CN110669106B - 一种成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药领域，具体公开了一种促进骨质疏松特定人群骨形成的成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物及其制备方法和应用，成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物其结构式如下：
所述成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物制备方法如下：将室温条件下将2‑(4‑含苯氧基的肉桂酰)醋酸、缩合剂和催化剂溶于有机溶剂中，加入(DSS)6多肽反应，反应结束后进行分离、纯化即得。本发明骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物可有效促进特定人群的骨质疏松患者骨形成，还具有很好的成骨细胞靶向性、比较好的水溶性和安全性；在制备治疗促进骨质疏松特定人群骨形成药物方面有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种促进骨质疏松特定人群骨形成的 成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物以及制备方法和应用。
背景技术
骨质疏松症居我国常见慢性病第四位，也是中老年最常见的骨骼疾病。 目前我国60岁以上的人口约1.73亿，是世界上老年人口绝对数量最多的国 家。60岁以上的人群中骨质疏松症的患病率明显增高，女性尤为突出。从 患者角度来看，骨质疏松症大大提高了骨折的风险，及伴随而来的行动不 便和生活无法自理将大大降低患者生活质量。同时骨质疏松症所致髋部或 脊柱骨折使患者1年内死亡率增加高达20％。
到目前为止，仅有少数药物通过促骨形成治疗老年骨质疏松，但长期 使用这些药物会产生副作用。开发具促老年骨质疏松病患骨形成而副作用 较少的药物一直是现在医药领域的一个重要方向。骨形态发生蛋白-2 (BMP-2)是公认的成骨细胞转化促进因子，具有较强的促进骨形成作用。 但是临床研究发现，部分老年骨质疏松病患对重组BMP-2的治疗无明显响 应。
发明人通过对脊柱融合术后获得的老年骨质疏松病患的骨标本进行检 测，发现骨内BMP-2蛋白表达和Smurf1活性(通过Smurf1-Smad1复合体 含量显示)有所不同，根据这两种指标将病患分为两种分型，骨内BMP-2 低表达同时Smurf1活性正常，及骨内BMP-2正常表达同时Smurf1高活性。 同时，发明人发现骨内BMP-2正常表达同时Smurf1高活性的老年骨质疏松 病患对重组BMP-2治疗无明显响应。
该临床现象在老年骨质疏松动物模型中也同样存在。去势诱导的老年 骨质疏松小鼠模型会自发形成上述两种分型。骨内BMP-2正常表达同时 Smurf1高活性的老年骨质疏松小鼠对重组BMP-2治疗也无明显响应。从该 分型分选出的成骨细胞对重组BMP-2治疗也无明显响应。但重组BMP-2 联合Smurf1siRNA治疗后，该分型小鼠分选出的成骨细胞对联合治疗有明 显响应。联合治疗后，细胞中p-Smad1水平、骨钙素mRNA表达、碱性磷 酸酶的积累升高以及钙结节增多。上述数据提示，骨内BMP-2正常表达同 时Smurf1高活性病患和小鼠的成骨细胞对重组BMP-2单独治疗无明显响应 是由于骨内成骨细胞BMP-2下游的拮抗分子Smurf1活性增高，形成大量的 Smurf1-Smad1复合体，阻断BMP-Smad信号通路从而抑制成骨细胞骨形成。
六个天门冬氨酸-丝氨酸-丝氨酸多肽重复序列(DSS)6具有良好的成骨 细胞靶向作用，同时可增强先导化合物的水溶性。
CN102824647A公开了一种基于小核酸药物成骨治疗的骨靶向递送系 统及其制备方法，该发明中BMP-2是治疗老年骨质疏松的常规药物，但是 临床上有部分病患对BMP-2治疗不响应，对这部分患者不起治疗作用，因 此有必要开发一种针对这些特定人群患者治疗的药物。
目前还尚未发现将查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸与(DSS)6相偶联，生成成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物，以进行查尔酮衍生物2-(4- 含苯氧基的肉桂酰)醋酸的成骨细胞靶向递送、从而实现对特定人群骨质疏 松患者的相关报道。
发明内容
本发明人研究发现了部分病患对BMP-2不响应的分子机制，并得到药 物查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸是治疗该特定病患的骨形成能 力低下的潜在药物。同时研究发现，而查尔酮衍生物，即2-(4-含苯氧基的 肉桂酰)醋酸没有成骨细胞靶向作用，同时水溶性较差，发明人进一步将药 物靶向递送到成骨细胞中，以提高药物在骨组织内成骨细胞中的浓度，同 时改善了其水溶性并减少对非骨组织的潜在毒副作用。
本发明目的至于针对无有效治疗方案的骨质疏松特定人群患者、而提 供一种具有良好成骨细胞靶向性、水溶性和安全性的促骨形成的成骨靶向 肽修饰的查尔酮衍生物的新药物。
本发明的另一个目的在提供一种制备成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物 的方法。
本发明的再一个目的在于提供一种成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物制 备促进特定人群的骨质疏松患者的骨形成的药物中的应用。
本发明所述成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物，其结构为式(I)：
本发明中所述“查尔酮衍生物”即为2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸。
本发明还提供一种成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物的制备方法，所述 方法包括：1)将室温条件下将2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸、缩合剂和催化 剂溶于有机溶剂中，加入(DSS)6多肽反应；反应结束后进行分离、纯化即得；
所述方法反应示意图如下：
本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法步骤1)缩合剂为：2-(7- 氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、羟基苯并三唑、1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺或N,N'-二环己基碳二亚胺，或它们中的两种或 两种以上组合；
本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法步骤1)中催化剂为N,N- 二异丙基乙基胺、三乙胺或4-二甲氨基吡啶，或它们中的两种或两种以上 组合。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法步骤1)中有机溶剂为二 甲基甲酰胺、二甲亚砜或乙腈，或它们中的两种或两种以上组合。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法步骤1)中可选择地包括 活化剂，所述活化剂为N-羟基琥珀酰亚胺N-羟基硫代琥珀酰亚胺或N-羟 基琥珀酰亚胺磺酸钠盐，或它们中的两种或两种以上组合。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括2-(4-含苯氧 基的肉桂酰)醋酸的摩尔量为：1～5、最佳为2；缩合剂的摩尔量为1～10、 最佳为3；催化剂的摩尔量为：0.1～10、最佳为1；活化剂的摩尔量为1～5、 最佳为2；(DSS)6多肽的摩尔量为1。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤1)中反应结束后的分离 方法，可以采用本领域常用的方法，本发明包括但不限于：反应结束后加 入水稀释，并用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤， 无水硫酸钠或无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，即得。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤1)中对分离产物进行纯 化的方法，可以采用本领域常用的方法，作为实施方案之一，包括但不限 于：分离所得产物通过制备型色谱柱分离纯化，优选所述制备型色谱柱的 条件为：C-18反相色谱柱，0.1％TFA水溶液(A)，0.1％TFA乙腈(B)，B 的梯度20～80％，0.1％TFA乙腈的量从20％到40％，保持时间25min， 0.1％TFA乙腈的量从40％到80％，保持时间35min分离时间60min。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法包括：
在室温条件下，2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸、2-(7-氧化苯并三氮 唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和N,N-二异丙基乙基胺，并溶于二甲基 甲酰胺中，然后加(DSS)6多肽在此条件下反应；待反应完全后，加入水稀 释，并用二氯甲烷萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥， 过滤，浓缩；然后经过制备型色谱柱分离纯化得到纯品成骨靶向肽修饰的 查尔酮衍生物；
本发明方法中，作为实施方案之一，在室温条件下，查尔酮衍生物2-(4- 含苯氧基的肉桂酰)醋酸、羟基苯并三唑1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二 亚胺和三乙胺，溶于二甲基甲酰胺中，然后加入(DSS)6多肽，在此条件下 反应；待反应完全后，加入水稀释，并用二氯甲烷萃取，合并有机相，饱 和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩然后经过制备型色谱柱分离 纯化即得；
本发明方法中，作为实施方案之一，在室温条件下，查尔酮衍生物2-(4- 含苯氧基的肉桂酰)醋酸、N-羟基琥珀酰亚胺和N,N'-二环己基碳二亚胺溶于 25ml的二甲基甲酰胺中，在此条件下反应，待查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基 的肉桂酰)醋酸活化完全；然后加4-二甲氨基吡啶以及(DSS)6多肽，保持在 此条件下反应，待反应完全后，加入水稀释，并用二氯甲烷萃取，合并有 机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩；然后经过制备型色谱柱分离纯化即得。
本发明还提供一种成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物在制备抑制成骨细 胞的Smurf1-Smad1复合体形成的药物中的应用。
本发明还提供一种成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物在制备促进骨质疏 松特定人群骨形成药物中的应用，所述特定人群为骨内BMP-2正常表达同 时Smurf1高活性的骨质疏松病患，作为实施方案之一，优选中年或老年骨 质疏松病患；所述“Smurf1高活性”是指骨组织内BMP-2表达无明显变化 而Smurf1活性随时间延长而升高，Smurf1与Smad1形成大量稳定复合物。
本发明成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物是潜在的成骨细胞选择性药 物，可通过抑制成骨细胞中Smurf1-Smad1复合体形成，实现增强成骨细胞 生长及分化能力，并促特定分型小鼠骨形成，改善先导化合物的水溶性。
本发明人利用分子对接方法筛选出可特异性结合Smurf1WW活性结构 域的小分子化合物查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸。通过体内局 部治疗试验证明，查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸可特异性与 Smurf1WW结构域结合，抑制Smurf1-Smad1复合物形成，促体内局部新生 骨形成。但通过静脉全身给药后，小鼠模型中骨形成参数与溶媒组无明显 差别，骨组织中药物含量在各给药浓度组中相对一致。查尔酮衍生物2-(4- 含苯氧基的肉桂酰)醋酸的促骨形成作用随着其在骨组织中的浓度升高而具 有更好的疗效。针对成骨细胞选择性递送该药物，有利于查尔酮衍生物2-(4- 含苯氧基的肉桂酰)醋酸发挥骨形成作用。
试验证明本发明成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物可抑制BMP-2正常表 达同时Smurf1高活性分型中成骨细胞的Smurf1-Smad1复合体形成；可促 进老年骨质疏松小鼠中BMP-2正常表达而Smurf1高活性分型的骨形成；能 够进一步增强细胞的生长和分化能力，而且成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生 物在不同浓度下未对细胞造成显著的毒性作用、具有良好的骨组织靶向性； 对成骨细胞中Smurf1-Smad1复合体含量抑制作用可在24小时内维持在 50％以上。
本发明的有益效果在于，所述成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物可特异 性靶向骨内成骨细胞，抑制细胞中的Smurf1-Smad1复合体形成从而促骨内 BMP-2正常表达与Smurf1高活性分型老年骨质疏松病患骨形成方面的广阔 的应用前景。
附图说明
图1：实施例1制成的成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物纯品高效液相色 谱图和质谱图。
图2：试验例1中不同化合物对体外成骨细胞的生长和分化影响。
图3：试验例2中成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物对体外成骨细胞毒性 试验。
图4：试验例3中不同化合物的体内各主要脏器的靶向性研究。
图5：试验例4中不同化合物对体内骨组织中各功能性细胞靶向性研究。
图6：试验例5中不同化合物的量效关系和抑制Smurf1-Smad1复合物 形成持续性作用。
图7：试验例6中不同化合物对体内骨形成的作用。
图8：试验例8中造模前后动物模型中BMP-2表达及Smurf1活性的变 化。
具体实施方式
以下实施例仅用于进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明 的有效范围。
成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物的制备
实施例1
在室温条件下，于50ml圆底烧瓶中加入140mg的查尔酮衍生物2-(4- 含苯氧基的肉桂酰)醋酸、228mg的2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基 脲六氟磷酸酯和94mg的N,N-二异丙基乙基胺，并溶于25ml的二甲基甲酰 胺中，然后加入1130mg的(DSS)6多肽，这个反应体系保持在此条件下反应 12小时，薄层色谱监测。待反应完全后，加入水稀释，并用二氯甲烷萃取， 合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得粗品。将 粗品经过制备型色谱柱分离纯化得到纯品成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生 物，纯度为≥96％。所述制备型色谱柱条件为C-18反相色谱柱，0.1％TFA 水溶液(A)：0.1％TFA乙腈(B)，B的梯度20～80％，0.1％TFA乙腈的量 从20％到40％，保持时间25min，0.1％TFA乙腈的量从40％到80％，保持 时间35min，分离时间60min。所得产物经液相色谱法-质谱联用确定了成骨靶向肽修饰查尔酮衍生物的分子量，参见图1(A)-(B)。
实施例2
或在室温条件下，于50ml圆底烧瓶中加入140mg的查尔酮衍生物2-(4- 含苯氧基的肉桂酰)醋酸、74mg的羟基苯并三唑、155mg的1-乙基-(3-二甲 基氨基丙基)碳酰二亚胺和75mg的三乙胺，并溶于25ml的二甲基甲酰胺 中，然后加入1130mg的(DSS)6多肽，这个反应体系保持在此条件下反应 12小时，薄层色谱监测。待反应完全后，加入水稀释，并用二氯甲烷萃取， 合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得粗品。将 粗品经过制备型色谱柱分离纯化得到纯品成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生 物，纯度为≥96％。所述制备型色谱柱条件为C-18反相色谱柱，0.1％TFA 水溶液(A)：0.1％TFA乙腈(B)，B的梯度20～80％，0.1％TFA乙腈的量从 20％到40％，保持时间25min，0.1％TFA乙腈的量从40％到80％，保持时 间35min，分离时间60min。
实施例3
或在室温条件下，于50ml圆底烧瓶中加入140mg的查尔酮衍生物2-(4- 含苯氧基的肉桂酰)醋酸、69mg的N-羟基琥珀酰亚胺和154mg的N,N'-二 环己基碳二亚胺，并溶于25ml的二甲基甲酰胺中，这个反应体系保持在此 条件下反应，待查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸活化完全。然后 加入61mg的4-二甲氨基吡啶以及1130mg的(DSS)6多肽，保持在此条件下 反应12小时，薄层色谱监测。待反应完全后，加入水稀释，并用二氯甲烷 萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得粗 品。将粗品经过制备型色谱柱分离纯化得到纯品成骨靶向肽修饰的查尔酮 衍生物，纯度为≥96％。所述制备型色谱柱条件为C-18反相色谱柱，0.1％TFA 水溶液(A)：0.1％TFA乙腈(B)，B的梯度20～80％，0.1％TFA乙腈的量从 20％到40％，保持时间25min，0.1％TFA乙腈的量从40％到80％，保持时 间35min，分离时间60min。
试验例1
成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物促进体外成骨细胞的生长和分化。
1.1试剂及动物
试剂：小鼠骨钙素ELISA试剂盒，小鼠BMP-2ELISA试剂盒，小鼠 Smurf1ELISA试剂盒，小鼠p-Smad1ELISA试剂盒，RT-PCR试剂盒；抗 碱性磷酸酶抗体，Agorse A/G beads,抗Smad1抗体，细胞裂解液；查尔酮 衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸、非成骨靶向肽(NAA)6修饰的查尔酮衍 生物、成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物以及查尔酮衍生物与成骨靶向肽混 合物；DMSO，Trizol，重组BMP-2；碱性磷酸酶染色试剂盒，茜素红染色 试剂盒。
动物:6月龄小鼠按试验例8的方法接受去势手术后放回笼子里正常饲 养至15月龄。
1.2试验方法：
在15月龄老年骨质疏松小鼠模型中，根据试验例8的方法的血液骨钙 素相对水平分选方法，分选出骨内BMP-2正常表达同时Surmf1高活性的分 型。处死小鼠，取出胫骨和股骨，分离骨髓，通过流式分选的技术分选出 碱性磷酸酶(ALP)阳性细胞，作为成骨细胞。将该细胞以8X105个细胞/ 孔的密度铺24孔板过夜，加入不同浓度单位的查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基 的肉桂酰)醋酸、非成骨靶向肽(NAA)6修饰查尔酮衍生物、成骨靶向肽修饰 的查尔酮衍生物以及查尔酮衍生物与成骨靶向肽混合物。并设空白对照组。 孵育72小时后，裂解细胞，通过免疫共沉淀方法，沉淀出Smurf1-Smad1 复合体，用ELISA试剂盒检测其浓度。另外，该细胞以8X105个细胞/孔的 密度铺24孔板过夜，不同浓度单位的查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰) 醋酸、非成骨靶向肽(NAA)6修饰查尔酮衍生物、成骨靶向肽修饰的查尔酮 衍生物以及查尔酮衍生物与成骨靶向肽混合物，分别与100ng/ml重组 BMP-2共同处理细胞。共处理72小时后，一部分细胞用试剂盒提取总mRNA 和用免疫共沉淀方法提取Smad1蛋白，分别通过RT-PCR检测骨钙素mRNA 和通过ELISA检测p-Smad1蛋白表达水平；另一部分细胞用于碱性磷酸酶 染色检测细胞内的碱性磷酸酶表达，及用于茜素红染色检测钙结节形成。
1.3实验结果
实验结果参见图2(A)～(C)，其中(A)不同浓度单位成骨靶向肽修 饰的查尔酮衍生物、查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸、非成骨靶 向肽(NAA)6修饰查尔酮衍生物、以及查尔酮衍生物与成骨靶向肽混合物对 细胞中Smurf1-Smad1复合体形成的抑制作用(图2(A)中的Chalcone derivative：查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸,(NAA)6-derivative： 非成骨靶向肽(NAA)6修饰查尔酮衍生物,(DSS)6-derivative:成骨靶向肽(DSS)6修饰查尔酮衍生物，(DSS)6+derivative:查尔酮衍生物与成骨靶向肽 混合物)；(B)重组BMP-2与不同浓度单位各化合物联合治疗对细胞中骨 钙素mRNA和p-Smad1蛋白表达水平影响；(C)重组BMP-2与不同浓度 单位各化合物联合治疗对细胞的碱性磷酸酶积累和钙结节形成的影响。
结果显示，随着成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物的给药浓度增加，该 成骨细胞中Smurf1-Smad1复合体逐渐减少。在相同给药浓度下，成骨靶向 肽修饰的查尔酮衍生物组较其他组能更好地抑制Smurf1-Smad1复合体形 成。与重组BMP-2共同治疗下，随成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物浓度增 加，骨钙素mRNA表达和p-Smad1蛋白水平逐渐升高。同时细胞内碱性磷 酸酶的积累也随化合物浓度升高而逐渐升高，钙结节形成也具相同趋势。 在同一给药浓度下，成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物组较查尔酮衍生物 2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸、非成骨靶向肽(NAA)6修饰查尔酮衍生物以及 查尔酮衍生物与成骨靶向肽混合物组明显增强骨钙素mRNA水平和 p-Smad1蛋白表达，并增加细胞的碱性磷酸酶积累和钙结节形成。而重组 BMP-2单独治疗组与空白对照组在骨钙素mRNA表达水平和p-Smad1蛋白 表达无明显差别。即表明成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物可抑制BMP-2正 常表达同时Smurf1高活性分型中成骨细胞的Smurf1-Smad1复合体形成， 并进一步增强细胞的生长和分化能力。
试验例2成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物对体外成骨细胞毒性试验
2.1试剂及动物
试剂：小鼠骨钙素ELISA试剂盒；抗碱性磷酸酶抗体；成骨靶向肽修 饰的查尔酮衍生物；MTT溶液，DMSO。
动物：6月龄小鼠按试验例8的方法接受去势手术后放回笼子里正常饲 养至15月龄。
2.2试验方法：
在15月龄老年骨质疏松小鼠模型中，根据试验例8的血液骨钙素相对 水平分选方法，分选出骨内BMP-2正常表达同时Smurf1高活性的分型。处 死小鼠，取出胫骨和股骨，分离骨髓，通过流式分选的技术分选出碱性磷 酸酶(ALP)阳性细胞，作为成骨细胞。该成骨前体细胞以8X105个细胞/ 孔的密度铺24孔板过夜，经不同浓度单位的成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生 物分别孵育72小时后，加入MTT(5mg/ml)10ul，37℃孵育4小时后用 150ul DMSO溶液溶解紫色结晶后放置于酶标仪以570nm吸收度检测。
2.3试验结果：
试验结果参见图3结果显示，成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物在不同 浓度下未对细胞造成显著的毒性作用。
试验例3：成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物的体内各器官靶向性试验
3.1试剂及动物
试剂：小鼠骨钙素ELISA试剂盒；查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉 桂酰)醋酸、非成骨靶向肽(NAA)6修饰的查尔酮衍生物、成骨靶向肽修饰的 查尔酮衍生物以及查尔酮衍生物与成骨靶向肽混合物。
动物：6月龄小鼠按试验例8的方法接受去势手术后放回笼子里正常饲 养至15月龄
3.2试验方法：
在15月龄老年骨质疏松小鼠模型中，根据试验例8的血液骨钙素相对 水平分选方法，分选出骨内BMP-2正常表达同时Smurf1高活性的分型。随 机将小鼠均分为四组，每组通过尾静脉注射给予查尔酮衍生物2-(4-含苯氧 基的肉桂酰)醋酸、非成骨靶向肽(NAA)6修饰查尔酮衍生物、成骨靶向肽修 饰的查尔酮衍生物以及查尔酮衍生物与成骨靶向肽混合物。分别在给药4、 8和24小时后，处死小鼠，取骨及非骨器官(心脏、肝脏、脾脏、肺、肾 脏和肱四头肌)，用液相层析串联质谱仪检测组织中的各化合物的含量。
3.3试验结果
实验结果参见图4(A)-(C),其中图4(A)成骨靶向肽修饰的查尔酮 衍生物、查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸、非成骨靶向肽(NAA)6修饰查尔酮衍生物、以及查尔酮衍生物与成骨靶向肽混合物在骨组织中的 含量；图4(B)各化合物在肾脏中的含量；图4(C)各化合物在肝脏中的 含量。
结果显示，在给药4、8以及24小时后，在骨组织中成骨靶向肽修饰 的查尔酮衍生物含量较其他各组化合物含量高；在肾脏和肝脏中，成骨靶 向肽修饰的查尔酮衍生物含量较其他各组化合物含量低。在其他组织中各 化合物的含量均较少。即表明成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物较其他组具 有良好的骨组织靶向性。
试验例4成骨靶向肽修饰查尔酮衍生物的体内骨组织中各细胞靶向性 试验
4.1试剂及动物
试剂：小鼠骨钙素ELISA试剂盒；查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉 桂酰)醋酸、非成骨靶向肽(NAA)6修饰查尔酮衍生物、成骨靶向肽修饰的查 尔酮衍生物以及查尔酮衍生物与成骨靶向肽混合物；抗碱性磷酸酶抗体， 抗骨钙素抗体，抗破骨细胞关联受体抗体。
动物：6月龄小鼠接受去势手术后放回笼子里正常饲养至15月龄。
4.2试验方法：
在15月龄老年骨质疏松小鼠模型中，根据试验例8的血液骨钙素相对 水平分选方法，分选出骨内BMP-2正常表达同时Smurf1高活性的分型。随 机将小鼠均分为四组，每组通过尾静脉注射给予查尔酮衍生物2-(4-含苯氧 基的肉桂酰)醋酸、非成骨靶向肽(NAA)6修饰查尔酮衍生物、成骨靶向肽修 饰的查尔酮衍生物以及查尔酮衍生物与成骨靶向肽混合物。分别在给药后， 处死小鼠，取骨组织，通过流式分选的技术分选出碱性磷酸酶(ALP)阳性 细胞、碱性磷酸酶(ALP)阴性细胞、骨钙素(Osteocalcin)阳性细胞、骨 钙素(Osteocalcin)阴性细胞以及破骨细胞关联受体(OSCAR)阳性细胞， 然后用液相层析串联质谱仪检测细胞中的各化合物的含量。
4.3实验结果
实验结果参见图5(A)-(B),其中图5(A)不同化合物在碱性磷酸酶 (ALP)阳性、碱性磷酸酶(ALP)阴性和破骨细胞关联受体(OSCAR) 阳性细胞中的含量；图5(B)不同化合物在骨钙素(Osteocalcin)阳性、 骨钙素(Osteocalcin)阴性和破骨细胞关联受体(OSCAR)阳性细胞中的 含量。
结果显示，在给药后，在碱性磷酸酶(ALP)阳性细胞中成骨靶向肽修 饰的查尔酮衍生物含量较其他各组化合物含量高，而碱性磷酸酶(ALP)阴 性细胞以及破骨细胞关联受体(OSCAR)阳性细胞中各化合物含量无明显 差别。在骨钙素(Osteocalcin)阳性细胞中成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物 含量较其他各组化合物含量高，而骨钙素(Osteocalcin)阴性细胞以及破骨 细胞关联受体(OSCAR)阳性细胞中各化合物含量无明显差异。即表明成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物较其他化合物具有良好的成骨细胞靶向性。
试验例5成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物量效关系和抑制 Smurf1-Smad1复合体形成持续性研究
5.1试剂及动物
试剂：小鼠骨钙素ELISA试剂盒，小鼠Smurf1ELISA试剂盒，小鼠 p-Smad1ELISA试剂盒；查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸、非 成骨靶向肽(NAA)6修饰查尔酮衍生物、成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物以 及查尔酮衍生物与成骨靶向肽混合物；抗骨钙素抗体，抗Smad1抗体， Agorse A/G beads；Trizol和RT-PCR试剂盒。
动物：6月龄小鼠接按试验例8的方法受去势手术后放回笼子里正常 饲养至15月龄。
5.2试验方法：
(1)量效关系：在15月龄老年骨质疏松小鼠模型中，根据试验例8 的血液骨钙素相对水平分选方法，分选出骨内BMP-2正常表达同时Smurf1 高活性的分型。试验设计为四组：查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋 酸、非成骨靶向肽(NAA)6修饰查尔酮衍生物、成骨靶向肽修饰的查尔酮衍 生物以及查尔酮衍生物与成骨靶向肽混合物。每组注射的化合物剂量为0、 2.5、5.0、10.0、15.0和20.0umol/kg。分别在给药后，处死小鼠，取骨组织， 通过流式分选的技术分选出骨钙素(Osteocalcin)阳性细胞，然后通过免疫 共沉淀方法，并通过ELISA试剂盒，检测Smurf1-Smad1复合体浓度。(2) 抑制Smurf1-Smad1复合体形成持续性研究：在15月龄老年骨质疏松小鼠 模型中，根据前期建立的血液骨钙素相对水平分选方法，分选出骨内BMP-2 正常表达同时Smurf1高活性的分型。试验设计为四组：查尔酮衍生物2-(4- 含苯氧基的肉桂酰)醋酸、非成骨靶向肽(NAA)6修饰查尔酮衍生物、成骨靶 向肽修饰的查尔酮衍生物以及查尔酮衍生物与成骨靶向肽混合物。每组注 射的化合物为10.0umol/kg。在给药后0、4、8、16、24、48、72和96小 时，处死小鼠，取骨组织，通过流式分选的技术分选出骨钙素(Osteocalcin) 阳性细胞，一部分细胞通过免疫共沉淀方法，并通过ELISA试剂盒，检测 Smurf1-Smad1复合体浓度和p-Smad1蛋白表达水平；另一部分细胞用于提 取总mRNA，通过RT-PCR检测骨钙素mRNA。
5.3试验结果
试验结果参见图6(A)-(B)，其中图6(A)不同化合物在药物浓度 不同情况下对骨钙素(Osteocalcin)阳性细胞中Smurf1-Smad1复合物形成 影响；图6(B)不同化合物在药物浓度相同情况下对骨钙素(Osteocalcin) 阳性细胞中Smurf1-Smad1复合物形成、p-Smad1蛋白和骨钙素mRNA表达 水平的影响。
结果显示，在量效关系研究中，成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物在各 浓度下，与其他三组相比，其对成骨细胞中Smurf1-Smad1复合体形成的抑 制作用有显著差异。成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物在查尔酮衍生物浓度 在10.0umol/kg时，对成骨细胞中Smurf1-Smad1复合体形成的抑制率达50％ 以上。在抑制Smurf1-Smad1复合体形成持续性研究中，成骨靶向肽修饰的 查尔酮衍生物在给药4、8、16、24、48、72和96小时后检测成骨细胞中 的Smurf1-Smad1复合体含量、骨钙素mRNA表达水平和p-Smad1蛋白表 达水平，与其他三组相同时间点下相比有显著差异。同时，成骨靶向肽修 饰的查尔酮衍生物组对成骨细胞中Smurf1-Smad1复合体含量抑制作用可在 24小时内维持在50％以上。
试验例6成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物促进体内骨形成
6.1试剂及动物
试剂：小鼠骨钙素ELISA试剂盒，小鼠Smurf1ELISA试剂盒，小鼠 p-Smad1ELISA试剂盒；查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸、非 成骨靶向肽(NAA)6修饰查尔酮衍生物、成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物以 及查尔酮衍生物与成骨靶向肽混合物；抗骨钙素抗体，抗Smad1抗体， Agorse A/G beads；Trizol和RT-PCR试剂盒；二甲酚橙和钙黄绿素溶液。
动物：6月龄小鼠按试验例8的方法接受去势手术后放回笼子里正常 饲养至15月龄。
6.2试验方法：
在15月龄老年骨质疏松小鼠模型中，根据试验例8的血液骨钙素相对 水平分选方法，分选出骨内BMP-2正常表达同时Smurf1高活性的分型。试 验设计为六组，分别为模型组、溶媒对照组、查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基 的肉桂酰)醋酸组、非成骨靶向肽(NAA)6修饰查尔酮衍生物组、成骨靶向肽 修饰的查尔酮衍生物组以及查尔酮衍生物与成骨靶向肽混合物组。每组注 射的化合物剂量为10umol/kg，按照组别分别静脉重复给药(每周给药两次， 共十六次)。在给药第8周后，处死老鼠，对小鼠胫骨近端进行microCT 扫描。在处死小鼠第10及第2天前,腹腔注射二甲酚橙(30mg/kg)和钙黄 绿素(10mg/kg)。处死小鼠后,取小鼠左右胫骨，分别用于骨组织形态计量 学参数分析和骨生物力学性质检测。另外，取小鼠股骨，通过流式分选的 技术分选出骨钙素(Osteocalcin)阳性细胞，一部分细胞通过免疫共沉淀方 法，并通过ELISA试剂盒，检测Smurf1-Smad1复合体浓度和p-Smad1蛋 白表达水平；另一部分细胞用于提取总mRNA，通过RT-PCR检测骨钙素 mRNA。
6.3实验结果
实验结果参见图7(A)-(E)图7(A)各组化合物治疗后骨密度(BMD) 和骨体积分数(BV/TV)结果分析图；图7(B)各组的显微CT典型图； 图7(C)各组化合物治疗后骨小梁矿化率(MAR)与骨形成率(BFS/BS) 结果分析图；图7(D)各组双荧光标记典型图；图7(E)各组化合物治疗 后Smurf1-Smad1复合体形成、p-Smad1蛋白表达水平和骨钙素mRNA表达 水平的影响。
在治疗第8周后，microCT扫描成像结果显示，成骨靶向肽修饰的查 尔酮衍生物组的骨密度(BMD)和骨体积分数(BV/TV)与查尔酮衍生物 2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸组、非成骨靶向肽(NAA)6修饰查尔酮衍生物组 及成骨靶向肽和查尔酮衍生物混合物组，以及模型组相比均有明显差异。 查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸组、非成骨靶向肽(NAA)6修饰查 尔酮衍生物组、成骨靶向肽和查尔酮衍生物混合物组、模型组与溶媒组间相比两参数无明显差异。从microCT治疗前后的典型图中显示成骨靶向肽 修饰的查尔酮衍生物组具有更好组织显微结构，具有较其他组更密集的骨 小梁结构。成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物组的骨小梁矿化率(MAR)与 骨形成率(BFR/BS)较其他组均有显著性差异。查尔酮衍生物2-(4-含苯氧 基的肉桂酰)醋酸组、非成骨靶向肽(NAA)6修饰查尔酮衍生物组、成骨靶向 肽和查尔酮衍生物混合物组、模型组与溶媒组间相比两参数无明显差异。 在硬组织切片标本中双荧光标记观察显示，成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生 物组中两荧光线中间的距离较其他组宽，而面积比其他组大，说明骨表面 形成的活跃程度高。上述结果即说明成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物组可 促进老年骨质疏松小鼠中BMP-2正常表达而Smurf1高活性分型的骨形成。
试验例7成骨靶向肽修饰查尔酮衍生物体内毒性试验
7.1试剂及试验动物
试剂：小鼠骨钙素ELISA试剂盒；成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物。
动物：6月龄小鼠按试验例8的方法接受去势手术后放回笼子里正常饲 养至15月龄。
7.2试验方法：
(1)单次注射成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物对各生化和血液学指标 的影响:在15月龄老年骨质疏松小鼠模型中，根据试验例8的血液骨钙素相 对水平分选方法，分选出骨内BMP-2正常表达同时Smurf1高活性的分型。 随机分成七组,分别通过尾静脉注射的方式给予成骨靶向肽修饰的查尔酮衍 生物为0、2.5、5.0、10.0、15.0和20.0umol/kg和溶媒。72小时后检测 各生化和血液学指标。(2)重复注射成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物对各生化和血液学指标的影响：6月龄小鼠接受去势手术后放回笼子里正常饲养 至15月龄。然后在15月龄老年骨质疏松小鼠模型中，根据前期建立的血 液骨钙素相对水平分选方法，分选出骨内BMP-2正常表达同时Smurf1高活 性的分型。随机分成两组，分别尾静脉重复注射成骨靶向肽修饰查尔酮衍 生物(每周给药两次，共十六次)和溶媒。
7.3试验结果
试验结果参见表1。结果显示，成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物经各给 药浓度单次给药组和多次注射给药组与溶媒组在各生化和血液学指标相比 无明显差异。这说明成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物对体内无显著的毒性 作用。
表1成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物体内毒性试验结果
ALT：alanine transaminase；AST：aspartate transaminase；BUN：blood ureanitrogen；WBC：white blood cell；HGB：haemoglobin；RBC：red blood cell；HCT：hematocrit；PLT：platelets.
试验例8血液骨钙素相对水平分选方法
血浆骨钙素是反应骨形成的标记物，血浆骨钙素含量高，骨形成率高， 反之亦然。
将6月龄小鼠进行去势手术后放回笼子里正常饲养至8月龄或15月龄 后，分别检测小鼠的血浆骨钙素含量。在8月和15月龄骨质疏松小鼠模型 中，均发现血浆骨钙素含量在同一月龄模型小鼠间有差异。其中，同月龄 中一部分模型小鼠的血浆骨钙素的含量相对较高，另一部分相对较低(图 8A)。因此、将同月龄模型组小鼠，根据相对血浆骨钙素含量，分成相对高 血浆骨钙素表达小鼠以及相对低血浆骨钙素表达小鼠，并检测小鼠骨组织 中BMP-2以及Smurf1活性(Smurf1-Smad1复合物含量)。
结果显示，相对高血浆骨钙素模型组中，骨组织内BMP-2表达在造模 前后无明显变化而Smurf1活性随造模时间延长而升高(图8B)；而相对低 血浆骨钙素模型组中，骨组织内BMP-2表达随造模时间延长而降低，但 Smurf1活性在造模前后无明显变化(图8C)。
根据血浆骨钙素相对含量将去势诱导小鼠分成：BMP-2表达正常而 Smurf1高活性分型(相对高血浆骨钙素)和BMP-2低表达而Smurf1正常 活性分型(相对低血浆骨钙素)。
Claims (18)
1.一种成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物，其特征在于，所述成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物的结构为式(I)：
2.权利要求1所述成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物的制备方法，其特征在于，所述方法包括：步骤1)将室温条件下将2-(4-肉桂酰苯氧基)乙酸、缩合剂和催化剂溶于有机溶剂中，加入(DSS)6多肽反应，反应结束后进行分离、纯化即得。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法步骤1)缩合剂为：2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、羟基苯并三唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺或N,N'-二环己基碳二亚胺，或它们中的两种或两种以上组合。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法步骤1)中催化剂为N,N-二异丙基乙基胺、三乙胺、或4-二甲氨基吡啶，或它们中的两种或两种以上组合。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法步骤1)中有机溶剂为二甲基甲酰胺、二甲亚砜或乙腈，或它们中两种或两种以上组合。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法步骤1)中可选择地包括活化剂，所述活化剂为N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、或N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐，或它们中的两种或两种以上组合。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括2-(4-肉桂酰苯氧基)乙酸的摩尔量为：1～5；缩合剂的摩尔量为1～10；催化剂的摩尔量为：0.1～10；活化剂的摩尔量为1～5；(DSS)6多肽的摩尔量为1。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括2-(4-肉桂酰苯氧基)乙酸的摩尔量为2。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括缩合剂的摩尔量为3。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括催化剂的摩尔量为1。
11.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括活化剂的摩尔量为2。
12.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中分离进一步包括：反应结束后加入水稀释，并用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠或无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩即得。
13.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中纯化进一步包括：分离所得产物通过制备型色谱柱分离纯化。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述制备型色谱柱的条件为：C-18反相色谱柱，A液0.1％TFA水溶液：B液0.1％TFA乙腈，B的梯度20～80％，分离时间60min。
15.根据权利要求2～14任一所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
在室温条件下，2-(4-肉桂酰苯氧基)乙酸、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和N,N-二异丙基乙基胺，并溶于二甲基甲酰胺中，然后加(DSS)6多肽在此条件下反应；待反应完全后，加入水稀释，并用二氯甲烷萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩；然后经过制备型色谱柱分离纯化得到纯品成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物；或
在室温条件下，查尔酮衍生物2-(4-肉桂酰苯氧基)乙酸、羟基苯并三唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和三乙胺，溶于二甲基甲酰胺中，然后加入(DSS)6多肽，在此条件下反应；待反应完全后，加入水稀释，并用二氯甲烷萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩；然后经制备型色谱柱分离纯化即得；或
在室温条件下，查尔酮衍生物2-(4-肉桂酰苯氧基)乙酸、N-羟基琥珀酰亚胺和N,N'-二环己基碳二亚胺溶于25ml的二甲基甲酰胺中，在此条件下反应，待查尔酮衍生物2-(4-肉桂酰苯氧基)乙酸活化完全；然后加4-二甲氨基吡啶以及(DSS)6多肽，保持在此条件下反应，待反应完全后，加入水稀释，并用二氯甲烷萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩；然后经过制备型色谱柱分离纯化即得。
16.权利要求1所述的成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物在制备抑制成骨细胞的Smurf1-Smad1复合体形成的药物中的应用。
17.权利要求1所述的成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物在制备促进骨质疏松特定人群骨形成药物中的应用，所述特定人群为骨内BMP-2正常表达同时Smurf1高活性的骨质疏松病患。
18.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述特定人群为骨内BMP-2正常表达同时Smurf1高活性的中年或老年骨质疏松病患。
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