CN110664792B - 一种用于脊柱融合复合的组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于脊柱融合复合的组合物及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110664792B
CN110664792B CN201810715806.7A CN201810715806A CN110664792B CN 110664792 B CN110664792 B CN 110664792B CN 201810715806 A CN201810715806 A CN 201810715806A CN 110664792 B CN110664792 B CN 110664792B
Authority
CN
China
Prior art keywords
component
phenoxy
acetic acid
smurf1
composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810715806.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110664792A (zh
Inventor
刘振丽
张保亭
梁超
党蕾
吕诚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Heli Consulting Co ltd
Original Assignee
Beijing Heli Consulting Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Heli Consulting Co ltd filed Critical Beijing Heli Consulting Co ltd
Priority to CN201810715806.7A priority Critical patent/CN110664792B/zh
Publication of CN110664792A publication Critical patent/CN110664792A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110664792B publication Critical patent/CN110664792B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/192—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having aromatic groups, e.g. sulindac, 2-aryl-propionic acids, ethacrynic acid 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
    • A61K31/047—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates having two or more hydroxy groups, e.g. sorbitol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A61K31/366—Lactones having six-membered rings, e.g. delta-lactones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/06—Aluminium, calcium or magnesium; Compounds thereof, e.g. clay
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/06—Aluminium, calcium or magnesium; Compounds thereof, e.g. clay
    • A61K33/10—Carbonates; Bicarbonates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/14—Alkali metal chlorides; Alkaline earth metal chlorides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/42—Phosphorus; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及医药领域，具体提供了一种2‑(4‑含苯氧基的肉桂酰)醋酸在制备促进BMP‑2正常表达同时Smurf1高活性的骨质疏松病患脊柱融合药物中的新用途及含有2‑(4‑含苯氧基的肉桂酰)醋酸的组合物和制备方法。本发明2‑(4‑含苯氧基的肉桂酰)醋酸及其组合物可有效促进特定人群脊柱融合,并具有良好的生物相容性和安全性，使用简便。

Description

一种用于脊柱融合复合的组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药生物领域。具体涉及一种2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸制备促进特定人群脊柱融合复合药物中的应用及其药物组合物和制备方法。
背景技术
据统计，1996～2001年美国脊柱融合人数增加了77％，髋关节、膝关节替代人数同期增加了13％～14％，融合手术费用昂贵，不包括医生手术费用，全美医院平均每人年费用不少于34,000美元。融合术应用增加最多的是因为椎管狭窄而实施椎板切除术的老年患者。在融合手术后，常用抗骨质疏松药物来调节骨重建从而促进脊柱融合。其中，骨形态发生蛋白-2(BMP-2) 是临床常使用的促脊柱融合药物，同时大量动物实验已证实其促脊柱融合作用。
临床研究发现，椎管狭窄的老年骨质疏松患者与成人腰椎椎间盘突出患者相比，其骨内的BMP-2蛋白表达水平和Smurf1高活性有所不同。可根据这两指标将老年骨质疏松患者，分为骨内BMP-2低表达同时Smurf1活性正常，和骨内BMP-2正常表达同时Smurf1高活性两型。两分型患者经腰椎减压融合术后，分别使用可吸收胶原蛋白骨水泥与重组BMP-2混合制成组合物进行治疗。但重组BMP-2组合物对骨内BMP-2正常表达同时Smurf1 高活性分型老年骨质疏松病患的脊柱融合无明显促进作用。
在动物试验中，去势诱导的老年骨质疏松小鼠也自发形成上述两种分型，一种是骨内BMP-2正常表达同时Smurf1高活性，另一种是骨内BMP-2 低表达同时Smurf1活性正常。随着模型小鼠的年龄增长，两分型的骨内 p-Smad1蛋白表达及血液中骨钙素水平会随之下降。而骨内BMP-2低表达同时Smurf1活性正常分型中，血液骨钙素水平下降较骨内BMP-2正常表达同时Smurf1高活性分型更显著。
因此，血液中骨钙素相对水平可作为生物标记物，用于区分这两分型。为验证这一假设，将去势诱导的老年骨质疏松小鼠，按其血液骨钙素相对高低分为两组。分别对两组小鼠骨内BMP-2、p-Smad1表达和Smurf1-Smad1 复合物含量(反应Smurf1活性指标)进行检测。结果显示，来自血液骨钙素含量较高组的小鼠，骨内BMP-2低表达、p-Smad1低表达和Smurf1-Smad1 复合物正常表达；而来自血液骨钙素含量较低组的小鼠，其骨内BMP-2正常表达、p-Smad1高表达和Smurf1-Smad1高表达。从上述结果，血液骨钙素相对水平可作为生物标记物用于区分这两分型。
根据血液骨钙素相对水平，将去势诱导的老年骨质疏松小鼠进行分型。分别对两分型小鼠进行横突后侧腰椎融合术。在手术局部L4-L6腰椎处使用重组BMP-2组合物治疗。结果显示，骨内BMP-2正常表达同时Smurf1 高活性的小鼠分型具与临床同分型患者相似的特点，对重组BMP-2治疗无明显响应。
为了阐明骨内BMP-2正常同时Smurf1高活性患者及小鼠对重组 BMP-2单独治疗无响应的分子机制，从两分型老年骨质疏松小鼠的股骨和胫骨中分离骨髓，通过流式分选技术，分选出碱性磷酸酶(ALP)阳性细胞，即为成骨细胞。从骨内BMP-2低表达同时Smurf1活性正常小鼠分选出的细胞对重组BMP-2单独治疗有响应。在治疗后，细胞中p-Smad1水平、骨钙素mRNA表达、细胞的碱性磷酸酶的积累升高及钙结节形成增多。但骨内 BMP-2正常表达同时Smurf1高活性小鼠中分选出的细胞对重组BMP-2单独治疗无明显响应。但重组BMP-2联合Smurf1siRNA治疗后，该成骨细胞对重组BMP-2治疗恢复响应。联合治疗后，细胞中p-Smad1水平、骨钙素 mRNA表达、细胞的碱性磷酸酶的积累升高以及钙结节增多。
从上述数据表明，骨内BMP-2正常表达同时Smurf1高活性病患和小鼠的成骨细胞对重组BMP-2单独治疗无响应的原因为由于骨内BMP-2下游的拮抗分子Smurf1活性增高，形成大量的Smurf1-Smad1复合体，阻断 BMP-Smad信号通路从而抑制成骨细胞骨形成。
若能抑制骨内成骨细胞中的Smurf1活性，逆转Smurf1-Smad1复合体形成，可能会促骨内BMP-2正常表达同时Smurf1高活性病患与小鼠的骨形成及脊柱融合。
因此，针对特定人群的中年或老年骨质疏松患者，开发出能够抑制骨内成骨细胞中的Smurf1活性复合体形成而实现促骨内BMP-2正常表达同时 Smurf1高活性分型的患者人群的脊柱融合的药物十分迫切。
发明内容
针对以上技术情况，本发明提供了一种2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸(又称为“查尔酮衍生物”)在制备抑制骨内成骨细胞中Smurf1-Smad1复合体形成的药物中的应用。
作为实施方案之一，本发明提供了一种2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸在制备促进特定人群患者脊柱融合的药物中的应用，其中所述特定人群患者是骨内BMP-2正常表达同时Smurf1高活性的骨质疏松病患；作为实施方案之一，优选为中年或老年骨质疏松患者。
本发明所述“Smurf1高活性”是指骨组织内BMP-2表达无明显变化而 Smurf1活性随造模时间延长而升高，Smurf1能与Smad1形成稳定复合物。
本发明所述查尔酮衍生物、即为2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸，其为已知化合物，
英文名字：2-(4-cinnamoylphenoxy)acetic acid(2-(4-含苯氧基的肉桂酰) 醋酸)
分子式：C17H14O4
分子量：282.295
化学结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
本领域技术人员可以通过市购或根据现有技术文献中记载的方法制备获得该化合物。
本发明2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸可特异性结合到Smurf1WW结构域，并具有抑制骨内成骨细胞中Smurf1-Smad1复合体形成，从而实现在制备促进骨内BMP-2正常表达同时Smurf1高活性的骨质疏松患者的脊柱融合的药物中的新应用。
Smurf1有一个HECT结构域、一个C2结构域和两个WW结构域(WW1 和WW2)。Smurf1中两个WW结构域可与Smad通路蛋白结合，其中Smurf1 会与Smad1形成活性复合体Smurf1-Smad1，从而促进Smad1/5/8蛋白酶解，实现抑制Smad信号通路和骨形成。
发明人通过试验从小分子库中筛选出了能特异性与Smurf1的WW结构域结合的查尔酮衍生物、即2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸，通过体外体内试验验证与Smurf1的WW结构域亲和性、对特定成骨细胞生长及分化作用和对特定分型骨质疏松小鼠的脊柱融合作用。
为实现将药物经注射送达体内特定部位，使之固化形成凝胶并释放出药物和在局部发挥药物治疗作用，本发明还提供一种含有2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸的组合物，以将该药物与生物相容性和安全性良好的载体混合制备成组合物后再进行使用。
本发明通过对查尔酮衍生物、即2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸特异性结合到Smurf1WW结构域，并抑制骨内成骨细胞中Smurf1-Smad1复合体形成，促骨内BMP-2正常同时Smurf1高活性的骨质疏松患者的骨脊柱融合进行相关的机理和药理研究。
体外药效实验显示，其中本发明查尔酮衍生物、即2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸能明显抑制来自BMP-2正常表达同时Smurf1高活性的老年骨质疏松小鼠成骨细胞中的Smurf1-Smad1复合体形成。其抑制Smurf1-Smad1 复合体形成作用较文献报道的Smurf1WW1结构域抑制剂A01更显著；同时，在与重组BMP-2共同治疗下，能明显增加细胞内骨钙素mRNA表达，且较A01作用强。以查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸进行体外亲和性实验，其与细胞内的Smurf1具有特异性结合，同时对Smurf1WW结构域有较高的选择性。以查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸进行体外药效实验，明显抑制来自BMP-2正常表达同时Smurf1高活性的老年骨质疏松小鼠分型中成骨细胞的Smurf1-Smad1复合体形成；在与重组BMP-2 联合治疗下，细胞内的p-Smad1蛋白及骨钙素mRNA表达水平也随给药浓度增加而增加，细胞内碱性磷酸酶的积累与钙结节形成也随给药浓度增加而增多。以查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸进行体内实验，对 BMP-2正常表达同时Smurf1高活性的老年骨质疏松小鼠分型进行脊柱融合术，在手术局部L4-L6腰椎使用生物相容性和安全性良好的载体与查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸制成的组合物治疗。治疗后，手术局部 L4-L6腰椎有大量新生骨形成和出现良好的脊柱融合。
本发明还提供了一种含有2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸的组合物，所述组合物由A组分和B组分组成，其中，
A组分(以10毫升溶液计)含有：
查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸 100～1000mg
海藻酸钠 100～400mg
B组分为每份(以10g计)中含有：
Figure BDA0001717423520000051
作为实施方案之一，所述含有2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸组合物中，
A组分(以10毫升溶液计)中含有：
查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸 500～1000mg
海藻酸钠 200～400mg
B组分为每份(以10g计算)中含有：
Figure BDA0001717423520000052
本发明中，作为实施方案之一，所述组合物中A组分每份的量为 200～1400mg，B组分每份的量为10g；优选为A组分每份的量为 700～1400mg，B组分每份的量为10g。
作为是理性的说明，所述A组分中(以10毫升水溶液计)查尔酮衍生物的量可以为、例如100、200、300、400、500、550、600、650、700、750、 800、850、900、950或1000mg，以及上述范围中任意自然数的量。
所述在A组分中(以10毫升水溶液计)海藻酸钠的量可以为、例如100、 150、200、250、300、350或400mg，以及上述范围中任意自然数的量；
本发明中，作为实施方案之一，所述B组分中(以10g计)水难溶性钙化合物的量作为示例性的说明可以为600、700、800、900、1000、1100、 1200、1300、1400或1500mg，以及上述范围中任意自然数的量；
所述所述B组分中(以10g计)葡萄糖酸内酯的量作为示例性的说明可以为500、600、700、800、900、1000mg，以及上述范围中任意自然数的量；
所述B组分中(以10g计)聚乙烯吡咯烷酮K90的量2000、2100、2200、 2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900或3000mg，以及上述范围中任意自然数的量。
本发明中，作为实施方案之一，所述水难溶性钙化合物为氯化钙、碳酸钙、硫酸钙或羟基磷灰石。
本发明还提供一种含有上述组合物的制剂，所述制剂包括但不限于冻干制剂，本领域技术人员可以根据本领域常规方法制备本发明组合物及含有该组合物的制剂。
作为实施方案之一，本发明所述方法包括但不限于以下步骤：
将海藻酸钠溶于l水中，查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸溶于适量乙醇中，混合两溶液然后冻干，即得A组分；
将水难溶性钙化合物和葡萄糖酸内酯混合，再加入余量甘露醇，混合均匀；再在混合物中加入聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液，润湿，调制成软膏，挤压过20目筛成颗粒状，80℃烘干，过40目筛整粒，即得B组分；
作为实施方案之一，所述聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液浓度为2～6g/100mL。
钴60照射对A组分和B组分灭菌后，将两组分分装成产品，即得。在使用本发明组合物的冻干制剂时，将冻干的A组分每份用10ml无菌生理盐水溶解，吸入注射器中待用，根据治疗需要取B组分，并按1mg用1ul无菌生理盐水润湿，然后将注射器中A组分加入B组分中，均匀混合成混悬液，经注射器注入病灶部位。经过一定时间后病灶部位形成凝胶。
用查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸治疗时，其与生物相容性和安全性良好的载体混合制成局部治疗组合物。
查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸剂量随患者的病情、给药途径、患者的年龄和体重而改变。剂量通常为成人0.1～20mg/kg/天，优选为 0.2～10mg/kg/天。
在药物的安全性方面，在小鼠体外毒性实验结果发现，查尔酮衍生物 2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸对小鼠成骨细胞无明显毒性。在小鼠体内毒性实验结果发现，查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸对小鼠无明显毒性。
本发明2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸促进BMP-2正常表达同时Smurf1 高活性的老年骨质疏松小鼠和患者的脊柱融合。
本发明2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸及其组合物和制剂相对于BMP-2 治疗不响应、没有治疗效果患者，通过用Smurf1抑制剂2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸，阻断Smurf1-Smad1复合体形成是可用于解决这些BMP-2正常表达而Smurf1高活性的病患骨形成低下的问题。该发明是首次发现的一个新颖机制及相应制备制药的新应用，解决了现有药物无法治疗给患者所带来的痛苦。
附图说明
图1试验例1中查尔酮衍生物对成骨细胞中Smurf1-Smad1复合体形成及骨钙素mRNA表达水平的影响。
图2试验例2中查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸与Smurf1 蛋白及Smurf1WW结构域亲和性。(A)查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸与成骨细胞中Smurf1蛋白的亲和性；(B)阴性对照白藜芦醇与成骨细胞中Smurf1蛋白的亲和性；(C)查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸对Smurf1WW各突变结构域的亲和性。
图3试验例3中查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸对成骨细胞的生长和分化影响。(A)不同浓度单位查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸对细胞中Smurf1活性(以Smurf1-Smad1复合物形成量进行判定) 的影响；(B)联合重组BMP-2治疗下各不同浓度单位查尔酮衍生物2-(4- 含苯氧基的肉桂酰)醋酸对细胞中骨钙素mRNA表达的影响；(C)联合重组 BMP-2治疗下各不同浓度单位查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸对细胞中p-Smad1蛋白表达的影响；(D)联合重组BMP-2治疗下各不同浓度单位查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸对细胞中碱性磷酸酶的积累和钙结节形成的影响。
图4试验例4中查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸对体外成骨细胞毒性试验。
图5试验例6查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸局部治疗对融合术后BMP-2正常表达同时Smurf1高活性分型老年骨质疏松小鼠体内骨形成和脊柱融合影响。(A)查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸治疗组的脊柱融合发生率；(B)查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸治疗组对成骨细胞中Smurf1活性(以Smurf1-Smad1复合物形成量进行判定)的影响；(C)8周治疗后各组脊柱融合手术部位的X射线检测结果；(D)8 周治疗后各组脊柱融合手术部位骨密度(BMD)和骨体积分数(BV/TV) 结果分析图；(E)8周治疗后各组脊柱融合手术部位的microCT扫描结果； (F)8周治疗后各组脊柱融合手术部位四环素双荧光标记典型图；(G)8 周治疗后各组脊柱融合手术部位骨小梁矿化率(MAR)与骨形成率 (BFR/BS)结果分析图。
图6试验例7中血液骨钙素相对水平分选方法中血浆骨钙素变化图。
具体实施方式
以下实施例用于进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明的有效范围。
实施例1
将200mg海藻酸钠溶于10ml水中，配置成浓度为2％的海藻酸钠水溶液，另用2ml乙醇溶解100mg查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸，混合两溶液后冻干，即得A组分；
0.68g氯化钙，0.68g葡萄糖酸内酯，加入6.54g甘露醇，混合均匀，再加入35ml浓度为6g/100mL的聚乙烯吡咯烷酮K90乙醇溶液，润湿后，混合均匀后制成软膏，挤压过20目筛成颗粒状，80℃烘干，过40目筛整粒，此为B组分；
用60Co照射A组分和B组分，进行灭菌；灭菌后将A组分和B组分分装成产品。
实施例2
将300mg海藻酸钠溶于10ml水中，配置成浓度为3％的海藻酸钠水溶液，另用20ml乙醇溶解1000mg查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸，混合两溶液并冻干，此为A组分；
1.48g硫酸钙，0.98g葡萄糖酸内酯，加入5.04g甘露醇，混合均匀，再加入50ml浓度为5g/100mL的聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液，润湿后，混合均匀后制成软膏，挤压过20目筛成颗粒状，80℃烘干，过40目筛整粒，此为B组分；
用60Co照射A组分和B组分，进行灭菌；灭菌后将A组分和B组分分装成产品。
实施例3
将400mg海藻酸钠溶于10ml水中，配置成浓度为4％的海藻酸钠水溶液，另用20ml乙醇溶解1000mg查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸，混合两溶液并冻干，此为A组分；
1.25g碳酸钙，0.55g葡萄糖酸内酯，加入5.8g甘露醇，混合均匀，再加入40ml浓度为6g/100mL的聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液，润湿后，混合均匀后制成软膏，挤压过20目筛成颗粒状，80℃烘干，过40目筛整粒，此为B组分；
用60Co照射A组分和B组分，进行灭菌；灭菌后将A组分和B组分分装成产品。
试验例1、小分子化合物查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸的筛选
1.1试剂及动物
试剂：小鼠骨钙素ELISA试剂盒，小鼠BMP-2ELISA试剂盒，小鼠 Smurf1ELISA试剂盒，RT-PCR试剂盒；抗碱性磷酸酶抗体，Agorse A/G beads,抗Smad1抗体，细胞裂解液,DMSO，Trizol，重组BMP-2蛋白；各候选小分子(参见表1)和Smurf1抑制剂A01。
动物：6月龄小鼠接受去势手术后放回笼子里正常饲养至15月龄。
1.2试验方法
按试验例7方法，在15月龄老年骨质疏松小鼠模型中，根据血液中骨钙素相对水平，分选出骨内BMP-2正常表达同时Smurf1高活性的分型。处死小鼠，取出胫骨和股骨，分离骨髓，通过流式分选的技术，分选出碱性磷酸酶(ALP)阳性细胞。该碱性磷酸酶(ALP)阳性细胞作为成骨细胞的细胞模型。该细胞以8X105个细胞/孔的密度铺24孔板过夜。分子对接方法筛选出的各候选小分子和Smurf1抑制剂A01分别以单位浓度5.0uM孵育 72小时。孵育后裂解细胞，通过免疫共沉淀方法，沉淀细胞中Smurf1-Smad1 复合体，用ELISA试剂盒检测其浓度。另外，该细胞以8X105个细胞/孔的密度铺24孔板过夜，上述各候选小分子化合物和Smurf1抑制剂A01分别以单位浓度5.0uM与100ng/ml重组BMP-2共同处理细胞。处理72小时后，裂解细胞，提取总mRNA，通过RT-PCR检测骨钙素mRNA水平。
实验结果
实验结果如图1(A)-(B)所示，其中图1(A)分子对接方法筛选出候选分子分别对细胞中Smurf1-Smad1复合体形成的影响；图1(B)在重组BMP-2联合治疗下候选分子对细胞中骨钙素mRNA表达水平的影响。
表1
Figure BDA0001717423520000101
Figure BDA0001717423520000111
结果显示，在候选小分子化合物中，第9号化合物(查尔酮衍生物2-(4- 含苯氧基的肉桂酰)醋酸)在5.0uM终浓度时，明显抑制细胞中Smurf1-Smad1 复合体形成，其对Smurf1活性抑制作用强于Smurf1抑制剂A01；同时，各候选化合物与重组BMP-2联合处理时，第9号化合物(查尔酮衍生物2-(4- 含苯氧基的肉桂酰)醋酸)能显著增加细胞中骨钙素mRNA表达，并与其他候选化合物组有显著性差异。而重组BMP-2单独治疗与空白对照组相比没有显著差异。
试验例2、查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸与Smurf1蛋白及Smurf1WW结构域的亲和性
2.1试剂及动物
试剂:小鼠骨钙素ELISA试剂盒，小鼠BMP-2ELISA试剂盒；抗碱性磷酸酶抗体，抗Flag标签抗体，Agorse A/G beads,抗Smurf1抗体，细胞裂解液；查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸和白藜芦醇；携带有Flag标签标记的正常Smurf1蛋白序列及WW结构域各突变Smurf1
(Flag-R289A,Flag-G248A,Flag-Y297A,Flag-G248A/Y297A)蛋白序列载体。
动物：6月龄小鼠接受去势手术后放回笼子里正常饲养至15月龄。
2.2试验方法
按试验例7方法在15月龄老年骨质疏松小鼠模型中，根据血液中骨钙素相对水平，分选出骨内BMP-2正常表达同时Smurf1高活性的分型。处死小鼠，取出胫骨和股骨，分离骨髓，通过流式分选的技术分选出碱性磷酸酶(ALP)阳性细胞。该细胞中，分别加入查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸和阴性对照白藜芦醇。孵育48小时后，裂解细胞，通过免疫共沉淀方法，沉淀得Smurf1蛋白，用液相色谱-质谱联用分析共沉淀产物中查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸或白藜芦醇含量。另外，该细胞分别转入携带有Flag标签标记的正常Smurf1蛋白序列及WW结构域各突变 Smurf1(Flag-R289A,Flag-G248A,Flag-Y297A,Flag-G248A/Y297A)蛋白序列载体。然后用查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸处理细胞。处理 48小时后，裂解细胞，通过免疫共沉淀方法，沉淀出Smurf1蛋白，用液相色谱-质谱联用分析共沉淀产物中查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸含量。
2.3实验结果
结果显示，通过免疫共沉淀结合液相色谱-质谱联用分析共沉淀物中查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸的含量发现，细胞中的Smurf1蛋白中存有大量的查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸，而同样通过免疫共沉淀结合液相色谱-质谱联用分析共沉淀物中对照白藜芦醇的含量发现，细胞中的Smurf1蛋白中几乎不存有对照白藜芦醇，这提示查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸与Smurf1蛋白特异性结合，而对照白藜芦醇与细胞中Smurf1蛋白无特异性结合。同时，通过免疫共沉淀结合液相色谱-质谱联用分析Smurf1蛋白中查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸的含量发现，正常Smurf1蛋白较其他各WW结构域突变的Smurf1蛋白中结合更多的查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸，其中G248A和 Y297A关键残基分别突变后，可明显降低Smurf1蛋白与查尔酮衍生物2-(4- 含苯氧基的肉桂酰)醋酸的生物相互作用。这提示G248A和Y297A在Smurf1 与查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸相互作用中发挥关键作用。
试验例3、查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸促进体外成骨细胞的生长和分化
按试验例7方法，6月龄小鼠接受去势手术后放回笼子里正常饲养至 15月龄。然后在15月龄老年骨质疏松小鼠模型中，根据血液中骨钙素相对水平，分选出骨内BMP-2正常表达同时Smurf1高活性的分型。处死小鼠，取出胫骨和股骨，分离骨髓，通过流式分选的技术分选出碱性磷酸酶(ALP) 阳性细胞，作为成骨细胞。将该细胞以8X105个细胞/孔的密度铺24孔板过夜，加入不同浓度单位的查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸。孵育 72小时后，裂解细胞，通过免疫共沉淀方法，沉淀出Smurf1-Smad1复合物，用ELISA试剂盒检测其浓度。另外，该细胞以8X105个细胞/孔的密度铺24 孔板过夜，不同浓度单位的查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸分别与100ng/ml重组BMP-2共同处理细胞。共处理72小时后，一部分细胞用试剂盒提取总mRNA和用免疫共沉淀方法提取Smad1蛋白，并分别通过 RT-PCR检测骨钙素mRNA和通过ELISA检测p-Smad1蛋白表达水平；另一部分细胞用于碱性磷酸酶染色检测细胞内的碱性磷酸酶表达，及用于茜素红染色检测钙结节形成。
结果显示，随着查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸的给药浓度增加，该成骨细胞中Smurf1-Smad1复合物含量逐渐减少。在与重组BMP-2 共同处理下，随查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸浓度增加，骨钙素mRNA和p-Smad1蛋白水平逐渐升高，而重组BMP-2单独治疗组与空白对照组间骨钙素mRNA和p-Smad1蛋白表达无显明差异。同时，查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸浓度增加，成骨细胞碱性磷酸酶的积累随给药浓度升高而逐渐升高，钙结节形成也随之增加。这查尔酮衍生物2-(4- 含苯氧基的肉桂酰)醋酸可抑制BMP-2正常表达同时Smurf1高活性分型的成骨细胞中Smurf1活性，即Smurf1-Smad1复合物形成量，并进一步增强该细胞的生长和分化能力。
试验例4、查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸对体外成骨细胞毒性试验。
按试验例7方法6月龄小鼠接受去势手术后放回笼子里正常饲养至15 月龄。然后在15月龄老年骨质疏松小鼠模型中，根据血液中骨钙素相对水平，分选出骨内BMP-2正常表达同时Smurf1高活性的分型。处死小鼠，取出胫骨和股骨，分离骨髓，通过流式分选的技术分选出碱性磷酸酶(ALP) 阳性细胞，作为成骨细胞。该成骨前体细胞以8X105个细胞/孔的密度铺24 孔板过夜，不同浓度单位的查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸分别孵育72小时后，加入MTT(5mg/ml)10ul，37℃孵育4小时后用150ul DMSO 溶液溶解紫色结晶后放置于酶标仪以570nm吸收度检测。
结果显示，查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸在不同浓度下未对成骨细胞造成显著的毒性作用。
试验例5、以查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸为活性成分的组合物制备与生物相容性以及安全性试验
本实施例所述查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸为活性成分的组合物制备采用以下方法制备而成：
1)将200mg海藻酸钠溶于10ml水中，配置成浓度为2％的水溶液，另用2ml乙醇溶解100mg查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸，混合两溶液并冻干，此为A组分；0.68g氯化钙，0.68g葡萄糖酸内酯，加入6.54g 甘露醇，混合均匀，再加入35ml浓度为6g/100mL的聚乙烯吡咯烷酮K90 乙醇溶液，润湿后，混合均匀后制成软膏，挤压过20目筛成颗粒状，80℃烘干，过40目筛整粒，此为B组分；用60Co照射A组分和B组分，进行灭菌；灭菌后将A组分和B组分分装成产品。
2)将300mg海藻酸钠溶于10ml水中，配置成浓度为3％的水溶液，另用20ml乙醇溶解1000mg查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸，混合两溶液并冻干，此为A组分；1.48g硫酸钙，0.98g葡萄糖酸内酯，加入5.04g 甘露醇，混合均匀，再加入50ml浓度为5g/100mL的聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液，润湿后，混合均匀后制成软膏，挤压过20目筛成颗粒状，80℃烘干，过40目筛整粒，此为B组分；用60Co照射A组分和B组分，进行灭菌；灭菌后将A组分和B组分分装成产品。
3)将400mg海藻酸钠溶于10ml水中，配置成浓度为2％的水溶液，另用20ml乙醇溶解1000mg查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸，混合两溶液并冻干，此为A组分；1.25g碳酸钙，0.55g葡萄糖酸内酯，加入5.8g 甘露醇，混合均匀，再加入40ml浓度为6g/100mL的聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液，润湿后，混合均匀后制成软膏，挤压过20目筛成颗粒状，80℃烘干，过40目筛整粒，此为B组分；用60Co照射A组分和B组分，进行灭菌；灭菌后将A组分和B组分分装成产品。
将上述制得的A、B两种组分，按照使用将冻干的A组分每份用10ml 无菌生理盐水溶解，吸入注射器中待用，根据治疗需要取B组分，并按1mg 用1ul无菌生理盐水润湿，然后将注射器中A组分加入B组分中，均匀混合成混悬液，取其中3ml混悬液，铺到T-25细胞培养瓶中，在37℃，5％CO2培养箱中放置半小时。在凝固后，向瓶中轻轻加入10mL培养液。继续置于培养箱中，浸提24小时。然后，取出培养液，2000xg离心，直径为0.22um 的滤膜过滤，所得滤液作为浸提液。浸提液用培养基稀释一倍后按 GB/T16886.5.2003中规定的体外细胞毒性试验方法进行。其结果应符合该标准中4.6.5要求。
评价标准(采用从上述特定分型的模型小鼠中分选出碱性磷酸酶(ALP) 阳性细胞测试)(见表2)
表2
Figure BDA0001717423520000161
结果显示，上述三种复合组合物的细胞毒性实验结果均为合格。说明此复合组合物生物相容性好，无毒且安全。
试验例6、查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸局部给药促进体内骨形成和脊柱融合
按试验例7方法6月龄小鼠接受去势手术后放回笼子里正常饲养至15 月龄。然后在15月龄老年骨质疏松小鼠模型中，根据血液中骨钙素相对水平，分选出骨内BMP-2正常表达同时Smurf1高活性的分型。该动物模型进行后侧横突脊柱融合术后，在小鼠的手术部位L4-L6腰椎，放入以查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸为活性成分的组合物(按照试验例5中的1)方法制备)进行如下体内疗效实验。其中，查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸的给药剂量分别为2mg/只(低剂量组)和4mg/只(高剂量组)，并设有正常对照组和载体组作为对照。在手术后0周、4周及8周进行临床触诊，判断其脊柱融合的效果，同时抽取血液，检测血液中骨钙素水平和各生化及血液学指标。在治疗第8周时，处死老鼠，对小鼠的L4-L6 腰椎进行X射线检测和microCT扫描。在处死小鼠第10及第2天前,腹腔注射二甲酚橙(30mg/kg)和钙黄绿素(10mg/kg)。处死小鼠后,小鼠的L4-L6 脊椎用于骨组织形态计量学参数分析和骨生物力学性质检测。
结果显示，在触诊检查中查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸的两治疗组，对该特定分型老年骨质疏松小鼠的脊柱融合均有促进作用。而高剂量组较底剂量组的脊柱融合机率高。同时，在同一取血点，血液样本中骨钙素浓度也随着给药浓度增加而增加。从治疗前后各血生化指标结果得出查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸复合组合物对小鼠无明显毒性。第8周治疗后，在X射线检测结果中显示小鼠的L4-L6脊柱融合手术部位在两个治疗组出现明显的脊柱融合现象，而两治疗组与正常对照组和载体组均有显著性差异。在microCT扫描成像结果显示，查尔酮衍生物2-(4- 含苯氧基的肉桂酰)醋酸的两治疗组在L4-L6脊椎融合部分较正常对照组和载体组有更多新骨形成。同时，治疗组的骨密度(BMD)和骨体积分数 (BV/TV)较正常对照组和载体组均有显著性差异。而这两个参数在正常对照组与载体组间无显著差异。在硬组织切片标本中，两治疗组中两荧光线中间的距离较其他组宽，而面积比其他组大，说明骨表面形成的活跃程度高。两治疗组的骨小梁矿化率(MAR)与骨形成率(BFR/BS)较其他组均有显著性差异。说明查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸可促进老年骨质疏松小鼠中BMP-2正常表达而Smurf1高活性分型的给药局部骨形成和脊柱融合。参见表3和4。
表3 2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸组合物的生物性相容性和安全性研究
Figure BDA0001717423520000171
表4 2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸复合组合物的体内毒性试验结果
Figure BDA0001717423520000181
ALT:丙氨酸氨基转移酶；AST：门冬氨酸氨基转移酶；BUN:血尿素；WBC:白细胞；HGB:血红蛋白；RBC:红细胞；HCT: 红细胞比容；PLT:血小板；
试验例7血液骨钙素相对水平分选方法
血浆骨钙素是反应骨形成的标记物，血浆骨钙素含量高，骨形成率高，反之亦然。
将6月龄小鼠进行去势手术后放回笼子里正常饲养至8月龄或15月龄后，分别检测小鼠的血浆骨钙素含量。在8月和15月龄骨质疏松小鼠模型中，均发现血浆骨钙素含量在同一月龄模型小鼠间有差异。其中，同月龄中一部分模型小鼠的血浆骨钙素的含量相对较高，另一部分相对较低(图6A)。因此、将同月龄模型组小鼠，根据相对血浆骨钙素含量，分成相对高血浆骨钙素表达小鼠以及相对低血浆骨钙素表达小鼠，并检测小鼠骨组织中BMP-2以及Smurf1活性(Smurf1-Smad1复合物含量)。
结果显示，相对高血浆骨钙素模型组中，骨组织内BMP-2表达在造模前后无明显变化而Smurf1活性随造模时间延长而升高(图6B)；而相对低血浆骨钙素模型组中，骨组织内BMP-2表达随造模时间延长而降低，但 Smurf1活性在造模前后无明显变化(图6C)。
根据血浆骨钙素相对含量将去势诱导小鼠分成：BMP-2表达正常而 Smurf1高活性分型(相对高血浆骨钙素)和BMP-2低表达而Smurf1正常活性分型(相对低血浆骨钙素)。

Claims (9)

1.一种2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸在制备促进特定人群脊柱融合的药物中的应用，所述特定人群是骨内BMP-2正常表达同时Smurf1高活性的骨质疏松病患。
2.一种2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸在制备治疗特定人群的骨质疏松患者的药物中的应用，所述特定人群是骨内BMP-2正常表达同时Smurf1高活性的骨质疏松病患。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸为组合物的形式，其特征在于，所述组合物由A组分和B组分组成，所述组合物中，
A组分、以10毫升溶液计、含有：
查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸 100～1000mg
海藻酸钠 100～400mg
B组分、以10g计、含有：
Figure FDA0003618584660000011
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述组合物中，
A组分、以10毫升溶液计、含有：
查尔酮衍生物2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸 500～1000mg
海藻酸钠 200～400mg
B组分、以10g计、含有：
Figure FDA0003618584660000012
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的组合物中，A组分每份的量为200～1400mg，B组分每份的量为10g。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的组合物中，A组分每份的量为700～1400mg，B组分每份的量为10g。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述水难溶性钙化合物为碳酸钙、硫酸钙或羟基磷灰石。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述组合物为制剂形式，其中所述制剂为冻干制剂。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述冻干制剂的制备方法包括以下步骤：
将海藻酸钠溶于水中，并将2-(4-含苯氧基的肉桂酰)醋酸溶于适量乙醇中，混合两溶液然后冻干，即得A组分；
将水难溶性钙化合物和葡萄糖酸内酯混合，再加入甘露醇，混合均匀；再在混合物中加入聚乙烯吡咯烷酮K90的乙醇溶液，润湿，调制成软膏，挤压过20目筛成颗粒状，80℃烘干，过40目筛整粒，即得B组分；
钴60照射对A组分和B组分灭菌后，将两组分分装成产品，即得。
CN201810715806.7A 2018-07-03 2018-07-03 一种用于脊柱融合复合的组合物及其制备方法和应用 Active CN110664792B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810715806.7A CN110664792B (zh) 2018-07-03 2018-07-03 一种用于脊柱融合复合的组合物及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810715806.7A CN110664792B (zh) 2018-07-03 2018-07-03 一种用于脊柱融合复合的组合物及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110664792A CN110664792A (zh) 2020-01-10
CN110664792B true CN110664792B (zh) 2022-08-09

Family

ID=69065334

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810715806.7A Active CN110664792B (zh) 2018-07-03 2018-07-03 一种用于脊柱融合复合的组合物及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110664792B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003037315A1 (en) * 2001-11-01 2003-05-08 Angiolab Inc. Pharmaceutical composition containing chalcone or its derivatives for matrix metalloproteinase inhibitory activity
CN1586621A (zh) * 2004-07-22 2005-03-02 徐放 注射的凝胶型骨修复生物活性材料及其制备方法
CN103655567A (zh) * 2013-12-04 2014-03-26 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种骨形成负调控因子Smurf1的小分子抑制剂

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003037315A1 (en) * 2001-11-01 2003-05-08 Angiolab Inc. Pharmaceutical composition containing chalcone or its derivatives for matrix metalloproteinase inhibitory activity
CN1586621A (zh) * 2004-07-22 2005-03-02 徐放 注射的凝胶型骨修复生物活性材料及其制备方法
CN103655567A (zh) * 2013-12-04 2014-03-26 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种骨形成负调控因子Smurf1的小分子抑制剂

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Synthesis and in vitro antiplasmodial evaluation of 7-chloroquinoline-chalcone and 7-chloroquinoline-ferrocenylchalcone conjugates;Raghu Raj等;《European Journal of Medicinal Chemistry》;20150320;第95卷;230-239 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110664792A (zh) 2020-01-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Imam et al. A systematic review of the concept and clinical applications of bone marrow aspirate concentrate in tendon pathology
Salem et al. Renoprotective effect of platelet‐rich plasma on cisplatin‐induced nephrotoxicity in rats
Ha et al. Variability of the composition of growth factors and cytokines in platelet-rich plasma from the knee with osteoarthritis
Muench et al. Preliminary clinical outcomes following biologic augmentation of arthroscopic rotator cuff repair using subacromial bursa, concentrated bone marrow aspirate, and platelet-rich plasma
CN1177611C (zh) 用于药物诱导型肾病和肝病的预防或治疗组合物
Sirin et al. The association between different molecular weights of hyaluronic acid and CHAD, HIF-1α, COL2A1 expression in chondrocyte cultures
CN111789833A (zh) 2-溴棕榈酸在制备防治骨丢失相关疾病的药物中的应用
CN110840882A (zh) 一种治疗骨质疏松的组合物
CN113456645A (zh) Dmxaa在制备防治骨质疏松症药物中的应用
Maale et al. The evolution from the two stage to the one stage procedure for biofilm based periprosthetic joint infections (PJI)
Yan et al. α-Tocopherol protected against cobalt nanoparticles and cocl2 induced cytotoxicity and inflammation in Balb/3T3 cells
Kaya et al. Investigation of the effects of methylphenidate, an amphetamine derivative, on intervertebral disc tissue cell cultures and matrix structures
CN110664792B (zh) 一种用于脊柱融合复合的组合物及其制备方法和应用
EP2087886A1 (en) Therapeutic agent for rheumatoid arthritis
Al-Rekabi et al. Immunomodulatory effects of quercetin in patient with active rheumatoid arthritis
Wang et al. DAla2GIP antagonizes H2O2-induced chondrocyte apoptosis and inflammatory factor secretion
Brown et al. The effect of muscle flap transposition to the fracture site on TNFα levels during fracture healing
CN114984047A (zh) 血浆外泌体在制备治疗骨质疏松症药物中的应用
CN110607279B (zh) 一种原代肿瘤细胞的3d培养体系及其培养方法和应用
CN110694051B (zh) 一种神经导向因子Sema在制备治疗骨关节炎注射剂中的应用
Kuroda et al. Phase III clinical trial of autologous CD34+ cell transplantation to accelerate fracture nonunion repair
JP2018014972A (ja) 未分化細胞が除去された分化誘導細胞集団の製造方法
Hussein et al. Association between cadmium and lead in active and passive cigarette smokers with bone mass: a retrospective study
CN106974903A (zh) 洛铂在制备治疗恶性滋养细胞肿瘤药物中的应用
EP3795677A1 (en) Composition for promoting stem cell differentiation, comprising progenitor cell culture solution and multilayer graphene film, and use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant