CN104650190A - 肝癌细胞表面特异性结合的多肽 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肝癌细胞表面特异性结合的多肽，利用噬菌体展示随机十二肽库筛选得到一条多肽片段，其氨基酸序列为：LWDMSTPHRPLT。本发明利用噬菌体多肽展示技术筛选肝癌细胞结合的多肽序列，ELISA鉴定噬菌体克隆与肝癌细胞的亲和力，获得8个噬菌体克隆，测序获得4条多肽序列，其共有氨基酸序列为L(H)***S(T)*P(H)H(S)*P(L)LT(L)，细胞免疫荧光进一步鉴定噬菌体阳性克隆的靶向性结果提示噬菌体阳性克隆能够特异性结合肝癌细胞，筛选获得的肝癌细胞特异性多肽为肝癌的早期诊断、抗肿瘤药物的靶向运输及靶向短肽药物的研发提供实验依据。

Description

肝癌细胞表面特异性结合的多肽

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及筛选肿瘤组织特异性结合肽，特别是一种肝癌细胞表面特异性结合的多肽(序列)。

背景技术

肝癌(Hepatocarcinoma)是消化道常见恶性肿瘤之一。在中国，肝癌是发病率高、死亡率高、治疗费用高的疾病。我国是世界上肝癌高发区之一，其肝癌发病率约为欧美地区的10倍。就死亡率而言，肝癌在我国恶性肿瘤死亡率位居第二，仅次于肺癌，每年约50万人死于肝癌，而且发病率和死亡率一直处于上升趋势。因为肝癌在早中期可能不会有症状，所以多数癌症病人就诊时已是晚期，错过了肝癌治疗的最佳时间。晚期肝癌的有效治疗方案很少，病人多数前景不好。所以，要提高肝癌术后生存率和降低死亡率的关键就在于早期发现、早期诊断和早期治疗。但是，目前对肝癌由于仍然缺乏特异的、廉价的、方便的早期诊断方法，所以对肝癌的早期检出率仍很低，病人死亡率仍很高。

噬菌体展示技术(Phage Display Technology)是一项特异性多肽或蛋白的筛选技术，此技术可将目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子(如抗体、酶和细胞表面受体等)的多肽配体通过体外亲和淘选程序得以快速鉴定。噬菌体展示技术已被广泛用于肿瘤诊断标志物和抗肿瘤先导化合物的筛选、肿瘤特异性抗体和肿瘤药物靶向运输等方面的研究。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种由噬菌体展示十二肽库筛选得到的、对肝癌细胞表面特异性结合的多肽序列，并提供鉴定该多肽与肝癌细胞的亲和力和特异性的实验结果，证明该多肽在肝癌的早期分子影像学诊断、靶向化疗、与其它材料偶联而进行的肝癌靶向治疗等方面具有的巨大应用价值。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

肝癌细胞表面特异性结合的多肽，其特征在于，利用噬菌体展示十二肽库筛选得到一条多肽片段，其氨基酸序列为：LWDMSTPHRPLT。

该多肽片段能够特异性结合肝癌细胞，而不识别人胚肾细胞(即正常细胞)，并对其他消化道肿瘤细胞表现出极低亲和力或者无亲和力。

上述肝癌细胞表面特异性结合的多肽的筛选方法，利用噬菌体随机十二肽库，以体外培养的肝癌细胞HepG2系为靶细胞，以人胚肾细胞HEK293细胞系为吸附细胞，进行4轮全细胞消减筛选，随机挑取30个噬菌体克隆扩增并滴定，利用酶联免疫吸附实验鉴定阳性克隆，比较阳性克隆与HepG2细胞的亲和力，提取阳性噬菌体克隆单链DNA测序，将测序结果比对后获得拥有“共有序列”的阳性克隆组4个，对这4条公有序列组以细胞免疫荧光法鉴定它们的特异性和敏感性，最后，获得了本发明所提供的肽序为最佳肽序。

以该肽序列为模板合成荧光标记的肝癌特异性多肽探针(命名为FITC-Hepa探针)，进一步以肝癌细胞和消化道其他癌细胞、肝癌临床组织标本芯片来鉴定该多肽对肝癌细胞和组织的特异性和敏感性。

各种噬菌体水平和合成肽(FITC-Hepa探针)水平的免疫荧光实验结果进一步提示该多肽能够特异性结合人肝癌细胞和组织，这为肝癌的早期诊断、抗肿瘤药物的靶向运输及靶向纳米药物的研发提供了实验依据。

附图说明

图1是噬菌体克隆位点序列特征；

图2是精简遗传密码子表；

图3是10个阳性噬菌体克隆与HepG2细胞亲和力的ELISA鉴定；

图4是阳性克隆靶向HepG2细胞的免疫荧光检测结果，其中：A：肝癌细胞HepG2；B：肝癌细胞SMMC7721；C：HEK293细胞；D：结直肠癌细胞；E：胃癌细胞；F：食道癌细胞；G：对照多肽与HepG2细胞；H：PBS对照；

图5是HCC1靶向肝癌细胞部位的激光共聚焦显微镜检测结果。其中：A：肝癌HepG2细胞；B：肝癌SMMC7721细胞；C：HEK293细胞。

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

本发明是在以往曾经筛选的基础上，利用同样筛选方法和材料再次筛选获得的一种对人肝癌细胞具有很好的结合特异性和敏感性的12肽序列。肽库筛选实验结果即何种肽序的获取完全具有不确定性，对于本领域技术人员来讲具有不可预料性。

一、技术路线

本发明采用噬菌体多肽展示技术，以人肝癌HepG2细胞系为靶细胞，以人胚肾HEK293细胞为阴性吸附细胞进行4轮消减筛选，从噬菌体12肽库中筛选能特异性结合肝癌HepG2细胞的多肽基序，检索其可能识别的细胞表面受体，为肝癌早期诊断和靶向治疗的进一步研究提供良好的实验依据，具体技术路线如图1所示。

二、材料与方法

2.1主要实验材料

2.1.1细胞、噬菌体肽库、宿主菌

(1)细胞株：人肝癌细胞株HepG2，人胚肾细胞株HEK293，购于美国ATCC(Rockville，美国)。

(2)噬菌体肽库：随机十二肽噬菌体展示文库(Ph.D.-12^TM Phage DisplayPeptide Library Kit)购自New England Biolabs，USA。

(3)宿主菌：大肠杆菌E.coli ER2738：购自New England Biolabs，USA。

(4)细胞培养基：RPMI 1640完全培养基，购自美国Invitrogen公司。

2.2实验方法

2.2.1细胞培养

用RPMI 1640完全培养基、37℃、饱和湿度、5％CO2孵箱。

2.2.2宿主菌E.coli ER2738的培养

E.coli ER2738是NEB公司的Ph.D系列噬菌体肽库的专用菌株。用LB-Tet培养基、37℃恒温摇床、300rpm振荡过夜。

2.2.3噬菌体展示十二肽库的消减筛选

以人胚肾HEK293细胞为阴性吸附细胞，肝癌HepG2细胞为靶细胞，参照随机十二肽噬菌体展示文库(Ph.D.-12TM Phage Display Peptide Library Kit)使用说明书，优化改良筛选方法，进行4轮消减筛选，保持每一轮筛选投入噬菌体量不少于1.5×1010PFU。第一轮筛选程序如下：

(1)细胞准备：将生长状态良好的人肝癌细胞HepG2和人胚肾HEK293细胞，分别传代，接种于10cm2细胞培养瓶，置于37℃、饱和湿度、5％CO2孵箱培养24h后换液，培养至细胞贴壁，生长状态良好，待融合度为90％以上,汇合成单层细胞时进行筛选。

(2)细菌活化：将过夜振荡培养的ER2738以1:100稀释于20ml LB-Tet液体培养基中，37℃，225rpm，缓慢振摇2～3h至对数前期，于紫外分光光度计上测OD600～0.5。

(3)封闭：取融合度为90％以上的HEK293细胞，吸弃培养基，用PBS轻轻洗涤两次，加无血清培养基，37℃、5％CO2培养1h，吸去培养液，加入Blocking buffer(3％BSA+PBS)，37℃封闭2h；重复同样操作，封闭肝癌细胞HepG2细胞。

(4)洗涤：吸弃封闭液，用0.1％TBST轻柔地洗涤6次，操作要避免细胞脱落。

(5)阴性细胞吸附：将10μl噬菌体库(第2轮至第4轮筛选取扩增库1.5×1010PFU)与1ml TBS混合，与HEK293细胞孵育，37℃，孵育1h，孵育期间每隔15min放脱色摇床上微摇。

(6)取上清：用吸管缓慢吸取上清，转移至2ml灭菌离心管，1000rpm，离心5min，转移上清至新离心管，再离心一次以去除上清中可能含有的细胞。

(7)结合：迅速将上清与已封闭、洗涤好的肝癌HepG2细胞孵育，37℃，孵育2h。

(8)洗涤：小心吸弃上清，消化收集细胞于离心管，1000rpm，离心5min，吸弃上清，用0.1％TBST反复吹打洗涤HepG2细胞20次，1000rpm，离心5min，重复洗涤4次，弃尽上清获得细胞沉淀，用无菌滤纸条吸尽剩余液滴。

(9)扩增：将细胞沉淀加入已摇至对数前期的ER2738菌液中，置于恒温摇床，37℃，225rpm，振荡培养4.5h。

(10)噬菌体纯化：

①将噬菌体扩增菌液分装于灭菌的1.5ml离心管，每管1ml，13000rpm，离心10min，上清转入新离心管中，再离心，取上清上部80％转入新离心管中。

②加入1/6体积的PEG/NaCl(167μl/tube)，反复vertex混匀，4℃沉淀噬菌体过夜。

③次日，4℃，13000rpm，离心过夜沉淀物15min。

④倒掉上清，再次短暂离心，用微量移液器吸尽残留上清液。

⑤每管加入1ml TBS重悬沉淀，反复vertex混匀，悬液转移至灭菌1.5ml离心管中，4℃，13000rpm，离心5min，以去除残余细胞。

⑥上清转入另一无菌微量离心管中，用1/6PEG/NaCl(170μl/tube)，反复vertex混匀，再次沉淀，冰上孵育60min，4℃，13000rpm，离心10min。

⑦弃上清，再次短暂离心，用微量移液器吸去残余上清。

⑧每管加入200μl TBS/0.02％NaN3，反复vertex混匀，短暂离心1min，沉淀任何残余不溶物，上清转入新1.5ml离心管中，此即为扩增后的一级库，标记，以1:1加入灭菌甘油，-20℃保存。

(11)噬菌体滴定：

①取2～3μl E.coli ER2738宿主菌，涂布M9-Tet平板，置于恒温培养箱37℃倒置培养过夜。

②菌操作挑取分离良好的单克隆于3ml LB-Tet液体培养基中，置于恒温摇床37℃，300rpm，振荡培养16～18小时。

③将过夜ER2738培养物1:100稀释于3ml LB-Tet培养基中，225rpm，振荡培养1.5h～2h，至OD600～0.5。

④准备5个LB/IPTG/Xgal平板于37℃恒温培养箱预热(每个噬菌体稀释度对应一个平板)。

⑤预先准备45℃水浴，微波炉中融化Top Agarose，分装于10ml离心管中，3ml/tube，置于水浴中备用。

⑥将ER2738(OD600～0.5)分装于1.5ml灭菌离心管中(每个噬菌体稀释度对应一管)，200μl/tube，4℃保存备用。

⑦在LB中准备10倍系列稀释的噬菌体扩增库，稀释范围为102～1011。

⑧取107～1011不同噬菌体稀释度，每管10μl，分别与200μl宿主菌混合，快速振荡混匀，室温温育5min。

⑨将感染的细菌快速加入45℃预温的Top Agarose中，每次一管，快速vortex混匀，立即倾注于37℃预热的LB/IPTG/Xgal平板上，快速旋转倾斜平版使之均匀铺展开来。室温冷却5min，置于恒温培养箱中，37℃倒置培养过夜。

⑩次日，待平板长出蓝斑，选择密度合适(～100个蓝斑)的平板计数，计算扩增噬菌体库的滴度。计算方法如下：扩增噬菌体库的滴度＝(蓝斑数目×对应噬菌体稀释倍数)/10μl(pfu/μl)。

(12)新一轮筛选：将滴定后的次级库再次与HEK293细胞和肝癌HepG2细胞孵育，筛选过程如上述，分别用上一轮结合、扩增、滴定的噬菌体次级库，进行3轮筛选，每轮筛选投入的噬菌体量均为1.5×1010PFU，逐轮增加筛选强度：与阴性细胞HEK293细胞孵育时间增加至1.25h、1.5h、2h；与靶细胞HepG2细胞孵育时间每轮筛选减少为1.5h、1.25h、1h；TBST洗涤次数相应增加为6次、8次、10次；洗涤液中Tween-20浓度依次增加为0.2％、0.3％、0.5％。

2.2.4噬菌体阳性克隆的鉴定(ELISA法)

按照常规细胞ELISA实验流程进行。首先对从最后一轮筛选的洗脱液克隆化后挑去的数十个克隆以ELISA判定它们对肝癌细胞的特异性亲和力，取与阴性对照吸光度比值大于2.0者初步定为“阳性克隆”。

2.2.5阳性噬菌体克隆多肽序列的测定：

按照噬菌体测序常规准备和送送南京金丝瑞生物工程公司全自动测序。96gⅢ测序引物：5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’。根据肽库试剂盒说明书读序图，利用DNAStar软件找到EgalⅠ酶切位点CGGCCG和KpnⅠ酶切位点GGTACC，确定12肽基因区段，按照试剂盒说明书提供的三联密码子表及克隆方案(参见图1、图2)翻译成多肽序列。

2.2.7阳性噬菌体克隆的特异性和敏感性的鉴定

测序后根据每个共有序列(Consensus sequences)所包含克隆结合初步ELISA结果确定各对应共有序列的代表性克隆，对这些代表性克隆再以常规细胞免疫荧光法进行结合特异性和敏感性的最终鉴定。

2.2.8统计学方法

采用SPSS 16.0-GLM中的Univariate分析数据，数据均以±SD表示，组间多重比较采用Duncan检验处理。P<0.01为差异极显著，P<0.05为差异显著，P>0.05为无统计学意义。

三、实验结果

3.1噬菌体十二肽库4轮消减筛选

本发明是从噬菌体随机十二肽库中筛选出与人肝癌细胞亲和力较高的噬菌体多肽，以人源肝癌HepG2细胞为靶细胞，以人胚肾细胞HEK293细胞为阴性吸附细胞，完成对噬菌体十二肽库4轮消减筛选，回收与肝癌HepG2细胞结合的噬菌体，重复对阴性细胞的消减筛选以排除非特异克隆。在筛选过程中，严格控制每轮筛选中加入噬菌体的数量，以保证筛选结果的稳定性。噬菌体原库的效价为1.5×1013pfu/ml，第一轮筛选投入噬菌体为1.5×10¹¹pfu，回收噬菌体滴定后每轮尽量保证投入噬菌体量在1.5×10¹⁰pfu以上(如表3-1和图4所示)，通过4轮消减筛选，特异性克隆得到大量富集和扩增，为进一步挑取阳性克隆奠定良好的实验基础，提高了获得具有高亲和力噬菌体十二肽的可能性。

表3-1 四轮消减筛选中投入噬菌体量和回收噬菌体滴度

Round of biopanning	Input phages(pfu)	Output phages(pfu/ml)
			1	1.5×1011	1.71×1013
2	1.5×1011	1.62×1013
			3	1.5×1011	1.60×1013
4	1.5×1011	1.54×1013

3.2细胞ELISA初步鉴定噬菌体阳性克隆

第4轮消减筛选后不进行扩增，直接滴定，从约有100个蓝斑的LB/IPTG/Xgal平板上随机挑取30个噬菌体单克隆，感染宿主菌扩增、纯化并滴定，经细胞酶联免疫分析(ELISA)初步鉴定，依据噬菌体克隆与肝癌HepG2细胞结合情况，排除非特异性结合的克隆，以PBS为空白克隆对照，同时以原库单克隆为无关克隆对照(URPs)，三次实验结果显示(表3-2，表3-3)：OD450值阳性细胞组(HepG2细胞)与阴性细胞组(HEK293细胞)之比均大于2.1倍，它们能与肝癌HepG2细胞较好结合，与人胚肾HEK293细胞亲和力较弱或不结合，无关克隆对照和PBS空白克隆对照组蓝色较弱或无色。利用ELISA法，对噬菌体阳性克隆在HepG2细胞上的结合特异性进行反复鉴定(图3)，对ELISA数据结果进行统计学分析，显示阳性克隆与HepG2细胞的亲和力均显著高于无关克隆对照组和PBS对照组(P<0.01)。

表3-2 ELISA鉴定噬菌体单克隆与HepG2细胞的亲和力

表3-3 ELISA鉴定阳性克隆与HepG2细胞的亲和力

**：P<0.01与PBS对照组和噬菌体无关克隆(URPs)对照组比较。

#：P>0.05与PBS对照组比较。

3.3噬菌体阳性克隆的测序结果及分析

3.3.1测序结果

表3-4：噬菌体阳性克隆测序

测序结果如表3-4显示，8个噬菌体克隆测序正确、含有外源插入的随机序列，并在随机区域内含有编码十二肽的36个碱基，且每一密码子第三位碱基为G或T，符合噬菌体随机肽库的构建原则，结果显示与肝癌细胞结合的阳性噬菌体克隆含有4个公有序列：LWDMSTPHRPLT，LLDATRHSPPLT，LHWSTPHHELLT和HWSDSHHHGPLL。分别命名为HCC1、HCC2、HCC3、HCC4。

3.3.2氨基酸序列比对分析

HCC1、HCC2、HCC3、HCC4的序列之间有不同程度的重复序列，将四条多肽序列编辑为FASTA格式，采用Clustal X1.83软件分析，Load序列，选择Do Complete Alignment菜单，寻找保守氨基酸位点。通过BioEdit软件分析四条多肽序列的基序(Motif Sequence)，输出序列比对结果如下：

表3-5：Clustal X多序列比对

Peptide Name	Consenusus Sequence
		HCC1	LWDMSTPHRPLT
HCC2	LLDATRHSPPLT
		HCC3	LHWSTPHHELLT
HCC4	HWSDSHHHGPLL
		Motif Sequence	L(H)***S(T)*P(H)H(S)*P(L)LT(L)

*表示随机氨基酸位点

3.4阳性噬菌体克隆的特异性和敏感性鉴定

采用细胞免疫荧光技术，以FITC标记的IgG为二抗，抗M13多克隆抗体为一抗，荧光显微镜放下显示绿色荧光。将展示四条HepG2细胞特异性多肽基序的噬菌体阳性克隆、无关克隆对照(URPs)和PBS对照分别与肝癌HepG2细胞和人胚肾HEK293细胞孵育，经过洗涤和一抗二抗孵育，倒置荧光显微镜下检查结果如图4、图5所示，结果显示HCC1～4多肽的噬菌体阳性克隆均不同程度地结合到HepG2细胞上，并主要结合于细胞膜上。而阳性噬菌体克隆不与HEK293细胞结合，PBS对照组和无关克隆对照组亦无绿色荧光。

本发明以肝癌HepG2细胞为靶细胞，以人胚肾HEK293为吸附细胞，采用全细胞筛选策略，经过4轮消减筛选，经过酶联免疫吸附试验鉴定，随机挑取的30个噬菌体克隆中有10个阳性克隆，进一步鉴定其中8个阳性克隆与HepG2细胞的亲和力发现28号克隆亲和力最高，阳性克隆的测序获得4条共同多肽序列，分别为LWDMSTPHRPLT(HCC1)，LLDATRHSPPLT(HCC2)，LHWSTPHHELLT(HCC3)和HWSDSHHHGPLL(HCC4)。Motif sequence为L(H)***S(T)*P(H)H(S)*P(L)LT(L)。细胞免疫荧光进一步鉴定HCC1噬菌体克隆对于肝癌HepG2细胞的靶向性最强，能够特异性靶向肝癌细胞(HepG2和SMMC7721细胞)，而不识别正常细胞(人胚肾HEK293细胞)以及消化道其他组织来源的癌细胞(图4、5)。

本发明利用噬菌体多肽展示技术，筛选获得1条肝癌HepG2细胞特异性多肽，在肝癌早期检测和靶向治疗方面具有潜在的应用价值，在治疗方面，有望利用特异性高、分子量小、穿透力强、亲和力高的短肽来取代传统化疗药物，或与某些化疗药物如顺铂、阿霉素等偶联，达到靶向给药的目的，减小化疗药物的非特异性和毒副作用；在肝癌早期检测方面，利用荧光标记的多肽可以结合肝癌细胞而非正常组织，肝癌细胞特异性多肽经放射性同位素标记能够在肿瘤组织中特异性富集，适用于肿瘤成像和分子影像诊断，多肽对于肿瘤细胞分子标记物设计和造影剂的改造也具有重要意义，对于肝癌早期检测、癌细胞定位和疗效评价都具有重要意义。

Claims (2)

1.肝癌细胞表面特异性结合的多肽，其特征在于，其氨基酸序列为：LWDMSTPHRPLT。

2.如权利要求1所述的肝癌细胞表面特异性结合的多肽，其特征在于，所述的多肽能够特异性结合肝癌细胞，而不识别正常人胚肾细胞以及消化道组织来源的癌细胞。