CN113527431A - 特异靶向人结直肠癌细胞的多肽及其用途 - Google Patents
特异靶向人结直肠癌细胞的多肽及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113527431A CN113527431A CN202010293450.XA CN202010293450A CN113527431A CN 113527431 A CN113527431 A CN 113527431A CN 202010293450 A CN202010293450 A CN 202010293450A CN 113527431 A CN113527431 A CN 113527431A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polypeptide
- seq
- colorectal cancer
- cancer cells
- phage
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 78
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 73
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 70
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 52
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 title claims abstract description 52
- 230000008685 targeting Effects 0.000 title claims abstract description 22
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 29
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 6
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 claims description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 2
- 239000003596 drug target Substances 0.000 claims description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 claims description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 20
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 15
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 9
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 abstract description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 238000012827 research and development Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 abstract description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 52
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 24
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 22
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 13
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 12
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 6
- 210000003771 C cell Anatomy 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 5
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000012216 imaging agent Substances 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000000118 anti-neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- RTZCUEHYUQZIDE-WHFBIAKZSA-N Ala-Ser-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O RTZCUEHYUQZIDE-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ITHMWNNUDPJJER-ULQDDVLXSA-N Arg-His-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ITHMWNNUDPJJER-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- DOURAOODTFJRIC-CIUDSAMLSA-N Asn-Ser-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N DOURAOODTFJRIC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 206010052804 Drug tolerance Diseases 0.000 description 1
- AAJHGGDRKHYSDH-GUBZILKMSA-N Glu-Pro-Gln Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O AAJHGGDRKHYSDH-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- SYIPVNMWBZXKMU-HJPIBITLSA-N His-His-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N SYIPVNMWBZXKMU-HJPIBITLSA-N 0.000 description 1
- CNHSMSFYVARZLI-YJRXYDGGSA-N His-His-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O CNHSMSFYVARZLI-YJRXYDGGSA-N 0.000 description 1
- DGLAHESNTJWGDO-SRVKXCTJSA-N His-Ser-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N DGLAHESNTJWGDO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 101150098499 III gene Proteins 0.000 description 1
- UCXQIIIFOOGYEM-ULQDDVLXSA-N Leu-Pro-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 UCXQIIIFOOGYEM-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- RPWTZTBIFGENIA-VOAKCMCISA-N Lys-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O RPWTZTBIFGENIA-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- IHITVQKJXQQGLJ-LPEHRKFASA-N Met-Asn-Pro Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N IHITVQKJXQQGLJ-LPEHRKFASA-N 0.000 description 1
- KZKVVWBOGDKHKE-QTKMDUPCSA-N Met-Thr-His Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 KZKVVWBOGDKHKE-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010359 Newcastle Disease Diseases 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- NJJBATPLUQHRBM-IHRRRGAJSA-N Phe-Pro-Ser Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O NJJBATPLUQHRBM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- FNGOXVQBBCMFKV-CIUDSAMLSA-N Pro-Ser-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FNGOXVQBBCMFKV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- BEAFYHFQTOTVFS-VGDYDELISA-N Ser-Ile-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N BEAFYHFQTOTVFS-VGDYDELISA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- JAJOFWABAUKAEJ-QTKMDUPCSA-N Thr-Pro-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N)O JAJOFWABAUKAEJ-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 1
- IXEGQBJZDIRRIV-QEJZJMRPSA-N Trp-Asn-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IXEGQBJZDIRRIV-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- STTVVMWQKDOKAM-YESZJQIVSA-N Tyr-His-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)[C@H](CC3=CC=C(C=C3)O)N)C(=O)O STTVVMWQKDOKAM-YESZJQIVSA-N 0.000 description 1
- CVXURBLRELTJKO-BWAGICSOSA-N Tyr-His-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N)O CVXURBLRELTJKO-BWAGICSOSA-N 0.000 description 1
- XGZBEGGGAUQBMB-KJEVXHAQSA-N Tyr-Pro-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N)O XGZBEGGGAUQBMB-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 1
- GNWUWQAVVJQREM-NHCYSSNCSA-N Val-Asn-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N GNWUWQAVVJQREM-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 108010086434 alanyl-seryl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 239000003972 antineoplastic antibiotic Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 150000004696 coordination complex Chemical class 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007822 cytometric assay Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000001365 lymphatic vessel Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000079 pharmacotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N sodium azide Substances [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
- A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
- A61K51/04—Organic compounds
- A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种结直肠癌细胞特异结合多肽及其用途。所述多肽的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO.1 WNELPYHHTHSH；SEQ ID NO.2：ASGTPHRHYMTH；SEQ ID NO.3：PSEFPSYHTNSH；SEQ ID NO.4：MNPYPTHHIVNH；SEQ ID NO.5：KTLEPQYHPSIH。本发明还涉及了上述多肽及其生物活性片段和衍生物作为靶向多肽与能杀伤癌细胞的制剂和显像制剂形成的药物组合物和分子影像探针及其用途。本发明所述多肽对结直肠癌细胞具有特异靶向结合能力，选择性强，为临床上肿瘤的早期诊断和靶向药物的研发提供了新思路和新方向。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及能特异靶向人结直肠癌细胞的多肽；包含该多肽的衍生物；编码上述多肽及其衍生物的核酸；及该多肽或衍生物的应用，尤其是用于肿瘤的预防、诊断和治疗。
背景技术
结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一, 据“Global cancer statistics 2018”显示，其发病率已位居全球第3位，死亡率也位于恶性肿瘤前列。由于结直肠癌细胞具有快速增殖能力和转移能力，其发病率和致死率呈逐年上升趋势。结直肠癌的诱因多且隐匿，许多患者确诊时已至中晚期，失去了最佳治疗时机。结肠部分的毛细血管和淋巴管较为丰富，易发生远处转移，病情进展快，给治疗增加了困难。因此，针对结直肠癌的早期诊断和治疗相关研究具有十分重要的临床意义。因此，寻找与结直肠癌细胞及组织具有较高结合特异性和敏感性的靶向分子，进而展开分子探针及靶向化疗药物载体的开发具有重要的临床价值。
我们把一类对肿瘤组织或血管具有特异亲合作用的多肽,叫做肿瘤归巢肽(tumorhoming peptides，THPs)，它们能识别和结合肿瘤组织或血管表面的特异性受体或标志物，从而将抗肿瘤药物直接靶向递送至肿瘤组织、细胞中,能够减少或消除药物耐受及毒副作用。当前发现的肿瘤归巢肽通常是由 5～31 个氨基酸构成的分子量很小的活性多肽。小分子多肽与抗体药物相比，克服了抗体药物因其分子量较大所致的难以渗透到肿瘤组织的缺欠，而多肽易通过生理屏障，亲和力高，且易化学合成。近十年中，肿瘤归巢肽作为抗肿瘤药物的有效靶向运载工具和肿瘤区域显像剂的分子探针的应用日益广泛。
噬菌体展示技术（phage display technology，PDT），是一种快速筛选多肽、蛋白质、抗体的高通量方法，并在2018年获得了诺贝尔化学奖。该技术的原理是将外源多肽或蛋白质的DNA序列插入中噬菌体次要外壳蛋白p III基因中，外源蛋白随着衣壳蛋白的表达而展示到噬菌体表面，建立了多肽基因型和表现型之间的联系。噬菌体展示肽库在构建、改造及筛选方面具有易操作的优点，因此形成了商业化试剂盒以供科研使用。
我们利用噬菌体12肽库对人结直肠癌细胞进行差减筛选，通过DNA测序并翻译，最终得到能与人结直肠癌细胞靶向结合12肽序列。其优势在于，（1）所得到的多肽片段水溶性高且较稳定，增强了多肽的实用性；（2）该多肽能特异亲合结直肠癌细胞，具有肿瘤靶向性。基于之前利用噬菌体展示技术靶向筛选的人结直肠癌细胞靶向亲和多肽，我们进一步做了验证，以证明该多肽的高效性和特异性，为进一步开展新型肿瘤靶向药物的设计和研发提供候选资源和奠定坚实基础。
发明内容
本发明的目的在于提供高亲和性、特异性结合结直肠癌细胞的多肽。这样的结合多肽尤其适用本发明的目的，在于提供一种靶向新型多肽及其用途，通过特异性靶向结合结直肠癌细胞，优选地将这种新型靶向上述多肽或其衍生产品用于制备靶向结直肠癌的抗肿瘤药物或显像制剂。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的首要目的在于提供能与人结直肠癌细胞特异靶向结合的多肽，其氨基酸序列分别为：SEQ ID NO.1 WNELPYHHTHSH；SEQ ID NO.2：ASGTPHRHYMTH；SEQ ID NO.3：PSEFPSYHTNSH；SEQ ID NO.4：MNPYPTHHIVNH；SEQ ID NO.5：KTLEPQYHPSIH。
上述肽链中单字母符号代表的氨基酸残基，见氨基酸缩略表：
表1 氨基酸缩略表
本发明目的之一在于提供一种生物活性片段或衍生物，其特征在于包含权利要求1所述的任一多肽序列为核心序列，包括共价连接的化合物以及由核心序列组成的多聚体混合。
优选地，该生物活性片段或衍生物与权利要求1中所述多肽具有相同的生物学功能，即同样具有结直肠癌细胞特异靶向作用。
本发明目的之一在于提供一种多聚核苷酸序列，其可以编码包含权利要求1所述的SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5的任一项多肽序列以及权利要求2所述的多肽活性片段及其衍生物。
本发明还进一步提供了一种用于肿瘤诊断的多肽分子探针，包含氨基酸序列为SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5所述多肽。
本发明还进一步提供了一种显像剂，包含本发明所述多肽和显影剂或放射性核素，包含氨基酸序列为SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5所述多肽，用于临床肿瘤的成像和诊断。
本发明还提供一种药物组合物，包括本发明提供的氨基酸序列为SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5所述的多肽作为靶向肽，作为用于肿瘤治疗的药物，也可作为药物靶头增加药物或载有药物的载体如纳米材料、脂质体等。
本发明提供的药物组合物还包括与所述的多肽相偶联或混合可制备靶向药物的载体。
进一步地，所述载体为目前药剂学广泛应为的、天然的高分子材料以及人工合成的分子聚合物及他们的混合物。
优选地，所述的制剂为能杀伤肿瘤细胞的化学药物、生物药物、纳米药物、放射性药物、光热治疗或光动力治疗药物或包裹这些药物的载体中的任意一种。
更优选地，所述的制剂为烷化剂、抗代谢药物、抗肿瘤天然药物、抗肿瘤抗生素、激素、金属络合物或肿瘤放射靶向标瘤放射靶向标记物中的任意一种。
本发明还提供上述药物组合物在任何药物治疗学上可接受的剂量和剂型。
本发明还提供了氨基酸序列为SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5所述的多肽及其生物活性片段或衍生物在制备用于预防、治疗或诊断肿瘤的药物或显像制剂中的用途。
所述肿瘤为结直肠癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌中的任意一种，优选为结直肠癌。
本发明利用了噬菌体展示技术筛选结直肠癌特异性结合的多肽，鉴定其特异性和亲和力，为结直肠癌诊断试剂及靶向治疗结直肠癌药物的研制奠定基础。
本发明的优势是：（1）本发明的多肽片段能够特异性结合结直肠癌细胞，而不识别正常结直肠癌上皮细胞（即正常细胞）。因此，该肿瘤靶向多肽及其衍生物在结直肠癌肿瘤分子诊断，筛查和靶向治疗中具有重要应用价值。
（2）该多肽的肿瘤特异性结合作用，为进一步寻找新的肿瘤靶点，研究大分子间相互作用的结合位点、寻找亲和力高且具有生物活性的配体分子以及药物的筛选、疫苗和新型诊断试剂的研发等领域带来了更多希望。
（3）与传统药物相比,在生产上,应用生物工程技术，短肽类药物合成和纯化简便,容易实现规模化生产，而且兼有相对分子质量较小、免疫原性弱、活性高等优点，为选出的多肽有望成为效果好、效益高的新时代药物带来更多希望。
附图说明
图1为噬菌体展示技术对结直肠癌细胞特异性结合阳性多肽的三轮减性筛选滴度实验结果图；其中A、B、C分别为第一、二、三轮筛选滴度实验蓝白斑平板图。
图2为ELISA鉴定1-20号阳性噬菌体克隆与人结直肠癌细胞HT29亲和力的OD405结果图。
图3为20个阳性噬菌体克隆的DNA测序结果。A为阳性噬菌体克隆DNA测序统计表；B为重复率最高的阳性噬菌体的DNA测序图。
图4为FITC标记的多肽FITC-WH与人正常肠上皮细胞NCM460和人结直肠癌细胞HT29结合能力的流式细胞检测结果图。A为FITC-WH与人正常肠上皮细胞HIEC和人结直肠癌细胞HT29结合的流式结果图；B为流式结果的统计图。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
实施例1利用噬菌体展示技术对结直肠癌细胞特异性结合阳性多肽的三轮差减筛选
1.1宿主菌E.coli ER2738的复苏、培养
制备大肠杆菌平板，取LB-TET培养平板置于37℃孵箱预热1小时，待E.coli ER2738菌液融化后，用接种环蘸取少量菌液均匀铺在培养平板，然后倒置于37℃的恒温培养箱中过夜培养。制备宿主菌液，从生长良好的培养板中挑取单一菌落，置于含有四环素的LB细菌培养液中，37℃、180rpm振荡过夜培养，使细菌处于对数生长期。制备好的含大肠杆菌LB-Tet平板放到4℃冰箱保存备用，宿主菌液放到-80℃冰箱保存备用。
1.2噬菌体展示十二肽库体外减性筛选
以人源性结直肠癌细胞HT29作为靶细胞，人正常肠上皮细胞NCM460为吸附细胞。利用噬菌体展示技术体外筛选方法，对纽英伦生物技术有限公司 (NEW ENGLAND Biolabs) 的Ph.D.-12TM Phage Display Peptide Library 进行3轮体外筛选。并尽量保证每一轮噬菌体的投入总量相同，每轮递增筛选压力，最终获得高度富集的噬菌体。具体筛选步骤如下：
1.2.1准备筛选所用细胞
挑选生长良好的人源性结直肠癌细胞HT29、人正常肠上皮细胞NCM460。用胰蛋白酶分别消化细胞，显微镜下观察细胞变圆变亮后，吸掉胰酶，加入细胞培养基，轻轻吹打细胞使贴壁细胞悬浮。将两种细胞悬液分别吸到预先制备好的，经过多聚赖氨酸处理的培养皿中，放到细胞孵育箱中，培养到细胞贴壁，待生长良好后用于筛选。
1.2.2准备菌液
筛选当天将过夜培养的宿主菌液加到LB培养液中。37℃、180rpm振荡约3小时。以上为筛选滴度测定及扩增使用菌液。
1.2.3封闭细胞
用吸管吸净培养皿中的液体，并在无菌滤纸上将培养皿中的液体拍甩干净后，用0.5%BSA封闭，37℃放置1小时。
1.2.4与12肽库结合
弃掉培养皿里的封闭液。加入用TBST稀释100倍的Ph.D. -12 TM原始噬菌体展示十二肽库，室温下120rpm微摇作用1小时。
1.2.5洗涤
吸掉第一轮未结合的噬菌体液，把培养皿放到无菌滤纸上用力拍干。用0.1%TBST洗涤培养皿10次，每次约30秒左右，并冲洗培养皿底部及其边缘，倒掉洗涤液，在无菌滤纸上拍干（注意每次洗涤后更换一张新的干净滤纸，防治交叉污染）。
1.2.6洗脱
培养皿里加入洗脱液（0.2M Glycine-HCl，PH2.2），常温下、80rpm、微摇15min。洗脱作用结束后，轻轻吹打洗脱液后吸出，加入到含有中和缓冲液的EP管里，混匀。
1.3测定噬菌体滴度
提前摇菌，加TET到LB中，37度180rpm，3小时后，达到对数生长期（OD值达到0.6左右为佳）。测定滴度前先将LB/ IPTG/Xgal平板在37℃孵箱预热1小时以上。准备琼脂糖凝胶，微波加热至融化。取吸附后中和洗脱液（或扩增后噬菌体上清液），用LB培养基倍数稀释噬菌体。稀释范围为：吸附后中和洗脱液稀释102-105；扩增后噬菌体上清液稀释109-1012。每个EP管加入备好的菌液，并在每管里加入10μl不同稀释倍数的噬菌体液。在振荡仪上振荡5min混匀。把感染后噬菌体液加到室温融化的琼脂中，立即将混悬液加至已预热的LB/ IPTG/Xgal平板里，用冷却的涂布玻璃棒均匀涂开（每个稀释倍数一个平板，并做好标记）。将涂好的平板倒置于37℃的孵箱过夜培养。第二天检查平板上的噬菌体蓝斑生长情况并计数（即数每个平板上的噬菌体斑个数）。
1.4噬菌体扩增纯化
把剩余的吸附后洗脱液进行扩增纯化，以备接下来的筛选。取无菌离心管，把备好的过夜宿主菌接种到LB培养基中，形成对数前宿主菌液。把所有的吸附后洗脱液加入到对数前宿主菌液里，于37℃、200rpm快速振荡5小时进行扩增。把扩增噬菌体液于4℃、12000rpm离心10min，把上清转到另一新的离心管里再次同等条件下离心。小心取离心管上部80%的上清液到一新的离心管里，再往离心管里加入六分之一体积的PEG/NaCl，放4℃冰箱过夜沉淀。次日，将前日沉淀50ml管于4℃、12000rpm条件下离心15min，弃上清，再次同等条件离心2min，弃掉剩余上清液。把沉淀物用1ml的TBS重悬后转移到无菌EP管里，于4℃、14000rpm条件下离心5min。上清转移到新的EP管里，再次加入六分之一体积的PEG/ NaCl，冰上沉淀1小时。于4℃、14000rpm条件下离心10min，弃掉上清液，保留沉淀。用200μl的TBS重悬沉淀物，于4℃、1000rpm离心1min，保留上清于新的EP管（此为扩增后噬菌体液），-20℃冰箱储存。
1.5第二到三轮筛选
筛选的基本步骤同第一轮。每下一轮筛选均选用前一轮扩增后的噬菌体液作为次级肽库，每轮尽量保持同第一轮基本一致的噬菌体投入量，总共进行三轮减性筛选。每轮筛选后的洗脱液均要测定噬菌体滴度，并计算噬菌体的回收率。
结果如图1所示，为利用噬菌体展示技术对结直肠癌细胞特异性结合阳性多肽的三轮减性筛选实验结果图，其中A、B、C分别为第一、二、三轮筛选后洗脱液的滴定实验蓝白斑平板图，上述结果显示经过三轮淘选后能够与结直肠癌细胞特异性结合的阳性噬菌体克隆显著富集。
实施例2酶联免疫吸附实验检测阳性噬菌体克隆与结直肠癌细胞的靶向亲合作用
2.1 纯化阳性噬菌体克隆
2.1.1阳性噬菌体的扩增：在锥形瓶中加入20mlLB/Tet液体培养基，然后按1:100加入大肠杆菌菌液和待扩增的噬菌体，置于37ºC，恒温振荡器中剧烈震荡4.5h，得到噬菌体的扩增液。
2.1.2阳性噬菌体的纯化：将经上述步骤得到的噬菌体扩增液4ºC、12000r/min，离心10min，取上清后加入1/6体积PEG-NaCl沉淀过夜后，12000r/min离心15min，弃去上清液，用TBS缓冲液溶解沉淀，再次给予1/6体积PEG-NaCl，冰上孵育1h。 4ºC、14000r/min，离心15min，弃去上清，将得到的沉淀用TBS-NaN3溶解后置于4ºC冰箱保存。
2.2 酶联免疫吸附实验检测亲和力
2.2.1制备细胞96孔板，铺板规则：96孔板边缘两列16个孔分别加入100μl×PBS作为空白组；然后1、2、3、4行的每个小孔按照蛇形各铺100μ人正常肠上皮细胞NCM460悬液，5、6、7、8行的每个小孔按照蛇形各铺100μ人源性结直肠癌细胞HT29悬液，然后将铺好的细胞平板置于通有5%CO2的37ºC细胞恒温培养箱中过夜即可进行ELISA实验。
2.2.2固定：取出过夜铺有细胞的96孔板，拍干孔中液体后，用PBS洗涤3次，然后加入4%多聚甲醛固定20min。
2.2.3阻断：取出固定后的96孔板，拍干孔中液体后，用PBS洗涤3次，然后加入3%过氧化氢,于37ºC细胞恒温培养箱中封闭30min，用以阻断内源性过氧化物酶的活性。
2.2.4封闭：取出阻断后的96孔板，拍干孔中液体后，用PBS洗涤3次，再加入3%BSA/PBS于37ºC细胞恒温培养箱中封闭1h。
2.2.5加噬菌体样品：取出封闭后的96孔板，拍干孔中液体后，加入纯化得到的20个阳性噬菌体，于37ºC细胞恒温培养箱中反应1h。
2.2.6加一抗：取出反应后的96孔板，拍干孔中液体后，用PBS洗涤3次后加入1:4000的M13抗体，4ºC过夜。
2.2.7：取出反应后的96孔板，拍干孔中液体后，用PBS洗涤3次，加二抗,于37ºC细胞恒温培养箱中反应30min。
2.2.8加底物TMB：将PBS洗涤3次后的96孔板于避光条件下加入TMB显示剂，避光置于37ºC细胞恒温培养箱中15min。
2.2.9终止：取出反应后的96孔板，加入2M硫酸终止反应。
2.2.10结果的测定：将完成全部反应的96孔板置于酶标仪中，于405nm处测定其OD值，保存结果并进行分析。
结果如图2所示，实验组结直肠癌细胞HT29的平均吸光度值OD405与对照组正常肠上皮细胞NCM460的平均吸光度值OD405相比明显增强。说明上述阳性噬菌体克隆能特异的与人源性结直肠癌细胞HT29结合而与人源性正常肠上皮细胞NCM460结合作用则较弱。
实施例3测定分析阳性噬菌体克隆DNA序列
3.1.阳性单克隆噬菌体挑选
把第三轮筛选后所得的噬菌体液，进行滴度测定并铺制LB平板，在生长的斑数不足100个的平板上，随机挑取20个间隔10mm生长良好的蓝斑。把随机挑取的20个蓝斑分别加入到1ml对数前宿主菌液（同噬菌体扩增），于37℃、200rpm快速振荡4.5小时进行扩增。
3.2阳性单克隆噬菌体单链DNA提取
将扩增的单克隆噬菌体液分别于4℃、14000rpm离心30秒，取上清液转到新管中，4℃、1000rpm离心30秒，取上清的80% 转到新的无核酸酶离心管里，取300ul菌液按1:1比例加300ul甘油，-20度冰箱冻存，取此即为扩增的单克隆噬菌体液。剩下500ul菌液加200ulPEG，混匀室温静置20min，4度离心14000r，10min，弃上清，4度14000rpm离心3min，弃上清，加100ul NaI，混合均匀，加250ul无水乙醇，静置10min，4度10000rpm离心10min，弃上清，用预冷的70%乙醇轻微洗3次，晾干30min，10000rpm离心5min，弃上清，加60ul TE。
3.3 DNA纯化
取上一步60ul TE管，加40ul TE补足至100ul。向离心管里加入500ul Buffer B3，充分混匀。将混合液全部移入吸附柱，室温下，8000g，离心30秒，将滤出液再次加入吸附柱中再次过柱。倒掉收集管里的液体，将吸附柱放回收集管里。向吸附柱里加入500μl WashSolution，9000g，离心30秒。倒掉收集管里的液体，吸附柱重新放到收集管中。重复上一步骤，将空吸附柱和收集管放入离心机，9000g，离心1min。在吸附膜中央加入40μl的ElutionBuffer，室温静置2min。9000g离心1min，将所得到的DNA溶液进行测序。
3.4 测定DNA序列并分析
将提取的单链DNA进行序列测定，并根据三联密码子的原则翻译出相应的氨基酸序列。用DNAstar软件将其翻译为短肽序列和结构分析，并运用NCBI Blast与已知蛋白多肽序列对比同源性；GeneBank、Swiss-prot蛋白数据库对核苷酸序列进行相似性分析。
结果如图3所示为阳性噬菌体克隆的测序结果，A为DNA测序结果中筛选出来的5个序列和重复次数，其中共测了20个阳性单克隆噬菌体，其中重复次数最高的SEQ ID NO.1为6次，其他序列重复次数分别为SEQ ID NO.2为6次，SEQ ID NO.3为4次，SEQ ID NO.4为3次，SEQ ID NO.5为1次，将5个序列与已知蛋白多肽序列对比同源性和相似性分析结果为与已知蛋白多肽序列没有同源性，与核苷酸序列没有相似性；B为重复率最高的阳性噬菌体克隆的DNA测序波形图。
实施例4流式细胞术鉴定FITC-WH与结直肠癌细胞的特异性靶向结合能力
将HT29和NCM460细胞铺于带有载玻片的6孔板中，放细胞孵箱培养细胞贴壁并铺满单层。24小时后，弃去培养基，加胰酶消化1min，离心1000rpm 5min，用含有10%的血清停止消化，弃去上清液，PBS洗1次，离心1000rpm 5min，弃上清。加入5μM FITC-WH，混合均匀，37度孵育15min。离心1000rpm 5min，弃上清。加PBS洗一遍，室温1000rpm离心5min，弃上清。加300ul PBS混合均匀，上样进行流式细胞仪检测。
结果如图4所示，A为多肽FITC-WH与结直肠癌细胞特异性靶向结合的流式结果图，结直肠癌细胞HT29与多肽几乎全部结合，并检测到强荧光信号；而在正常肠上皮NCM460细胞则与多肽几乎不结合，同时检测到微弱的荧光信号。B荧光强度统计柱形图，可以发现与正常肠上皮相比，多肽FITC-WH与结直肠癌细胞的结合能力显著增强，有统计学差异， ***P<0.001。
从实验例中可以得出，本发明的多肽具有靶向结直肠癌细胞的特性，因此能够作为靶向多肽与能杀伤癌细胞的制剂相偶联或混合，用于肿瘤的靶向治疗；或可与显影剂相偶联或混合，用于靶向肿瘤的分子成像与诊断。
序列表
<110> 辽宁中健医药科技有限公司
<120> 特异靶向人结直肠癌细胞的多肽及其用途
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 1
Trp Asn Glu Leu Pro Tyr His His Thr His Ser His
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 2
Ala Ser Gly Thr Pro His Arg His Tyr Met Thr His
1 5 10
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 3
Pro Ser Glu Phe Pro Ser Tyr His Thr Asn Ser His
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 4
Met Asn Pro Tyr Pro Thr His His Ile Val Asn His
1 5 10
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 5
Lys Thr Leu Glu Pro Gln Tyr His Pro Ser Ile His
1 5 10
Claims (5)
1.一种与人结直肠癌细胞特异靶向结合的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列分别为：
SEQ ID NO.1：WNELPYHHTHSH；
SEQ ID NO.2：ASGTPHRHYMTH；
SEQ ID NO.3：PSEFPSYHTNSH；
SEQ ID NO.4：MNPYPTHHIVNH；
SEQ ID NO.5：KTLEPQYHPSIH。
2.一种生物活性片段或衍生物，其特征在于包含权利要求1所述的任一多肽序列为核心序列，包括共价连接的化合物以及由核心序列组成的多聚体混合物，同时该生物活性片段或衍生物与权利要求1中所述多肽具有相同的生物学功能，即同样具有结直肠癌细胞特异靶向作用。
3.一种多聚核苷酸序列，其可以编码包含权利要求1所述的SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5的任一项多肽序列以及权利要求2所述的多肽活性片段及其衍生物。
4.权利要求1所述的多肽以及权利要求3所述的生物活性片段或衍生物在结直肠癌诊断和治疗中的应用，优选地，这种应用可以是任意形式存在的用于结直肠癌的精准检测的分子探针和治疗药物的药物靶头。
5.权利要求1所述的多肽以及权利要求3所述的生物活性片段或衍生物在肿瘤诊断和治疗中的应用，其肿瘤包括结直肠癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌，其特征在于在上述肿瘤中的应用都可能具有权利要求4所述的等同的应用价值，优选为结直肠癌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010293450.XA CN113527431B (zh) | 2020-04-15 | 2020-04-15 | 特异靶向人结直肠癌细胞的多肽及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010293450.XA CN113527431B (zh) | 2020-04-15 | 2020-04-15 | 特异靶向人结直肠癌细胞的多肽及其用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113527431A true CN113527431A (zh) | 2021-10-22 |
| CN113527431B CN113527431B (zh) | 2024-04-19 |
Family
ID=78088160
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010293450.XA Active CN113527431B (zh) | 2020-04-15 | 2020-04-15 | 特异靶向人结直肠癌细胞的多肽及其用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113527431B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060058228A1 (en) * | 2002-04-05 | 2006-03-16 | Kelly Kimberly A | Colon tumor specific binding peptides |
| CN108610396A (zh) * | 2018-04-26 | 2018-10-02 | 中国医科大学 | 一种靶向人结肠癌细胞的特异性多肽 |
| CN108640976A (zh) * | 2018-04-26 | 2018-10-12 | 中国医科大学 | 一种与人结肠癌细胞特异性结合的多肽 |
-
2020
- 2020-04-15 CN CN202010293450.XA patent/CN113527431B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060058228A1 (en) * | 2002-04-05 | 2006-03-16 | Kelly Kimberly A | Colon tumor specific binding peptides |
| CN108610396A (zh) * | 2018-04-26 | 2018-10-02 | 中国医科大学 | 一种靶向人结肠癌细胞的特异性多肽 |
| CN108640976A (zh) * | 2018-04-26 | 2018-10-12 | 中国医科大学 | 一种与人结肠癌细胞特异性结合的多肽 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113527431B (zh) | 2024-04-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111253472B (zh) | 一种靶向多种肿瘤细胞的新型多肽及其用途 | |
| CN108610396B (zh) | 一种靶向人结肠癌细胞的特异性多肽 | |
| CN104650190B (zh) | 肝癌细胞表面特异性结合的多肽 | |
| CN108640976B (zh) | 一种与人结肠癌细胞特异性结合的多肽 | |
| CN110330551B (zh) | 一种胰腺癌特异结合肽及其制备方法与用途 | |
| CN108341854B (zh) | 一种肿瘤靶向的新型多肽及其用途 | |
| CN111393507B (zh) | 一种与多种肿瘤细胞特异性结合的新型多肽及其用途 | |
| CN113480603B (zh) | 一种靶向脑胶质瘤细胞的特异性短肽、编码基因及其应用 | |
| CN112358531B (zh) | 靶向her2蛋白的多肽及其应用 | |
| CN111518171B (zh) | 一种靶向人肝癌细胞的多肽及其用途 | |
| CN112409447B (zh) | 一种靶向识别膜联蛋白a2的亲和短肽及其制备方法与用途 | |
| CN113527431B (zh) | 特异靶向人结直肠癌细胞的多肽及其用途 | |
| CN113527429B (zh) | 人肝癌细胞特异结合多肽及其用途 | |
| CN111269288B (zh) | 一种靶向热休克蛋白60的亲和多肽及其筛选方法与用途 | |
| CN111040019B (zh) | 一种用于与TfR蛋白特异性结合的配体多肽及其应用 | |
| CN111018951B (zh) | 一种靶向三阴性乳腺癌细胞的多肽及其应用 | |
| CN113527430B (zh) | 一种肿瘤细胞特异靶向的新型多肽及其用途 | |
| CN108822189B (zh) | 一种靶向结合淋巴癌细胞系的特异性多肽及其应用 | |
| CN112979757B (zh) | 特异靶向人肝癌细胞的多肽 | |
| CN108864255B (zh) | 一种乳腺癌干细胞特异性结合多肽及其在制备治疗乳腺癌药物中的应用 | |
| CN104650187B (zh) | 多肽、其生产方法及用途 | |
| CN116375802B (zh) | 一种小窝膜联蛋白AnnA1的亲和多肽及应用 | |
| CN117264061B (zh) | 一种识别uPAR的纳米抗体及其应用 | |
| CN113185579B (zh) | 一种fmod拮抗多肽及其衍生物与应用 | |
| CN103788181B (zh) | 肺癌细胞特异性粘附短肽及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |