KR101501799B1

KR101501799B1 - 세포의 자가소화작용 유도용 조성물

Info

Publication number: KR101501799B1
Application number: KR1020110039741A
Authority: KR
Inventors: 이제호; 박경숙; 송상용
Original assignee: 사회복지법인 삼성생명공익재단
Priority date: 2011-04-27
Filing date: 2011-04-27
Publication date: 2015-03-12
Also published as: KR20120121754A

Abstract

본 발명은 세포의 자가소화작용 유도용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 디코프 3(Dickkopf 3, DKK3) 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 세포의 자가소화작용 유도용 조성물, 및 디코프 3(Dickkopf 3, DKK3) 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 자가소화작용 장애 관련 질환을 치료할 수 있는 약학 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 DKK3 폴리펩타이드 및 베클린-1 폴리펩타이드의 상호작용을 이용하여, 세포의 자가소화작용을 상향 또는 하향 조절하는 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

Description

세포의 자가소화작용 유도용 조성물{A Composition for Inducing Cell Autophagy}

진핵세포의 세포사멸은 3가지 기작, 즉 형태학적 및 생화학적 특징에 따라 크게 아팝토시스(apoptosis), 자가소화작용(autophagy) 및 괴사(necrosis)로 나타난다(Cell Death Differ. 12 Suppl 2:1463-1467, 2005). 이 중 자가소화작용은 일정한 상황에서 활성화되는 자가포식소체-리소좀성(autophagosomic-lysosomal) 단백질 분해의 이화 과정으로 정의되는데, 이러한 자가소화작용은 일반적으로 영양 부족의 조건 하에서 촉발되지만, 또한 발달, 분화, 신경퇴행성 질병, 감염 등의 생리학적 과정과 연관되어 있는 것으로도 알려져 있다(Reggiori, F. et al. (2002) Eukaryot. Cell 1, 11-21; Codogno, P. et al. (2005) Cell Death Differ. 12 Suppl 2, 1509-1518; Levine, B. et al. (2005) J. Clin. Invest. 115, 2679-2688). 상기 자가소화작용에 의한 세포사멸은 1형 세포사멸로 분류되는 아팝토시스(apoptosis)와는 상이한 경로를 통하는 2형 세포사멸(type Ⅱ programmed cell death)로 분류되고, 영양결핍(nutrient starvation)이나 환경적 스트레스, 또는 다양한 화합물들에 의해 증가되며, 그 과정은 소포체(endoplasmic reticulum, ER)에서 유래되거나 새롭게 합성되는 이중막 구조가 만들어지고, 여기에 세포 내 소기관(미토콘드리아 등)이나 세포질 내 단백질들을 고립시키면서 자가포식소체(autophagosome)를 형성하여, 궁극적으로 리소좀(lysosome)과 융합하여 파괴시킨다(Nat. Rev. Cancer., 5:726-734, 2005). 자가소화작용이 일정수준 이상이면 세포사멸을 일으키며, 이러한 자가소화작용에 의한 세포사멸을 이용한 질환치료제 개발이 현재 관심을 받고 있다(Clinical Science, 116:697-712, 2009).

자가소화작용은 진핵 세포에서 어디에서나 발견되는 3개 이상의 세포내 단백질 분해 경로인 거대자가소화작용, 미세자가소화작용(microautophagy) 및 샤페론(chaperone) 매개 자가소화작용으로 이루어진다. 거대자가소화작용이 수행되는 동안, 세포소기관을 포함하는 세포질 물질은 이중막으로 덮인 자가포식소체(autophagosome) 속으로 격리되고, 이후 자가포식소체는 엔도좀 및 리소좀과 융합된다. 이어서, 격리된 자가포식소체 내용물은 리소좀 하이드롤라제에 의해 분해되고 분해 산물은 세포에 의해 재활용된다.

이러한 자가소화작용에 관여하는 단백질로는 베클린-1(Beclin-1), LC3, mTOR 단백질 등이 알려져 있다. 베클린-1(BECN1)은 자가소화작용에 관여하는 중요한 단백질 중 하나이며, 효모 세포자기파괴 단백질 Apg6/Vps30의 포유류 상동물(orthologue)이다(Kametaka, S. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 22284-22291). 베클린-1은 Apg6의 결실로 인하여 발생하는 효모에서의 자가소화작용의 결함을 보충할 수 있으며, 포유류 세포에서 과다발현되는 경우 자가소화작용을 유발할 수 있다(Liang, X.H. et al. (1999) Nature 402, 672-676). 포유류 베클린-1은 본래 Bcl-2와 상호작용하는 단백질에 대한 효모-투하이브리드 스크리닝으로 동정되었고, Bcl-2 및 Bcl-xL과는 상호작용하지만 아팝토시스 경로에 관여하는 Bax 또는 Bak와는 상호작용하지 않는 것이 증명되었다(Liang, X.H. et al, (1998) J. Virol. 72, 8586-8596).

베클린-1은 일반적으로 다양한 세포에서 발현되며, 미토콘드리아를 포함한 세포질의 구조에 편재되지만, 베클린-1의 과다발현시 일부 핵성 염색 및 CRM1-의존 핵성 배출을 나타낸다(Liang, X.H. et al. (2001) Cancer Res. 6t1, 3443-3449). 생체 내에서 바이러스 감염된 뉴런에서의 베클린-1의 과다발현은 신드비스(Sindbis) 바이러스 유도 질병 및 뉴런 세포자살에 대한 현저한 보호를 야기하였다(Liang, X.H. et al, (1998) J. Virol. 72, 8586-8596). LC3(Light Chain 3)은 자가소화작용시 그 양이 증가하는 단백질이며, 본래 미세소관-연관 단백질 1A 및 1B의 서브유닛(MAP1LC3으로 명명됨)으로서 동정되었고(Mannm S.S. and Hammarback, J.A. (1994) J. Biol. Chem. 269, 11492-11497), 이어서 자가소화작용에 중요한 역할을 하는 효모 단백질 Apg8/Aut7/Cvt5에 유사한 것으로서 발견되었다(Lang, T et al. (1998) EMBO J. 17, 3597-3607). 인간에서는 LC3의 세가지 동형(isoform)으로 LC3A, LC3B, 및 LC3C가 알려져 있고 이들은 자가소화작용 과정 동안 전사후 변형의 과정을 거친다. LC3은 그 합성 후 즉시 이어지는 카르복시 말단의 첫번째로 절단을 통하여 세포질성 형태 LC3-I을 생성시키고, 자가소화작용 동안 LC3-I는 Apg7 및 Apg3이 관여하는 유비퀴틴 유사 시스템으로 인하여 LC3-II으로 변환되어 LC3이 자가포식소체에 연결된다. 따라서, 자가포식소체에서 LC3의 존재와 LC3의 더 낮은 이동 형태인 LC3-II으로의 변환은 자가소화작용의 지표로서 사용된다. mTOR(mammlian target of rapamycin)은 또한 FRAP 또는 RAFP로도 알려져 있으며(Sabers, C.J. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 815-822; Brown, E.J. et al. (1994) Nature 369, 756-758; Sabatini, D.M. et al. (1994) Cell 78, 35-43), Ser/Thr 키나아제이다. mTOR은 ATP 및 아미노산의 변화에 반응하며 영양분의 이용가능성 및 세포 성장의 균형을 맞추는 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Gingras, A.C. et al. (2001) Genes Dev. 15, 807-826; Dennis, P.B. et al. (2001) Science 294, 1102-1105). 충분한 영양분이 이용가능할 때는, mTOR은 포스파티드산-매개 신호로 응답하며(Fang, Y. et al. (2001) Science 294, 1942-1945), p70 S6 키나아제로 양성 신호를 전달하고 eIF4E 저해자인 4E-BP1의 불활성화에 관여하여 특정 mRNA 군의 번역을 야기한다. mTOR은 PI3 키나아제/Akt 신호 경로를 통하여 Ser2448에 인산화되거나 자발적으로 Ser2481에 인산화되어 p-mTOR이 생성된다(Nave, B.T. et al. (1999) Biochem. J. 344 Pt2, 427-431; Peterson, R.T. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 7416-7423). mTOR은 세포 성장이나 항상성에 핵심적인 역할을 하며, 세포자기파괴 작용은 mTOR에 의하여 저해되는 것으로 알려져 있다.

한편, 세포사멸에 대한 주요 조절자들에는 Bcl-2 단백질군의 멤버들이 포함된다(Farrow, S.N. 와 Brown, R. Curr. Opin. Gen. Dev., 1996,6:45-49). 상기 Bcl-2 단백질군은 자가사멸을 조절하기 위해 다양한 수준의 자가사멸 과정에서 작용하는 프로(pro)- 및 안티(anti)-자가사멸 단백질군 멤버들로 이루어진다. 상기 Bcl-2 군 멤버들은 하나 이상의 Bcl-2 상동성(BH) 자리를 포함한다(Farrow, S.N. 와 Brown, R. Curr. Opin. Gen. Dev., 1996,6:45-49). bcl-2 (B 세포 림프종/백혈병-2) 유전자의 과다 발현은 종양유발성(tumorigenicity)과 연관될 수 있다(Tsujimoto et al., 1985, Science 228:1440-1443). bcl -2 유전자는 세포 분화를 촉진하기보다는 세포 생존을 연장시킴으로써, 암의 병리 및 치료에 대한 저항성을 유도하는 것으로 생각된다. 사람 bcl-2 유전자는 특정 백혈병, 림프구 종양, 림프종, 신경모세포종 및 비인두, 전립선, 유방, 결장 암종의 병인에 관여하므로, 비-홉킨슨 림프종, 폐암, 유방암, 대장암, 전립선암, 직장암 및 급성과 만성 백혈병을 비롯한 다양한 종양에서 과다 발현되는 것으로 밝혀졌다.

상기 Bcl-2는 자가소화작용에도 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 국제특허공개 WO06/082303에는 Bcl-2 단백질과 결합하는 베클린 단백질의 모티프, 상기 모티프를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체, 이로부터 생산되는 펩타이드, 및 상기 펩타이드를 암 환자에게 투여함으로써 아팝토시스- 및 자식작용-형태의 아팝토시스를 유도하는 방법이 개시되어 있다.

상기와 같이, 진핵세포의 세포사멸을 유도하는 아팝토시스에 관련된 조절인자(BCL-2)와 자가소화작용에 관여하는 단백질(베클린-1)이 상호작용하여 세포의 자가소화작용을 통한 세포사멸에 관여함이 알려져 있으나, 이의 작용기작을 조절하는 방법에 대하여는 아직까지 보고되지 않았다. 특정한 조건이 요구되는 아팝토시스와는 달리, 자가소화작용은 영양고갈의 조건만으로도 충분히 유발될 수 있기 때문에, 자가소화작용의 유발을 조절할 수 있다면, 비정상적인 세포 및 단백질로 인하여 유발되는 각종 질환의 치료를 보다 용이하게 수행할 수 있을 것으로 예상되고 있으나, 아직까지는 별다른 연구성과가 보고되지 않고 있는 실정이다.

본 발명자들은 자가소화작용의 유발을 조절하는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 디코프 3(Dickkopf 3, DKK3)을 이용하면 BCL-2와 베클린-1의 상호작용을 억제할 수 있고, 이에 따라 자가포식소체의 형성을 촉진시켜서, 자가소화작용을 유발시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 주된 목적은 디코프 3(Dickkopf 3, DKK3) 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 세포의 자가소화작용 유도용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 DKK3 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 자가소화작용 장애 관련 질환을 치료할 수 있는 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 DKK3 및 베클린-1의 상호작용을 이용하여, 세포의 자가소화작용을 상향 또는 하향 조절하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 일 실시양태에 의하면, 본 발명은 디코프 3(Dickkopf 3, DKK3) 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 세포의 자가소화작용 유도용 조성물을 제공한다. 상기 세포의 자가소화작용 유도는 생체 내 또는 생체 외에서 이루어질 수 있다.

본 발명의 용어 "디코프 3(Dickkopf 3, DKK3)"는 REIC(reduced expression in immortalized cells)라고도 알려진 배아 발달 중에 세포의 운명을 조절하는 분비된 당단백질을 암호화하는 유전자 패밀리의 하나를 의미한다.

본 발명에서 디코프-3 단백질은 인간을 포함한 다양한 포유류 유래의 DKK3 단백질, 이와 기능적으로 동등한 변이체 또는 생리학적 활성을 유지하는 단편을 포함하는 개념이다. 여기서 "기능적으로 동등한 변이체"란 특정 종 유래의 야생형 단백질 또는 이의 유전자 서열과 비교하여 변이가 있지만 베클린-1 단백질과 결합하여 세포의 자가소화작용을 유도할 수 있는 기능을 갖는 기능적 등가물을 말한다. 본 발명에서 이용할 수 있는 DKK3 단백질은 바람직하게는 인간 유래의 DKK3, 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 DKK3 단백질(GenBank Accesstion No. AAQ88744.1)이지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 DKK3 단백질은 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. DKK3 단백질의 변이체란 DKK3 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아세틸화(acetylation), 당화(glycosylation), 메틸화 (methylation), 파렌실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다. 이러한 변이체는 실질적으로 동등한 활성을 갖는 기능적 등가물 또는 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키는 변형을 가지는 단백질을 포함한다. 물리 화학적 성질이 변형된 변이체는, 예를 들어, 온도, 수분, pH, 전해질, 환원당, 가압, 건조, 동결, 계면장력, 광선, 동결과 해동의 반복, 고농도 조건 등의 물리적 요인과 산, 알카리, 중성염, 유기용매, 금속이온, 산화환원제, 프로티아제 등의 화학적 요인의 외부 환경에 대한 구조적 안정성이 증대된 변이체이다.

상기 DKK3 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 분리하거나 합성(Merrifleld, J. Amer. chem. Soc..85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다(Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).

또한, 본 발명에서 DKK3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 DKK3 단백질을 코딩하는 핵산분자를 의미하며, 이들은 자연에서 분리되거나 인위적으로 합성 변형된 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드(GenBank Accesstion No. AY358378.1)일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 DKK3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드는 이의 작용성 등가물, 예를 들어, DKK3 폴리뉴클레오티드의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, DKK3 폴리뉴클레오티드와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다.

또한, 본 발명의 DKK3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 게놈 DNA, cDNA 및 화학합성 DNA를 포함할 수 있으며, 게놈 DNA 및 cDNA는 당업계의 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다.

게놈 DNA는 예를 들어, DKK3 유전자를 가지는 세포로부터 게놈 DNA를 추출하고 게놈 라이브러리(벡터는 예를 들면 플라스미드, 파지, 코스미드, BAC, PAC 등이 이용될 수 있다)를 제작하고 상기 라이브러리를 본 발명의 DKK3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(예를들어, 서열번호 2)를 기초로 제작한 프로브를 이용하여 콜로니 또는 플라그 혼성화를 수행하거나, 본 발명의 DKK3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (예를들어, 서열번호 2) 에 특이적인 프라이머를 작성하고, 이를 이용한 폴리머라제 연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행함으로써 제조할 수도 있다.

cDNA 는 예를 들어, DKK3 유전자를 가지는 세포에서 추출한 mRNA를 기초로 cDNA를 합성하고, 상기 합성된 cDNA를 λZAP 등의 벡터로 삽입하여 cDNA 라이브러리를 제작하고, 상기 cDNA 라이브러리를 전개하여, 상기와 동일하게 콜로니 또는 플라그 혼성화를 수행하거나 또는 PCR을 수행하여 제조할 수 있다.

이렇게 분리된 폴리뉴클레오티드는 이들이 코딩하는 아미노산 수준에 있어서, DKK3 단백질의 아미노산 서열(서열번호 1)과 높은 상동성을 가지는 것이 바람직하며, 높은 상동성이란 아미노산 서열 전체에서, 적어도 50% 이상, 더 바람직하게는 70% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상의 서열 동일성을 가리킨다. 아미노산 서열이나 염기서열의 상동성은 BLAST (Karlin, S and Altschul, SF. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873-5877, 1993) 에 기초하여 개발된 BLASTN 이나 BLASTX 라 불리는 프로그램 (Altschul, SF. et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990) 을 사용하여 분석될 수 있으며 구체적인 방법은 다음의 웹사이트에 공지되어 있다 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.).

한편, 본 발명의 DKK3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포 내 전달을 위한 발현 벡터에 포함되어 제공될 수 있다.

본 발명의 DKK3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 DNA 및 DEAE-덱스트란의 복합체, DNA 및 핵 단백질의 복합체, DNA 및 지질의 복합체 등의 다양한 형질전환 기술을 이용하여 세포 내로 도입시킬 수 있는데, 이를 위해 상기 폴리뉴클레오티드는 세포 내로의 효율적인 도입을 가능하게 하는 전달체 내에 포함된 형태일 수 있다. 상기 전달체는 바람직하게는 벡터이며, 바이러스 벡터 및 비바이러스 벡터 모두 사용 가능한데, 예를 들어 플라스미드, 파아지, 코스미드, 바이러스 벡터 등이 포함될 수 있으며, 이러한 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.

본원에서 "도입"은 형질전환 또는 형질도입에 의해 외래 DNA를 세포로 유입시키는 것을 의미한다. 형질전환은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 형질전환법, 폴리브렌-매개 형질전환법, 전기충격법, 미세 주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당업계에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 또는 바이러스 벡터 입자를 사용하여 세포 내로 유전자를 전달시키는 것을 의미한다.

또한, DKK3 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터 내에서 프로모터/인핸서 서열과 같은 발현 조절 서열 및 기타 전사, 해독 또는 프로세싱에 필요한 서열들과 함께 작동 가능하게 결합될 수 있다. 조절 서열은 뉴클레오타이드의 구성적 발현(constitutive expression)을 지시하는 것뿐만이 아니라 조직-특이적 조절 및/또는 유도성 서열을 포함할 수 있으며, 발현 벡터의 설계는 형질전환시킬 숙주 세포, 목적하는 발현 수준 등과 같은 요소에 의해 결정될 수 있다.

또한, 본 발명의 DKK3 폴리뉴클레오티드는 벡터에 포함된 상태로 세포배양 시스템에서 적절한 진핵세포에 도입시켜 DKK3을 직접적으로 발현시키거나, 원핵세포에 형질전환시켜 DKK3 단백질을 발현시킨 후, 이들 단백질을 정제하여 사용할 수 있다. 이러한 본 발명의 DKK3 단백질은 예를 들면 정제된 단백질, 수용성 단백질, 또는 표적 세포로의 전달 또는 투여를 위한 담체에 결합된 형태의 단백질이나 아미노산 잔기와 융합된 형태를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 내인성 DKK3를 활성화시키는 물질을 이용할 수도 있다. "DKK3를 활성화시키는 물질"이란 DKK3에 직접 또는 간접적으로 작용하여 DKK3의 생물학적 활성을 개선, 유도, 자극, 증가시키는 물질을 의미한다. 이런 물질은 유기 또는 무기 화합물과 같은 단일 화합물 펩타이드, 단백질, 핵산, 탄수화물 및 지질과 같은 생체 고분자 화합물 및 복수 화합물의 복합체 등을 포함한다. 상기 물질이 DKK3를 활성화시키는 기작은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 물질은 전사, 번역 등의 유전자 발현을 증대시키거나, 비활성형을 활성형으로 전환시키는 기작으로 작용할 수 있다. 당업자는 당 분야의 공지기술을 이용하거나 또는 본 발명의 스크리닝 방법을 통하여 DKK3를 활성화시키는 물질을 스크리닝할 수 있다.

본 발명자들은 DKK3가 자가소화작용에 미치는 영향을 확인하기 위하여 다양한 연구를 수행한 결과, 상기 DKK3가 자가포식소체의 형성을 유도하여, 결과적으로는 세포에서 자가소화작용이 수행될 수 있도록 하고, DKK3 단백질이 베클린-1 단백질내 존재하는 BCL-2 결합도메인인 BD도메인에 결합하여 베클린-1과 BCL-2의 결합을 저해함으로써 BCL-2의 활성을 저해하고 베클린-1의 자가소화작용 유도효과를 유지시키며, 자가소화작용을 억제하는 PI3K 클래스 I mTOR 신호전달 경로를 억제하고, 자가소화작용을 활성화시키는 PI3K 클래스 III 신호전달 경로를 활성화시킴으로써, 자가소화작용을 유도하는 결과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

본 발명의 다른 실시양태에 의하면, 본 발명은 상기 디코프 3(Dickkopf 3, DKK3) 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 자가소화작용 장애 관련 질환을 치료할 수 있는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "자가소화작용 장애 관련 질환"은 비정상 세포 또는 단백질이 발생하고 자가소화작용에 의하여 제거되지 않음에 의하여 유발되는 모든 질환을 의미한다. 예를 들어, 자가소화작용에 필요한 자가포식소체의 성숙 결함이 있는 질환을 포함한다.

본 발명의 용어 "비정상 세포"는 형태적 또는 기능적으로 정상세포와 유의하게 구별되는 세포를 의미한다. 상기 비정상세포는 영양이 고갈된 세포, 유전적으로 변형되어 세포의 형태 및 기능이 손상된 세포, 물리적으로 손상된 세포 등을 모두 포함한다. 본 발명의 용어 "비정상 단백질"은 형태적 또는 기능적으로 정상 단백질과 유의하게 구별되는 단백질을 의미한다. 상기 비정상 단백질은 아미노산 변이 등에 의하여 3차 구조가 변형된 응집성 변이 단백질(aggregate-prone mutant proteins) 등을 모두 포함한다.

구체적으로, 자가소화작용 장애 관련 질환은 각종 종양성 질환, 다양한 퇴행성 질환을 모두 포함한다.

본 발명의 용어 "퇴행성 질환"은 시간에 따라 영향을 받은 조직 또는 기관의 구조 또는 기능이 점점 퇴화되는 질병을 의미한다. 상기 퇴행성 질환에는 척추 질환, 관절 질환, 뇌신경 질환 등이 포함되는데, 상기 척추 질환은 특별히 이에 제한되지 않으나, 척추과민증, 잠재이분척추, 척추관협착증 등을 포함하고, 상기 관절 질환은 특별히 이에 제한되지 않으나, 관절강직, 무균성 골괴사, 골수염, 골종양 등을 포함하며, 상기 뇌신경 질환은 특별히 이에 제한되지 않으나, 알쯔하이머 질환, 파킨슨 질환, 뇌졸중, 타우병증, 근위축성 측삭경화증(ALS), 헌팅턴 질환 등을 포함한다.

더욱 구체적으로, 암, 신경퇴행성질환(알츠하이머 병, 헌팅턴 병, 파킨슨 병, 치매 등), 데스민 관련 심근증(desmin-related cardiomyopathy), 감염, 염증 및 노화 질환을 모두 포함한다. 그 외, 자가소화작용 장애는 만성 염증 및 암과 연관된 α1-안티트립신 부족 간 질환(Perlmutter, 2006), 심근증 및 근육병변 등과 관련된 다농병(Danon disease)과 같은 근육퇴행성 질환을 포함한다. (Beth Levine et al. (2008) Cell. January 11; 132(1): 2742)

신경퇴행성질환에 있어서, 헌팅턴 병 및 척수소뇌성 실조증(spinocerebellar ataxia)은 폴리글루타민 (polyQ) 확장관 단백질이 제거되지 않음과 관련되고, 파킨슨병은 돌연변이 알파 사이뉴클레인(α-synucleins)이 제거되지 않음과 관련되며, 전두측두엽 치매는 돌연변이 타우 단백질이 제거되지 않음과 관련된다(Williams et al., 2006).

감염과 관련하여, 세포 내로 침입한 병원체는 자가소화작용 의존 경로에 의하여 분해되므로(Nakagawa et al., 2004), 자가소화작용 장애에 의하여 감염 질환이 발생할 수 있다. 또한, 자가소화작용은 세포사멸 사체의 빠른 제거를 유도하여 조직 염증을 예방하고 전신홍반성낭창(systemic lupus erythematosis)과 같은 자가항원에 대한 자가면역질환을 예방할 수 있으므로(Grossmayer et al., 2005), 자가소화작용 장애에 의하여 염증 또는 자가면역질환이 발생할 수 있다.

암의 경우, 대부분의 암세포의 경우 아팝토시스 관련 경로가 결손되어 있는 경우가 많으므로, 단순히 아팝토시스를 유도하는 기존의 치료 전략은 암을 효과적으로 치료하지 못하였다. 본 발명은 아팝토시스와 상이한 경로인 자가소화작용 의존 경로를 촉진함으로써 기존의 항암제에 내성이 있던 암도 효과적으로 치료할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 통상의 방법에 따른 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "약학적으로 허용가능한"은 생리학적으로 허용가능하며 전형적으로 인간에게 투여되었을 때 예상 밖의 반응을 일으키지 않는 조성물 및 분자들을 의미한다. 바람직하게, 여기서 사용되는 바와 같이, 상기 용어 "약학적으로 허용가능한"은 포유동물 및 특히 인간에의 사용에 관해 다른 일반적으로 알려진 약전에 의해 승인되는 것을 의미한다.

본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 DKK3 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충전제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 활석과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액상 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(Tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 치료를 필요로하는 개체에 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 자가소화작용 장애 관련 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

자가소화작용 장애 관련 질환의 종류나 투여 형태, 그리고 치료 효과 등을 고려하여 당업자에게 통상적으로 알려진 다양한 방법에 따라 본 발명의 DKK3 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 조성물을 적절히 투여할 수 있을 것이다.

본 발명의 또다른 실시양태에 의하면, 본 발명은 DKK3 폴리펩타이드 또는 그의 단편 및 베클린-1 폴리펩타이드 또는 그의 단편과의 상호작용을 이용하여, 세포의 자가소화작용을 상향 또는 하향 조절하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 구체적으로 베클린-1 폴리펩타이드의 BCL-2 결합도메인과 DKK3 폴리펩타이드의 상호작용을 이용할 수 있다. 상기 스크리닝된 물질은 세포의 자가소화작용 조절 연구에도 사용될 수 있고, 또한 자가소화작용 장애 관련 질환의 치료제로 이용될 수 있다.

상기 상호작용은 특별히 이에 제한되지 않으나, DKK3 폴리펩타이드 및 베클린-1 폴리펩타이드의 직접적 또는 간접적 결합일 수 있다.

구체적으로, DKK3 폴리펩타이드 또는 그의 단편과 베클린-1 또는 그의 단편과의 결합은 상기 결합을 유도 또는 촉진시켜서 자가소화작용을 촉진하는 물질의 추가에 의하여 상향 조절될 수도 있고, 반대로 상기 결합을 억제 또는 저해시켜서 자가소화작용을 억제하는 물질의 추가에 의하여 하향 조절될 수도 있다. 베클린-1 폴리펩타이드의 BCL-2 결합도메인과 DKK3 폴리펩타이드의 상호작용의 조절은 곧 베클린1과 BCL-2 단백질의 상호작용의 조절로 연결되므로, 세포의 자가소화작용을 상향 또는 하향 조절하는 물질을 스크리닝할 수 있다.

상기 스크리닝하는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, in vivo 또는 in vitro 상에서 자가소화작용에 대한 효과가 알려지지 않은 물질을 DKK3 및 베클린-1가 존재하는 시스템에 가하여 상기 물질의 효과를 검출하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 상기 스크리닝 방법은 in vitro 조건에서 DKK3 및 베클린-1가 존재하는 반응물에 상기 물질을 가하고, 반응시킨 후, 전기영동방법으로 DKK3 및 베클린-1의 결합에 대한 상기 물질의 효과를 검출하는 단계를 포함하도록 구현될 수도 있고; in vivo 조건에서 DKK3 및 베클린-1가 발현되는 세포에서 상기 물질을 발현시키고, 상기 세포에서의 자가소화작용 여부를 검출하여 상기 물질의 효과를 검출하는 단계를 포함하도록 구현될 수도 있다.

본 발명의 DKK3 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하면, 자가소화작용 장애로 인하여 비정상 세포 또는 단백질에 의하여 유발되는 질환을 치료하거나 또는 개선할 수 있으므로, 보다 효과적인 질환의 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다. 또한, 디코프-3 단백질은 인체 내 존재하여 분비되는 단백질이므로 인공 합성약에서 발생될 수 있는 부작용을 최소화할 수 있다.

도 1. DKK3은 자가소화작용을 유도한다.
A. DKK3의 외래성 발현을 통한 자가소화작용의 유도
자가소화작용에 대한 DKK3의 관련성을 확인하기 위하여 전체 세포분쇄물을 수득하였다. DKK3를 안정하게 발현하거나 또는 대조군을 발현하는 헬라세포의 전체 세포분쇄물을 대상으로 하여 면역블럿 분석법을 이용하여, 내재적 자가소화작용 단백질의 발현을 시험하였다. 항-DKK3 항체를 이용한 면역블럿 분석법을 통하여 DKK3의 발현이 확인되었다.
B. DKK3에 의한 자가소화작용 단백질의 용량의존적 증가
Flag-DKK3 발현벡터를 헬라세포에 도입하고, 이의 전체 세포분쇄물에서의 내재적 자가소화작용 단백질의 발현을 면역블롯 분석법을 통해 확인하였다. 항-DKK3 항체를 이용한 면역블럿 분석법을 통하여 DKK3의 발현이 확인되었다.
C. DKK3의 손상은 DKK3 유도된 자가소화작용을 저해시킨다.
무작위적 siRNA 또는 DKK3-특이적 siRNA를 정상적 인간의 폐 섬유아세포인 MRC5 세포에 도입하고, 이의 전체 세포분쇄물을 이용하여 자가소화단백질의 면역블롯 분석법을 수행하였다. 내부대조군으로는 항-GAPDH 항체가 사용되었다.
도 2. DKK3에 의한 자가포식소체(autophagosome) 형성의 촉진
A. DKK3를 발현하는 헬라세포의 수득
대조군의 Flag 벡터 또는 실험군의 DKK3 벡터를 헬라세포에 도입하여 형질전환체를 수득하고, Alexa 488로 표지된 항-DKK3 항체를 이용한 면역형광 분석법을 수행하여, DKK3를 발현하는 헬라세포의 수득하였다. 이때, 헬라세포의 DNA는 DAPI로 염색되었다. DKK3의 발현 역시 상기 Alexa 488로 표지된 항-DKK3 항체를 이용한 면역형광 분석법에 의해 확인되었다. 내부대조군으로는 항-GAPDH 항체가 사용되었다.
B. DKK3를 통한 자가포식소체 형성의 유도
상기 대조군과 실험군의 벡터로 형질전환된 헬라세포에 GFP-LC3을 도입하고, 공초점 현미경을 통해 세포질에서 자가포식소체 형성을 시험하였다. 자가소화작용 억제제인 3-MA는 DKK3에 의해 유도된 자가포식소체의 형성을 억제하였다.
C. 자가포식소체 형성의 유도는 세가지 독립적 실험에서 GFP-LC3 양성세포를 계수하여 정량분석되었다. 에러바는 표준오차를 나타낸다.
D. DKK3에 의한 자가포식소체 유도의 TEM 분석
DKK3 또는 대조군의 Flag 벡터를 안정하게 발현하는 헬라세포는 공지된 방법에 의하여 전자현미경 분석법에 적용되었다.
도 3. DKK3는 베클린-1과 반응하여 베클린-1-BCL-2 반응에 간섭한다.
A. DKK3는 베클린-1과 반응한다.
MCF-7 세포에 Flag-베클린-1 벡터를 도입하고, Flag-아가로스 비드를 사용하여 면역침전시킨 다음, 항-DKK3 항체를 이용하여 면역블롯 분석을 수행하였다. 동일한 면역분석을 항-베클린-1 항체를 이용하여 수행하여 상기 결과를 확인하였다.
B. DKK3는 베클린-1의 BD 도메인을 통해 내재적인 베클린-1과 반응한다.
DKK3를 발현하는 헬라세포의 세포분쇄물은 베클린-1 항체를 사용하여 반응시킨 후 프로테인 A/G 아가로스 비드를 사용하여 면역침전되었다. 면역블롯 분석은 항-DKK3 항체에 의해 수행되었다. 표시된 항체를 이용한 동일한 면역분석법이 베클린-1과 BCL-2의 발현을 확인하는데 사용되었다.
C. DKK3와 베클린-1은 세포질내에서 동일한 위치에 존재한다.
베클린-1과 DKK3의 세포질 내의 위치를 공초점 현미경을 이용하여 확인하였다. DKK3를 발현하는 헬라세포는 항-DKK3 항체 및 항-베클린-1 항체와 이후의 Alexa 488(녹색)- 및 Alexa 568(적색)으로 결합된 DKK3와 베클린을 검출하기 위한 이차항체를 이용하여 면역형광염색되었다.
D.MCF-7 세포는 베클린-1 또는 V5 표지된 베클린-1의 BD 도메인을 포함하는 벡터로 형질전환되었다.
항-V5 항체를 이용하여 상기 세포분쇄물에서 면역침전되었고, 항-DKK3 항체를 이용해서 면역블롯 분석을 수행하였다(패널상단). 베클린-1의 발현은 항-V5 항체를 이용한 면역블롯 분석에 의해 확인되었다(패널하단).
E. DKK3 단백질이 베클린-1 단백질의 BD 도메인에 결합함을 효모-투하이브리드 스크리닝 방법으로 확인한 것이다.
해당 베클린-1 단백질의 도메인을 발현하는 효모 발현벡터를 제조한 후 효모-투하이브리드 분석을 수행하여 DKK3와 베클린-1 단백질의 결합도메인을 분석하였다.
F. DKK3의 외래발현은 베클린-1-hVps34 복합체의 형성에 영향을 미치지 않는다.
MCF-7-DKK3 세포에 V5 표지된 베클린-1을 도입하고, 항-V5 항체를 이용하여 면역침전시킨 다음, 항-hVps34 항체로 면역블롯 분석을 수행하였다. 세포분쇄물에서 항-DKK3 항체를 이용한 면역블롯 분석으로 DKK3의 발현을 확인하였다.
도 4. 세포내 환경에서 DKK3에 의한 자가포식소체 형성의 유도
A. 무혈청 DKK3 조정배지의 분석
대조군 벡터 또는 DKK3 HEK 293T 형질도입체의 조정배지를 수집 및 농축한 후, 항-DKK3 항체를 이용한 면역블롯 분석을 수행하였다. 재조합 DKK3 단백질의 함량은 무혈청 조정배지에 존재하는 DKK3의 농도를 결정하는데 사용되었다.
B. DKK3에 의한 생체내 자가소화작용의 유도
동물실험을 통해 대조군 또는 DKK3 293T 조정배지로 처리된 조직의 세포분쇄물에서, 내재적 자가소화작용 관련 단백질의 발현이 면역블롯 분석법으로 분석되었다. GAPDH은 내부대조군으로 사용되었다.
C. 전자현미경 분석에 의한 자가포식소체 형성
대조군 또는 DKK3 293T 조정배지로 처리된 조직을 TEM 분석법으로 처리, 분석한 결과, DKK3 처리된 조직에서는 현저한 자가포식소체의 형성을 나타내었다.
도 5. DKK3에 의한 PI3K 신호전달 경로의 조절
신호전달 단백질의 항체를 이용한 면역블롯 분석법을 통해서, MCF-7(A 및 B) 유래의 세포분쇄물에서 클래스 I 및 III의 PI3K 신호전달 경로가 분석되었다. 내부 대조군으로 항-GAPDH 항체가 사용되었다.
도 6. DKK3 과발현이 영양이 풍부한 배양 조건에서도 자가포식소체 형성을 증가시킴을 면역형광현미경 분석을 통해 확인한 것이다. HeLa-Flag 또는 HeLa-DKK3 안정화 세포가 10% FBS 포함 배지에서 GFP 표지된 자가포식소체 결합 LC3벡터로 형질전환한 후 자가포식소체 형성을 공초점 현미경으로 분석하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실험재료 및 방법

세포 배양

인간의 배아신장 HEK293 세포, 인간의 배아 폐 섬유아세포 MRC5 및 헬라세포, MCF-7 세포는 10% FBS 및 항생제를 포함하는 DMEM 배지에서, 37℃ 5% CO₂의 조건으로 배양되었다.

재조합 벡터 및 형질도입

Flag 표지된 전장 인간의 DKK3 cDNA와 인간의 베클린-1 단편은 인간의 태아 뇌 cDNA 라이브러리를 이용한 높은 정확도의 PCR을 수행하여 수득하였다. 상기 단편은 Flag 표지된 pcDNA 벡터의 EcoR1 및 XhoI 부위에 도입되도록 클로닝되어, 전장 DKK3 발현벡터(Flag-DKK3)와 베클린-1 발현벡터(Flag-Beclin 1)를 각각 수득하였다. 모든 클로닝된 cDNA의 염기서열은 DNA 서열분석을 통해 확인되었다. 상기 수득한 벡터는 Effectene(Qiagen)을 이용하여 상기 인간의 세포주에 도입되었다. 대조군 벡터와 DKK3를 발현하는 형질도입체(HeLa, MCF-7, 293T)는 3주동안 G418 함유배지에서 개개의 콜로니를 얻은 후 계대 배양하여 증식시켜서 생성되었다. 형질도입체의 순도는 항-DKK3 항체로 염색하는 간접 면역형광법을 사용하여 확인되었다. 전장 베클린-1 또는 베클린-1의 BD를 포함하는 발현벡터를 V5로 표지하고, Effectene(Qiagen)을 이용하여 세포에 도입한 후 DKK3와 베클린-1 사이의 반응을 확인하였다.

siRNA 도입

DKK3를 표적으로 하는 siRNA 올리고뉴클레오티드 서열은 상업적으로 입수하였다(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). 100nM DKK3 siRNA는 Oligofectamin 시약(Invitrogen)을 사용하여 DKK3의 발현을 감소시키는데 사용되었다. DKK3 발현의 억제는 항-DKK3 항체를 이용한 면역블럿 분석법으로 확인되었다.

면역블럿 분석법 및 동시 면역침전 분석법

도입된 세포를 방사성면역침전분석용(RIPA) 완충용액에서 단백질 분해효소 억제제 혼합물(Roche, Mannheim, Germany)와 탈인산화 억제제(Sigma Aldrich, St. Louis, MO)의 존재하에 분해하였다(Park et al., 2005). 총 세포분쇄물(500㎍)을 항체를 이용하여 면역침전시켰다. 침전된 단백질을 5회 세척하고, 10% SDS-PAGE에 적용한 다음, ELC 막(BioRad Laboratories, Hercules, CA)에 전이시켰으며, ECL 검출키트(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)를 사용하여 면역블럿에 적용하였다. 내부대조군으로는 항-β-액틴 항체(Sigma, St. Louis, MO) 또는 항-GAPDH 항체(Sigma Aldrich)를 사용하였다.

간접 면역형광 분석법

6-웰 플레이트 내에서 커버슬립에 배양된 세포주에 목적하는 발현벡터를 도입하였다. 도입 30시간이 경과한 후, 상기 세포를 PBS로 세척하고 PBS에 완충된 4% 포르말린용액으로 고정시킨 다음, 간접 면역형광 분석에 적용하였다. 목적하는 1차 항체를 가하여 반응시킨 다음, 상기 세포에 Alexa 568 또는 Alexa 488가 결합된 IgG를 이차항체(Invitrogen)로서 가하여 반응시켰다. DAPI(Roche)를 이용하여 핵을 염색하였다. 목적하는 단백질의 발현 및 세포내 분포는 공초점 현미경(BioRad, Hertfordshire, UK)을 이용하여 분석되었다.

GFP-LC3의 정량

GFP 표지된 미세소관 결합 단백질 1 경쇄 3(LC3) 발현 벡터를 타모스 요시모리(Osaka University, Osaka, Japan)로부터 입수하였다. 대조군 벡터 또는 DKK3를 발현시키는 MCF-7 또는 헬라세포에, 유전자 전이 시약(Qiagen, Valencia, CA)을 이용하여 GFP-LC3 발현벡터를 도입하고, 10% FBS를 포함하는 영양풍부 조건 또는 4시간 동안 EBSS에서의 배양을 통한 영양고갈 조건에서 배양한 다음, 공초점 현미경(Radiance 2000, Biorad)으로 평가하였다. 자가소화작용의 유도를 정량화하기 위하여, 공초점 현미경을 이용하여 점형태의 자가포식소체의 형성이 결정된 10개 이상의 점을 가지는 200개의 GFP 양성 세포를 계수하였다.

마이크로 어레이 분석 및 RT-PCR 분석

DKK3 발현에 의해 활성화된 하류의 표적을 확인하기 위하여, 공지된 방법(Lee et al., 2005)에 따라, TRIZOL 시약(Invitrogen Life Technologies, Grand Island, NY)을 사용하여 DKK3 발현 세포 및 대조군 벡터 세포로부터 총 세포 RNA를 추출하고, 상기 cDNA를 DNA 칩(Genetrack Human 17K cDNA chip; Genomictree Products, Taejon, South Korea)을 사용하여 cDNA 마이크로어레이 분석에 적용하였다. RT-PCR 분석을 위하여, 역전사효소(Superscript II Reverse Transcriptase, Invitrogen) 및 올리고 (dT) 프라이머를 사용하여 목적하는 세포로부터 추출한 총 세포 RNA를 역전사시키고, 결과로서 얻어진 cDNA를 PCR 증폭용 주형으로 사용하였다. DKK3를 증폭시키기 위한 프라이머의 염기서열은 다음과 같다:

DKK3 정방향 프라이머, 5'-GAG CGA GCA GAT CCA GTC-3'(서열번호 3)

DKK3 역방향 프라이머, 5'-AGC CAT GTA GAA CAA ACG GC-3'(서열번호 4).

PCR 조건은 최초 변성 95℃ 1분; 95℃ 30초, 60℃ 1분 및 72℃ 1분 30회 반복; 및, 최종 연장 72℃ 7분이었다. 결과로서 얻어진 절편은 2% 아가로스겔 전기영동에 적용하고, DNA 염색시약(0.01% SYBR safe DNA gel stain, Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 염색하였다.

TEM 분석법

배양된 포유동물 세포 또는 조직을 2.5% 글루타르알데히드를 포함하는 0.1 M 카코딜레이트 완충용액(cacodylate buffer, pH 7.4)으로 40℃에서 45분동안 고정하고, 글루타르알데히드를 포함하지 않는 완충용액으로 세척하였으며, 1% OsO4를 포함하는 카코딜레이트 완충용액으로 후고정하고, 탈수시킨 다음, Epon에 포매하였다. 마이크로톰(Reichert Ultracut S ultramicrotome, Leica)으로 초박편(70 nm)으로 절단하였다. 상기 박편을 4% 우라닐 아세테이트로 염색하고, 전자현미경(Hitachi H-7100)으로 촬영하였다.

모델 동물

5주령의 자성 BALB/c 누드(nu/nu) 마우스를 상업적으로 입수하고(Charles River Laboratory, Japan), 무균조건에서 사육하였다. 각 실험군별로 5마리의 동물을 포함한다. 대조군 벡터 또는 DKK3를 발현하는 293T 세포에서 유래된 무혈청 조정배지(CM)를 원심분리하여 수집하고, 센트리콘 장치(Centricon filter devices, MWCO 30, Millipore, Bedford, MA)를 이용하여 농축하였다. 농축된 조정배지의 순도 및 농도는 SDS-PAGE 이후의 면역블럿 분석법을 이용하여 측정하였다. 마우스에 인간의 헬라세포(5 x 10⁶ cells)를 경피적으로 주사하고 10일이 경과한 후, 대조군 벡터 또는 DKK3 발현 형질도입체로부터 준비된 농축되고 정제된 무혈청 조정배지를 2주동안 1주일에 2회 마우스에 주사하였다(총 43㎍). 상기 조직을 잘라내어, 중량을 측정한 다음, 면역블럿 분석, 면역조직화학적 분석 및 전자현미경 분석에 적용하였다.

통계적 분석

실험 결과의 차이에 대한 통계적인 유의성은 독립적 분산분석법에 의해 평가하였고, 확률값은 독립적 T 테스트에 의해 산출되었다. P < 0.05인 경우 통계적으로 유의하다고 간주되었다.

실시예 1: DKK3의 자가소화작용 유도

본 발명자들은 β-카테닌 단백질의 분해에 프로테아좀 매개 유비퀴틴 분해활성 보다도 DKK3가 관여함을 밝혀내었다. 따라서, DKK3가 자가소화작용에 관여하는지의 여부를 확인하고자 하였다.

우선, 내재적 DKK3가 결여된 헬라세포에 외래의 DKK3 단백질을 발현시킨 후, 자가소화작용 단백질의 발현량을 측정함으로써, 자가소화작용에 대한 DKK3의 효과를 확인하였다. DKK3 발현벡터의 도입을 통한 DKK3의 외래발현은 내재적 자가소화작용 마커 단백질인 베클린-1과 막결합 미세소관 관련 단백질 1의 경쇄 3(MAP1 LC3-II)의 발현을 증가시켰다(도 1A).

세포질내 LC3-I를 LC3-II로 전환시키는 해독이후 변형은 근처의 자가포식소체의 막에 LC3-II가 위치한 후에 발생된다고 알려져 있다. 본 발명자들은 DKK3의 증가된 발현이 내재적인 LC3-II와 베클린-1의 수준향상을 유도하고, 용량-의존적인 DKK3 매개 자가소화작용의 유도를 제안하였다(도 1B).

추가로, 본 발명자들은 인간의 정상 MRC5 세포에서 siRNA 매개 실험을 통해 자가소화작용에서의 DKK3의 역할을 연구하였다. DKK3-특이적 siRNA는 80% 정도의 DKK3 단백질 발현을 감소시켰고, 내재적인 LC3-II를 감소시켰다(도 1C).

신규한 DKK3-매개 자가소화작용 유도를 확인하고, 분자기작을 탐색하기 위하여, 본 발명자들은 카스파제 3가 결여되고, 카스파제-9의 미약한 활성을 나타내며 DKK3가 발현되지 않는 MCF-7 세포주를 선택하였다. 아팝토시스 유도에 의한 비특이적 세포독성 효과로부터 DKK3의 활성을 구별하기 위하여, 헬라세포와 MCF-7 세포에서 DKK3를 안정하게 발현시켰고, 대조군의 벡터를 발현시킨 다음, G418를 함유하는 배지에서 선별하였다.

DKK3 단백질 발현은 항 DKK3 항체를 이용한 간접적인 면역형광염색법 및 면역블롯 분석법으로 확인되었다(도 2A). DKK3 단백질은 형질전환체의 세포질에서 발현되었다(도 2A, left).

헬라 DKK3 세포에서 DKK3 매개 자가소화작용의 유도를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 GFP 표지된 자가포식소체 결합 LC3 벡터를 대조군 또는 DKK3 발현 헬라세포에 도입한 후, 공초점 현미경으로 자가소화작용 유도의 중요한 초기 마커인 자가포식소체 형성을 시험하였다. LC3에 PE(phosphatidylethanolamine)를 결합시키면, 자가소화작용 유도조건하에서 자가포식소체의 막에 결합된 LC3를 불용성화하게 된다. 그 결과, GFP-LC3는 정상적인 조건하에서는 세포에 분산된 형태로 존재하는 반면, 막에 결합된 형태를 반영하는 점형태로 GFP-LC3가 존재하면 자가소화작용의 유도를 입증하는 증거가 될 수 있다.

따라서, 본 발명자들은 LC3-II의 생성 및 형광표지된 LC3의 세포내 분포 형태의 관찰에 의하여 생화학적으로 자가소화작용의 유도를 확인하는 실험을 수행하였다. 예상대로, 공초점 현미경은 대조군 벡터를 발현하는 세포에서는 GFP-LC3가 분산된 형태로 세포에 존재하지만, DKK3를 발현하는 세포에서는 GFP-LC3가 점의 형태로 세포내에 존재함을 보여주었고, 이로부터 영양이 풍부한 조건에서 조차도 외래 DKK3의 발현에 의하여 자가포식소체의 형성이 유도됨을 알 수 있었다(도 6). DKK3를 발현하는 세포에서 자가포식소체 형성의 증가는 무혈청 조건에서 입증되었다(도 2B).

이에 비하여, 클래스 III PI3K(Vps34)의 억제제인 3-MA(3-methyladenine)의 처리는 DKK3 유도된 자가포식소체 형성을 방해하였다(도 2B, right). 무혈청 조건에서 DKK3의 발현은 자가포식소체 형성을 3배 이상 증가시켰다(도 2C).

다음으로, 본 발명자들은 자가포식소체 형성의 DKK3 매개 유도를 TEM 분석법으로 확인하였다. TEM 분석법을 통한 형태학적 접근으로부터, 영양이 풍부한 조건하에서 대조군의 세포에 비하여 DKK3가 발현되는 세포에서는 이중막으로 감싸여진 자가소화작용을 나타내는 자가포식소체가 대량으로 축적되어 있음을 확인하였다(도 2D). 이로부터 생리학적 수준으로의 DKK3의 외래 발현은 자가포식소체의 형성을 향상시킴을 알 수 있었다.

실시예 2: 베클린-1과 BCL-2의 결합에 대한 DKK3의 간섭효과

DKK3 매개 자가포식소체 유도의 기작을 설명하기 위하여, 본 발명자들은 DKK3가 자가소화작용의 초기단계에서 자가포식소체 형성에 중요한 역할을 수행하는 베클린-1과 물리적으로 반응하는지의 여부를 확인하였다. Flag-베클린-1이 도입된 MCF-7-DKK3 세포를 분석하여 DKK3와 베클린-1 사이의 반응을 나타내었다(도 3A).

다음으로, 내재적 베클린-1 역시 자가소화작용을 조절가능한 수준으로 내재적으로 발현하는 자가소화-적격 헬라세포를 사용하였다. DKK3를 발현하는 헬라세포에서 항-베클린-1으로 면역침전시킨 결과, 내재적인 베클린-1과 DKK3의 복합체가 형성됨을 확인할 수 있었다(도 3B).

그들의 반응을 추가로 확인하고자, 베클린-1과 DKK3의 세포내 위치를 직접적인 면역형광 염색 및 공초점 현미경 촬영에 의해 결정하였다. 세포질에서 베클린-1과 같이 위치하는 DKK3는 공초점 현미경상에서 관찰되었으므로, DKK3가 베클린-1과 반응함을 알 수 있었다(도 3C).

다음으로, 본 발명자들은 DKK3가 베클린-1-BCL-2 반응에 영향을 미치는지의 여부를 확인하고자 하였다. DKK3의 외래 발현은 베클린-1-BCL-2 반응을 간섭하였고, 이는 베클린-1에 결합하는 DKK3와 BCL-2 사이의 경쟁을 제안하였다(도 3B).

BCL-2는 베클린-1의 BD(BCL-2 binding domain)를 통해 베클린과 반응하고, 자가소화작용의 핵형성 단계에서 베클린-1 의존적 자가소화작용을 하향조절하는 것으로 알려져 있기 때문에, 본 발명자들은 DKK3가 베클린-1의 BD에 결합하여, DKK3가 베클린-1-BCL-2 반응을 억제하는지의 여부를 연구하였다.

DKK3를 발현하는 MCF-7 세포에 Flag 표지된 베클린-1의 전체 또는 BD를 발현하는 발현벡터를 도입하였다. V5 표지된 베클린-1 발현벡터를 이용한 동시 면역침전 분석법은 DKK3가 베클린-1의 BD에 결합할 수 있음을 보여주었다 (도 3D).

놀랍게도, 상기 DKK3와 베클린-1의 BD의 반응은 전체 베클린-1과 DKK3의 반응과 유사하였다(도 3D). 따라서, DKK3는 베클린-1-BCL-2 반응을 억제함에 의하여 자가포식소체의 형성을 유도할 수 있고, 이에 의하여 성공적인 자가포식소체의 형성에 필요한 핵형성을 촉진시킬 수 있다.

또한 DKK3 단백질과 베클린-1의 BD 도메인간의 결합은 효모-투하이브리드 분석을 통해 직접적인 상호 결합함을 확인하였다. 4가지 종류의 베클린-1 컨스트럭트를 제작하여 종래에 기술된 대로 수행하였다(Park et al., Cancer Res 65(3):749-757, 2005). 요약하면, 헬라세포 유래의 cDNA 라이브러리(Clontech, USA)에서 PCR 방법으로 베클린-1 단백질을 코딩하는 DNA 단편을 pJG4-5(Clontech, USA)의 EcoRI 및 XhoI 위치로 클로닝하고, DKK3 전장은 LexA와의 융합 단백질로의 발현을 위해 pGilda 벡터(Clontech, USA)의 BamH I 및 Xho I 위치에 클로닝하였다. 각각의 pGilda 및 pJG4-5 융합 컨스트럭트를 실험 효모 균주인 EGY 48(Clontech, USA)에 도입하고, 2% 갈락토스를 포함하는 류신-결핍 배지에서 세포가 자라는 능력, 및 X-gal, 2% 갈락토스 및 2% 라피노스를 포함하는 합성 배지에서 파란색 콜로니 형성 여부를 통해 융합된 단백질 사이의 상호작용을 결정하였다.

도 3E에서 확인할 수 있는 바와 같이, 베클린-1 단백질의 BD 도메인 단독(1-150)을 포함하는 베클린-1 단백질은 전장 베클린-1 단백질(1-450)과 대등한 수준으로 DKK3와 상호작용을 하였으나, 다른 도메인을 포함하는 베클린-1은 DKK3와 전혀 상호작용을 하지 않았다. 따라서, 이러한 결과는 베클린-1과 DKK3와의 상호작용에서 베클린-1 단백질의 BD도메인의 중요성을 나타내고, 베클린-1의 BD도메인이 DKK3와의 상호작용에 필수충분조건임을 제시한다.

상기 베클린-1-hVps34 복합체는 전구-자가포식소체 막의 형성시의 핵형성 또는 초기에 관여하는 것으로 알려져 있다. BCL-2는 자가소화작용을 촉진하는 베클린-1-hVps34 복합체의 형성을 억제하고, 베클린-1과 연관된 클래스 III PI3K의 활성을 감소시키기 때문에, 본 발명자들은 MCF-7 세포에서 베클린-1-hVps34 복합체에 DKK3 발현이 어떠한 영향을 미치는지 연구하였다. MCF7-DKK3 세포에 V5로 표지된 베클린-1의 유전자를 도입하고, 항-V5 항체로 면역침전시킨 다음, 항-hVps34 항체를 이용하여 면역블럿 분석을 수행하였다.

DKK3의 발현은 베클린-1-hVps34 반응에 거의 영향을 미치지 못하였다(도 3F). 따라서, 베클린-1에 대한 Bcl-2의 결합은 상술한 바(도 3B)와 같이 DKK3 발현에 의하여 감소되는 반면, 베클린-1에 대한 hVps34의 결합은 DKK3에 의하여 별다른 영향을 받지 않았다.

다음으로, 본 발명자들은 동시 면역침전 분석법을 이용하여 베클린-1에 대한 DKK3의 결합특이성을 확인하고, 면역블럿 분석법을 이용하여 자가소화작용 단백질 발현의 유도를 확인함에 의하여 DKK3 매개 자가포식소체 형성의 특이성을 연구하였다. DKK3가 베클린-1과 강하게 반응하는 반면(도 3A), 다른 DKK 패밀리 중의 하나인 DKK2는 베클린-1과 반응하지 못하였을 뿐만 아니라 내재적인 자가소화작용 단백질인 LC3-II 및 베클린-1의 발현을 유도하지도 못하였다.

실시예 3: DKK3 의 자가포식소체의 형성유도

생체내 환경에서 자가포식소체의 형성에 대한 DKK3의 효과를 확인하기 위하여, 헬라세포를 이식한 모델 마우스를 이용하였다. DKK3 또는 대조군을 발현하는 293T 세포(293T-DKK3 및 293T-Con)로부터 유래된 무혈청 조정배지를 면역블럿 분석법으로 상업적으로 입수가능한 재조합 DKK3 단백질과 비교하여 DKK3의 순도 및 농도를 평가하였다(도 4A). DKK3의 함량과 순도는 상기 조정배지와 제조한 DKK사이에 유의한 차이를 나타내지 않았으므로, 상기 조정배지를 사용함에 대한 근거를 제공하였다.

실험실적 환경의 것과 동일하게, 면역블럿 분석법은 대조군의 조정배지를 처리한 것에 비하여 DKK3 조정배지를 처리한 후에 베클린-1과 LC3-II의 극적인 상향조절 및 BCL-2의 하향조절을 나타내었다(도 4B). 다음으로, 생체내 환경에서 DKK3 조정배지 매개 자가포식소체의 형성은 2주일 동안 주 2회 주사된 대조군 조정배지 또는 DKK3 조정배지로 처리한 조직의 전자현미경 분석을 통해 확인되었다.

조직의 전자현미경 분석으로, 대조군 조정배지를 처리한 조직세포에 비하여 DKK3 조정배지를 처리한 조직세포에서 자가포식소체의 수가 극적으로 증가되었음을 확인할 수 있었다(도 4C). 이러한 결과는 생체내 환경에서 DKK3의 외래발현이 자가포식소체의 형성을 유도함을 나타내었다.

실시예 4: DKK3에 의한 PI3K 신호전달 경로의 조절

클래스 I PI3K 및 mTOR 조절 경로는 자가소화작용을 억제함에 반하여, 클래스 III PI3K는 자가소화작용을 활성화시킨다. 자가소화작용의 조절에 관여하는 PI3K 신호전달 경로에 DKK3의 외래 발현의 효과를 확인하고자, 상기 경로에 관여하는 신호전달 단백질에 대한 항체를 이용한 면역블롯 분석법을 이용하여 P13K 신호전달 경로상에 DKK3의 생리학적인 발현수준의 효과를 평가하기 위하여 DKK3를 발현하는 세포가 사용되었다(도 5).

자가소화작용을 유도하는 DKK3의 능력 그대로, MCF-7 세포에서 외래 DKK3 발현은 mTOR 표적 단백질인 p70S6K의 인산화를 감소시켜서, mTOR 신호전달을 억제하였다. mTOR의 신호전달 억제 그대로, 본 발명자들은 베클린-1 및 LC3-II 전환율의 수준이 증가하고, Bcl-2의 수준이 감소하며, PI3K 클래스 III 신호전달 경로를 활성화시키는 결과를 나타내었다(도 5A 및 5B).

추가로, Ras는 클래스 I PI3-인산화효소 신호전달 경로를 통해 영양고갈로 인한 자가소화작용의 하향조절자로서 중요한 역할을 수행한다(Furuta et al., 2004). 따라서, 본 발명자들은 자가소화작용의 조절에 관여하는 클래스 I PI3-인산화효소 신호전달 경로에 대한 DKK3의 효과를 결정하고자 하였다. DKK3의 외래 발현은 Ras 및 Raf 단백질의 수준을 하향조절하는 결과를 초래하였고, 이는 클래스 I PI3-인산화효소 신호전달 경로의 하향조절을 의미하였다(도 5B).

결과적으로, DKK3의 외래 발현은 PI3K 클래스 I mTOR 신호전달 경로를 억제하지만, PI3K 클래스 III 신호전달 경로를 활성화시킴으로써, 자가소화작용을 유도하는 결과를 나타냄을 알 수 있었다.

<110> SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION <120> A Composition for Inducing Cell Autophagy <130> PA110272/KR <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 350 <212> PRT <213> Human Dickkopf 3 <400> 1 Met Gln Arg Leu Gly Ala Thr Leu Leu Cys Leu Leu Leu Ala Ala Ala 1 5 10 15 Val Pro Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Ala Thr Ser Ala Pro Val 20 25 30 Lys Pro Gly Pro Ala Leu Ser Tyr Pro Gln Glu Glu Ala Thr Leu Asn 35 40 45 Glu Met Phe Arg Glu Val Glu Glu Leu Met Glu Asp Thr Gln His Lys 50 55 60 Leu Arg Ser Ala Val Glu Glu Met Glu Ala Glu Glu Ala Ala Ala Lys 65 70 75 80 Ala Ser Ser Glu Val Asn Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Tyr His Asn 85 90 95 Glu Thr Asn Thr Asp Thr Lys Val Gly Asn Asn Thr Ile His Val His 100 105 110 Arg Glu Ile His Lys Ile Thr Asn Asn Gln Thr Gly Gln Met Val Phe 115 120 125 Ser Glu Thr Val Ile Thr Ser Val Gly Asp Glu Glu Gly Arg Arg Ser 130 135 140 His Glu Cys Ile Ile Asp Glu Asp Cys Gly Pro Ser Met Tyr Cys Gln 145 150 155 160 Phe Ala Ser Phe Gln Tyr Thr Cys Gln Pro Cys Arg Gly Gln Arg Met 165 170 175 Leu Cys Thr Arg Asp Ser Glu Cys Cys Gly Asp Gln Leu Cys Val Trp 180 185 190 Gly His Cys Thr Lys Met Ala Thr Arg Gly Ser Asn Gly Thr Ile Cys 195 200 205 Asp Asn Gln Arg Asp Cys Gln Pro Gly Leu Cys Cys Ala Phe Gln Arg 210 215 220 Gly Leu Leu Phe Pro Val Cys Thr Pro Leu Pro Val Glu Gly Glu Leu 225 230 235 240 Cys His Asp Pro Ala Ser Arg Leu Leu Asp Leu Ile Thr Trp Glu Leu 245 250 255 Glu Pro Asp Gly Ala Leu Asp Arg Cys Pro Cys Ala Ser Gly Leu Leu 260 265 270 Cys Gln Pro His Ser His Ser Leu Val Tyr Val Cys Lys Pro Thr Phe 275 280 285 Val Gly Ser Arg Asp Gln Asp Gly Glu Ile Leu Leu Pro Arg Glu Val 290 295 300 Pro Asp Glu Tyr Glu Val Gly Ser Phe Met Glu Glu Val Arg Gln Glu 305 310 315 320 Leu Glu Asp Leu Glu Arg Ser Leu Thr Glu Glu Met Ala Leu Gly Glu 325 330 335 Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Gly Gly Glu Glu Ile 340 345 350 <210> 2 <211> 1053 <212> DNA <213> Human Dickkopf 3 <400> 2 atgcagcggc ttggggccac cctgctgtgc ctgctgctgg cggcggcggt ccccacggcc 60 cccgcgcccg ctccgacggc gacctcggct ccagtcaagc ccggcccggc tctcagctac 120 ccgcaggagg aggccaccct caatgagatg ttccgcgagg ttgaggaact gatggaggac 180 acgcagcaca aattgcgcag cgcggtggaa gagatggagg cagaagaagc tgctgctaaa 240 gcatcatcag aagtgaacct ggcaaactta cctcccagct atcacaatga gaccaacaca 300 gacacgaagg ttggaaataa taccatccat gtgcaccgag aaattcacaa gataaccaac 360 aaccagactg gacaaatggt cttttcagag acagttatca catctgtggg agacgaagaa 420 ggcagaagga gccacgagtg catcatcgac gaggactgtg ggcccagcat gtactgccag 480 tttgccagct tccagtacac ctgccagcca tgccggggcc agaggatgct ctgcacccgg 540 gacagtgagt gctgtggaga ccagctgtgt gtctggggtc actgcaccaa aatggccacc 600 aggggcagca atgggaccat ctgtgacaac cagagggact gccagccggg gctgtgctgt 660 gccttccaga gaggcctgct gttccctgtg tgcacacccc tgcccgtgga gggcgagctt 720 tgccatgacc ccgccagccg gcttctggac ctcatcacct gggagctaga gcctgatgga 780 gccttggacc gatgcccttg tgccagtggc ctcctctgcc agccccacag ccacagcctg 840 gtgtatgtgt gcaagccgac cttcgtgggg agccgtgacc aagatgggga gatcctgctg 900 cccagagagg tccccgatga gtatgaagtt ggcagcttca tggaggaggt gcgccaggag 960 ctggaggacc tggagaggag cctgactgaa gagatggcgc tgggggagcc tgcggctgcc 1020 gccgctgcac tgctgggagg ggaagagatt tag 1053 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gagcgagcag atccagtc 18 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 agccatgtag aacaaacggc 20

Claims

디코프 3(Dickkopf 3, DKK3) 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는,
비정상 단백질 축적으로 인한 질환 또는 퇴행성 질환 중 어느 하나인 자가소화작용(autophagy) 장애 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 DKK3는 세포내에서 자가포식소체(autophagosome)의 형성을 유도하는 것인 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 DKK3는 베클린-1과 BCL-2의 결합을 저해하여 BCL-2의 활성을 저해하고 베클린-1의 자가소화작용 유도효과를 유지하는 것인 약학 조성물.
제3항에 있어서,
상기 DKK3는 베클린-1 단백질 내 존재하는 BCL-2 결합도메인에 결합하여 베클린-1과 BCL-2의 결합을 저해하는 것인 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 DKK3는 자가소화작용을 억제하는 PI3K 클래스 ImTOR 신호전달 경로를 억제하고, 자가소화작용을 활성화시키는 PI3K 클래스 III 신호전달 경로를 활성화시키는 것인 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 DKK3 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 인간 유래인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 DKK3 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것인 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 DKK3를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 핵산서열을 갖는 것인 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 DKK3를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포 내 전달을 위한 발현 벡터에 포함되는 것인 약학 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 자가소화작용 장애 관련 질환은 척추과민증, 잠재이분척추, 척추관협착증, 관절강직, 무균성 골괴사, 골수염, 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 뇌졸중, 타우병증, 근위축성 측삭경화증(ALS), 헌팅턴 병, 전두측두엽 치매, 치매, 척수소뇌성 실조증, 데스민 관련 심근증(desmin-related cardiomyopathy), 감염성 질환, 염증성 질환, α1-안티트립신 부족 간 질환(Perlmutter, 2006) 및 다농병(Danon disease)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 약학 조성물.
디코프 3(Dickkopf 3, DKK3) 단백질을 코딩하는 폴리펩타이드 및 베클린-1 폴리펩타이드의 상호작용을 이용하여, 세포의 자가소화작용을 상향 또는 하향 조절하는 물질을 스크리닝하는 방법.
제13항에 있어서,
상기 상호작용은 베클린-1 폴리펩타이드의 BCL-2 결합도메인과 DKK3 폴리펩타이드의 결합인 것인 방법.