CN116655906B - 一种硫酸化糖多肽、制备方法及抗病毒应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于高分子合成及病毒预防技术领域，公开了一种硫酸化糖多肽、制备方法及抗病毒应用。该种聚多肽结合了聚合物的“多价效应”、侧链的疏水结构以及硫酸化糖单元，作为细胞膜表面的病毒受体硫酸乙酰肝素的模拟物，与病毒结合从而阻止病毒对正常细胞的侵袭。该种聚多肽采用具有α‑螺旋结构的主链，α‑螺旋结构的引入能够促进聚多肽和病毒的结合，增强抗病毒的效率，能够对新冠假病毒达到85％的抑制率，并且其半抑制浓度能够低至0.71μg/mL。该聚多肽也具有广谱抗病毒能力，对无包膜的肠病毒也能够进行有效的抑制。

Description

一种硫酸化糖多肽、制备方法及抗病毒应用
技术领域
本发明属于高分子合成和病毒预防技术领域，涉及一种硫酸化糖基修饰的聚多肽、制备方法及在抗病毒领域的应用。
背景技术
病毒引起的疾病是人们健康的主要威胁，尽管疫苗或其他策略可以有效地限制病毒感染，但由于新变体的频繁出现、抗病毒药物的缺乏和耐药性，病毒性疾病的治疗仍然面临巨大挑战。大多数市面上的小分子抗病毒药物，例如肝素、利巴韦林、阿昔洛韦等，主要利用两种机制来实现活性：在细胞外阻断病毒-细胞相互作用和在细胞内干扰病毒复制。
与小分子抗病毒药物相比，大分子药物具有多样化结构、以及可灵活调节的聚合度、官能团和二级结构等，在控制其抗病毒活性方面具有突出的优势。聚合物所表现的“多价效应”，有助于多个重复单位或侧链配体与多个生物受体协同结合。与传统的聚合物不同，多肽作为蛋白质模拟物，具有优异的生物相容性和独特的二级构象(α-螺旋和β-折叠)，广泛用于药物传递、基因传递和抗菌领域。然而，很少有研究关注多肽的抗病毒活性。特别是，由于侧链官能团的暴露，独特的α-螺旋构型可以形成纳米级的组装体，这可以放大“多价效应”，使其成为潜在的聚合物基抗病毒药物的候选药物。考虑到α-螺旋聚多肽特殊的二级结构，聚多肽能很好地阻断病毒对宿主细胞的附着。
糖萼是位于细胞膜上的多糖蛋白复合物，形成一层薄薄的带负电荷的糖残基，如唾液酸(SA)、硫酸化糖和糖醛酸作为受体。许多病毒病原体利用这些糖残基作为结合因子进行附着，促进病毒粒子的膜融合和内化。硫酸化糖，特别是高硫酸化线性多糖硫酸肝素(HS)，也是大多数病毒的受体，如登革病毒、单纯疱疹病毒和人乳头瘤病毒。如前所述，抗病毒药物的设计原则之一是阻断病毒与膜受体的相互作用。除了受体介导的靶向外，利用病毒与宿主细胞膜之间的静电相互作用促进特异性结合和靶向也是一种替代策略。值得注意的是，近期研究表明，SARS-CoV-2刺突蛋白可通过其受体结合结构域(RBD)与细胞内HS和血管紧张素转换酶2(ACE2)相互作用，形成以HS为支架的三元复合物而外源性肝素可以与细胞表面的HS竞争，从而抑制SARS-CoV-2的感染，这说明靶向“病毒-HS”相互作用的药物在控制SARS-CoV-2感染和传播方面的治疗潜力(Thomas Mandel Clausen等人,SARS-CoV-2infection depends on cellular heparan saulfate and ACE2,Cell,2020,183(4),1043-1057)。这一发现启发我们在聚合物上引入外源性肝素基序可以进一步提高抗病毒活性。由于α-螺旋多肽具有膜活性和多价性放大的优点，含有硫酸化聚糖的α-螺旋多肽可以有效地在细胞外捕获游离病毒，与宿主细胞竞争，最终抑制感染。
因此，我们合成了一系列具有不同的聚合度、构象和刚性/柔性的硫酸化糖多肽。该类聚多肽能够有效地阻断SARS-CoV-2病毒进入宿主细胞，抑制感染，并且能够对非包膜肠道病毒具有良好的抑制效果。这项工作的结果将为开发针对当前和重新出现的病原体的聚合物防病毒剂提供指导。
发明内容
本发明的目的之一是一种硫酸化糖多肽、制备方法及抗病毒应用。
本发明的技术方案：
一种硫酸化糖多肽，结构如下：
其中，20≤n≤200；式(1)为刚性侧链硫酸化糖多肽；式(2)为柔性侧链硫酸化糖多肽。
一种硫酸化糖多肽的制备方法，合成路线如下：
其中，n代表多肽单元的聚合度，具体包括以下步骤：
(1)炔基侧链的聚多肽的合成
将L-谷氨酸溶于水，并逐滴滴加醋酸铜的水溶液，其中，L-谷氨酸和醋酸铜的摩尔浓度比为1:1，室温静置2天后，用水、乙醇和乙醚分别洗1-2次，真空干燥，得到蓝色粉末状固体，即化合物a；将溴丙炔、碳酸钾、对羟基苯甲醇和18-冠醚-6按照摩尔比1:(1-2):(1-2):(0.006-0.007)溶于丙酮中，其中溴丙炔浓度为0.4-0.6M，72℃加热回流12h；旋蒸后，将粗产物溶于水并用二氯甲烷萃取三次，再用饱和氢氧化钠和饱和食盐水洗涤各洗涤一次，无水硫酸钠干燥，旋蒸，得到棕黄色油状物；将棕黄色油状物溶于二氯甲烷中，浓度为10-12M，冰水浴下缓慢加入1.3-1.5当量棕黄色油状物的二氯亚砜，室温搅拌3.5h；加入10倍二氯甲烷体积的去离子水淬灭反应，提取有机相后用10倍二氯甲烷体积的饱和食盐水洗涤三次，无水硫酸钠干燥，旋蒸，得到棕黄色油状物，即化合物b；将化合物a、L-谷氨酸和四甲基胍按照1:2:4的摩尔比溶于体积比为6:1的N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)和水的混合溶剂，其中，L-谷氨酸的浓度为0.9-1.2M，40℃加热反应2h；向上述溶液中逐滴滴加3.6M的化合物b的DMF溶液，化合物b和L-谷氨酸的摩尔比为(2.6-3):1；室温反应48h后，再加入10倍DMF体积的丙酮，搅拌过夜；粗产物8000rpm离心5min，弃上清，蓝色沉淀继续用丙酮洗至上清无黄色，水洗至上清无蓝色；用0.45M的乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-Na2)过夜洗两次，抽滤；粗产物溶于体积比为2:1的异丙醇和水的混合溶液，80℃热过滤，冻干，得到白色固体，即化合物c；将化合物c、三光气和环氧丙烷按照摩尔比1:(0.5-3):(5-10)，溶于四氢呋喃中，化合物c的浓度为0.1-0.3M；室温搅拌10min-2h后，溶液变成澄清状态，浓缩溶液，通过SiO2柱层析进行提纯得到白色固体，即化合物d；氮气保护下，将化合物d溶于DMF中，加入六甲基二硅氮烷的DMF溶液；其中，化合物d的浓度为0.3-0.5M，化合物d和六甲基二硅氮烷的摩尔比为(20-200):1；室温搅拌48-72h后，冰甲醇沉淀，离心，干燥后得到白色固体，即化合物e；
将L-谷氨酸和6-庚炔醇按照摩尔比1:(1.5-2)混合，并在0℃下搅拌下，缓慢滴入浓硫酸，浓硫酸与L-谷氨酸的摩尔比为(1.1-1.3):1，室温搅拌16-24h，倒入碳酸氢钠溶液，碳酸氢钠与浓硫酸摩尔比为2:1；过滤后，将粗产物在体积比为1:1～2:1的异丙醇和水中重结晶；干燥后得到白色固体，即化合物f；将化合物f、三光气和环氧丙烷按照摩尔比1:(0.5-3):(5-10)溶于四氢呋喃中，化合物f的浓度为0.1-0.3M；室温搅拌10min-2h后，溶液变成澄清状态，浓缩溶液，通过SiO2柱层析进行提纯得到无色透明粘稠物，即为化合物g；将化合物g溶于DMF中，加入六甲基二硅氮烷的DMF溶液；其中，化合物g的浓度为0.3-0.5M，化合物g和六甲基二硅氮烷的摩尔比为(20-200):1；室温搅拌48-72h后，冰甲醇沉淀，离心，干燥后得到白色固体，即化合物h；
(2)硫酸化糖基聚多肽的合成
2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖酰基叠氮化物溶于甲醇钠的甲醇溶液(甲醇钠浓度为20mM)，其中2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖酰基叠氮化物和甲醇钠的摩尔比为2:1，搅拌2-3h后，通过SiO2柱层析进行提纯得到白色固体，命名为GlcNAc-N3；氮气氛围下，将化合物e、GlcNAc-N3、溴化亚铜和五甲基二乙烯三胺按照摩尔比1:(1.2-2):(0.1-1):(0.45-4.5)溶于干燥的DMF中，其中，化合物e的浓度为(0.1-0.5)M，室温搅拌24-48h后，加入与DMF等体积的1M盐酸，继续搅拌1h；在去离子水中透析24-48h(MWCO＝1kDa)，冷冻干燥后得到白色固体，即刚性侧链糖多肽；氮气保护下，以羟基数计，将刚性侧链糖多肽和三氧化硫吡啶按照摩尔比1:(5-10)溶于DMF中，三氧化硫吡啶浓度0.5-1M，室温搅拌48-72h后，置于冰箱冷藏静置3-6h，倾倒上清液，加入5-40倍羟基当量的1M碳酸氢钠溶液，搅拌24h，在去离子水中透析24-48h(MWCO＝1kDa)，冷冻干燥后得到白色固体，即刚性侧链硫酸化糖多肽；采用相同的合成方法，将化合物e换成化合物h，即可合成柔性侧链硫酸化糖多肽。
本发明的目的之二是主要提供了一种该类聚合物在抗病毒方面的应用。
本发明的机理：具有α-螺旋构型的高度硫酸化的糖基聚多肽能够作为细胞表面硫酸乙酰肝素(病毒靶点)的模拟物。具有α-螺旋构型的聚多肽有利于暴露侧链上硫酸化糖类位点，放大聚合物的“多价效应”，引入外源性的模拟物与细胞竞争与病毒的结合，阻隔病毒对细胞的侵入和感染。
本发明的有益效果：
(1)本发明提出了一种硫酸乙酰肝素的模拟物，即高度硫酸化糖修饰的聚多肽的制备方法。
(2)本发明提出了二级结构增强抗病毒效率的策略，与商用肝素或无螺旋结构的阴离子聚合物相比，该类聚多肽具有更优异的抗病毒能力。
(3)本发明提出二级结构、多价效应、疏水结构和糖单元的引入协同提高抗病毒效果，对新冠假病毒的抑制效率能够达到85％，并且半抑制浓度能够低至0.71μg/mL。
(4)该聚多肽具有优异的广谱抗病毒能力，对新冠病毒和无包膜的肠病毒能够进行有效的抑制。
附图说明
图1是实施例2中H-1的氢核磁。
图2是实施例2中H-2的氢核磁。
图3是实施例2中H-1、R-1和H-2的圆二色光谱。
图4是实施例3中H-1、R-1和H-2对新冠假病毒的抑制效率。
图5是实施例3中H-1的抑制率-剂量的关系图。
图6是实施例4中H-1、R-1和H-2对CVB3病毒的抑制效率。
具体实施方式
以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。
实施例1：炔基侧链的聚多肽的合成
将L-谷氨酸(0.1mol)溶于375mL去离子水中，并逐滴滴加375mL醋酸铜的水溶液(0.1mol)，室温静置2天。水、乙醇和乙醚分别洗2次，真空干燥，得到蓝色粉末状固体，即化合物a；将溴丙炔(70mmol)、碳酸钾(110mmol)、对羟基苯甲醇(75mmol)和18-冠醚-6(0.44mmol)溶于150mL丙酮中，72℃加热回流12h。旋蒸后，将粗产物溶于水并用二氯甲烷(30mL×3)萃取，饱和氢氧化钠(200mL×1)和饱和食盐水(200mL×1)洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸，得到棕黄色油状物。将棕黄色油状物(52mmol)溶于二氯甲烷(5mL)中，冰水浴下缓慢加入二氯亚砜(70mmol)，室温搅拌3.5h。加入50mL去离子水淬灭反应，提取有机相后用饱和食盐水洗涤(50mL×3)，无水硫酸钠干燥，旋蒸，得到棕黄色油状物，即化合物b；依次加入化合物a(6.7mmol)、L-谷氨酸(13.4mmol)、DMF(12mL)、水(2mL)和四甲基胍(26.8mmol)，40℃加热反应2h。向上述溶液中逐滴滴加10mL化合物b的DMF溶液(3.6M),室温反应48h。加入200mL丙酮，搅拌过夜。粗产物8000rpm离心5min，弃上清，蓝色沉淀继续用丙酮洗至上清无黄色，水洗至上清无蓝色。EDTA-Na2(0.45M)过夜洗两次，抽滤。粗产物溶于异丙醇/水(v/v＝2:1)，80℃热过滤，冻干，得到白色固体，即化合物c；在耐压瓶中，将化合物c(2.68mmol)和环氧丙烷(26.8mmol)分散四氢呋喃(25mL)中，然后将三光气(1.34mmol)直接加入上述溶液中。室温搅拌30min后，溶液变成澄清状态，浓缩溶液，通过柱层析法(SiO2，乙酸乙酯:正己烷＝1:3)纯化，浓缩后得到白色固体，即为化合物d。氮气保护下，将化合物d(0.32mmol)溶于1mL DMF中，加入64μL六甲基二硅氮烷的DMF溶液(0.1M)。室温搅拌48h。冰甲醇沉淀，离心，干燥后得到白色固体，即化合物e。
将L-谷氨酸(68mmol)和6-庚炔醇(108mmol)混合，在0℃下搅拌下，缓慢滴入4mL浓硫酸，控制时间超过10min，室温搅拌16h，倒入100mL碳酸氢钠溶液(12.5g)，过滤，重结晶(异丙醇:水＝1:1)，干燥后得到白色固体，即化合物f。在耐压瓶中，将化合物f(2.68mmol)和环氧丙烷(26.8mmol)分散四氢呋喃(25mL)中，然后将三光气(1.34mmol)直接加入上述溶液中。室温搅拌至溶液变成澄清状态，浓缩溶液，通过柱层析法(SiO2，乙酸乙酯:正己烷＝1:3)纯化，浓缩后得到无色粘稠液体，即化合物g。氮气保护下，将化合物g(0.32mmol)溶于1mL DMF中，加入64μL六甲基二硅氮烷的DMF溶液(0.1M)。室温搅拌48h。冰甲醇沉淀，离心，干燥后得到白色固体，即化合物h。
实施例2：硫酸化糖基聚多肽的合成
2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖酰基叠氮化物(0.28mmol)溶于7mL甲醇钠的甲醇溶液(20mM)，搅拌2h后，通过SiO2柱层析(二氯甲烷:甲醇＝5:1)进行提纯得到白色固体，命名为GlcNAc-N3。氮气氛围下，将化合物e(0.073mmol)、GlcNAc-N3(0.117mmol)、溴化亚铜(0.0146mmol)、五甲基二乙烯三胺(0.0657mmol)溶于干燥的DMF(500μL)中，室温搅拌48h后，加入500μL的盐酸(1M)，继续搅拌1h。在去离子水中透析24h(MWCO＝1kDa)，冷冻干燥后得到白色固体，即刚性侧链糖多肽。氮气保护下，将刚性侧链糖多肽(以羟基数计，0.057mmol)和三氧化硫吡啶(0.285mmol)溶于500μL的DMF中，室温搅拌48h后，置于冰箱冷藏静置6h，倾倒上清液，加入2.28mL碳酸氢钠溶液(1M)，搅拌24h，在去离子水中透析24h(MWCO＝1kDa)，冷冻干燥后得到白色固体，即具有α-螺旋结构的刚性侧链硫酸化糖多肽，命名为H-1(产率93％),H-1的氢谱核磁表征如图1所示；采用相同的合成方法，将化合物e换成化合物h，即可合成柔性侧链硫酸化糖多肽H-2(产率90％)，H-2的氢谱核磁表征如图2所示；作为对比例，无螺旋结构的刚性侧链硫酸化糖多肽R-1的合成方法与H-1一致，除了将L-谷氨酸替换成DL-谷氨酸。H-1、H-2和R-1的圆二色光谱如图3所示。
实施例3：抗新冠假病毒效果的评估
在假病毒感染实验中，将Hela-hACE2细胞(2×104cells/100μL)接种于96孔板中，使感染前的融合度达到70％。然后用100μL的假病毒悬液感染细胞并立即用聚多肽处理。感染48小时后，用荧光素酶检测系统(Promega,cat:E1501)裂解感染细胞，并使用20/20发光检测仪(Promega,USA)测量发光信号，每次感染试验进行3次。H-1、H-2和R-1对新冠假病毒的抑制效率如图4所示，H-1的抑制率-剂量关系如图5所示。
实施例4：抗CVB3病毒效果的评估
为了制备用于病毒感染和复合处理的细胞，将HeLa细胞分配到12孔板中培养16h，融合度达到90％。在37℃、5％CO2条件下，用无血清培养基稀释CVB3原液制成感染培养基，最终感染性滴度为4×106PFU/mL。在感染前，用无血清培养基清洗细胞2次，然后用0.5mL/孔的感染培养基孵育1h，使CVB3感染细胞，病毒感染复数为5。孵育后，除去感染培养基，用含有聚多肽的完整培养基代替。细胞继续孵育7小时，然后收集细胞进行RNA提取。使用SuperScript III第一链合成系统(ThermoFisher,USA)进行逆转录合成cDNA。采用SYBRGreen qPCR Master Mix(Bimake,China)进行实时定量PCR(qPCR)。检测人甘油醛3-磷酸脱氢酶(hGAPDH)的mRNA水平，作为内源性对照。所有qPCR实验均以无模板为阴性对照，重复3次。hGAPDH和CVB3 VP1 qPCR引物见表1。
表1用于实时定量PCR的引物

Claims (3)

1.一种硫酸化糖多肽，其特征在于，该硫酸化糖多肽的结构如下：
其中，20≤n≤200；式(1)为刚性侧链硫酸化糖多肽；式(2)为柔性侧链硫酸化糖多肽。
2.一种硫酸化糖多肽的制备方法，其特征在于，合成路线如下：
其中，n代表多肽单元的聚合度，具体包括以下步骤：
(1)炔基侧链的聚多肽的合成
将L-谷氨酸溶于水，并逐滴滴加醋酸铜的水溶液，其中，L-谷氨酸和醋酸铜的摩尔浓度比为1:1，室温静置2天后，用水、乙醇和乙醚分别洗1-2次，真空干燥，得到蓝色粉末状固体，即化合物a；将溴丙炔、碳酸钾、对羟基苯甲醇和18-冠醚-6按照摩尔比1:(1-2):(1-2):(0.006-0.007)溶于丙酮中，其中溴丙炔浓度为0.4-0.6M，72℃加热回流12h；旋蒸后，将粗产物溶于水并用二氯甲烷萃取三次，再用饱和氢氧化钠和饱和食盐水洗涤各洗涤一次，无水硫酸钠干燥，旋蒸，得到棕黄色油状物；将棕黄色油状物溶于二氯甲烷中，浓度为10-12M，冰水浴下缓慢加入1.3-1.5当量棕黄色油状物的二氯亚砜，室温搅拌3.5h；加入10倍二氯甲烷体积的去离子水淬灭反应，提取有机相后用10倍二氯甲烷体积的饱和食盐水洗涤三次，无水硫酸钠干燥，旋蒸，得到棕黄色油状物，即化合物b；将化合物a、L-谷氨酸和四甲基胍按照1:2:4的摩尔比溶于体积比为6:1的N,N’-二甲基甲酰胺DMF和水的混合溶液中，其中，L-谷氨酸的浓度为0.9-1.2M，40℃加热反应2h；向上述溶液中逐滴滴加3.6M的化合物b的DMF溶液，化合物b和L-谷氨酸的摩尔比为(2.6-3):1；室温反应48h后，再加入10倍DMF体积的丙酮，搅拌过夜；粗产物8000rpm离心5min，弃上清，蓝色沉淀继续用丙酮洗至上清无黄色，水洗至上清无蓝色；用0.45M的乙二胺四乙酸二钠盐过夜洗两次，抽滤；粗产物溶于体积比为2:1的异丙醇和水的混合溶液，80℃热过滤，冻干，得到白色固体，即化合物c；将化合物c、三光气和环氧丙烷按照摩尔比1:(0.5-3):(5-10)溶于四氢呋喃中，化合物c的浓度为0.1-0.3M；室温搅拌10min-2h后，溶液变成澄清状态，浓缩溶液，通过SiO2柱层析进行提纯得到白色固体，即化合物d；氮气保护下，将化合物d溶于DMF中，加入六甲基二硅氮烷的DMF溶液；其中，化合物d的浓度为0.3-0.5M，化合物d和六甲基二硅氮烷的摩尔比为(20-200):1；室温搅拌48-72h后，冰甲醇沉淀，离心，干燥后得到白色固体，即化合物e；
将L-谷氨酸和6-庚炔醇按照摩尔比1:(1.5-2)混合，并在0℃下搅拌下，缓慢滴入浓硫酸，浓硫酸与L-谷氨酸的摩尔比为(1.1-1.3):1，室温搅拌16-24h，倒入碳酸氢钠溶液，碳酸氢钠与浓硫酸摩尔比为2:1；过滤后，将粗产物在体积比为1:1～2:1的异丙醇和水中重结晶；干燥后得到白色固体，即化合物f；将化合物f、三光气和环氧丙烷按照摩尔比1:(0.5-3):(5-10)溶于四氢呋喃中，化合物f的浓度为0.1-0.3M；室温搅拌10min-2h后，溶液变成澄清状态，浓缩溶液，通过SiO2柱层析进行提纯得到无色透明粘稠物，即为化合物g；将化合物g溶于DMF中，加入六甲基二硅氮烷的DMF溶液；其中，化合物g的浓度为0.3-0.5M，化合物g和六甲基二硅氮烷的摩尔比为(20-200):1；室温搅拌48-72h后，冰甲醇沉淀，离心，干燥后得到白色固体，即化合物h；
(2)硫酸化糖基聚多肽的合成
2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖酰基叠氮化物溶于浓度为20mM甲醇钠的甲醇溶液，其中2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖酰基叠氮化物和甲醇钠的摩尔比为2:1，搅拌2-3h后，通过SiO2柱层析进行提纯得到白色固体，命名为GlcNAc-N3；氮气氛围下，将化合物e、GlcNAc-N3、溴化亚铜和五甲基二乙烯三胺按照摩尔比1:(1.2-2):(0.1-1):(0.45-4.5)溶于干燥的DMF中，其中，化合物e的浓度为(0.1-0.5)M，室温搅拌24-48h后，加入与DMF等体积的1M盐酸，继续搅拌1h；在去离子水中透析24-48h，冷冻干燥后得到白色固体，即刚性侧链糖多肽；氮气保护下，以羟基数计，将刚性侧链糖多肽和三氧化硫吡啶按照摩尔比1:(5-10)溶于DMF中，三氧化硫吡啶浓度0.5-1M，室温搅拌48-72h后，置于冰箱冷藏静置3-6h，倾倒上清液，加入5-40倍羟基当量的1M碳酸氢钠溶液，搅拌24h，在去离子水中透析24-48h，冷冻干燥后得到白色固体，即刚性侧链硫酸化糖多肽。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，采用权利要求2相同的合成方法，将化合物e换成化合物h，即合成柔性侧链硫酸化糖多肽。
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