CN109575108A

CN109575108A - 以ptp1b为靶点的新型bh3模拟肽化合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109575108A
Application number: CN201811517551.XA
Authority: CN
Inventors: 张传亮; 王树林; 路晓; 吴丽娟
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2018-12-12
Filing date: 2018-12-12
Publication date: 2019-04-05
Anticipated expiration: 2038-12-12
Also published as: CN114437178A; CN114437178B; CN114437177A; CN109575108B; CN114409739B; CN114409739A; CN114437177B

Abstract

本发明提供了以PTP1B为靶点的新型BH3模拟肽化合物及其制备方法和应用，所述BH3模拟肽化合物的结构式如下所示：所述BH3模拟肽化合物结构中的氨基酸均为天然氨基酸，肽链的氨基端与R₁基团通过酰胺键相连，R₁为羧酸或二羧酸，R₂为OH或NH₂。该类模拟肽化合物衍生自Bcl‑2抗凋亡蛋白的BH3结构域的核心区域，采用多肽固相合成方法进行制备。本发明通过实验证明，所述BH3模拟肽化合物能够显著抑制蛋白质酪氨酸磷酸化酶1B（PTP1B）的活性，在以PTP1B为靶点的相关疾病如糖尿病、癌症、阿尔兹海默症等的药物开发中具有潜在的应用价值。

Description

以PTP1B为靶点的新型BH3模拟肽化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及以PTP1B为靶点的新型BH3模拟化合物及其制备方法和应用。

背景技术

蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B)早在1988年即被成功分离鉴定，后续的大量研究结果表明，PTP1B的过量异常表达与和T2DM肥胖症的发病及发展有密切的关系。PTP1B是一个新颖的治疗T2DM和肥胖症的潜在靶点。PTP1B是胰岛素信号转导通路中的关键的负调节蛋白，PTP1B抑制剂通过阻断胰岛素刺激的胰岛素受体(IR)的酪氨酸磷酸化，进而影响胰岛素受体底物(IRS-1)的磷酸化，使类胰岛素和胰岛素增敏，改善胰岛素抵抗效应，降低血糖。同时，能使瘦素信号增强，诱导脂肪代谢水平升高，体重下降。通过抑制PTP1B活性，能够增强胰岛素敏感性，有效改善T2DM患者的胰岛素抵抗，从源头对T2DM和肥胖症的治疗都将会有显著改善。PTP1B被认为是非胰岛素依赖性抗2型糖尿病和肥胖症药物开发最理想的靶标之一。因此，寻找和开发特异性高、毒性小的PTP1B抑制剂有着非常广阔的应用前景。目前已吸引了众多制药公司如辉瑞、ISIS、Tabacco、TransTech等开发其特异性、高效性抑制剂，以作为T2DM和肥胖症治疗的新药。我国也有多家科研院所(如中国科学院药物所、中国科学院海洋所、上海交通大学、浙江大学、吉林大学、华东理工大学、南开大学、复旦大学、中国药科大学、中山大学等)正在开展PTP1B抑制剂的基础理论和应用研究，使PTP1B抑制剂成为降糖类药物开发中的一个非常活跃的领域。相继有多个候选化合物如Ertiprotafib、TTP814、ISIS-PTPRx、ISIS-113715、MSI-1436、HPN等进入临床前及临床I、II期实验。

此外，近期的研究表明：PTP1B可以作为抗肿瘤和阿尔兹海默症药物开发的(潜在)靶标。文献Protein tyrosine phosphatases，new targets for cancertherapy.Curr.Cancer Drug Targets 2006，6，519-532.；A brake becomes anaccelerator：PTP1B-a new therapeutic target for breast cancer.Cancer Cell2007，11，214-216.；Discovery of [(3-bromo-7-cyano-2-naphthyl)(difluoro)methyl]-phosphonic acid，a potent and orally active small molecule PTP1B inhibitor.Bioorg.Med.Chem.Lett.2008，18，3200-3205.；Recent advances in the discovery ofcompetitive protein tyrosine phosphatase 1B Inhibitors for the treatment ofdiabetes，obesity，and cancer.J Med Chem，53(6)(2010)，pp.2333-2344.；PTP1Bcontrols non-mitochondrial oxygen consumption by regulating RNF213 to promotetumour survival during hypoxia.Nat Cell Biol，18(2016)，p.803.等研究发现PTP1B过表达能够显著促进小鼠体内肿瘤的发生和生长，通过抑制剂一直PTP1B的表达能够产生抗肿瘤效果；机制研究发现PTP1B通过调控RNF213基因从而控制细胞非线粒体氧消耗，进而促进缺氧条件下肿瘤细胞的生存和生长。据此，PTP1B被看作是抗肿瘤药物的靶标。文献Protein tyrosine phosphatase 1B(PTP1B)：a potential target for alzheimer’sTherapy？Front Aging Neurosci，9(7)(2017)总结了近些年PTP1B作为中枢神经系统中与阿尔兹海默症相关生理过程中的调控作用，提出通过抑制PTP1B进而拮抗PTP1B调控的与阿尔兹海默症相关的有害生理过程的策略，进行抗阿尔兹海默症药物的研发。

因此，PTP1B已成为抗糖尿病、癌症及阿尔兹海默症药物开发的热门靶点。目前已发现的PTP1B的抑制剂主要可以分为三类：第一类是无机小分子类化合物，这类化合物以钒酸钠为代表，它们与PTP1B作用底物磷酸根具有相似的结构，能够竞争性地与PTP1B结合并抑制其活性。但是其选择性非常低，对所有的PTPs都有较强的抑制性，所以该类化合物没有开发前景，也不可能应用到临床治疗当中。第二类是有机化合物，该类物质大多通过有机合成和组合化学的方法进行筛选，先筛选到具有抑制PTP1B活性的化合物，再对化合物的取代基团进行修饰，最后得到一种较好的PTP1B抑制剂。然而此类抑制剂存在稳定性差、带电荷较高、亲脂系数过高等制约成药性的问题。尽管目前已经有一些选择性相对较好的抑制剂，但这些PTP1B抑制剂对于PTP1B同源性最高的TCPTP也都有抑制作用，因此，寻找高度专一性、高效、低毒的PTP1B抑制剂仍是很大的挑战。近年来，国内外研究人员将目光投向了第三类PTP1B抑制剂，即天然产物中PTP1B抑制剂的研究与开发。通过对自然界中分离鉴定的天然产物进行高通量筛选，获得了一些作用位点虽不是很明确，但具有高选择性和活性的PTP1B抑制剂。基于此类天然产物的母核结构，结合PTP1B酶的催化活性位点，对其进行结构修饰和改造。从而开发高选择性、低毒且高效的PTP1B抑制剂。

总结并分析PTP1B有机小分子抑制剂的开发现状可以发现，PTP1B小分子抑制剂的开发受困于两点：①PTP1B抑制剂的选择性：PTP1B与其他蛋白磷酸酶如TCPTP高度同源，尤其是活性位点同源性更高达94％；②PTP1B抑制剂的透膜能力：PTP1B催化蛋白磷酸水解得活性位点带电，所以具有PTP1B抑制活性的化合物都带电或强极性；而PTP1B又是分布在细胞膜内，带电或强极性的化合物难以通过细胞膜而起效。因此，弥补现有PTP1B抑制分子的缺陷，开发结构新颖、选择性强的新型PTP1B抑制剂以满足国内临床上的迫切需求，就显得十分必要。而其中的关键就在于探索发现新的先导结构及作用方式，也是当前PTP1B基础研究方面的热点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以PTP1B为靶点的BH3模拟肽化合物及其制备方法和应用，本发明所提供的BH3模拟肽化合物具有显著的蛋白酪氨酸磷脂酶1B(PTP1B)的抑制活性，可用于制备预防或治疗以PTP1B为靶点的相关疾病的药物开发。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了以PTP1B为靶点的BH3模拟肽化合物，所述模拟肽化合物的结构式如下：

其中，R₁为羧酸或二羧酸，R₂为OH或NH₂。

进一步的：所述BH3模拟肽化合物中的氨基酸均为天然氨基酸，肽链的氨基端与R₁基团通过酰胺键相连。

进一步的：所述BH3模拟肽化合物具体为：

本发明还提供了所述的BH3模拟肽化合物的制备方法，它包括以下步骤：

(1)树脂活化：室温下，称取相应量的Fmoc-Phe-Wang树脂，置于手动多肽固相合成器中，活化；

(2)加入哌啶和二甲基甲酰胺的混合液脱除Fmoc保护基；

(3)加入3～4倍树脂摩尔量的N-Fmoc保护氨基酸、HOBt、HBTU和DIEA，室温振荡反应2～4h；

(4)重复步骤(2)和(3)，直至完成整个多肽序列的合成；

(5)将树脂抽干，加入裂解液，摇床振荡后，过滤，鼓氮气除去剩余三氟乙酸，加入乙醚，析出固体后离心、烘干得模拟肽化合物粗品；

(6)粗品使用反相制备液相色谱纯化，收集目标峰流动相溶液脱去乙腈后冷冻干燥得模拟肽化合物纯品。

进一步的：所述裂解液包括苯酚、水、苯甲硫醚和三氟乙酸。

本发明还提供了以所述的BH3模拟肽化合物为活性成分的药物或药物组合物，包含任一所述BH3模拟肽化合物和一种或多种药学上可接受的载体或赋型剂。

本发明还提供了所述的BH3模拟肽化合物在制备用于预防或治疗以PTP1B为靶点的疾病的药物中的应用。

进一步的：所述疾病包括糖尿病、癌症和阿尔兹海默症。

进一步的：以所述的BH3模拟肽化合物为活性成分的药物或药物组合物以口服或注射给药。

本发明的优点和技术效果是：本发明提供了以PTP1B为靶点的BH3模拟肽化合物及其制备方法和应用，所述BH3模拟肽化合物能够显著抑制蛋白质酪氨酸磷酸化酶1B(PTP1B)的活性，在以PTP1B为靶点的相关疾病如糖尿病、癌症、阿尔兹海默症等的药物开发中具有潜在的应用价值，具有优异的PTP1B抑制剂开发前景。

附图说明

图1为模拟肽化合物Pal-PUMA在不同浓度梯度下进行了PTP1B抑制率曲线；

图2为模拟肽化合物Pal-BID在不同浓度梯度下进行了PTP1B抑制率曲线；

图3为模拟肽化合物Pal-BAK在不同浓度梯度下进行了PTPlB抑制率曲线；

图4为模拟肽化合物Pal-BIK在不同浓度梯度下进行了PTP1B抑制率曲线。

具体实施方式：

以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。

本发明所述以PTP1B为靶点的BH3模拟肽化合物，均按照多肽固相合成方法得到。

实施例1

1、Pal-PUMA具体制备过程如下：

(1)树脂活化：室温下，称取相应量的Fmoc-Phe-Wang树脂，二氯甲烷(DCM)洗4次，置于手动多肽固相合成器中，加入5ml DCM溶胀活化3h，二甲基甲酰胺(DMF)洗4次，加入20％哌啶DMF脱去Fmoc保护基20min，5ml DMF洗4次，5ml DCM洗4次，Kaiser’s试剂检测。

(2)连接Leu(L)：DMF洗涤3次，分别加入3倍树脂摩尔量的Fmoc-Leu-OH、HBTU、HOBt和6倍树脂摩尔量的DIEA，溶于10ml DMF中，室温搅拌反应2h，DMF洗4次，加入20％哌啶DMF脱去Fmoc保护基20min，5ml DMF洗4次，5ml DCM洗4次，Kaiser’s试剂检测。

(3)连接Asp(D)：DMF洗涤3次，分别加入3倍树脂摩尔量的Fmoc-Asp(OtBu)-OH、HBTU、HOBt和6倍树脂摩尔量的DIEA，溶于10ml DMF中，室温搅拌反应2h，DMF洗4次，加入20％哌啶DMF脱去Fmoc保护基20min，5ml DMF洗4次，5ml DCM洗4次，Kaiser’s试剂检测。

(4)连接Asp(D)：DMF洗涤3次，分别加入3倍树脂摩尔量的Fmoc-Asp(OtBu)-OH、HBTU、HOBt和6倍树脂摩尔量的DIEA，溶于10ml DMF中，室温搅拌反应2h，DMF洗4次，加入20％哌啶DMF脱去Fmoc保护基20min，5ml DMF洗4次，5ml DCM洗4次，Kaiser’s试剂检测。

(5)连接Ala(A)：DMF洗涤3次，分别加入3倍树脂摩尔量的Fmoc-Ala-OH、HBTU、HOBt和6倍树脂摩尔量的DIEA，溶于10ml DMF中，室温搅拌反应2h，DMF洗4次，加入20％哌啶DMF脱去Fmoc保护基20min，5ml DMF洗4次，5ml DCM洗4次，Kaiser’s试剂检测。

(6)连接Met(M)：DMF洗涤3次，分别加入3倍树脂摩尔量的Fmoc-Met-OH、HBTU、HOBt和6倍树脂摩尔量的DIEA，溶于10ml DMF中，室温搅拌反应2h，DMF洗4次，加入20％哌啶DMF脱去Fmoc保护基20min，5ml DMF洗4次，5ml DCM洗4次，Kaiser’s试剂检测。

(7)连接Arg(R)：DMF洗涤3次，分别加入3倍树脂摩尔量的Fmoc-Arg(Mtr)-OH、HBTU、HOBt和6倍树脂摩尔量的DIEA，溶于10ml DMF中，室温搅拌反应2h，DMF洗4次，加入20％哌啶DMF脱去Fmoc保护基20min，5ml DMF洗4次，5ml DCM洗4次，Kaiser’s试剂检测。

(8)连接Arg(R)：DMF洗涤3次，分别加入3倍树脂摩尔量的Fmoc-Arg(Mtr)-OH、HBTU、HOBt和6倍树脂摩尔量的DIEA，溶于10ml DMF中，室温搅拌反应2h，DMF洗4次，加入20％哌啶DMF脱去Fmoc保护基20min，5ml DMF洗4次，5ml DCM洗4次，Kaiser’s试剂检测。

(9)连接Leu(L)：DMF洗涤3次，分别加入3倍树脂摩尔量的Fmoc-Leu-OH、HBTU、HOBt和6倍树脂摩尔量的DIEA，溶于10ml DMF中，室温搅拌反应2h，DMF洗4次，加入20％哌啶DMF脱去Fmoc保护基20min，5ml DMF洗4次，5ml DCM洗4次，Kaiser’s试剂检测。

(10)连接Glu(Q)：DMF洗涤3次，分别加入3倍树脂摩尔量的Fmoc-Glu(OtBu)-OH、HBTU、HOBt和6倍树脂摩尔量的DIEA，溶于10ml DMF中，室温搅拌反应2h，DMF洗4次，加入20％哌啶DMF脱去Fmoc保护基20min，5ml DMF洗4次，5ml DCM洗4次，Kaiser’s试剂检测。

(11)连接Ala(A)：DMF洗涤3次，分别加入3倍树脂摩尔量的Fmoc-Ala-OH、HBTU、HOBt和6倍树脂摩尔量的DIEA，溶于10ml DMF中，室温搅拌反应2h，DMF洗4次，加入20％哌啶DMF脱去Fmoc保护基20min，5ml DMF洗4次，5ml DCM洗4次，Kaiser’s试剂检测。

(12)连接Gly(G)：DMF洗涤3次，分别加入3倍树脂摩尔量的Fmoc-Gly-OH、HBTU、HOBt和6倍树脂摩尔量的DIEA，溶于10ml DMF中，室温搅拌反应2h，DMF洗4次，加入20％哌啶DMF脱去Fmoc保护基20min，5ml DMF洗4次，5ml DCM洗4次，Kaiser’s试剂检测。

(13)连接Ile(I)：DMF洗涤3次，分别加入3倍树脂摩尔量的Fmoc-Ile-OH、HBTU、HOBt和6倍树脂摩尔量的DIEA，溶于10ml DMF中，室温搅拌反应2h，DMF洗4次，加入20％哌啶DMF脱去Fmoc保护基20min，5ml DMF洗4次，5ml DCM洗4次，Kaiser’s试剂检测。

(14)连接棕榈酸(Pal)：DMF洗涤3次，分别加入6倍树脂摩尔量的棕榈酸、HBTU、HOBt和10倍树脂摩尔量的DIEA，溶于10ml DMF中，室温搅拌反应4h，5ml DMF洗4次，5ml DCM洗4次，Kaiser’s试剂检测。

(15)切割，解侧链保护基：产物抽干、加入裂解液(所述裂解液包括250mg苯酚、0.5ml水、0.5ml苯甲硫醚和9.0ml三氟乙酸)，室温搅拌2.5h，过滤，N₂吹去三氟乙酸，加入30ml冷的无水乙醚，5000rpm离心5分钟，得到白色沉淀，用冷的无水乙醚重复洗涤3次，真空干燥，得粗产物。

(16)粗产物使用反相制备液相色谱(RP-HPLC)纯化、收集目标峰流动相溶液脱去乙腈后冷冻干燥得白色固体，即BH3模拟肽化合物纯品，通过质谱和高效液相色谱分析进行结构确证。

实施例2

8种BH3模拟肽化合物的质谱数据和HPLC纯度分析数据见表1。

表1.BH3模拟肽的质谱数据和HPLC纯度分析数据

实施例3、蛋白酪氨酸磷脂酶1B(PTP1B)抑制活性测定

本发明中采用MES缓冲液为反应体系，利用人源蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)，以对硝基苯磷酸二钠(pNPP)为特异性底物，选择原钒酸钠作为阳性药、以DMSO为阴性对照，建立了基于酶反应速率的96孔微板为载体的筛选模型，通过酶学方法寻找PTP1B抑制剂。

具体实施方法为：采用MES缓冲体系(25mM，pH6.5)，在96孔板内依次加入10μLpNPP(77mM)、86μL MES缓冲液、4μL化合物(2mM化合物母液溶解于DMSO中)、100μL PTP1B溶液(50nM)，反应总体积为200μL。每组3个平行，以DMSO为阴性对照，原钒酸钠(2mM)为阳性对照，25℃下，在摇床上摇动1min，酶标仪上每隔60s读数一次，动态测定5min，测其OD 405的变化(OD/min)。每个孔的初始阶段反应速率呈线性相关，动力学曲线线性部分的斜率决定PTP1B的反应速度，以速度表示酶活。化合物对PTP1B的抑制率计算公式：

抑制率(％)＝(vDMSO-v样本)/vDMSO*100；

vDMSO、v样本分别表示阴性对照组和受试化合物的初始平均反应速率。

所得数据用标示，各组数据运用t检验分析。结果见表2。

表2受试模拟肽对PTP1B活性的抑制结果

受试物	浓度(μmol/L)	抑制率(％)
			阴性对照	-	0±4.01
原钒酸钠	200	27.54±2.03
			<u>Pal-PUMA</u>	10	55.16±15.18
Pal-BAD	10	9.67±2.43
			<u>Pal-BID</u>	10	99.31±0.28
Pal-NOXA	10	-9.54±1.51
			<u>Pal-BAK</u>	10	99.85±0.1
<u>Pal-BIK</u>	10	99.96±0.18
			Pal-BMF	10	6.63±1.62
Pal-HRK	10	3.04±1.02

本发明对模拟肽化合物Pal-PUMA、Pal-BID、Pal-BAK和Pal-BIK在不同浓度梯度下进行了PTP1B抑制率及IC₅₀测定，结果见表3及图1-图4。

表3不同浓度梯度的多肽对PTP1B活性的抑制率及IC₅₀

采用GraphPad Prism 5.0软件进行统计学处理，绘制出抑制率曲线，见图1至图4，从而得到模拟肽化合物Pal-PUMA、Pal-BID、Pal-BAK和Pal-BIK的PTP1B抑制中浓度IC₅₀分别为6.84μmol/L、2.15μmol/L、1.28μmol/L、0.94μmol/L。

试验结果表明：模拟肽化合物Pal-PUMA、Pal-BID、Pal-BAK和Pal-BIK对蛋白质酪氨酸磷酸酯酶1B表现出显著的抑制作用，具有优异的PTP1B抑制剂开发前景。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实例对本发明进行了详细的说明，对本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims

1.以PTP1B为靶点的BH3模拟肽化合物，其特征在于：所述模拟肽化合物的结构式如下：

其中， R₁为羧酸或二羧酸，R₂为OH或NH₂。

2.根据权利要求1所述的BH3模拟肽化合物，其特征在于：所述BH3模拟肽化合物中的氨基酸均为天然氨基酸，肽链的氨基端与R₁基团通过酰胺键相连。

3.根据权利要求1所述的BH3模拟肽化合物，其特征在于：所述BH3模拟肽化合物具体为：

。

4.权利要求1所述的BH3模拟肽化合物的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：

（1）树脂活化：室温下，称取相应量的Fmoc-Phe-Wang树脂，置于手动多肽固相合成器中，活化；

（2）加入哌啶和二甲基甲酰胺的混合液脱除Fmoc保护基；

（3）加入3～4倍树脂摩尔量的N-Fmoc保护氨基酸、HOBt 、HBTU和DIEA，室温振荡反应2～4h；

（4）重复步骤（2）和（3），直至完成整个多肽序列的合成；

（5）将树脂抽干，加入裂解液，摇床振荡后，过滤，鼓氮气除去剩余三氟乙酸，加入乙醚，析出固体后离心、烘干得模拟肽化合物粗品；

（6）粗品使用反相制备液相色谱纯化，收集目标峰流动相溶液脱去乙腈后冷冻干燥得模拟肽化合物纯品。

5.根据权利要求4所述的BH3模拟肽化合物的制备方法，其特征在于：所述裂解液包括苯酚、水、苯甲硫醚和三氟乙酸。

6.以权利要求1-3任一项所述的BH3模拟肽化合物为活性成分的药物或药物组合物，包含任一所述BH3模拟肽化合物和一种或多种药学上可接受的载体或赋型剂。

7.权利要求1-3任一项所述的BH3模拟肽化合物在制备用于预防或治疗以PTP1B为靶点的疾病的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的BH3模拟肽化合物在制备用于预防或治疗以PTP1B为靶点的疾病的药物中的应用，其特征在于：所述疾病包括糖尿病、癌症和阿尔兹海默症。

9.根据权利要求7所述的BH3模拟肽化合物在制备用于预防或治疗以PTP1B为靶点的疾病的药物中的应用，其特征在于：以所述的BH3模拟肽化合物为活性成分的药物或药物组合物以口服或注射给药。