CN108003343B - α螺旋阳离子聚多肽及其制备方法和应用 - Google Patents

α螺旋阳离子聚多肽及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种α螺旋阳离子聚多肽及其制备方法和应用，以光敏剂卟啉为核心、α螺旋聚多肽为四臂，由该聚合物组成的核酸药物可在核酸药物给药系统中应用。本发明得到的聚合物具有良好的生物相容性、低细胞毒性和光可激活性。本发明提供的聚合物，在水溶液中自组装形成纳米颗粒，具有良好的稳定性、生物相容性和低细胞毒性，而且制备方法简单，可重复性高，作为载体能保护DNA等核酸免于降解，又能结合纳米颗粒本身的尺度效应，用于疾病的治疗；此外，通过光可激活性还能够实现对不同癌细胞的促转染作用。

Description

α螺旋阳离子聚多肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于高分子材料技术和药剂学领域，涉及一种含侧链和光敏剂的α螺旋阳离子聚多肽及其的制备方法及应用。
背景技术
细胞穿膜肽（cell penetrating peptide, CPP）是一类可穿透细胞膜的短链多肽，通常由几个或十几个氨基酸组成。但是，用作基因载体时，CPP具有较大的缺陷：CPP主链长度过短，负载核酸分子后CPP的正电荷和二级结构被屏蔽，穿膜能力显著降低，因而无法单独完成基因的高效递送。阳离子聚多肽，如聚赖氨酸（PLL）、聚精氨酸（PLR），分子主链长，因此可以独立地复合并递送核酸分子。但是，阳离子聚多肽侧链带电基团间强烈的静电排斥作用使其无法维持α螺旋的构象，而主要以无规卷曲的形式存在，因此穿膜能力差，基因转染效率也较差。所以需要研发毒副作用小、生物相容性好的α螺旋构象的细胞穿膜阳离子聚多肽制剂用于疾病的治疗，用以解决CPP和阳离子聚多肽的上述缺陷非常重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种含侧链和光敏剂的α螺旋构象的阳离子聚多肽，设计的具有足够链长且具有稳定α螺旋构象的细胞穿膜阳离子聚多肽可以作为核酸药物的载体且具有良好的稳定性、生物穿膜性和光可激活性，并提供上述α螺旋阳离子聚多肽结合核酸的制备方法和在核酸药物给药系统中的应用。
本发明提供一种含侧链和光敏剂的α螺旋构象的阳离子聚多肽，具体技术方案为，一种α螺旋阳离子聚多肽，由含氨基的光敏剂引发五元环N-羧酸酐化合物聚合得到，优选的，所述α螺旋阳离子聚多肽具有式I所示的结构，本发明的阳离子聚多肽具有α螺旋构型，以光敏剂为引发剂。
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE001
其中，R为端基；PS为光敏剂基团；n为20～200；m为3～8；a为1～5。
优选的，所述R为氨基或者胍基；所述PS光敏剂基团为5,10,15,20-四苯-卟啉基，5-苯-10,15,20-三苯基卟啉基、5,10,15,20-四(4-酯基苯基)卟啉基、1,8,15,22-四-氨基金属酞菁基或2,9,16,23-四-氨基金属酞菁基，结构可表示如下：
Figure RE-DEST_PATH_771481DEST_PATH_IMAGE001
Figure RE-DEST_PATH_423042DEST_PATH_IMAGE002
Figure RE-DEST_PATH_937200DEST_PATH_IMAGE003
Figure RE-DEST_PATH_66830DEST_PATH_IMAGE004
Figure RE-DEST_PATH_615623DEST_PATH_IMAGE005
具体的，本发明的α螺旋阳离子聚多肽为以下化学结构式中的一种：
Figure RE-DEST_PATH_172506DEST_PATH_IMAGE006
Figure RE-DEST_PATH_423228DEST_PATH_IMAGE007
Figure RE-DEST_PATH_356549DEST_PATH_IMAGE008
Figure RE-DEST_PATH_759848DEST_PATH_IMAGE010
Figure RE-DEST_PATH_487633DEST_PATH_IMAGE011
本发明提供了一种α螺旋阳离子聚多肽的制备方法，包括以下步骤：
（1）以五元环N-羧酸酐化合物、含氨基的光敏剂为原料，反应制备中间产物；
（2）以中间产物与叠氮端基化合物原料，反应制备得到α螺旋阳离子聚多肽；
所述五元环N-羧酸酐化合物的化学结构式为：
Figure RE-DEST_PATH_976383DEST_PATH_IMAGE012
。
本发明还提供了一种中间产物的制备方法，包括以下步骤：
（1）以五元环N-羧酸酐化合物、含氨基的光敏剂为原料，反应制备中间产物；
所述五元环N-羧酸酐化合物的化学结构式为：
Figure RE-661433DEST_PATH_IMAGE012
。
上述技术方案中，步骤（1）中，以1,5,7-三氮杂二环[4.4.0]癸-5-烯为催化剂，反应为室温反应72 h；步骤（2）中，以五甲基二乙烯三胺、溴化亚铜为催化体系，反应为室温反应48小时。
上述技术方案中，步骤（1）中，以对羟基苯甲醇、溴丙炔为原料制备化合物1，再以化合物1、亚硫酰氯为原料制备化合物2，再以化合物2、L-谷氨酸为原料制备化合物3，最后以化合物3、三光气为原料，制备五元环N-羧酸酐化合物。
上述技术方案中，本发明的含氨基的光敏剂包括本身带有氨基的光敏剂或者本身不带氨基的光敏剂但氨基化后的产物，比如5,10,15,20-四（4-氨基苯）-卟啉、5-（4-氨基苯基）-10,15,20-三苯基卟啉、5,10,15,20-四(4-酯基苯基)卟啉、1,8,15,22-四-氨基金属酞菁或2,9,16,23-四-氨基金属酞菁；所述叠氮端基化合物的化学结构式为：
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE013
。
本发明还公开了一种中间产物，其具有如下化学结构式：
Figure RE-922650DEST_PATH_IMAGE014
本发明制备α螺旋阳离子聚多肽的方法具体可举例如下：
（1）碳酸钾（15.2 g，0.11 mol）和对羟基苯甲醇（9.3 g，0.075 mol）溶于150 mL丙酮，加入溴丙炔（10 mL，0.09 mol）和18-冠醚-6（0.1 mL）。溶液在75℃下油浴回流反应，12h后旋蒸除去丙酮。往粗产物中加入200 mL水，用30 mL二氯甲烷（DCM）萃取3遍，取下层有机相。有机相用15%氢氧化钠（200 mL）和饱和食盐水（200 mL）清洗，并用Na2SO4干燥，过滤，除去溶剂得到化合物1，氘代氯仿打核磁；
（2）将化合物1 (8.5 g, 52 mmol) 溶于二氯甲烷中，在冰浴的条件下滴加亚硫酰氯 (5 mL, 68 mmol)。在室温下搅拌反应3.5h，加入100mL水猝灭亚硫酰氯后，用50mL水萃取有机相三遍，并用MgSO4干燥，过滤，除去溶剂得到化合物2，氘代氯仿打核磁；
（3）将含铜的L-谷氨酸 (3.29 g, 6.7 mmol) 和L-谷氨酸 (1.99 g,13.4 mmol)加入12 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和2 mL水的混合溶液中，并加入1,1,3,3-四甲基胍(3.4 mL, 27 mmol)，在40℃条件下搅拌2 h直至溶解。加入10 mL DMF和化合物2 (6.5 g,36 mmol)，在室温下搅拌反应48h后加入200mL丙酮，搅拌过夜。离心得到粗产物，用丙酮洗4次至溶液不再有黄色后，用水洗3次至溶液不在有蓝色，用乙二胺四乙酸二钠（现配现用）洗2次。将产物进行重结晶 (异丙醇：水= 80:40 mL）加热至80℃溶解，热过滤拿到化合物3，氘代二甲基亚砜/氘代重水，9:1, v/v打核磁；
（4）化合物3 (1.15 g, 4.0 mmol) 溶解于25 mL干燥的四氢呋喃（THF）中，随后加入三光气（0.52 g），在50℃下反应2h，之后在常温下反应过夜，在真空条件下除去溶剂，粗产物进行重结晶3次 (THF:正己烷=1:5，v/v) ，制备化合物4即五元环N-羧酸酐化合物，氘代氯仿打核磁；
（5）将1,6-二溴己烷(1.26mL, 8 mmol)和叠氮化钠(1.6g, 24 mmol) 加入 19 mLDMF中，在60℃反应24h。（反应会有不溶物）加入大约150 mL水使其溶解后，用20 mL乙醚萃取3次，收集有机相，用硫酸钠干燥，过滤，旋蒸得到化合物5，氘代氯仿打核磁；
（6）取化合物5 (3.33 g, 20 mmol)、Et2O (15 mL), EtOAc (15 mL)、5% HCl(30mL, 5 mL浓HCl + 25 mL H2O)，在冰浴条件 (0℃)下缓慢加三苯基磷(5.51 g, 22 mmol)，保证两相分层，保证冰水浴下反应大于1h, 在常温下反应24h；加30 mL 1M HCl (2.5 mL浓盐酸 +27.5 mL水)，出现分层后弃上层有机相，取下层水相；水相用20mL DCM萃取3次，收集下层水相；接着用NaOH调节水相使pH≥12，再用20 mL DCM萃取4次，收集上层有机相，有机相进行干燥，过滤，旋蒸，得到化合物6，氘代氯仿打核磁；
（7）取化合物6 (1.42 g, 10 mmol) ， 1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐(1.47 g, 10mmol)，15mL 无水DMF，DIEA (1.74 mL, 10 mmol)，在室温条件下搅拌反应24 h；加入150mL乙醚使产物沉淀（黄色油状物），用离心管收集黄色油状物，加入乙醚，涡旋振荡几分钟后倒掉乙醚，重复多次直至溶液澄清，油泵除去溶剂得到化合物7作为叠氮端基化合物，氘代氯仿打核磁；
（8）在手套箱里，化合物4溶于N,N-二甲基甲酰胺，随后加入含氨基的光敏剂和1,5,7-三氮杂二环[4.4.0]癸-5-烯，并在室温搅拌72 h后用冰甲醇沉淀得到中间产物；
（9）在手套箱中，将中间产物 (20 mg, 0.072 mmol炔基) 溶解于DMF中，加入化合物7 (0.144 mmol)和五甲基二乙烯三胺 (15 μL, 0.072 mmol)，随后加入溴化亚铜 (2mg, 0.0144 mmol)，反应时间为48小时；反应结束，加入1mL 1M 盐酸后，用水透析3天(分子量为3500 Da)后冻干，得到α螺旋阳离子聚多肽。
上述具体反应可表示如下：
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE015
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE017
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE019
本发明提供的含侧链和光敏剂的α螺旋构象的阳离子聚多肽可以与核酸药物自组装形成纳米粒，纳米粒由荷正电的α螺旋构象的阳离子聚多肽和荷负电的核酸药物组成，因此本发明还公开了一种纳米药物，包括α螺旋阳离子聚多肽与核酸药物。
本发明还公开了一种纳米药物的制备方法，其是将含侧链和光敏剂的α螺旋构象的阳离子聚多肽溶解于DEPC水中，并与提前溶解好的核酸溶液按不同质量比例进行混合，并置于37℃水浴孵育30min后得到最终的纳米药物。
上述技术方案中，所述核酸药物选自DNA、RNA、低聚核苷酸或者多核苷酸。
上述技术方案中，所述DNA为质粒DNA，可以表达蛋白质或转录成小分子干扰RNA。
上述技术方案中，α螺旋阳离子聚多肽与核酸药物的质量比为（1~30）∶1，优选的质量比为（5~20）∶1，更优选的质量比为（10~15）∶1。
上述技术方案中，所述纳米药物的粒径为100~1000 nm，优选的粒径为100~300nm，更优选的粒径为100~150 nm。
上述技术方案中，所述纳米药物的Zeta电势为-20~50 mV，优选的Zeta电势为5~45mV，更优选的Zeta电势为30~40 mV。
本发明还公开了上述中间产物在制备α螺旋阳离子聚多肽或在制备核酸药物载体中的应用。
本发明还公开了上述α螺旋阳离子聚多肽在制备核酸药物载体中的应用。
本发明进一步公开了上述α螺旋阳离子聚多肽或者纳米药物在制备基因药物中的应用。
本发明的主要优势在于：
（1）光敏剂作为内核，具有如下优点和作用：①光可激活性，通过添加光敏剂，从而通过光照，可控产生活性氧，进而破坏生物膜，促进纳米颗粒更好的内吞进入细胞，同时更有效的逃逸内涵体；②具有优良的细胞穿膜活性，聚多肽可以和细胞膜发生可逆相互作用，进而通过“打孔方式”进入细胞，提高细胞摄取效率；③细胞毒性低；④合成方法简单可控；⑤原料较为廉价，节约成本。
（2）得到的α螺旋阳离子聚多肽纳米颗粒具有良好的细胞穿膜活性、低细胞毒性和光可激活性；本发明提供的聚合物，在水溶液中自组装形成纳米颗粒，具有良好的稳定性，制备方法简单，可重复性高，作为载体能保护DNA等核酸免于降解，又能结合光动力破膜促进细胞转染效果，进而用于癌症的治疗。
（3）本发明公开的α螺旋阳离子聚多肽包载DNA在不同细胞模型中可以起到明显的肿瘤细胞或正常细胞转染的效果，并进一步通过光照，增加了光动力破膜的效果，进一步提高基因转染效果。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为实施例一化合物4的1H NMR谱；
图2为实施例二化合物7的1H NMR谱；
图3为实施例三的1H NMR谱；
图4为实施例三和对比例一的GPC谱图
图5为实施例三和对比例一包裹DNA后的粒径图；
图6为实施例三和对比例一包裹DNA后的电势图；
图7为实施例三和对比例一包裹DNA后的溴化乙锭处理的DNA包裹图；
图8为实施例三和对比例一包裹DNA后的肝素钠处理的DNA释放图；
图9为HeLa细胞上，实施例三，对比例一和聚乙二醇包裹DNA后复合物的基因转染图；
图10为HeLa细胞上，实施例三和聚乙二醇包裹DNA后的光照前后基因转染图；
图11为HeLa细胞上，实施例三，对比例一和聚乙二醇包裹DNA后复合物的细胞摄取效率图；
图12为HeLa细胞上，实施例三，对比例一和聚乙二醇的穿膜效率图；
图13为HeLa细胞上，实施例三光照前后的细胞逃逸的荧光图；
图14为HeLa细胞上，实施例三，对比例一和聚乙二醇包裹DNA后的复合物的细胞毒性图；
图15为HeLa细胞上，实施例三，对比例一和聚乙二醇的复合物的细胞毒性图；
图16为实施例三，对比例一和聚乙二醇聚合物包裹DNA后在体内的基因转染图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
实施例一
（1）碳酸钾（15.2 g，0.11 mol）和对羟基苯甲醇（9.3 g，0.075 mol）溶于150 mL丙酮，加入溴丙炔（10 mL，0.09 mol）和18-冠醚-6（0.1 mL）。溶液在75℃下油浴回流反应，12h后旋蒸除去丙酮。往粗产物中加入200 mL水，用30 mL二氯甲烷（DCM）萃取3遍，取下层有机相。有机相用15%氢氧化钠（200 mL）和饱和食盐水（200 mL）清洗，并用Na2SO4干燥，过滤，除去溶剂得到化合物1；
（2）将化合物1 (8.5 g, 52 mmol) 溶于二氯甲烷中，在冰浴的条件下滴加亚硫酰氯 (5 mL, 68 mmol)。在室温下搅拌反应3.5h，加入100mL水猝灭亚硫酰氯后，用50mL水萃取有机相三遍，并用MgSO4干燥，过滤，除去溶剂得到化合物2；
（3）将含铜的L-谷氨酸 (3.29 g, 6.7 mmol) 和L-谷氨酸 (1.99 g,13.4 mmol)加入12 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和2 mL水的混合溶液中，并加入1,1,3,3-四甲基胍(3.4 mL, 27 mmol)，在40℃条件下搅拌2 h直至溶解。加入10 mL DMF和化合物2 (6.5 g,36 mmol)，在室温下搅拌反应48h后加入200mL丙酮，搅拌过夜。离心得到粗产物，用丙酮洗4次至溶液不再有黄色后，用水洗3次至溶液不在有蓝色，用乙二胺四乙酸二钠（现配现用）洗2次。将产物进行重结晶 (异丙醇：水= 80:40 mL）加热至80℃溶解，热过滤拿到化合物3，氘代二甲基亚砜/氘代重水；
（4）化合物3 (1.15 g, 4.0 mmol) 溶解于25 mL干燥的四氢呋喃（THF）中，随后加入三光气（0.52 g），在50℃下反应2h，之后在常温下反应过夜，在真空条件下除去溶剂，粗产物进行重结晶3次 (THF:正己烷=1:5，v/v) ，制备化合物4即五元环N-羧酸酐化合物，氘代氯仿打核磁；附图1为其核磁谱图。
实施例二
（1）将1,6-二溴己烷(1.26mL, 8 mmol)和叠氮化钠(1.6g, 24 mmol) 加入 19 mLDMF中，在60℃反应24h。（反应会有不溶物）加入大约150 mL水使其溶解后，用20 mL乙醚萃取3次，收集有机相，用硫酸钠干燥，过滤，旋蒸得到化合物5；
（2）取化合物5 (3.33 g, 20 mmol)、Et2O (15 mL), EtOAc (15 mL)、5% HCl(30mL, 5 mL浓HCl + 25 mL H2O)，在冰浴条件 (0℃)下缓慢加三苯基磷(5.51 g, 22 mmol)，保证两相分层，保证冰水浴下反应大于1h, 在常温下反应24h；加30 mL 1M HCl (2.5 mL浓盐酸 +27.5 mL水)，出现分层后弃上层有机相，取下层水相；水相用20mL DCM萃取3次，收集下层水相；接着用NaOH调节水相使pH≥12，再用20 mL DCM萃取4次，收集上层有机相，有机相进行干燥，过滤，旋蒸，得到化合物6；
（7）取化合物6 (1.42 g, 10 mmol) ， 1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐(1.47 g, 10mmol)，15mL 无水DMF，DIEA (1.74 mL, 10 mmol)，在室温条件下搅拌反应24 h；加入150mL乙醚使产物沉淀（黄色油状物），用离心管收集黄色油状物，加入乙醚，涡旋振荡几分钟后倒掉乙醚，重复多次直至溶液澄清，油泵除去溶剂得到化合物7作为叠氮端基化合物，氘代氯仿打核磁；附图2为其核磁谱图。
实施例三
（1）在手套箱里，实施例一的五元环N-羧酸酐溶于N,N-二甲基甲酰胺，随后加入5,10,15,20-四（4-氨基苯）-卟啉（TAPP）和1,5,7-三氮杂二环[4.4.0]癸-5-烯，并在室温搅拌72 h后用冰甲醇沉淀得到中间产物；5,10,15,20-四（4-氨基苯）-卟啉（TAPP）与实施例一的五元环N-羧酸酐的摩尔比为1:60；
（2）在手套箱中，将中间产物 (20 mg, 0.072 mmol炔基) 溶解于DMF中，加入实施例二的叠氮端基化合物(0.144 mmol)和五甲基二乙烯三胺 (15 μL, 0.072 mmol)，随后加入溴化亚铜 (2 mg, 0.0144 mmol) ，手套箱室温搅拌反应48小时；反应结束，从手套箱取出，开盖搅拌20 min后，加入1mL 1M 盐酸，用水透析3天(分子量为3500 Da)，冷冻干燥，得到α螺旋阳离子聚多肽，为星形拓扑结构聚多肽；附图3为其核磁谱图。
上述反应示意图可参见发明内容部分。
实施例四
（1）在手套箱里，实施例一的五元环N-羧酸酐溶于N,N-二甲基甲酰胺，随后加入5-（4-氨基苯基）-10,15,20-三苯基卟啉和1,5,7-三氮杂二环[4.4.0]癸-5-烯，并在室温搅拌72 h后用冰甲醇沉淀得到中间产物；5-（4-氨基苯基）-10,15,20-三苯基卟啉与实施例一的五元环N-羧酸酐的摩尔比为1:60；
（2）在手套箱中，将中间产物 (20 mg, 0.072 mmol炔基) 溶解于DMF中，加入实施例二的叠氮端基化合物(0.144 mmol)和五甲基二乙烯三胺 (15 μL, 0.072 mmol)，随后加入溴化亚铜 (2 mg, 0.0144 mmol) ，手套箱室温搅拌反应48小时；反应结束，从手套箱取出，开盖搅拌20 min后，加入1mL 1M 盐酸，用水透析3天(分子量为3500 Da)，冷冻干燥，得到α螺旋阳离子聚多肽，分子量为18 kg/mol，聚合度为57；化学结构式如下：
Figure RE-DEST_PATH_447816DEST_PATH_IMAGE013
实施例五
（1）在手套箱里，实施例一的五元环N-羧酸酐溶于N,N-二甲基甲酰胺，随后加入5,10,15,20-四（4-氨基苯）-卟啉（TAPP）和1,5,7-三氮杂二环[4.4.0]癸-5-烯，并在室温搅拌72 h后用冰甲醇沉淀得到中间产物；5,10,15,20-四（4-氨基苯）-卟啉（TAPP）与实施例一的五元环N-羧酸酐的摩尔比为1:100；
（2）在手套箱中，将中间产物 (20 mg, 0.072 mmol炔基) 溶解于DMF中，加入实施例二的叠氮端基化合物(0.144 mmol)和五甲基二乙烯三胺 (15 μL, 0.072 mmol)，随后加入溴化亚铜 (2 mg, 0.0144 mmol) ，手套箱室温搅拌反应48小时；反应结束，从手套箱取出，开盖搅拌20 min后，加入1mL 1M 盐酸，用水透析3天(分子量为3500 Da)，冷冻干燥，得到α螺旋阳离子聚多肽，分子量为30 kg/mol，聚合度为102，结构式同实施例三。
实施例六
（1）在手套箱里，实施例一的五元环N-羧酸酐溶于N,N-二甲基甲酰胺，随后加入5,10,15,20-四（4-氨基苯）-卟啉（TAPP）和1,5,7-三氮杂二环[4.4.0]癸-5-烯，并在室温搅拌72 h后用冰甲醇沉淀得到中间产物；5,10,15,20-四（4-氨基苯）-卟啉（TAPP）与实施例一的五元环N-羧酸酐的摩尔比为1:60；
（2）在手套箱中，将中间产物 (20 mg, 0.072 mmol炔基) 溶解于DMF中，加入氨基小分子(0.144 mmol)和五甲基二乙烯三胺 (15 μL, 0.072 mmol)，随后加入溴化亚铜 (2mg, 0.0144 mmol) ，手套箱室温搅拌反应48小时；反应结束，从手套箱取出，开盖搅拌20min后，加入1mL 1M 盐酸，用水透析3天(分子量为3500 Da)，冷冻干燥，得到α螺旋阳离子聚多肽，分子量为19 kg/mol，聚合度为60，化学结构式如下：
Figure RE-DEST_PATH_705622DEST_PATH_IMAGE014
实施例七
（1）称取100 mg 的5,10,15,20-四(4-羧基苯基)卟啉溶解于干燥的DCM (10 mL)，然后加1.5 mL草酰氯 (2M) 和催化剂DMF (1 µL)，在氮气保护下反应过夜；随后加入112mg丁二胺和二异丙基乙胺 (500 µL) ，再在氮气保护下反应过夜；粗产物依次用10%柠檬酸，1M NaOH和饱和食盐水洗，硫酸钠干燥；加TFA/DCM=1:1进行脱保护反应1.5小时，之后再在用DCM和甲醇过柱子，抽溶剂，得到中间产物1；
（2）在手套箱里，实施例一的五元环N-羧酸酐溶于N,N-二甲基甲酰胺，随后加入中间产物1和1,5,7-三氮杂二环[4.4.0]癸-5-烯，并在室温搅拌72 h后用冰甲醇沉淀得到中间产物2；中间产物11与实施例一的五元环N-羧酸酐的摩尔比为1:60；
（3）在手套箱中，将中间产物2 (20 mg, 0.072 mmol炔基) 溶解于DMF中，加入胍基小分子(0.144 mmol)和五甲基二乙烯三胺 (15 μL, 0.072 mmol)，随后加入溴化亚铜(2 mg, 0.0144 mmol) ，手套箱室温搅拌反应48小时；反应结束，从手套箱取出，开盖搅拌20 min后，加入1mL 1M 盐酸，用水透析3天(分子量为3500 Da)，冷冻干燥，得到α螺旋阳离子聚多肽，分子量为20 kg/mol，聚合度为66，化学结构式如下：
Figure RE-DEST_PATH_869887DEST_PATH_IMAGE015
实施例八
（1）在手套箱里，实施例一的五元环N-羧酸酐溶于N,N-二甲基甲酰胺，随后加入1,8,15,22-四-氨基金属酞菁和1,5,7-三氮杂二环[4.4.0]癸-5-烯，并在室温搅拌72 h后用冰甲醇沉淀得到中间产物；1,8,15,22-四-氨基金属酞菁与实施例一的五元环N-羧酸酐的摩尔比为1:60；
（2）在手套箱中，将中间产物 (20 mg, 0.072 mmol炔基) 溶解于DMF中，加入氨基小分子(0.144 mmol)和五甲基二乙烯三胺 (15 μL, 0.072 mmol)，随后加入溴化亚铜 (2mg, 0.0144 mmol) ，手套箱室温搅拌反应48小时；反应结束，从手套箱取出，开盖搅拌20min后，加入1mL 1M 盐酸，用水透析3天(分子量为3500 Da)，冷冻干燥，得到α螺旋阳离子聚多肽，分子量为20 kg/mol，聚合度为66；化学结构式如下：
Figure RE-DEST_PATH_596665DEST_PATH_IMAGE016
实施例九
（1）在手套箱里，实施例一的五元环N-羧酸酐溶于N,N-二甲基甲酰胺，随后加入2,9,16,23-四-氨基金属酞菁和1,5,7-三氮杂二环[4.4.0]癸-5-烯，并在室温搅拌72 h后用冰甲醇沉淀得到中间产物；2,9,16,23-四-氨基金属酞菁与实施例一的五元环N-羧酸酐的摩尔比为1:60；
（2）在手套箱中，将中间产物 (20 mg, 0.072 mmol炔基) 溶解于DMF中，加入氨基小分子(0.144 mmol)和五甲基二乙烯三胺 (15 μL, 0.072 mmol)，随后加入溴化亚铜 (2mg, 0.0144 mmol) ，手套箱室温搅拌反应48小时；反应结束，从手套箱取出，开盖搅拌20min后，加入1mL 1M 盐酸，用水透析3天(分子量为3500 Da)，冷冻干燥，得到α螺旋阳离子聚多肽，分子量为20 kg/mol，聚合度为66；化学结构式如下：
Figure RE-DEST_PATH_606210DEST_PATH_IMAGE017
对比例一
（1）在手套箱里，实施例一的五元环N-羧酸酐溶于N,N-二甲基甲酰胺，随后加入六甲基二硅氮烷和1,5,7-三氮杂二环[4.4.0]癸-5-烯，并在室温搅拌72 h后用冰甲醇沉淀得到中间产物；六甲基二硅氮烷与五元环N-羧酸酐的摩尔比为1:60；
（2）在手套箱中，将中间产物 (20 mg, 0.072 mmol炔基) 溶解于DMF中，加入实施例二的叠氮端基化合物(0.144 mmol)和五甲基二乙烯三胺 (15 μL, 0.072 mmol)，随后加入溴化亚铜 (2 mg, 0.0144 mmol) ，手套箱室温搅拌反应48小时；反应结束，从手套箱取出，开盖搅拌20 min后，加入1mL 1M 盐酸，用水透析3天(分子量为3500 Da)，冷冻干燥，得到阳离子聚多肽，此阳离子聚多肽，作为阳性对照，其化学结构式如下：
Figure RE-DEST_PATH_984101DEST_PATH_IMAGE018
实施例十
以实施例三阳离子聚多肽为载体的纳米药物的制备以及表征、性能。
配制实施例三阳离子聚多肽和DNA（质粒DNA，从大肠杆菌中提取的含luciferase表达的质粒）浓度分别为1 mg/mL和0.1 mg/mL 的DEPC水溶液。按照阳离子聚多肽/DNA不同重量比混合，将混合物涡旋10秒，然后在37℃下孵育30分钟，以形成阳离子聚多肽/DNA复合物。
利用动态光散射（DLS）评估阳离子聚多肽/DNA在不同重量比混合下，复合物的粒径和电位。
将EB溶液与DNA以重量比为10:1混合。并在室温下孵育1小时。然后按照阳离子聚多肽/DNA不同重量比将实施例加入到EB/DNA混合物中，进一步将混合物放在室温下孵育30分钟，通过酶标仪测定其荧光强度（λex = 510 nm，λem = 590 nm）定量测定DNA包裹效率。
将肝素钠加入到复合物溶液中形成一系列最终浓度，并将此溶液放在37℃下孵育1小时，最后按照上述EB排阻实验过程来测定DNA释放效率。
HeLa细胞以每孔2.5×104个接种到96孔板内，然后在含有10％FBS的DMEM培养基中培养24小时。然后培养基替换成无血清的DMEM，并按照0.1 µg DNA/每孔的浓度加入阳离子聚多肽/DNA复合物。37 ℃孵育4小时后，移除培养基，替换成新鲜培养基，将细胞分为两组，一组进行光照（661 nm, 4 min），一组不进行光照，之后进一步孵育20小时。使用荧光素酶试剂盒测定荧光素酶表达，并使用BCA试剂盒测定细胞蛋白浓度，评价其基因转染效率。
用YOYO-1（20 μM）来标记DNA （每50 bp DNA被一个染料分子标记），然后按照不同重量比来制备阳离子聚多肽/YOYO-1-DNA复合物。HeLa细胞以每孔2.5×104个接种到96孔板内，然后在含有10 % FBS的DMEM培养基中培养24小时，换成无血清培养基，然后按照0.1μg YOYO-1-DNA/孔的浓度加入复合物。37℃下孵育4小时后，用含有肝素钠（20 U/mL）的PBS洗涤细胞四次以除去未进入的复合物，随后在室温下用RIPA裂解缓冲液裂解 20分钟。可以通过分光荧光测定法（λex = 485 nm，λem = 530 nm）定量YOYO-1-DNA荧光强度，并使用BCA试剂盒测定蛋白质的浓度，评价细胞摄取水平。
共聚焦激光扫描显微镜可以进一步观察复合物的细胞内化和分布。HeLa细胞以每孔1.5×104个接种到24孔板内，然后在含有10％FBS的DMEM培养基中培养24小时后，换成无血清培养基，按照1 μg YOYO-1-DNA/孔的浓度加入复合物。37℃培养4小时。用含肝素钠的PBS洗涤三次，用Lysotracker-Red（200 nM）染色1小时；再用含肝素钠的PBS洗三次后，用4％多聚甲醛固定15分钟；随后用含肝素钠的PBS洗三次后用DAPI（5 μg/mL）染10分钟；最后用甘油封片。其荧光强度通过激光共聚焦显微镜进行观察。
HeLa细胞以每孔2.5×104个接种到96孔板内，培养24小时。然后换成无血清培养基，按照0.3 µg DNA/每孔的浓度加入不同重量比的阳离子聚多肽/DNA复合物。37 ℃下孵育4小时后，弃复合物，换成10％FBS的DMEM培养基中培养20小时后。通过MTT法测定细胞存活率。
将雄性C57/BL6小鼠（18-20 g）脱毛，异氟烷麻醉后在右背处注射1×107个B16F10细胞。当肿瘤体积达到100 mm3（8天左右）时，向肿瘤内注射阳离子聚多肽/DNA复合物，以20μg DNA /小鼠（〜50 μL/注射）（两次注射）。注射后48小时，处死小鼠，取出肿瘤， PBS洗涤3次，加入含有蛋白酶抑制剂的组织裂解缓液，匀浆。将匀浆液在液氮中冷冻，并在常温解冻，反复三次。最后在4 ℃，12000 rpm下离心10分钟。使用荧光素酶试剂盒测定荧光素酶表达，并使用BCA试剂盒测定细胞蛋白浓度，评价其体内转染效率。
将实施例三的阳离子聚多肽（TAPP-PPOBLG）更换为对比例一的阳离子聚多肽（PPOBLG），并与现有聚合物进行比较，结果如下：
图4为实施例三和对比例一的GPC谱图，利用图进行数据分析，实施例三和对比例一拥有约20 kg/mol分子量，聚合度约为60。
图5为实施例三和对比例一包裹DNA后的粒径图，从图5中发现本发明的多肽作为载体拥有良好的纳米粒径分布，约为100~150 nm。
图6为实施例三和对比例一包裹DNA后的电势图，从图6中发现实施例三和对比例一在和核酸药物质量比为2时就从负电荷变为正电荷，约为20~40 mV，证明实施例三和对比例一与核酸药物复合良好，同时实施例三拥有更强的电势。
图7为实施例三和对比例一包裹DNA后的溴化乙锭处理的DNA包裹图，从图7中发现实施例三和对比例一在和核酸药物质量比为2时就高达将近90%的包载率，证明实施例三和对比例一均可以很好的包裹核酸药物。
图8为实施例三和对比例一包裹DNA后的肝素钠处理的DNA释放图，从图8中发现，当增加正电荷的肝素钠浓度，会有更多的核酸药物被竞争释放下来，利于本发明药物到达病症部位后的释放，同时实施例三比对比例一拥有更快的释放速率。
图9为HeLa细胞上，实施例三，对比例一和聚乙二醇包裹DNA后复合物的基因转染，从图9中可以发现实施例三在和对比例一在和核酸药物相同质量比的时候，实施例三拥有更高的转染效率，尤其是在质量比为15时，转染效率要比对比例一高出将近14倍，显示出拓扑结构对聚多肽的优良影响。
图10为HeLa细胞上，实施例三和聚乙二醇包裹DNA后的光照前后基因转染，从图10中可以发现，当对实施例三进行短光照，实施例三的转染效果相较于非光照有着明显提高，在质量比为10时有将近10倍的提高，证明实施例三具有良好的光可激活性，促进光动力破膜，有利于复合物逃逸内涵体。
图11为HeLa细胞上，实施例三，对比例一和聚乙二醇包裹DNA后复合物的细胞摄取效率，从图11中发现，实施例三拥有比对比例和聚乙二醇更好的细胞摄取效率。
图12为HeLa细胞上，实施例三，对比例一和聚乙二醇的穿膜效率，从图12中发现，实施例三拥有比对比例和聚乙二醇更好的细胞穿膜效率。
图13为HeLa细胞上，实施例三光照前后的细胞逃逸的荧光图，从图13中可以发现光照后，红色和绿色荧光重叠减少，证明有更多的复合物逃逸出内涵体，有利于促进基因转染。
图14为HeLa细胞上，实施例三，对比例一和聚乙二醇包裹DNA后的复合物的细胞毒性，从图14中可以发现相比聚乙二醇复合物，实施例三和对比例一复合物拥有更多的细胞存活率，证明复合物没有什么毒性，生物相容性高。
图15为HeLa细胞上，实施例三，对比例一和聚乙二醇的复合物的细胞毒性，从图15中可以发现相比聚乙二醇，实施例三和对比例一聚多肽本身拥有更多的细胞存活率，证明聚多肽本身也没有什么毒性； 图16为实施例三，对比例一和聚乙二醇聚合物包裹DNA后在体内的基因转染，从图16可以看到，当对实体黑色素瘤进行瘤内注射时，与体外数据一致的是，实施例三光照后表现出比实施例三光照前更高的转染效率，同时它们也比聚乙二醇高1个数量级，再次表明实施例三在基因递送方面有潜在应用。
本发明提供的含侧链和光敏剂的α螺旋构象的阳离子聚多肽，设计的具有足够链长且具有稳定α螺旋构象的细胞穿膜阳离子聚多肽可以作为核酸药物的载体且具有良好的稳定性、生物穿膜性和光可激活性，在核酸药物给药系统中具有良好的应用。

Claims (5)

1.一种α螺旋阳离子聚多肽，其特征在于，所述α螺旋阳离子聚多肽由含氨基的光敏剂引发五元环N-羧酸酐化合物聚合得到；所述α螺旋阳离子聚多肽具有式I所示的结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
其中，R为端基；PS为光敏剂基团；
所述式I所示的结构中，n为20～200；m为3～8；a为1～5；所述R为氨基或胍基；所述光敏剂基团为5,10,15,20-四苯-卟啉基、5-苯-10,15,20-三苯基卟啉基、5,10,15,20-四(4-酯基苯基)卟啉基、1,8,15,22-四-氨基金属酞菁基或2,9,16,23-四-氨基金属酞菁基。
2.根据权利要求1所述α螺旋阳离子聚多肽，其特征在于，所述α螺旋阳离子聚多肽的制备方法包括以下步骤：
（1）以五元环N-羧酸酐化合物、含氨基的光敏剂为原料，反应制备中间产物；
（2）以中间产物与叠氮端基化合物原料，反应制备得到α螺旋阳离子聚多肽。
3.根据权利要求2所述α螺旋阳离子聚多肽，其特征在于，步骤（1）中，所述含氨基的光敏剂包括本身带有氨基的光敏剂或者本身不带氨基的光敏剂氨基化后的产物；所述五元环N-羧酸酐化合物、含氨基的光敏剂的摩尔比为（20～200）∶1，反应以1,5,7-三氮杂二环[4.4.0]癸-5-烯为催化剂，反应为室温反应65～80 h；
以对羟基苯甲醇、溴丙炔为原料制备化合物1，再以化合物1、亚硫酰氯为原料制备化合物2，再以化合物2、L-谷氨酸为原料制备化合物3，最后以化合物3、三光气为原料，制备五元环N-羧酸酐化合物；
所述五元环N-羧酸酐化合物的化学结构式为：
Figure 102320DEST_PATH_IMAGE002
步骤（2）中，以五甲基二乙烯三胺、溴化亚铜为催化体系，反应为室温反应40～50小时；所述叠氮端基化合物的化学结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
。
4.权利要求1所述α螺旋阳离子聚多肽在制备核酸药物载体中的应用。
5.权利要求1所述α螺旋阳离子聚多肽在制备基因药物中的应用。
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