RNA。
其中，具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽与核酸的质量比为（1~30）：1，优选的质量比为（8~20）：1，更优选的质量比为（10~15）：1。所述纳米药物的粒径为100~1000 nm，优选的粒径为100~500 nm，更优选的粒径为100~150 nm。所述纳米药物的Zeta电势为-20～70 mV。
本发明公开了上述中间体在制备具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽或在制备基因药物载体中的应用。
上述具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽在制备基因药物载体中的应用；或者上述具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽在制备基因药物中的应用；或者上述纳米药物在制备基因药物中的应用。优选的，基因药物为治疗乳腺癌的药物。
本发明涉及的基团、化合物或者聚合物的化学结构式如下：
所述γ-(4-炔丙氧基苄基)-L-谷氨酸-N-羧酸酐单体、γ-炔丙基-L-谷氨酸盐-N-羧酸酐单体、N,N-苄氧羰基-L-赖氨酸酸酐单体的化学结构式分别为：
Figure 820852DEST_PATH_IMAGE002
Figure 481640DEST_PATH_IMAGE003
Figure 436958DEST_PATH_IMAGE004
步骤（2）中，电性小分子的化学结构式如下之一：
Figure 524999DEST_PATH_IMAGE005
、
Figure 57612DEST_PATH_IMAGE006
、
Figure 522091DEST_PATH_IMAGE007
、
Figure 581183DEST_PATH_IMAGE008
、
Figure 840126DEST_PATH_IMAGE009
、
Figure 860035DEST_PATH_IMAGE010
Figure 862626DEST_PATH_IMAGE011
、
Figure 526956DEST_PATH_IMAGE012
、
Figure 222380DEST_PATH_IMAGE013
、
Figure 729585DEST_PATH_IMAGE014
。
中间体的化学结构式为:
Figure 270288DEST_PATH_IMAGE015
树枝状分子聚丙烯酰胺的化学结构式如下：
Figure 805436DEST_PATH_IMAGE016
其中，a为2～8，优选2, 3, 4, 5；具体为：
Figure 406182DEST_PATH_IMAGE017
Figure 400683DEST_PATH_IMAGE018
Figure 745076DEST_PATH_IMAGE019
Figure 243054DEST_PATH_IMAGE021
N-羧酸酐单体单元来自不同N-羧酸酐单体的开环聚合，其结构式具体为以下一种：
Figure 155646DEST_PATH_IMAGE022
电性小分子单元选自以下基团的一种：
Figure 371864DEST_PATH_IMAGE023
、
Figure 519948DEST_PATH_IMAGE024
、
Figure 138012DEST_PATH_IMAGE025
、
Figure 470773DEST_PATH_IMAGE026
、
Figure 174287DEST_PATH_IMAGE027
Figure 860483DEST_PATH_IMAGE028
、
Figure 598632DEST_PATH_IMAGE029
、
Figure 853027DEST_PATH_IMAGE030
、
Figure 43837DEST_PATH_IMAGE031
、
Figure 533724DEST_PATH_IMAGE032
本发明中，n代表聚多肽主链的重复单元数，即聚合度，n为20～200，比如n=20,50, 100, 200；m为1～6，比如m=1, 4, 6。
本发明设计的聚多肽可以通过点击化学反应在末端引入不同电性基团，其中三维球形α螺旋阳离子聚多肽，树枝状分子表面丰富的氨基提供了足够的聚合位点，使聚多肽形成了三维球形拓扑结构，同时拓扑结构为开环聚合反应初期的加速作用提供了契机。聚多肽侧链修饰的胍基带来了较高的正电荷密度，可以通过正负电荷间的静电作用获得高效的基因负载能力，且增强了二级结构上的α螺旋刚性结构进而拥有更强的穿膜能力。
一种详细的具有式（Ⅰ）结构的三维球形α螺旋阳离子聚多肽的制备方法，如下：
①以L-谷氨酸和水合醋酸铜为原料，制备L-谷氨酸铜（Ⅱ）络合物；
以对羟基苯甲醇、溴丙炔、氯化亚砜、L-谷氨酸铜（Ⅱ）络合物和双(三氯甲基)碳酸酯为原料，制备γ-(4-炔丙氧基苄基)-L-谷氨酸-N-羧酸酐单体；
②以1,6-二溴己烷、叠氮化钠、三苯基磷和1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐为原料，制备叠氮胍基小分子；
③以第三代树枝状分子聚丙烯酰胺、γ-(4-炔丙氧基苄基)-L-谷氨酸-N-羧酸酐单体和叠氮胍基小分子为原料，制备三维球形α螺旋阳离子聚多肽。
上述制备具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽的方法具体可举例如下：
①将水合醋酸铜水溶液滴加入L-谷氨酸水溶液中，静置后依次用水、乙醇和石油醚搅拌洗涤沉淀，然后抽滤得到蓝色固体，即L-谷氨酸铜（Ⅱ）络合物；
将溴丙炔与18-冠醚-6加入含有碳酸钾和对羟基苯甲醇的溶液中，回流反应后除去溶剂，再加入水，然后用二氯甲烷萃取，得到的有机相用氢氧化钠水溶液洗涤后干燥、过滤、旋蒸，得到化合物1；
冰浴条件下，将氯化亚砜加入化合物1的二氯甲烷溶液中，室温下搅拌反应后用水洗涤，得到的有机相干燥、过滤、旋蒸，得到化合物2；
将化合物2加入L-谷氨酸铜（Ⅱ）络合物、L-谷氨酸、DMF、水、1, 1, 3, 3-四甲基胍的混合液中，室温下搅拌反应，然后加入丙酮，再次搅拌后离心得到固体物；固体物依次经过丙酮洗涤、水洗涤、乙二胺四乙酸二钠洗涤后加入异丙醇和水的混合溶液中，然后热过滤得到化合物3；
将（三氯甲基）碳酸酯加入化合物3的无水四氢呋喃溶液中，回流反应后在真空条件下除去溶剂，剩余物进行重结晶，得到γ-（4-炔丙氧基苄基）-L-谷氨酸-N-羧酸酐单体；
②将1, 6-二溴己烷和叠氮化钠溶解于DMF中，在60 ℃下反应24 h；随后加入水，再用乙醚萃取并收集有机相，然后有机相用硫酸钠干燥后，过滤并旋蒸得到白色油状物，即化合物4；
将化合物4溶解于乙醚和乙酸乙酯的混合溶剂中，并加入盐酸溶液，然后在冰浴条件下加入三苯基磷，反应后加入盐酸溶液洗涤，出现分层后收集水相；将水相用二氯甲烷萃取，然后将收集的下层水相用氢氧化钠调节pH≥12，再用二氯甲烷萃取并收集有机相，得到的有机相加入硫酸钠干燥后过滤并旋蒸得到化合物5；
将化合物5、1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐、无水N,N-二甲基甲酰胺、N, N-二异丙基乙胺的混合液在室温条件下搅拌反应后加入乙醚，然后离心收集沉淀，再将沉淀与乙醚涡旋振荡后倒掉乙醚，除去溶剂后得到叠氮胍基小分子，即电性小分子；
③在手套箱中，将γ-(4-炔丙氧基苄基)-L-谷氨酸-N-羧酸酐单体溶解于有机溶剂中，并加入树枝状分子，室温搅拌反应后将反应相滴加入冰甲醇中，然后离心除去甲醇得到聚合物A；优选的，有机溶剂为无水N,N-二甲基甲酰胺或者无水二氯甲烷；进一步优选的，当有机溶剂为无水二氯甲烷时，室温搅拌反应的时间为30 min，当有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺时，室温搅拌反应的时间为72h；
在手套箱中，将聚合物A溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺中，加入胍类小分子、N, N,N', N, 'N''-五甲基二亚乙基三胺和溴化亚铜，在室温下搅拌反应后将反应瓶移出手套箱，加入1M盐酸溶液并搅拌，优选搅拌30分钟；然后反应相用水透析（透析袋分子量为3.5kDa，透析3天）后冻干得到具有式（Ⅰ）结构的三维球形α螺旋阳离子聚多肽。
上述具体反应（涉及的原料以及各步产物）可表示如下：
Figure 860800DEST_PATH_IMAGE033
Figure 983301DEST_PATH_IMAGE034
Figure 661407DEST_PATH_IMAGE035
本发明提供的侧链含胍基的具有三维球形拓扑结构的α螺旋构象的阳离子聚多肽可以与核酸药物自组装形成纳米粒，纳米粒由正电荷的α螺旋构象的阳离子聚多肽和负电荷的核酸药物组成，因此本发明还公开了一种纳米药物，包括α螺旋阳离子聚多肽与核酸药物。本发明多肽不仅可以包载基因形成药物，还可共同包载基因与其他药物形成复合纳米药物，其他药物比如染料，具体为吲哚菁绿等。
本发明的主要优势在于：
（1）以树枝状分子作为引发剂，具有如下优点：树枝状分子作为疏水内腔，可以用于嵌入疏水小分子药物；不同代数树枝状分子末端分别有8，16，32，64个氨基，为形成三维球形拓扑结构的聚多肽提供了丰富的位点。
（2）本发明以介电常数较小的二氯甲烷为溶剂，多肽链形成α螺旋构象时，氢键网络沿着螺旋轴产生极大的偶极矩，加快了开环聚合的传播速率，基于这一创造性技术手段，聚多肽的聚合速率相比以N, N-二甲基甲酰胺为溶剂时，提高了61~432倍。
（3）本发明的阳离子聚多肽，其三维表面拥有更高的正电荷密度，从而在吸附核酸分子时能够更加紧密的进行压缩和保护核酸分子。另外高电荷密度的三维球形拓扑结构以及更强刚性的α螺旋构象，有助于同细胞膜相互作用提高穿膜活性和递送核酸分子到胞内并且更高效的逃逸内含体/溶酶体，使其具有高效的基因转染效率和较低的细胞毒性。
附图说明
图1为实施例一中化合物1以氘代氯仿作为溶剂时的核磁共振氢谱图；
图2为实施例一中化合物2以氘代氯仿作为溶剂时的核磁共振氢谱图；
图3为实施例一中化合物3以重水作为溶剂时的核磁共振氢谱图；
图4为实施例一中γ-(4-炔丙氧基苄基)-L-谷氨酸-N-羧酸酐单体以氘代氯仿作为溶剂时的核磁共振氢谱图；
图5为实施例二中化合物4以氘代氯仿作为溶剂时的核磁共振氢谱图；
图6为实施例二中化合物5以氘代氯仿作为溶剂时的核磁共振氢谱图；
图7为实施例二中叠氮胍基小分子以重水作为溶剂时的核磁共振氢谱图；
图8为实施例三中聚合物A以氘代氯仿作为溶剂时的核磁共振氢谱图；
图9为实施例三中三维球形α螺旋阳离子聚多肽以氘代三氟乙酸：重水=9:1（v:v）作为溶剂时的核磁共振氢谱图；
图10为实施例三中在γ-(4-炔丙氧基苄基)-L-谷氨酸-N-羧酸酐单体起始浓度为50 mM，聚合物A（M/I=50）的核磁监测图；
图11为实施例三中聚合物A的聚合速率图；其中，图11A为实施例三中聚合物A在γ-(4-炔丙氧基苄基)-L-谷氨酸-N-羧酸酐单体起始浓度分别为50 mM时，聚合物A（M/I=20, 50, 100, 200, 400）聚合速率图；图11B为实施例三中聚合物A在 γ-(4-炔丙氧基苄基)-L-谷氨酸-N-羧酸酐单体起始浓度分别为100 mM时，聚合物A（M/I=20, 50, 100, 200,400）聚合速率图，NCA表示γ-(4-炔丙氧基苄基)-L-谷氨酸-N-羧酸酐单体；
图12为聚合物的GPC谱图，其中图12A为对比例一中聚合物的GPC谱图（M/I=20,50, 100, 200）；图12B为对实施例三中聚合物A的GPC谱图（M/I=20, 50, 100, 200），HG表示：对比例一中聚合物；GG表示：实施例三中聚合物A；
图13为阳离子聚多肽的粒径图，其中，图13A为对比例一中阳离子聚多肽的粒径图（M/I=20, 50, 100, 200）；图13B为实施例三中阳离子聚多肽的粒径图（M/I=20, 50, 100,200），L表示对比例一中阳离子聚多肽，D表示实施例三中阳离子聚多肽；
图14为实施例三中阳离子聚多肽和对比例一的电势图（M/I=20, 50, 100, 200）；其中，LPP表示：对比例一中阳离子聚多肽；DPP表示：实施例三中阳离子聚多肽；
图15A为对比例一中阳离子聚多肽的圆二色谱图（M/I=20, 50, 100, 200）；图15B为实施例三中阳离子聚多肽的圆二色谱图（M/I=20, 50, 100, 200）；
图16为实施例三中阳离子聚多肽和对比例一在不同氯化钠浓度下构象稳定性的圆二色谱图（M/I=20, 50, 100, 200）；
图17为实施例三中阳离子聚多肽和对比例一在不同pH下构象稳定性的圆二色谱图（M/I=20, 50, 100, 200）；
图18为实施例四中复合物2在不同质量比下的凝胶电泳图；D-I/siRNA表示：实施例四中复合物2；
图19为复合物2和复合物3的粒径分布图；其中，D-I/P表示：复合物2，D-I/P@HSA表示：复合物3；
图20为复合物2和复合物3在血清中粒径的变化图；
图21为MCF-7 细胞对复合物4的摄取水平图；其中，Poly/siRNA表示复合物4，聚合多肽与核酸分子的质量比，Con表示：对照组；
图22为MCF-7细胞对异硫氰酸荧光素的摄取水平图；
图23为MCF-7细胞上，复合物的内含体/溶酶体逃逸情况图；
图24为MCF-7细胞上，复合物3的细胞毒性图；其中，A:MCF-7细胞上，在光照条件为808 nm, 0.5W/cm2,5 min时，复合物3的细胞毒性图；B: MCF-7细胞上，在光照条件为808nm, 1W/cm2,5 min时，复合物3的细胞毒性图；(+L)表示：光照，(-L)表示：不光照；D-I/S@HSA：实施例三中阳离子聚合物与吲哚菁绿，无义序列RNA siScr以及人血清白蛋白的复合物，
D-I/P@HSA:复合物3；
图25为动物实验效果图，其中图25A为荷MCF-7原位瘤雌性Balb/C小鼠体内基因转染图;图25B为荷MCF-7原位瘤雌性Balb/C小鼠体内热休克蛋白表达图；HSP70，HSP90表示：两种热休克蛋白；GAPDH表示：谷胱甘肽。
具体实施方式
另外制备了以六甲基二硅胺为引发剂，以N,N-二甲基甲酰胺为反应溶剂，引发γ-(4-炔丙氧基苄基)-L-谷氨酸-N-羧酸酐单体的开环聚合，并通过胍基小分子修饰得到二维线性α螺旋阳离子聚多肽，作为本发明中三维球形α螺旋阳离子聚多肽的阳性对照。
实施例一
将L-谷氨酸溶于水 (375 mL) 中，并搅拌加热至70 ℃后，将水合醋酸铜 (18.6g, 103 mmol) 的水溶液 (375 mL) 逐滴的加入到L-谷氨酸溶液中。之后停止搅拌，在室温下静置48 h后，分别用水、乙醇和石油醚搅拌洗涤沉淀24 h，抽滤得到蓝色固体，即L-谷氨酸铜（Ⅱ）络合物，冷冻干燥后保存于干燥器中备用；
将碳酸钾 (15.2 g, 0.11 mol) 和对羟基苯甲醇 (9.3 g, 0.075 mol) 溶于丙酮 (150 mL) 中，并向溶液中加入溴丙炔 (6.75 mL, 0.09 mol) 和18-冠醚-6(0.1 g)。溶液在75 ℃下回流反应12 h后，通过旋转蒸发仪除去丙酮，且加入水 (200 mL) 溶解剩余固体。用二氯甲烷(30 mL×3) 萃取溶液，合并有机相。用15 %氢氧化钠 (200 mL) 和水 (200mL) 洗涤有机相后，加入硫酸钠进行干燥。溶液过滤并旋蒸后得到化合物1，氘代氯仿打核磁，附图1为其核磁谱图。
将化合物1 (8.5 g, 52 mmol) 溶解于二氯甲烷中，在冰浴条件下缓慢滴加氯化亚砜 (6 mL, 68mmol)，随后在室温下搅拌反应3.5 h。反应完毕后，加入水 (100 mL) 淬灭剩余的氯化亚砜，并用水 (50 mL×3) 洗涤有机相。加入硫酸镁干燥有机相后，过滤并旋蒸除去二氯甲烷得到化合物2，氘代氯仿打核磁，附图2为其核磁谱图。
将L-谷氨酸铜（Ⅱ）络合物 (3.29 g, 6.7 mmol) 和L-谷氨酸 (1.99 g, 13.4mmol) 加入DMF (12 mL) 和水 (2 mL) 的混合溶液中，并加入1, 1, 3, 3-四甲基胍 (3.4mL, 27 mmol)，在40℃条件下搅拌2 h直至固体溶解。随后加入DMF (10mL) 和化合物2(6.5 g, 36 mmol)，在室温下搅拌反应48h。接着加入丙酮 (200mL)，在室温下搅拌过夜后，离心得到粗产物(5000 rpm, 5 min, 25 ℃)。粗产物用丙酮洗涤4次(直至上清无黄色)，水洗涤3次(直至上清无蓝色)，乙二胺四乙酸二钠洗涤2次。随后将产物加入到异丙醇和水的混合溶液中(异丙醇：水=2:1)，加热至80 ℃溶解，热过滤拿到最终产物化合物3。重水打核磁，附图3为其核磁谱图。
将化合物3（1.15 g, 4.0 mmol）溶解于无水四氢呋喃（25 mL）中，随后加入（三氯甲基）碳酸酯（0.52g），并在50 ℃下回流反应2 h。随后在真空条件下除去溶剂，粗产物进行重结晶3次（四氢呋喃:正己烷=1:5）得到γ-（4-炔丙氧基苄基）-L-谷氨酸-N-羧酸酐单体，氘代氯仿打核磁，附图4为其核磁谱图。
实施例二
将1, 6-二溴己烷（1.26 mL, 8 mmol）和叠氮化钠（1.6 g, 24 mmol）溶解于DMF（19 mL）中，在60 ℃下反应24 h。随后加入水（150 mL）使不溶物溶解，用乙醚（20 mL×3）萃取并收集有机相。有机相用硫酸钠干燥后，过滤并旋蒸得到白色油状物，即化合物4，氘代氯仿打核磁，附图5为其核磁谱图。
将化合物4（3.33 g, 20 mmol）溶解于乙醚（15 mL）和乙酸乙酯（15 mL）的混合溶剂中，并加入5 % 盐酸溶液（30 mL），在冰浴条件下缓慢加三苯基磷（5.51 g, 22 mmol），保证两相分层并缓慢搅拌反应1 h后，在室温下反应24 h。随后加入1M 盐酸溶液（30mL）洗涤有机相，出现分层后收集水相。水相用二氯甲烷（20mL×3）萃取，继续收集下层水相。接着用氢氧化钠调节水相使pH≥12，再用二氯甲烷（20 mL×4）萃取并收集有机相。加入硫酸钠干燥有机相后，过滤并旋蒸得到化合物5，氘代氯仿打核磁，附图6为其核磁谱图。
将化合物5（1.42 g, 10 mmol）, 1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐（1.47 g, 10 mmol）溶解无水N,N-二甲基甲酰胺（15 mL）中，并加入N, N-二异丙基乙胺（1.74 mL, 10 mmol），在室温条件下搅拌反应24 h。加入乙醚（150 mL）使产物沉淀并用离心管收集，再次加入乙醚涡旋振荡几分钟后倒掉乙醚，重复多次直至溶液澄清，除去溶剂后得到叠氮胍基小分子，重水打核磁，附图7为其核磁谱图。
实施例三
在手套箱中，将γ-(4-炔丙氧基苄基)-L-谷氨酸-N-羧酸酐单体（50 mg, 1.6mmol）溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺（1 mL）中，并加入第三代树枝状分子（0.68 mg, 0.001mmol），室温搅拌反应72 h。随后将反应相逐滴加入冰甲醇（50 mL）中使沉淀，离心后除去甲醇得到聚合物A，氘代氯仿打核磁，附图8为其核磁谱图。
在手套箱中，将γ-(4-炔丙氧基苄基)-L-谷氨酸-N-羧酸酐单体（50 mg, 1.6mmol）溶解于无水二氯甲烷（1 mL）中，并加入第三代树枝状分子（0.68 mg, 0.001 mmol），室温搅拌反应30 min。随后将反应相逐滴加入冰甲醇（50 mL）中使沉淀，离心后除去甲醇得到聚合物A，氘代氯仿打核磁，附图8为其核磁谱图，聚合物A的数均分子量为190 kg/mol，M/I=50，用于以下细胞实验以及动物实验。
在手套箱中，将聚合物A（20 mg, 0.001 mmol）溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺（1mL）中，加入胍类小分子（12 mg, 1.6 mmol），N, N, N', N, 'N''-五甲基二亚乙基三胺（10μL）和溴化亚铜（5.2 mg），在室温下搅拌反应24 h。随后将反应瓶移出手套箱，加入1M盐酸溶液（1 mL）并搅拌30 min。反应相用水透析3天（透析袋分子量为3.5 kDa）后冻干得到三维球形α螺旋阳离子聚多肽，氘代三氟乙酸：重水=9:1（v:v）打核磁，附图9为其核磁谱图。
图10为实施例三中在γ-(4-炔丙氧基苄基)-L-谷氨酸-N-羧酸酐单体起始浓度为50 mM，聚合物A（M/I=50）的核磁监测图，由图中可知，15 min内单体五元环上的氮氢质子峰消失（7.06 ppm），并且出现了新的酰胺质子峰（6.76 ppm）。
图11为实施例三中聚合物A在 γ-(4-炔丙氧基苄基)-L-谷氨酸-N-羧酸酐单体起始浓度分别为50 mM和100 mM时，聚合物A（M/I=20, 50, 100, 200, 400）聚合速率图，根据图中数据分析，在单体初始浓度为50 mM，反应溶剂为二氯甲烷时，聚合度为20,50,100,200,400的聚合物A分别在10，20，30，40，60 min内完成聚合；在单体初始浓度为100 mM，反应溶剂为二氯甲烷时，聚合度为20,50,100,200,400的聚合物A分别在15，20，30，50，70 min内完成聚合；相较于以N, N-二甲基甲酰胺为反应溶剂时的 72 h，其聚合速率提高了61~432倍。
图12为实施例三中聚合物A和对比例一的GPC谱图（M/I=20, 50, 100, 200），利用图进行数据分析，实施例三分别拥有拥有约50 kg/mol，190 kg/mol，460 kg/mol，640 kg/mol分子量；而对比例一分别拥有8 kg/mol，24 kg/mol，34 kg/mol，65 kg/mol分子量。
图13为实施例三中三维球形α螺旋阳离子聚多肽和对比例一的粒径图（M/I=20,50, 100, 200），由图13可以发现实施例三中阳离子聚多肽虽然拥有更大的分子量，但是其粒径仍能维持在50~150 nm。
图14为实施例三中三维球形α螺旋阳离子聚多肽和对比例一的电势图（M/I=20,50, 100, 200）；根据数据分析，本发明的聚多肽有更高的正电荷，约为40~70 mV。
图15为实施例三中三维球形α螺旋阳离子聚多肽和对比例一的圆二色谱图（M/I=20, 50, 100, 200），由图15发现，本发明的聚多肽有更高的螺旋度，约为36%~82 %。
图16为实施例三中三维球形α螺旋阳离子聚多肽和对比例一在不同氯化钠浓度下构象稳定性的圆二色谱图（M/I=20, 50, 100, 200），根据数据分析，本发明的聚多肽的α螺旋构象在不同氯化钠浓度下较稳定。
图17为实施例三中三维球形α螺旋阳离子聚多肽和对比例一在不同pH下构象稳定性的圆二色谱图（M/I=20, 50, 100, 200），根据数据分析，本发明的聚多肽的α螺旋构象在不同pH下较稳定。
对比例一
在手套箱里，实施例一的γ-(4-炔丙氧基苄基)-L-谷氨酸-N-羧酸酐单体溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，随后加入六甲基二硅氮烷（引发剂）和1,5,7-三氮杂二环[4.4.0]癸-5-烯，并在室温搅拌72 h后用冰甲醇沉淀得到中间产物；如果采用无水二氯甲烷替换无水N,N-二甲基甲酰胺，反应72h能得到相应的中间产物聚合度，但是并不存在上述的聚合加速作用，即反应1h得到的中间产物聚合度太低（小于5），无法继续使用。
M/I=20, 50, 100, 200下，对比例一的中间产物分别拥有8 kg/mol，24 kg/mol，34 kg/mol，65 kg/mol分子量。
在手套箱中，将中间产物 (20 mg, 0.072 mmol炔基) 溶解于DMF中，加入实施例二的叠氮胍基小分子(0.144 mmol)和五甲基二乙烯三胺 (15 μL, 0.072 mmol)，随后加入溴化亚铜 (2 mg, 0.0144 mmol) ，手套箱室温搅拌反应48小时；反应结束，从手套箱取出，开盖搅拌20 min后，加入1mL 1M 盐酸，用水透析3天(分子量为3500 Da)，冷冻干燥，得到阳离子聚多肽，此阳离子聚多肽，作为阳性对照，其化学结构式如下:
Figure 954985DEST_PATH_IMAGE036
实施例四
以实施例三阳离子聚多肽为基因载体用于乳腺癌细胞的光热-基因联合治疗的制备以及表征、性能。
配制实施例三阳离子聚多肽浓度为1 mg/mL的超纯水溶液和吲哚菁绿浓度为10mg/mL的甲醇溶液，取30 μL吲哚菁绿与1 mL阳离子聚多肽混合，室温下搅拌 24 h，然后超滤除去甲醇与游离的吲哚菁绿，得到复合物1。
配制复合物1和siPKM2（购自吉玛基因（上海，中国））浓度分别为1 mg/mL和0.1mg/mL 的DEPC水溶液。按照复合物1/ siPKM2不同质量比（8/1，10/1，12/1，15/1 和 20/1）混合，涡旋10秒并室温孵育 30 min，通过静电吸附作用形成复合物1/ siPKM2复合物，称为复合物2。
将人血清白蛋白与复合物2按不同的质量比（1/4，1/2，1/1，2/1 和 4/1）混合，涡旋10秒并室温孵育30 min，形成复合物3。
将FAM-siRNA（购自吉玛基因（上海，中国））与实施例三中聚多肽以及对比例一中聚多肽分别以不同的质量比（1/5，1/10，1/15 和 1/20）混合，涡旋10秒并室温孵育30 min，形成复合物4。
另外FAM-siRNA与 PEI 以 1/5混合，与 LPF 以 1/2 混合，涡旋10秒并室温下孵育 30 min，形成的复合物作为对照。
将复合物2上样到 2%琼脂糖凝胶电泳上样孔内，120 V 下运行 20 min，溴化乙锭染色显示，凝胶成像系统成像，测定siRNA的包裹效率。
利用动态光散射（DLS）测定复合物3的粒径分布。
将复合物2和复合物3在含 10% FBS 的磷酸盐缓冲液中孵育不同时间，监测粒径的变化，以评价复合物2和复合物3在血清中的稳定性。
MCF-7细胞以每孔2×104个接种到96孔板内，然后在含有10％ FBS的DMEM培养基中培养24小时。然后培养基替换成无血清的DMEM，将复合物4按照每孔 0.1 μg FAM-siRNA加入到孔中，孵育 4 h。用含肝素钠的 缓冲液润洗 3 次，加入 RIPA 裂解液（100 µL）裂解，酶标仪测定 FAM-siRNA 的含量（λ ex = 480 nm，λ em = 530 nm），BCA 试剂盒测定细胞内蛋白含量，以研究复合物4的细胞摄取效率。
将MCF-7细胞以每孔2×104个接种到 96 孔板，然后在含有10％ FBS的DMEM培养基中培养24小时。换成无血清DMEM培养基，加入实施例三中聚多肽（2 µg/孔）和异硫氰酸荧光素（1 µg/孔）的混合溶液，孵育2 h，用含肝素钠的PBS润洗3次，RIPA 裂解液（100 µL）裂解，最后用酶标仪测定 FITC 的荧光强度（λ ex = 480 nm，λ em = 530 nm），BCA试剂盒测定细胞内蛋白含量，来探究实施例三中聚多肽的打孔能力。
利用共聚焦激光扫描显微镜观察复合物4的内涵体逃逸情况。按照2×104细胞/孔的密度将MCF-7细胞接种到玻底培养皿（15 mm），然后在含有10％ FBS的DMEM培养基中培养24小时。换成无血清DMEM培养基，加入复合物4（w/w = 15，1 µg FAM-siRNA/孔），孵育4 h。用含有肝素钠的缓冲液润洗3次，Hoechst（5 µg/mL）和Lysotracker Red（200 nM）各染色30min和1 h，共聚焦激光扫描显微镜下观察。利用ImageJ计算FAM-siRNA和Lysotracker Red的共定位率。
MCF-7细胞以每孔8000个接种到96孔板内，然后在含有10％ FBS的DMEM培养基中培养24小时。随后换成无血清DMEM培养基，加入不同浓度的复合物3，孵育24 h，换液，细胞用808 nm光源辐照5 min（0.5 W/cm2或1 W/cm2），继续孵育24 h。最后用 MTT 法检测细胞存活率。
荷MCF-7原位瘤（200 mm3）雌性Balb/C小鼠（18-20 g），通过尾静脉注射复合物4（siRNA 1.25 mg/kg；ICG 2.25mg/kg）。给药 24 h 后对一半的小鼠肿瘤进行 808 nm的光源辐照（0.8 W/cm2，5 min）。24 h 后处死小鼠，收集肿瘤。用1 mL TRIZOL试剂匀浆30 mg肿瘤提取RNA，用1 mL裂解缓冲液匀浆60 mg肿瘤提取蛋白。利用 real time-PCR、Westernblot 和免疫荧光技术研究体内的基因转染效率。
图18为实施例四中复合物2在不同质量比下的凝胶电泳图，数据分析得出，在质量比大于等于10时，复合物2可以完全包载住siRNA。图19为复合物2和复合物3的粒径分布图，由图19确定HSA与实施例三中阳离子聚多肽的最佳质量比为 1/1。图20为复合物2和复合物3在血清中粒径的变化图，数据分析得到，复合物3的粒径在48 h内能保持稳定，说明人血清白蛋白能够提高复合物的血清稳定性。图21为MCF-7 细胞对复合物4的摄取水平图，复合物4的细胞摄取效率比对比例一相关的复合物提高 2 倍。图22为MCF-7细胞对异硫氰酸荧光素的摄取水平图，代表了实施例三和对比例一中聚多肽的穿膜活性，数据说明实施例三中的聚多肽具有更强的穿膜能力。图23为MCF-7细胞上，复合物的内含体/溶酶体逃逸情况，复合物的共定位率分别为~20%和~32%，说明实施例三的聚多肽可以实现高效的溶酶体逃逸，并且逃逸能力优于对比例一聚多肽。图24为MCF-7细胞上，复合物3的细胞毒性，从图24中可以发现复合物3的 PKM2 介导的肿瘤饥饿增强光热消融，其抗肿瘤效果明显优于单一的光热治疗或饥饿治疗。图25为荷MCF-7原位瘤雌性Balb/C小鼠体内基因沉默效率和热休克蛋白的抑制效率，复合物3的转染效率在有无光照的条件下均能将 PKM2 mRNA 水平下调70%以上，证明了实施例三的聚多肽在基因递送方面的优势；另外复合物3可有效降低 PKM2 蛋白的表达，最终抑制热休克蛋白等下游代谢物的产生。

Claims (8)

1.一种具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽，其特征在于，所述具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽具有式（I）所示的结构；
Figure 634945DEST_PATH_IMAGE001
式（I）中，R1为树枝状分子聚丙烯酰胺单元，R2为N-羧酸酐单体单元，R3为电性小分子单元；n为20～200；
所述具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽的制备方法包括如下步骤：
（1）具有式（II）、式（III）、式（Ⅳ）或式（Ⅴ）结构的树枝状分子聚丙烯酰胺与N-羧酸酐化合物在有机溶剂中反应得到中间体；所述N-羧酸酐化合物为γ-(4-炔丙氧基苄基)-L-谷氨酸-N-羧酸酐或者γ-炔丙基-L-谷氨酸盐-N-羧酸酐；
（2）将所述中间体与电性小分子通过点击化学反应得到具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽；
式（II）结构的树枝状分子聚丙烯酰胺如下：
Figure 286506DEST_PATH_IMAGE002
式（III）结构的树枝状分子聚丙烯酰胺如下：
Figure 597402DEST_PATH_IMAGE003
式（Ⅳ）结构的树枝状分子聚丙烯酰胺如下：
Figure 789349DEST_PATH_IMAGE005
式（Ⅴ）结构的树枝状分子聚丙烯酰胺如下：
Figure 338142DEST_PATH_IMAGE007
所述电性小分子的化学结构式如下：
Figure 957342DEST_PATH_IMAGE008
。
2.根据权利要求1所述具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽，其特征在于，步骤（1）中，所述有机溶剂为二氯甲烷时，反应为室温下反应0.5～1 h；有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺时，反应为室温下反应72 h；步骤（2）中，点击化学反应以五甲基二乙烯三胺、溴化亚铜为催化体系，反应为室温反应24 h。
3.一种具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）具有式（II）、式（III）、式（Ⅳ）或式（Ⅴ）结构的树枝状分子聚丙烯酰胺与N-羧酸酐化合物在有机溶剂中反应得到中间体；所述N-羧酸酐化合物为γ-(4-炔丙氧基苄基)-L-谷氨酸-N-羧酸酐或者γ-炔丙基-L-谷氨酸盐-N-羧酸酐；
（2）将所述中间体与电性小分子通过点击化学反应得到式（I）具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽：
式（II）结构的树枝状分子聚丙烯酰胺如下：
Figure 958796DEST_PATH_IMAGE002
式（III）结构的树枝状分子聚丙烯酰胺如下：
Figure 705166DEST_PATH_IMAGE003
式（Ⅳ）结构的树枝状分子聚丙烯酰胺如下：
Figure 108466DEST_PATH_IMAGE005
式（Ⅴ）结构的树枝状分子聚丙烯酰胺如下：
Figure 898567DEST_PATH_IMAGE007
所述电性小分子的化学结构式如下：
Figure 387317DEST_PATH_IMAGE008
。
4.一种纳米药物，包括权利要求1所述具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽与核酸分子。
5.根据权利要求4所述纳米药物，其特征在于，所述核酸分子包括DNA、RNA、低聚核苷酸或者多核苷酸；所述三维星型α螺旋阳离子聚多肽与核酸分子的质量比为（1～30）∶1；所述纳米药物的粒径为100～1000 nm；所述纳米药物的Zeta电势为-20～70 mV。
6.权利要求1所述具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽在制备核酸药物载体中的应用。
7.权利要求1所述具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽在制备基因药物中的应用。
8.权利要求4所述纳米药物在制备基因药物中的应用。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111803653B (zh) * 2020-06-27 2022-04-15 苏州大学 可脱混合细胞膜包被的基因递送体系及其制备方法与应用
WO2023138211A1 (zh) * 2022-01-21 2023-07-27 苏州万维生命科学技术有限公司 星型β-抗菌糖肽、其制备方法及应用
CN116515102A (zh) * 2022-01-21 2023-08-01 苏州万维生命科学技术有限公司 星型β-抗菌糖肽、其制备方法及应用
CN115010919B (zh) * 2022-06-07 2023-11-24 苏州大学 一种聚多肽、基于该聚多肽的纳米开关及其制备方法和应用

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003055935A1 (en) * 2001-12-21 2003-07-10 Board Of Regents - The University Of Texas System Dendritic poly (amino acid) carriers and methods of use
WO2012068187A1 (en) * 2010-11-19 2012-05-24 Merck Sharp & Dohme Corp. Poly(amide) polymers for the delivery of oligonucleotides
CN105418939A (zh) * 2015-12-15 2016-03-23 华东师范大学 胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料、制备方法和应用
CN106188550A (zh) * 2016-07-08 2016-12-07 清华大学深圳研究生院 树枝状嵌段共聚物PAM‑PGlu‑b‑TPGS及其制备方法与应用
CN106267324A (zh) * 2016-08-09 2017-01-04 西北师范大学 一种温度响应型高分子生物医用胶黏剂及其合成方法
CN106589355A (zh) * 2016-12-12 2017-04-26 广州医科大学 一类基于阳离子螺旋多肽的非病毒基因转染载体材料
WO2018042060A1 (de) * 2016-09-05 2018-03-08 Drei Lilien Pvg Gmbh & Co. Kg Offenporige membran mit innerem raumdurchspannendem polymerem strukturnetzwerk zur elektrophoretischen stoffselektiven separation sowie verfahren zu deren herstellung und anwendung
CN108003343A (zh) * 2017-11-26 2018-05-08 苏州大学 α螺旋阳离子聚多肽及其制备方法和应用
WO2018081845A1 (en) * 2016-11-02 2018-05-11 The University Of Melbourne Antibacterial compositions and methods
CN108329467A (zh) * 2018-02-10 2018-07-27 中国科学院大学 一种新型的超支化抗菌肽聚合物的制备方法
CN108743969A (zh) * 2018-05-24 2018-11-06 合肥工业大学 一种拟细胞穿膜肽功能的肿瘤靶向纳米载体的制备方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100389136C (zh) * 2005-07-01 2008-05-21 中国科学院化学研究所 一种疏水缔合聚丙烯酰胺及其制备方法
CN100465209C (zh) * 2006-08-17 2009-03-04 同济大学 用于形状记忆管腔内支架的可降解高分子材料的制备方法
CN102604013B (zh) * 2012-03-09 2014-08-13 齐鲁工业大学 一种树核星形阳离子聚丙烯酰胺的制备方法
CN102936337B (zh) * 2012-10-30 2014-10-22 中国科学院长春应用化学研究所 聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)-聚氨基酸嵌段共聚物、功能化嵌段共聚物及制备方法
KR102358824B1 (ko) * 2014-01-29 2022-02-07 이섬 리서치 디벨러프먼트 컴파니 오브 더 히브루 유니버시티 오브 예루살렘 엘티디. 다공성 나노결정성 셀룰로오스 구조
JP7246644B2 (ja) * 2016-12-03 2023-03-28 ザ ユーエービー リサーチ ファウンデイション 肺炎球菌表面プロテインａの選択されたアルファヘリカルドメインおよびプロリンリッチドメインを組み合わせた肺炎球菌ワクチン

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003055935A1 (en) * 2001-12-21 2003-07-10 Board Of Regents - The University Of Texas System Dendritic poly (amino acid) carriers and methods of use
WO2012068187A1 (en) * 2010-11-19 2012-05-24 Merck Sharp & Dohme Corp. Poly(amide) polymers for the delivery of oligonucleotides
CN105418939A (zh) * 2015-12-15 2016-03-23 华东师范大学 胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料、制备方法和应用
CN106188550A (zh) * 2016-07-08 2016-12-07 清华大学深圳研究生院 树枝状嵌段共聚物PAM‑PGlu‑b‑TPGS及其制备方法与应用
CN106267324A (zh) * 2016-08-09 2017-01-04 西北师范大学 一种温度响应型高分子生物医用胶黏剂及其合成方法
WO2018042060A1 (de) * 2016-09-05 2018-03-08 Drei Lilien Pvg Gmbh & Co. Kg Offenporige membran mit innerem raumdurchspannendem polymerem strukturnetzwerk zur elektrophoretischen stoffselektiven separation sowie verfahren zu deren herstellung und anwendung
WO2018081845A1 (en) * 2016-11-02 2018-05-11 The University Of Melbourne Antibacterial compositions and methods
CN106589355A (zh) * 2016-12-12 2017-04-26 广州医科大学 一类基于阳离子螺旋多肽的非病毒基因转染载体材料
CN108003343A (zh) * 2017-11-26 2018-05-08 苏州大学 α螺旋阳离子聚多肽及其制备方法和应用
CN108329467A (zh) * 2018-02-10 2018-07-27 中国科学院大学 一种新型的超支化抗菌肽聚合物的制备方法
CN108743969A (zh) * 2018-05-24 2018-11-06 合肥工业大学 一种拟细胞穿膜肽功能的肿瘤靶向纳米载体的制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A biodegradable and serum-resistant gene delivery carrier composed of polyamidoamine-poly N,N’-di-(2-aminoethyl) aminoethyl glutamine copolymer;Shirong Pan et al.;《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》;20121231;第104卷;第294-302页 *
Shirong Pan et al..A biodegradable and serum-resistant gene delivery carrier composed of polyamidoamine-poly N,N’-di-(2-aminoethyl) aminoethyl glutamine copolymer.《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》.2012,第104卷第294-302页. *
Short multi-armed polylysine-graft-polyamidoamine copolymer as efficient gene vectors;Shirong Pan et al.;《International Journal of Pharmaceutics》;20110827;第420卷;第206-215页 *

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