CN108822189B

CN108822189B - 一种靶向结合淋巴癌细胞系的特异性多肽及其应用

Info

Publication number: CN108822189B
Application number: CN201810667082.3A
Authority: CN
Inventors: 刘晗青; 张雅菲; 卢子文; 屠志刚; 梁智全
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2018-06-26
Filing date: 2018-06-26
Publication date: 2021-11-23
Anticipated expiration: 2038-06-26
Also published as: CN108822189A

Abstract

本发明涉及一种靶向结合淋巴癌细胞系的特异性多肽及其应用，属于生物医药领域；发明基于体外噬菌体展示技术，体外淘选并获得能靶向结合淋巴癌细胞系的特异性多肽TUZG12；经过体外细胞摄取及分布实验证明所述多肽对淋巴癌细胞系具有靶向结合活性；本发明还通过体外细胞活性实验结果表明，促凋亡肽DKK偶联TUZG12多肽后能在一定程度上提高DKK对淋巴癌细胞的增殖活性抑制效果；本发明筛选所得多肽对多个淋巴癌细胞系具有良好的靶向结合活性，并能提高细胞毒性多肽对靶标肿瘤细胞的杀伤作用，对临床上淋巴瘤的诊断和治疗具有重要的应用价值。

Description

一种靶向结合淋巴癌细胞系的特异性多肽及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种靶向结合淋巴癌细胞系的特异性多肽及其应用。

背景技术

与传统的抗体类靶向分子相比，特异性结合肿瘤的小分子多肽，由于其免疫原性较低，生产成本更低廉，可获得表面密度更高(每单位表面的肽数量较多，因此这种缀合物的亲和力较高)以及组织渗透效果更佳，可作为肿瘤诊断的标记物，又可将其与传统化疗药物偶联实现肿瘤的靶向治疗。在FDA批准的多肽药物中，已有一部分多肽药物被指定用于癌症治疗。亮丙瑞林是一种促性腺激素释放激素类似物，已被批准用于治疗前列腺癌，蛋白体抑制剂硼替佐米用于临床上治疗多发性骨髓瘤。在III期临床试验中的环状RGD肽Cilengitide(EMD121974)已经显示有希望治疗胶质母细胞瘤。Exherin(ADH-1)是一种N-钙粘蛋白的环状五肽(Ac-CHAVC)拮抗剂，在I期临床试验中耐受良好。应该指出的是，多肽药物非常适用于癌症适应症，多肽对细胞表面受体具有高亲和力，其在关键的细胞信号传导途径中起作用。此外，多肽的生产成本低于单克隆抗体药物，多肽药物的优势使得多肽疗法的市场发展迅速。

采用噬菌体展示技术，能够生物淘选出与癌细胞特异性结合的多肽。噬菌体展示通过将随机编码外源多肽链的基因与噬菌体外壳蛋白基因融合表达，从而使多肽以融合蛋白形式呈现在噬菌体表面，并能够保持相对独立的空间结构和生物学活性，从而形成数量庞大的随机多肽文库。

在淘选过程中，噬菌体肽库与特定靶标孵育，通过洗涤除去未结合的噬菌体，再通过酸或靶蛋白的配体洗脱与靶点结合的噬菌体，选择适当的宿主细胞繁殖扩增。经3-5轮淘选后，可获得与靶蛋白高亲和力结合的噬菌体克隆。多肽的一级结构可通过DNA序列推算获得。利用噬菌体展示技术筛选肿瘤靶向肽，具有良好的应用价值。自1985年G.P.Smith最早提出该技术以来，噬菌体展示技术已在体外靶分子淘选、全细胞淘选和体内淘选中得到广泛的应用，相关研究论文数量已达数千篇。

噬菌体展示是筛选与特定靶点结合的多肽分子的一项强有力技术，并且通常用于鉴定纯化蛋白的多肽配体。然而，人工培养的全细胞也可以用作分离细胞结合肽的靶标。相比靶蛋白体外淘选，直接采用全细胞淘选具有一定的优势：第一，不需要事先对受体结构的了解和分析，受体结构处于天然构象状态，筛选的过程受细胞膜蛋白的表达水平和空间结构调控，这是纯化的蛋白无法模拟的；第二，通过改变洗涤条件，可偏向于介导细胞摄取的多肽的筛选。当使用纯化的膜蛋白时，选择过程往往由由单一的结合驱动；第三，还可以通过淘选发现新的细胞表面标志物。

淋巴瘤特异性标记物一直是临床肿瘤学的重要研究方向。淋巴瘤准确的诊断和分类是影响治疗和预后的关键。目前发现的淋巴瘤的标记物有生物标记物和分子标记物两种。部分标记物为淋巴瘤的分型提供了有利的支持，已经成为细胞学和组织病理学诊断的重要辅助手段，对淋巴瘤的诊断、治疗方案的选择、预后的判定具有重要意义。目前对淋巴瘤诊断具有重要意义的标记物有上皮膜抗原(epithelial membrane antigen，EMA)，分化抗原簇CD15+，分化抗原簇CD20+，CD45+，神经特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、c-met等。这些标记物已在临床上广泛应用，但是由于亚型的不同、标志物特异性差等因素，因此常常需要多种标志物联合使用。这些标识物既有优势也有局限性，多个标记物联合使用势必增加患者经济负担。因此寻找特异性高和敏感性高的标志物迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的是提供一种能靶向结合多个淋巴癌细胞系的特异性结合多肽，所述多肽的氨基酸序列为MHPNAGHGSLMR(SEQ.ID.NO.1)，命名为TUZG12。

其中所述的淋巴癌细胞系包括但不限于Jeko-1、P815、Raji、Su-4细胞，优选的为Jeko-1淋巴癌细胞系。

本发明以Jeko-1淋巴癌细胞系为筛选靶标，将合适的十二肽噬菌体展示文库与靶细胞直接孵育反应，经过四轮淘选后，随机挑取噬菌体克隆进行测序分析，得到多个不同的多肽，并通过序列的检索对比，排除非特异序列后得到候选的多肽氨基酸序列，最终筛选到多肽TUZG12，其氨基酸序列为MHPNAGHGSLMR。

设置对照组随意序列多肽Random的氨基酸为VSYVPMQGALTQ(SEQ.ID.NO.2)；在多肽TUZG12和对照多肽Random的N端修饰FITC荧光分子用于定位并进行细胞的摄取和分布实验，结果表明多肽TUZG12能特异性结合淋巴癌细胞系Jeko-1，同时对其他三种淋巴癌细胞系P815、Raji、Su-4具有一定的结合能力，但与另外两种淋巴癌细胞系Romas和Granta-519及人正常淋巴细胞无结合活性，证明多肽TUZG12与靶细胞具有较好的特异性和选择性。

以淋巴瘤特异性结合多肽TUZG12为靶向配体，以两个甘氨酸为连接分子，以促凋亡肽为细胞毒性分子，来设计并合成偶联多肽TUZG12-DKK，其氨基酸序列为MHPNAGHGSLMRGGKLAKLAKKLAKLAK(SEQ.ID.NO.3)；对照组偶联多肽Random-DKK的氨基酸序列为VSYVPMQGALTQGGKLAKLAKKLAKLAK(SEQ.ID.NO.4)。偶联多肽TUZG12-DKK和Random-DKK投入到对Jeko-1和Raji两种淋巴癌细胞系中进行细胞毒性实验，用MTT发来测定对这两种淋巴癌细胞增殖活性的影响，结果表明TUZG12-DKK偶联多肽能在一定程度上增强促凋亡肽DKK对Jeko-1和Raji两种淋巴癌细胞系增殖活性的抑制作用。

进一步的，本发明还提供所述多肽特异性结合淋巴癌细胞系的应用，更进一步的，所述多肽在制备靶向治疗淋巴癌药物中的应用。

本发明还提供一种靶向治疗淋巴癌的药物，所述药物包括所述的多肽。

本发明的有益效果是：

本发明基于体外噬菌体展示技术，以Jeko-1淋巴癌细胞系为靶标细胞筛选所得特异性多肽TUZG12对Jeko-1、P815、Raji和Su-4四个淋巴癌细胞系有良好的特异性结合能力，对临床上淋巴瘤的诊断和治疗具有重要的意义和价值；本发明所涉及的具有一定氨基酸序列的多肽对多个淋巴癌细胞具有靶向结合活性，但不具备细胞杀伤效果，可作为淋巴癌细胞靶向配体来制备用于淋巴癌诊断和靶向治疗的制剂。

基于TUZG12多肽对淋巴癌细胞的靶向结合活性，以多肽TUZG12为靶向配体的TUZG12-DKK偶联多肽能在一定程度上增强促凋亡肽DKK对Jeko-1和Raji两种淋巴癌细胞系增殖活性的抑制作用，能提高促凋亡肽对淋巴癌细胞的杀伤效果，所述偶联多肽在临床上淋巴瘤的靶向治疗方面上具有重要的应用价值。

附图说明

图1为经过四轮淘选后的单克隆噬菌体PCR扩增后的2％琼脂糖凝胶电泳分析结果。

图2为单克隆噬菌体测序统计结果；图2左图为DNA测序后翻译为氨基酸序列结果；图2右图为各多肽序列分布情况。

图3为多肽TUZG12-FITC结构示意图。

图4为多肽TUZG12和多肽Random分别作用于Jeko-1淋巴瘤细胞系和人正常淋巴细胞后进行细胞免疫荧光实验的结果；图4A为荧光多肽和淋巴瘤细胞系Jeko-1结合情况；图4B为荧光多肽与人正常淋巴细胞结合情况，(标尺大小均为1mm)。

图5为多肽TUZG12和多肽Random分别作用于不同亚型淋巴瘤细胞系后进行细胞免疫荧光实验的结果；图5A为荧光多肽和Romas淋巴癌细胞系结合情况；图5B为荧光多肽与P815小鼠肥大细胞癌细胞结合情况；图5C为荧光多肽和Su-4淋巴瘤细胞系结合情况；图5D为荧光多肽和Granta-519淋巴瘤细胞系结合情况；图5E为荧光多肽和Raji淋巴瘤细胞系结合情况，(标尺大小均为1mm)。

图6为偶联多肽TUZG12-DKK对Jeko-1淋巴癌癌细胞存活率的影响结果；图6A为偶联多肽对Jeko-1淋巴瘤细胞细胞存活率的影响；图6B为偶联多肽对Jeko-1淋巴瘤细胞的半数抑制浓度(n≧3，***表示P<0.001；**表示P<0.01；*表示P<0.05)。

图7为偶联多肽TUZG12-DKK对Raji淋巴癌癌细胞存活率的影响结果；图7A为偶联多肽对Raji淋巴瘤细胞细胞存活率的影响；图7B为偶联多肽对Raji淋巴瘤细胞的半数抑制浓度(n≧3，***表示P<0.001；**表示P<0.01；*表示P<0.05)。

具体实施方式

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及材料均为常规市售。

实施例1：Jeko-1淋巴瘤细胞系的培养、噬菌体滴度测定、噬菌体展示淘选

A.Jeko-1淋巴瘤细胞系的培养：

Jeko-1淋巴瘤细胞系(ATCC，美国模式培养物保藏所)置于37℃、5％CO₂细胞培养箱培养，1640培养基中加入10％小牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素。

B.噬菌体滴度测定：

(1)-80℃取ER2738甘油菌(NEB公司)，在LB-Tet平板划线，37℃倒置培养12h-16h。

(2)用无菌枪头挑取ER2738单菌落于5-10mL LB-Tet培养基中，37℃、220rpm摇床培养至对数中期(OD₆₀₀＝0.5)。

(3)微波炉加热融化Top agar，分成3mL等份于无菌离心管中，45℃保温备用。

(4)37℃预温LB/IPTG/Xgal平板。

(5)用LB-Tet梯度稀释M13噬菌体(NEB公司)样品，每个梯度更换枪头。

(6)当菌体培养物达对数中期，分装成200μL每管。

(7)每管加入10μL不同稀释度的噬菌体样品，快速吹打混匀，室温温育5min。

(8)将感染噬菌体的细菌加入45℃预热的Top agar中，快速混匀，均匀倒在LB/IPTG/Xgal平板上。

(9)待Top agar冷却凝固后，倒置于37℃培养箱培养12h-16h。

(10)从37℃培养箱取出平板，数蓝斑计数，根据稀释梯度计算噬菌体样品的滴度。

C.噬菌体展示淘选：

第一轮淘选：

(1)-80℃取ER2738甘油菌，在LB-Tet平板划线，37℃倒置培养12h-16h。

(2)取20mL LB-Tet培养基于250mL无菌锥形瓶中，用无菌枪头接种ER2738单菌落，37℃、220rpm摇床培养至对数前期。

(3)用血球计数板对Jeko-1计数，取1×10⁶个细胞重悬于1640培养基中。

(4)加入10μL随机十二肽噬菌体展示文库(NEB公司，货号#E8111L)，4℃旋转孵育60min。

(5)4℃、500g、5min离心沉淀细胞，弃上清。

(6)1mL TBS重悬细胞，取10μL按照步骤B中“噬菌体滴度测定方法”做滴度测定，剩余990μL加入到步骤(2)中培养的20mL ER2738菌液中扩增，37℃220rpm摇床培养4.5h。

(7)取菌液转移到无菌离心管中，4℃10000rpm离心10min。弃沉淀，上清液转入另一无菌离心管中，再次4℃10000rpm离心10min。

(8)取上清液的上部80％转移到新的无菌离心管中，按照体积比1:6加入PEG/NaCl溶液，4℃过夜沉淀。

(9)4℃12000g离心沉淀15min。除去上清液，再离心1min，吸去残留上清。

(10)沉淀物重悬于1mL TBS中，悬液转入离心管中，4℃12000g离心5min使残余细胞沉淀。

(11)上清转入另一离心管中，用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀，冰上孵育15-60min。

(12)4℃12000g离心10min，弃上清，再离心1min，用微量移液枪吸去残余上清。

(13)沉淀重悬于200μLTBS,0.02％NaN₃中，12000g离心1min，除去沉淀。上清液转入新离心管中，此即为扩增后的第一轮噬菌体产物。

(14)按照步骤B中“噬菌体滴度测定方法”测定扩增后的第一轮噬菌体产物。

第二轮淘选：

(1)根据蓝斑数和稀释梯度计算噬菌体滴度，蓝斑数乘以稀释梯度即噬菌体滴度。根据滴度值来计算加入1-2×10¹¹pfu的噬菌体加入量。

(2)进行第二轮淘选，步骤重复第一轮。

第三轮淘选：

(1)根据蓝斑数和稀释梯度计算噬菌体滴度，根据滴度值来计算加入1-2×10¹¹pfu的噬菌体加入量。

(2)进行第三轮淘选，步骤重复第一轮。

第四轮淘选：

(2)进行第四轮淘选，步骤重复第一轮。

(3)在LB/IPTG/Xgal平板上测定第四轮淘选所得噬菌体回收量，即获得的噬菌体滴度。

实验结果显示：采用四轮淘选与Jeko-1淋巴瘤细胞系结合的噬菌体克隆，并将每一轮淘选获得的噬菌体进行计数，统计分析结果如表1所示。根据每轮噬菌体的回收率计算，经过四轮淘选后的阳性克隆数的浓度提高了约10⁴倍，说明存在与Jeko-1高亲和力结合的阳性噬菌体克隆。

表1.每轮淘选后噬菌体的富集结果

轮次	输入量(pfu)	回收量(pfu)	回收率
				1	1×10<sup>11</sup>	5×10<sup>3</sup>	5×10<sup>-8</sup>
2	1×10<sup>11</sup>	1×10<sup>4</sup>	1×10<sup>-7</sup>
				3	1×10<sup>11</sup>	5×10<sup>5</sup>	5×10<sup>-6</sup>
4	1×10<sup>11</sup>	1×10<sup>7</sup>	1×10<sup>-4</sup>

实施例2.噬菌体单克隆的获取和生物学信息分析

单克隆噬菌体扩增和纯化：

(2)取步骤(1)得到的ER2738单克隆菌斑于20mL LB-Tet，37℃220rpm摇床培养12h-16h。

(3)将步骤(2)中ER2738过夜培养物按1:100稀释接种于LB培养基，分1mL到15mL离心管中。

(4)取第四轮淘选的滴度测定时用的LB平板，枪头挑蓝色噬菌斑于步骤(3)1mLER2738菌液中，37℃220rpm摇床培养4h-5h。

(5)培养物转移到离心管中，14000rpm离心30s，上清转移至新离心管，重复离心30s，80％上清液转移至新离心管中，此为单克隆噬菌体贮液。

PCR扩增目的基因及测序：

(1)根据随机十二肽噬菌体展示文库中M13噬菌体序列设计引物：

Forward primer:5’-TTATTCGCAATTCCTTTAG-3’(SEQ.ID.NO.5)

Reverse primer:5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’(SEQ.ID.NO.6)

PCR体系

PCR反应条件：

预变性：95℃，5min；变性：95℃，30s；退火：58℃，30s；延伸：72℃，30s；30个循环；延伸：2℃，5min；12℃保存。

(2)PCR产物回收(参见生工SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒说明书)

a.在PCR反应液中加入5倍体积Buffer B3，吹打充分混匀。

b.将混合液全部移入吸附柱，8000g离心30s，倒掉收集管中的液体。

c.向吸附柱中加入500μL Wash Solution，9000g离心30s，倒掉收集管中的液体。

d.重复步骤c一次。

e.9000g离心空甩1min。

f.在吸附膜中央滴加15-40μL Elution Buffer，室温静置1-2min后，9000g离心1min。即为DNA溶液。

(3)将PCR纯化产物于2％琼脂糖胶电泳，确定成功PCR后，将PCR纯化产物寄至华大基因，利用反向引物进行正向测序。

(3)获得测序结果后，用Edit Seq软件反向互补得到模板链的DNA核酸序列，并按照三联密码子学说翻译成多肽序列。

实验结果显示：如图1，PCR扩增的目的基因，经2％琼脂糖凝胶电泳分析，不同噬菌体克隆的DNA大小不完全一致。这是由于噬菌体文库中存在一定数量的未能成功插入随机十二肽基因序列的噬菌体造成的，且野生型噬菌体具有明显的生长优势造成的，因此选取成功的噬菌体单克隆，经扩增后，将其PCR产物(图1中箭头所指处)送至华大基因测序。对测序结果通过Editseq软件进行分析，再将目的基因翻译成多肽序列，所获得的序列信息如图2所示，序列1和序列2所占比例分别为17％和14％，相同的噬菌体克隆存在富集现象，排除非特异序列1，将序列2作为候选研究多肽序列，命名为TUZG12，其氨基酸序列为MHPNAGHGSLMR。

实施例3.淋巴瘤细胞的培养、人淋巴细胞的提取及原代培养、荧光多肽合成、多肽的免疫荧光实验

淋巴瘤细胞的培养：

淋巴瘤细胞系Jeko-1、Romas、Raji、Su-4、Granta-519(均购至ATCC，美国模式培养物保藏所)，用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基培养。小鼠肥大细胞癌细胞P815(购至ATCC，美国模式培养物保藏所)用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养。所有细胞均在37℃、5％CO₂的细胞培养箱常规培养。

人淋巴细胞的提取及原代培养：

(1)将正常人的血液转移到15mL离心管内，500g离心8min，分离上清层血清于新的15mL的离心管内。

(2)加与步骤(1)中所得血清等体积的PBS于血清中，混匀。

(3)取新的15mL离心管，加与步骤(2)混合液总体积相同体积的人淋巴细胞分离液(HisToPAQVE@1077)，将步骤(2)中液体再次混匀，慢慢转移到这个离心管内。

(4)500g离心25min。

(5)弃掉上层和下层，取中层白色的淋巴细胞。

(6)加5倍体积的PBS洗一下，500g离心7min，弃上清。

(7)5mL PBS重悬，500g离心7min，弃上清。

(8)用4mL培养基重悬，转移到T25培养瓶中，置于培养箱中培养。

所述培养基配制：在完全RPMI1640培养基中加入适量步骤(1)所得的血清，使血清的终浓度为10％。

荧光多肽的合成：

TUZG12的氨基酸序列为MHPNAGHGSLMR，对照组多肽Random的序列为VSYVPMQGALTQ，FITC通过氨基己酸修饰在多肽N端，分别记作TUZG12-FITC和Random-FITC。荧光标记的多肽由南京金斯瑞生物科技公司采用固相合成法合成。

多肽的免疫荧光实验：

(1)荧光标记的多肽母液浓度为2mM。

(2)Jeko-1淋巴瘤细胞系及人正常淋巴细胞生长状态良好后，用血球计数板计数。320g离心5min，用PBS重悬，使细胞数为1x10³个/μL。

(3)用移液器取50μL细胞滴于载玻片上，37℃放置1h烘干。

(4)4％多聚甲醛室温固定10min，去掉固定液，PBS洗3次。

(6)将浓度为25μM的标记荧光的多肽(TUZG12-FITC和Random-FITC)悬液滴加在固定于载玻片上的细胞，于增湿容器中室温孵育1h。

(7)吸去标记荧光的多肽，PBS洗2次。

(8)用PBS按1:1000稀释4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，每个细胞上加50μL稀释后的DAPI，室温下反应5min。

(9)PBS洗3次。

(9)取10μL抗荧光淬灭剂p-苯二胺(PPD)于细胞上，盖上盖玻片并用树脂封片。

(10)在Olympus荧光倒置显微镜下观察并拍照。

实验结果显示：HPLC和质谱分析证明荧光多肽TUZG12-FITC和Random-FITC的纯度均大于95％；Random-FITC相对分子量为1810.60，TUZG12-FITC相对分子量为1810.60。

如图4和图5所示，以Random多肽为对照，图4中显示TUZG12有绿色荧光，表明有阳性反应，表示多肽TUZG12能够与细胞结合；而Random没有绿色荧光，表明其与细胞结合较弱或未与细胞结合。

图5中得出TUZG12多肽对Jeko-1、P815、Raji、Su-4四个淋巴癌细胞系具有靶向结合活性，但对Romas和Granta-519淋巴癌细胞系及人正常淋巴细胞无靶向结合活性。

实施例4.偶联多肽TUZG12-DKK的合成、偶联多肽对淋巴瘤细胞生存率的影响

本发明筛选所得多肽对多个淋巴瘤细胞只具有靶向的结合活性，几乎没有细胞毒性；偶联一个具有细胞毒性的多肽(可以想象为一般的化疗药物)，探索所得多肽在淋巴瘤靶向治疗方面上的应用。

偶联多肽TUZG12-DKK的合成：

以筛选得到的淋巴瘤特异性结合多肽TUZG12为靶向配体，以两个甘氨酸为连接分子，以促凋亡肽DKK为细胞毒性分子，来设计并合成偶联多肽TUZG12-DKK，其氨基酸序列为MHPNAGHGSLMRGGKLAKLAKKLAKLAK，对照组偶联多肽Random-DKK的序列为VSYVPMQGALTQGGKLAKLAKKLAKLAK，偶联多肽由南京金斯瑞生物科技公司采用固相合成法合成。

为了验证在偶联TUZG12多肽后，促凋亡肽被靶细胞摄取的量会得到一定程度的提高，从而能提高促凋亡肽的细胞杀伤效果，设置对照组，对照组偶联多肽Random-DK跟TUZG12多肽一样，通过两个G(甘氨酸)偶联在一起；对照组对实验细胞不具备靶向结合的活性，不能提高促凋亡肽向靶细胞的转运，因此细胞杀伤效果有限。

偶联多肽的细胞毒性实验：

采用MTT法检测两种偶联多肽分别对Jeko-1和Raji两种淋巴瘤细胞系增殖的影响。具体步骤如下：

(1)细胞生长状态良好后，取适当体积的细胞320g离心5min，弃上清，加适当培养基吹打混匀，吸取10μL于细胞计数板上计数，并用培养基稀释成1.3×10⁵个/mL。

(2)将稀释后的细胞接种于无菌96孔板中，每孔12000个细胞，每孔体积90μL。

(3)将多肽用无菌DMSO溶解，配制成浓度为1mM的母液。

(4)用培养基梯度稀释多肽至750μM、500μM、250μM、100μM、50μM。

(5)在96孔板中加入10μL多肽，使其终浓度为75μM、50μM、25μM、10μM、5μM，放入细胞培养箱中孵育1h。

(6)取出96孔板，每孔分别加入10μL 5mg/mL的MTT溶液，继续置培养箱中孵育1.5h。

(7)在显微镜下观察细胞，待实验组有明显紫色晶体出现并与对照组有明显差别时，将96孔板800g离心15min，吸弃培养基，加入100μL DMSO，水平摇床摇10-20min，使紫色晶体溶解。

(8)用酶标仪在550nm波长下检测，计算细胞存活率。

实验结果显示：HPLC和质谱分析证明偶联多肽TUZG12-DKK和Random-DKK的纯度均大于95％；Random-DKK相对分子量为1554.85；TUZG12-DKK相对分子量为1485.25。

如图6和图7所示，MTT检测结果表明两种偶联多肽TUZG12-DKK和Random-DKK均能引起人淋巴瘤细胞系Jeko-1和Raji存活率的降低，作用剂量越大，淋巴瘤细胞的存活率越低；相同浓度下，TUZG12-DKK对细胞活性的抑制效率高于Random-DKK；TUZG12-DKK和Random-DKK对人淋巴瘤细胞系Jeko-1的IC₅₀值，分别为24.18±1.92μM和74.88±3.08μM，统计学分析表明两者存在显著性差异。TUZG12-DKK和Random-DKK对人淋巴瘤细胞系Raji的IC₅₀值分别为10.44±1.79μM和25.29±0.81μM，统计学分析表明两者存在显著性差异。由此说明，TUZG12多肽(淋巴癌细胞特异性结合多肽)能提高促凋亡肽对细胞的杀伤作用。

序列表

<110> 江苏大学

<120> 一种靶向结合淋巴癌细胞系的特异性多肽及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met His Pro Asn Ala Gly His Gly Ser Leu Met Arg

1 5 10

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Val Ser Tyr Val Pro Met Gln Gly Ala Leu Thr Gln

1 5 10

<210> 3

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met His Pro Asn Ala Gly His Gly Ser Leu Met Arg Gly Gly Lys Leu

1 5 10 15

Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys

20 25

<210> 4

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Val Ser Tyr Val Pro Met Gln Gly Ala Leu Thr Gln Gly Gly Lys Leu

1 5 10 15

Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys

20 25

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttattcgcaa ttcctttag 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccctcatagt tagcgtaacg 20

Claims

1. 多肽 TUZG12在非诊断与治疗目的的特异性结合淋巴癌细胞系中的应用，所述多肽TUZG12的氨基酸序列为MHPNAGHGSLMR，所述淋巴癌细胞系为Jeko-1、P815、Raji 或Su-4淋巴癌细胞系。

2.多肽 TUZG12在制备靶向治疗淋巴癌的药物中的应用，所述多肽的氨基酸序列为MHPNAGHGSLMR，所述淋巴癌细胞系为Jeko-1、P815、Raji 或Su-4淋巴癌细胞系。

3. 一种偶联多肽 TUZG12-DKK，其特征在于，所述偶联多肽以氨基酸序列为MHPNAGHGSLMR的多肽 TUZG12 为靶向配体，以两个甘氨酸为连接分子，以促凋亡肽 DKK 为细胞毒性分子，其氨基酸序列为MHPNAGHGSLMRGGKLAKLAKKLAKLAK。

4. 权利要求3所述的偶联多肽 TUZG12-DKK在制备抑制淋巴癌细胞系增殖活性的药物中的应用，所述淋巴癌细胞系为Jeko-1、P815、Raji 或Su-4淋巴癌细胞系。

5. 权利要求 3 所述的偶联多肽 TUZG12-DKK 在制备靶向治疗由Jeko-1、P815、Raji或Su-4 细胞系引起的淋巴癌的药物中的应用。

6. 一种靶向治疗由Jeko-1、P815、Raji 或Su-4 细胞系引起的淋巴癌的药物，其特征在于，所述药物包括氨基酸序列为MHPNAGHGSLMR的多肽 TUZG12。

7. 一种靶向治疗由Jeko-1、P815、Raji 或Su-4 细胞系引起的淋巴癌的药物，其特征在于，所述药物包括权利要求3中所述的偶联多肽。