CN103113457A - 拮抗肽sa-12及其在治疗乳腺癌药物中的应用 - Google Patents
拮抗肽sa-12及其在治疗乳腺癌药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种拮抗肽SA-12，其氨基酸序列为Ser-Val-Pro-Leu-Phe-Asn-Phe-Ser-Val-Tyr-Leu-Ala，分子量为1356.60。本发明还公开了该拮抗肽SA-12在制备乳腺癌药物中的应用。本发明拮抗肽SA-12与现有抗肿瘤多肽无同源性，该肽作用于乳腺癌细胞系，能够抑制乳腺癌肿瘤细胞生长并诱导肿瘤细胞凋亡，为广谱、高效、低副作用的靶向性乳腺癌治疗策略提供新的药物候选和物质基础。
Description
技术领域
本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域，具体涉及一种拮抗肽SA-12及其在治疗乳腺癌药物中的应用。
背景技术
1、乳腺癌分子靶向治疗研究现状。
乳腺癌分子靶向治疗是通过特异性阻断肿瘤细胞生长所依赖的信号传导途径而达到抑制肿瘤细胞增殖的目的，其优点是以肿瘤细胞特异性表达的基因或基因产物为靶点，在避免损伤正常组织细胞的同时，最大限度地杀伤肿瘤细胞，是继手术治疗、放疗、化疗及内分泌治疗后又一种重要的、最有前途的治疗策略。乳腺癌的分子靶向治疗研究成果日新月异，以单克隆抗体为基础的分子靶向药物研究取得的成果有目共睹。然而，乳腺癌治疗中的广谱有效性、毒副作用以及长期使用导致的耐药性依然是分子靶向治疗亟需解决的核心问题。因而，新的广谱性、高效性、低毒副作用的乳腺癌分子靶向治疗药物及其作用机制的探索对于发掘新的乳腺癌更加有效的治疗策略具有深远的意义。
2、多肽类抗肿瘤药物研究现状。
多肽被认为是一种介于传统小分子化合物与生物大分子之间的一类药物，而兼具有二者的优点。多肽类药物在结构上比小分子化合物更接近生物大分子，因而安全性更好、生物兼容性与特异性更强，与药物靶点的亲合力也要比小分子化合物高出数十甚至上千倍。与蛋白类药物相比，多肽类药物具有以下优点：①分子量小，免疫原性低，不易产生蛋白类药物常见的免疫排斥与免疫耐受反应；②对肿瘤细胞穿透性强，易于进入实体瘤及其周围的微循环，迅速有效发挥药效；③血循环和全身廓清快，肝肾毒性显著下降；④特异性强，使得药物的靶向性增强，可以准确、高效到达病变组织；⑤结构域单一、功能专一，有效避免蛋白类药物存在的多结构域、多表位所导致的副作用的发生；⑥生产成本低，易于制备、储存，有效避免了蛋白质表达、纯化、储存等过程中的繁琐及大量成本的投入；⑦最重要的是易于进行结构的优化与修饰改造，为更高效的药物开发提供先决条件。
肿瘤的发生与发展是细胞生物学功能执行过程中多种异常因素共同作用的结果，涉及到细胞增殖、细胞周期、凋亡、信号转导、物质代谢、物质转运等过程，这些功能的异常最终都要涉及到生物大分子间相互作用的异常。不同的肿瘤发生、发展所涉及的酶、配体、受体等调控因子不同，因而，可以选择特异性多肽作用于肿瘤发生与发展关键环节所需的调控因子，使其失活或封闭其活性位点，从而抑制肿瘤的生长达到治疗效果。目前已发现多种与肿瘤发生、发展密切相关的肿瘤特异性基因表达产物及调控因子，它们之间的相互作用决定了细胞的命运。细胞生物学功能的执行是由这些调控因子之间相互作用的局部结构域所决定，这种结构域通常是由空间结构上相互毗邻的几个到十几个氨基酸所组成的多肽，因而，可以依据这样的相互作用结构域来设计多肽，用于抑制异常相互作用的发生，从而达到肿瘤治疗的目的。寻找与这些靶点特异性作用的多肽，为肿瘤的诊断与治疗提供高亲和性和特异性的多肽分子，已成为抗肿瘤药物研究的新热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种拮抗肽SA-12，并提供其制备方法和在治疗乳腺癌药物中的应用。
本发明所采用的技术方案是，拮抗肽SA-12，其氨基酸序列为：Ser-Val-Pro-Leu-Phe-Asn-Phe-Ser-Val-Tyr-Leu-Ala，分子量为1356.60。
拮抗肽SA-12在制备乳腺癌药物中的应用。
本发明的有益效果是，本发明拮抗肽SA-12与现有抗肿瘤多肽无同源性，该肽作用于乳腺癌细胞系，能够抑制乳腺癌肿瘤细胞生长并诱导肿瘤细胞凋亡，为广谱、高效、低副作用的靶向性乳腺癌治疗策略提供新的药物候选和物质基础。
附图说明
图1是本发明拮抗肽SA-12的RP-HPLC分析图，其保留时间tR＝11.52min，纯度为95.6％；
图2是本发明拮抗肽SA-12的ESI-MS鉴定图，[M+H]+＝1357.27，[M+Na]+＝1379.94(MW＝1356.60)；
图3是本发明拮抗肽SA-12抑瘤活性MTT实验SKBr-3细胞生长曲线与抑制曲线图；其中，图3-1是时间依赖的生长曲线图，横坐标为时间，纵坐标为OD490值；图3-2是浓度依赖的生长曲线图，横坐标为SA-12浓度梯度，纵坐标为OD490值；图3-2是时间依赖的抑制曲线图，横坐标为时间，纵坐标为抑制率(％)；图3-4是浓度依赖的抑制曲线图，横坐标为SA-12浓度梯度，纵坐标为抑制率(％)；
图4是本发明拮抗肽SA-12诱导乳腺癌细胞系SKBr-3凋亡流式细胞仪分析图；图4-1、图4-3、图4-5和图4-7分别为：加入本发明拮抗肽SA-12后18h、24h、30h和48h的凋亡诱导图，图4-2、图4-4、图4-6和图4-8分别为对应图4-1、图4-3、图4-5和图4-7的空白对照组。
具体实施方式
本发明拮抗肽SA-12，氨基酸序列为：Ser-Val-Pro-Leu-Phe-Asn-Phe-Ser-Val-Tyr-Leu-Ala(丝氨酸-缬氨酸-脯氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸-丝氨酸-缬氨酸-酪氨酸-亮氨酸-丙氨酸)，分子式为C67H97N13O17，分子量为1356.60。本发明拮抗肽SA-12作用于乳腺癌细胞系，能够抑制乳腺癌肿瘤细胞生长并诱导肿瘤细胞凋亡。
说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义如下：
Ser，丝氨酸；
Val，缬氨酸；
Pro，脯氨酸；
Leu，亮氨酸；
Phe，苯丙氨酸；
Asn，天冬酰胺；
Tyr，酪氨酸；
Ala，丙氨酸；
Fmoc，9-芴甲氧羰基；
MBHA，甲苯氢胺树脂；
DCM，二氯甲烷；
THF，四氢呋喃；
DMF，N，N-二甲基甲酰胺；
DIC，N，N-二异丙基碳二亚胺；
HOBt，1-羟基苯并三唑；
DMAP，4-二甲氨基吡啶；
MeOH，甲醇；
PIP，哌啶；
TIS，三异丙基硅烷；
TFA，三氟乙酸；
CH3CN，乙腈；
RP-HPLC，反相高效液相色谱；
ESI-MS，电喷雾电离质谱；
MTT，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐；
FITC，异硫氰酸荧光素。
实施例1
本实施例采用Fmoc固相多肽合成法合成本发明拮抗肽SA-12，具体步骤如下：
步骤1、第一个氨基酸Fmoc-Ala-OH与Rink Amide MBHA树脂的连接：
步骤1.1、将3g(6mmol，0.5mol/g)Rink Amide MBHA树脂置于反应器中，加入20ml DCM溶胀30min，抽滤除去DCM，得到溶胀后的树脂。
步骤1.2、将Fmoc-Ala-OH(18mmol)溶于20ml THF∶DMF(V∶V)＝11∶9溶液中，加入50ml溶有DIC(21.6mmol)和HOBt(18mmol)的THF∶DMF(V∶V)＝11∶9溶液，冰浴下混合，反应30min。然后将反应溶液中沉淀过滤除去，转入步骤1.1的得到的溶胀后的树脂中，再加入DMAP(3mmol)，室温下反应4h。抽滤除去反应液得到接合有Ala的树脂，用DMF、DCM、MeOH分别洗涤三次该接合有Ala的树脂，每次3min。
步骤1.3、将12ml无水吡啶、12ml乙酸酐溶于60ml DMF后，得到脱Fmoc试剂，将该脱Fmoc试剂加入上述步骤1.2得到的树脂中，反应2h；反应结束后将得到的树脂分别用DMF、DCM、MeOH各100ml依次洗涤，每次3min，真空干燥；再向树脂中加入30ml PIP∶DMF(V∶V)＝1∶4混合液，反应20min，脱去Fmoc保护基；最后依次加入30ml DMF、MeOH、DCM轮流洗涤树脂三遍，过滤。
步骤2、肽链的延伸：
根据步骤1得到的Fmoc-Ala-Rink Amide MBHA树脂的上载量，按照n(Fmoc-Leu-OH)∶n(DIC)∶n(HOBt)∶n(OH-Ala-Rink Amide MBHA)＝3∶3.5∶3∶1(n为摩尔量)的比例，将Fmoc-Leu-OH和HOBt溶解于40ml THF∶DMF(V∶V)＝11∶9的溶液中，缓慢加入DIC，20℃下反应1h，过滤掉沉淀，将滤液加入到步骤1得到的树脂中反应。反应进程采用Chloranil方法检测。反应结束后，过滤，依次加入60ml的DMF、MeOH和DCM洗涤树脂三遍，过滤。向树脂中加入30ml PIP∶DMF(V∶V)＝1∶4混合液，反应20min，脱去Fmoc保护基。依次加入30ml DMF、MeOH、DCM洗涤树脂三遍，并过滤。准备下一个氨基酸的缩合。
按照缩合Fmoc-Leu-OH的操作步骤，依次缩合其余10个氨基酸(Tyr、Val、Ser、Phe、Asn、Phe、Leu、Pro、Val和Ser)，得到12肽-树脂。
加入DCM洗涤该12肽-树脂，真空干燥10h。
步骤3、肽树脂的切割及纯化：
将步骤2得到的12肽-树脂置于砂芯反应器中，加入80ml切割试剂(2mlH20，2ml TIS，76ml TFA)，反应2h。反应完成后，过滤，旋转蒸发浓缩滤液。在浓缩液中加入400ml冰乙醚，析出沉淀。4℃下，5000rpm下离心10min，然后弃去上清液，真空干燥沉淀即为粗肽。
将得到的粗肽溶于水中，经冷冻干燥。将干燥后的粗肽溶于水中，10000r/min离心10min，除去沉淀再使用制备级RP-HPLC色谱纯化。
色谱纯化条件：色谱柱(4.6*250mn，VYDAC-C18)，流动相A为0.1％TFA/CH3CN，流动相B为0.1％TFA/H2O，检测波长为220nm。洗脱梯度为10-60％A，25min。收集保留时间tR＝15.61min处目标峰，冷冻干燥得到本发明SA-12肽纯品。
实施例2
本实施例采用Fmoc固相多肽合成法合成本发明拮抗肽SA-12，具体步骤如下：
步骤1、树脂前处理：
步骤1.1、溶胀：称取1.43g Rink Amide树脂(200～400目，1％交联度，取代值0.7mmol/g)加入反应器中，加入10ml DCM，振荡溶胀约2h，然后抽滤除去DCM，再加入10ml DMF将树脂清洗3遍。
步骤1.2、脱Fmoc：向反应器中加入10ml 20％PIP/DMF溶液脱Fmoc，重复两次，5min+20min。脱除反应完成后，用DMF清洗3遍，再用DCM清洗2遍，得到脱Fmoc的树脂。
步骤1.3、茚三酮检测：挑取少量脱Fmoc的树脂放入试管进行茚三酮检测，试管中分别滴加茚检试剂I、II、III各两滴，然后沸水浴加热3min，观察试管中树脂的颜色变化。树脂显蓝色则表明脱Fmoc完全。
步骤2、氨基酸活化：
在10ml圆底烧瓶中加入2当量Fmoc-Ala-OH和2当量HOBt，加入尽少量的DMF溶解。待充分溶解后，缓慢滴加入2当量DIC，磁力搅拌器搅拌反应10分钟。
步骤3、偶合反应：
向反应器中的树脂中加入10ml DMF溶液清洗树脂，重复三遍。将已活化的Fmoc-Ala-OH溶液逐滴加入反应器的树脂中，再补加适量DMF溶液，使树脂充分悬浮在反应器中。640r/min振荡反应2小时，抽去溶剂。
茚三酮及四氯苯醌检测：待反应完成后，向反应器中加入10ml DMF，清洗两遍。再加入10ml DCM，清洗两遍。挑取少量树脂放入试管进行茚三酮检测，分别滴加茚检试剂I、II、III各两滴，于沸水浴中加热3min，观察试管中树脂颜色变化。树脂无蓝色出现则表明偶合完全；脯氨酸的检测可以使用四氯苯醌进行辅助鉴定，即在加入了肽树脂的试管中分别滴加四氯苯醌检测试剂I、II各两滴，然后于常温下观察树脂颜色的变化。结果无蓝绿色出现则表明偶合完全。
茚三酮检测试剂的配制：
I、10g苯酚/2.5ml无水乙醇；
II、1ml0.01M KCN水溶液/49ml哌啶；
III、5％茚三酮/乙醇溶液。
四氯苯醌检测试剂的配制：
I、2％乙醛/DMF溶液(v/v)；
II、2％四氯苯醌/DMF溶液(w/v)。
步骤4、肽树脂的延伸
氨基酸缩合完成后，依次按照脱Fmoc、氨基酸活化、缩合反应的步骤重复进行缩合，完成本发明拮抗肽SA-12基酸序列中其余11个氨基酸的耦合，最终得到所需目标肽树脂。
步骤5、多肽的切割及纯化
将得到的肽树脂按如下方式进行清洗，DMF 10ml×2，MeOH 10ml×1，DCM 10ml×2，MeOH 10ml×2。清洗完毕后，将肽树脂真空抽干，约3小时。
所得肽树脂中加入26.5ml TFA切割剂(TFA/phenol/H2O/TIS＝88∶5∶5∶2)，640r/min振荡反应2小时。
切割完成后，将反应器中切割液注入10倍体积的冷乙醚(-20℃)中沉淀肽，再向反应器中补加2-3ml切割剂，振荡反应10min，注入冷乙醚中沉淀。将所得沉淀超声分散，使有机溶剂与杂质充分溶到乙醚中。在4℃下，4000r/min离心15分钟。弃去上清乙醚，重新加入冷乙醚，超声分散，同样条件下低温离心，重复三次。
将所得粗肽置于通风橱中，使其自然挥发至粉末状。粗肽溶于水中，经冷冻干燥。将干燥的粗肽溶于水中，10000r/min离心10min，除去沉淀，再使用制备型RP-HPLC纯化。
色谱纯化条件：色谱柱(4.6*250mm，kromasil C18-5)，流动相A为0.1％TFA/CH3CN，流动相B为0.1％TFA/H2O，检测波长为220nm。洗脱梯度为17-42％A，25min。收集保留时间tR＝9.32min处目标峰，冷冻干燥得到SA-12肽纯品。
收集目标峰，冷冻干燥得到拮抗肽SA-12纯品。
本发明拮抗肽SA-12还能根据本发明中氨基酸序列，使用其他常规合成法(如液相合成法、自动多肽合成仪等)合成其全序列。本实施例1和实施例2不限制本发明拮抗肽SA-12的制备方法。
实施例3
本发明拮抗肽SA-12的RP-HPLC分析及质谱鉴定：
RP-HPLC分析：取1mg SA-12肽纯品，用1ml双蒸水溶解，经直径0.22μm滤膜过滤以备分析。液相分析条件：色谱分析柱(Symmetrix ODS-R，4.6*250mm，5um)；流动相A：0.1％TFA in 100％ CH3CN；流动相B：0.1％TFAin 100％ H2O，流速：1.0ml/min，检测波长220nm。分析梯度为35-60％A，25min。保留时间tR＝11.52min，纯度为95.6％，结果如图1所示。
ESI-MS质谱分析：喷雾电压3.00kV，毛细管温度350℃，正离子检测。实施例1制备的拮抗肽SA-12的检测结果为：[M+H]+＝1357.7，[M+Na]+＝1379.94(拮抗肽SA-12分子量为1356.60)。质谱分析结果符合预测，可以推断产物为拮抗肽SA-12，结果如图2所示。
实施例4
本发明拮抗肽SA-12抑制肿瘤活性实验
MTT实验：
培养乳腺癌细胞系SKBr-3，待细胞生长至对数期后，分别加入8nM、80nM、800nM、8μM、80μM本发明拮抗肽SA-12，5％CO2、37℃条件下分别孵育24h、48h、72h，MTT法检测捕获肽对乳腺癌细胞系的生长抑制作用。
如图3所示，本发明拮抗肽SA-12的肿瘤抑制活性随着加药浓度的增高而升高，在80μM时，拮抗肽SA-12对乳腺癌细胞SKBr-3的生长具有明显的抑制作用(P≤0.05)。80μM肽浓度下，拮抗肽SA-12对于SKBr-3的24h、48h、72h肿瘤抑制率分别为35.39％、37.14％、54.19％，具有时间依赖性。
流式细胞仪检测：
培养乳腺癌细胞系SKBr-3，待细胞生长至对数期。实验组与对照组分别加入80μM本发明拮抗肽SA-12，5％CO2、37℃条件下孵育，分别于18h、24h、30h、48h收集一次细胞，流式细胞仪检测本发明拮抗肽SA-12对乳腺癌细胞的凋亡诱导效应。
流式细胞仪检测条件，激发波长Ex＝488nm，发射波长Em＝530nm，Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测；PI红色荧光通过PI通道(FL3)检测。荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。
如图4所示，与对照组相比，80μM肽浓度下，本发明拮抗肽SA-12对于SKBr-3的18h、24h、30h、48h凋亡诱导率分别为：9.49％、7.56％、7.16％、8.38％。本发明拮抗肽SA-12对乳腺癌细胞SKBr-3具有明显的凋亡诱导效应，其中，18h时凋亡诱导效应最明显。从图中可以看出，本发明拮抗肽SA-12对SKBr-3的凋亡诱导效应主要表现为对晚期凋亡的诱导与促进。
综观以上研究结果，本发明拮抗肽SA-12对于乳腺癌细胞系SKBr-3具有明显的肿瘤生长抑制与促凋亡活性，为乳腺癌的分子靶向治疗提供了新的药物候选与物质基础。
Claims (2)
1.一种拮抗肽SA-12，其特征在于，其氨基酸序列为：Ser-Val-Pro-Leu-Phe-Asn-Phe-Ser-Val-Tyr-Leu-Ala，分子量为1356.60。
2.权利要求1所述拮抗肽SA-12在制备乳腺癌药物中的应用。
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