JP2018014972A - 未分化細胞が除去された分化誘導細胞集団の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
多能性幹細胞を分化誘導することにより得られうる分化細胞を含有する細胞集団の製造方法であって、
BET阻害剤及びCDK阻害剤の存在下で、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られうる分化細胞を含有する細胞集団を培養することにより、未分化多能性幹細胞の含有割合を低減する工程
を含む、製造方法。
項2.
前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞である、項1に記載の製造方法。
項3.
前記人工多能性幹細胞が、iPS細胞である、項2に記載の製造方法。
項4.
前記胚性幹細胞が、ES細胞である、項2に記載の製造方法。
項5.
多能性幹細胞を分化誘導することにより得られうる分化細胞を含有する細胞集団の製造方法において、未分化多能性幹細胞の含有割合を低減するために用いられる、一剤型又は多剤型組成物であって、BET阻害剤及び/又はCDK阻害剤を少なくともいずれかの剤中に含有する、組成物。
項6.
多能性幹細胞を分化誘導することにより得られうる分化細胞を含有する細胞集団であって、未分化多能性幹細胞の含有割合が、0.05%以下である細胞集団。
項7.
項1〜4のいずれか一項に記載の製造方法により得られうる、項6に記載の細胞集団。
多能性幹細胞としては、特に限定されず、幅広く用いることができる。多能性幹細胞としては、人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞のいずれも用いることができる。
本発明の製造方法により得られる細胞集団は、特に限定されないが、未分化多能性幹細胞の含有割合が、通常は0.2%以下であり、好ましくは0.1%以下であり、より好ましくは0.05%以下である。本発明の製造方法により得られる細胞集団は、未分化多能性幹細胞の含有割合が低いことが特徴であり、必要に応じて、分化誘導細胞及び未分化多能性幹細胞とは異なる細胞をさらに含んでいてもよい。
本発明の製造方法は、BET阻害剤及びCDK阻害剤の存在下で、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られうる分化細胞を含有する細胞集団を培養することにより、未分化多能性幹細胞の含有割合を低減する工程を含むことを特徴とする。
本発明の製造方法では、ヒストンアセチル化阻害剤であるBET阻害剤を用いる。
本発明の製造方法では、BET阻害剤に加えてさらにCDK阻害剤を用いる。
本発明の製造方法では、さらに他の薬剤の存在下で未分化多能性幹細胞を培養してもよく、そのような他の薬剤として例えば、未分化細胞マーカーとして知られるCD30を特異的に認識する抗体からなる抗CD30抗体結合薬剤等が挙げられる。
また、リンカーとしては、特に限定されないが、例えば、蛋白質分解酵素により開裂するリンカー等が挙げられる。
本発明はさらに、上記の方法のために用いられる、一剤型又は多剤型組成物であって、BET阻害剤及び/又はCDK阻害剤を少なくともいずれかの剤中に含有する、組成物を包含する。
ヒトiPS細胞株253G1、201B7、及びMYH−GIP4を12穴プレートへ播種した(細胞密度:20% confluency)。播種48時間後、各ウェルにBET阻害剤(使用薬剤名:JQ1)及びCDK9阻害剤(使用薬剤名:Flavopiridol)をそれぞれ0及び0.2μMずつ添加(計4群を準備)(以後培地交換なし)。以後、細胞数を反映する細胞増殖アッセイ (CCK−8アッセイ)を行い、生細胞の評価を定量的に行った。
ヒトiPS細胞由来心筋細胞(iPS−CM)を対象とする。iPS−CMは心筋細胞の他、造腫瘍性を有する未分化細胞も含有すると考えられる。
ヒトiPS細胞株253G1から誘導したiPS−CMを12穴プレートへ播種した(細胞密度:90% confluency)。播種48時間後、各ウェルにJQ1及びFlavopiridolをそれぞれ0及び0.2μMずつ添加(以後培地交換なし)。以後、添加48時間後にTRA−1−60陽性率を定量化した。コントロールとして、Isotype control抗体を用いて同様に測定を行い、擬陽性がないことを確認した。
ヒトiPS細胞株253G1、201B7、及びMYH−GIP4を12穴プレートへ播種した(細胞密度:20% confluency)。播種48時間後、各ウェルにBET阻害剤(使用薬剤名:JQ1)を0及び1μMずつ及びCDK1阻害剤(使用薬剤名:Dinaciclib)をそれぞれ0及び20nMずつ添加(計4群を準備)(48時間毎に薬剤含有培地を交換)。以後、細胞数を反映する細胞増殖アッセイ(CCK−8アッセイ)を行い、生細胞の評価を定量的に行った。
ヒトiPS細胞由来心筋細胞(iPS−CM)を対象とする。iPS−CMは心筋細胞の他、造腫瘍性を有する未分化細胞も含有すると考えられる。
ヒトiPS細胞株253G1から誘導したiPS−CMを12穴プレートへ播種した(細胞密度:90% confluency)。播種48時間後、各ウェルにJQ1を0及び1μMずつ、及びDinaciclibを0及び20nMずつ添加(48時間毎に薬剤含有培地を交換)。以後、添加72時間後にTRA−1−60陽性率を定量化した。コントロールとして、Isotype control抗体を用いて同様に測定を行い、擬陽性がないことを確認した。
Claims (7)
- 多能性幹細胞を分化誘導することにより得られうる分化細胞を含有する細胞集団の製造方法であって、
BET阻害剤及びCDK阻害剤の存在下で、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られうる分化細胞を含有する細胞集団を培養することにより、未分化多能性幹細胞の含有割合を低減する工程
を含む、製造方法。 - 前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞である、請求項1に記載の製造方法。
- 前記人工多能性幹細胞が、iPS細胞である、請求項2に記載の製造方法。
- 前記胚性幹細胞が、ES細胞である、請求項2に記載の製造方法。
- 多能性幹細胞を分化誘導することにより得られうる分化細胞を含有する細胞集団の製造方法において、未分化多能性幹細胞の含有割合を低減するために用いられる、一剤型又は多剤型組成物であって、BET阻害剤及び/又はCDK阻害剤を少なくともいずれかの剤中に含有する、組成物。
- 多能性幹細胞を分化誘導することにより得られうる分化細胞を含有する細胞集団であって、未分化多能性幹細胞の含有割合が、0.05%以下である細胞集団。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の製造方法により得られうる、請求項6に記載の細胞集団。
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