CN112088163A - 微肽及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新的肽化合物，更特别地涉及衍生自与癌症和细胞可塑性有关的lncRNA的微肽。它还涉及所述微肽在治疗增殖性疾病中的用途，更特别地在治疗癌症中的用途。

Description

微肽及其用途

技术领域

本发明包括在生物医药领域中。它特别涉及微肽(micropeptide)及其在癌症治疗中的用途。

背景技术

癌症是全球发病率和死亡率领先的疾病之一。现在，它造成了全球近六分之一的死亡，并且新病例数预计在未来20年中将增加约70％。

癌症是一组疾病，其特征在于不受控制的细胞分裂(或生存或凋亡抑制的增加)，以及所述细胞侵袭其他邻近组织(侵袭)和扩散到通常不存在该细胞的人体的其他区域(转移)的能力。根据肿瘤是否可以通过侵袭和转移扩散，将肿瘤分类为良性的或恶性的：良性肿瘤是不能通过侵袭或转移而扩散的肿瘤，即它们仅局部地生长；而恶性肿瘤是能够通过侵袭和转移扩散的肿瘤。

存在几种类型的癌症，其可以根据其起源的细胞类型和细胞的位置来分类，即癌(carcinoma)，其由覆盖外部和内部身体表面(例如皮肤、消化道或腺)的细胞引起；白血病，其始于血液形成组织诸如骨髓，并导致大量异常血细胞产生并进入血液；淋巴瘤，其是起源于人体免疫系统的淋巴结和组织的癌症；黑素瘤，其出现在黑素细胞中；肉瘤，其始于骨骼或肌肉的结缔组织；以及畸胎瘤，其始于生殖细胞。

现在有许多药物可用于癌症的治疗中。然而，在许多情况下，癌症无法对抗癌疗法产生反应，或者癌症的生长和/或转移只会减慢。即使当肿瘤最初通过减小尺寸或进入缓解期而对抗癌疗法产生反应时，肿瘤也常常对药物产生抗性。由于这些原因，需要可以用于治疗仍没有可用的治疗方法的癌症和多耐药性癌症的新的抗癌剂和药物。

发明内容

本发明的作者已经发现三个长的非编码RNA(LncRNA)Linc00086、TINCR和ZEB2AS1包含编码微肽的区域，并且所述微肽具有肿瘤抑制活性。因此，本发明涉及提供具有充当抗癌药物的能力的微肽。尽管已知LncRNA为以组织和物种特异性方式表达的200bp以上的转录物的异质组，但它们中的大多数仍在功能上未表征。

因此，在第一方面，本发明涉及微肽，所述微肽包括选自由SEQ ID NO:1、2和3或其功能等效的变体组成的组的氨基酸序列。

在第二方面，本发明涉及能够特异性结合至本发明的微肽的抗体。

在第三方面，本发明涉及编码本发明的微肽的多核苷酸，条件是所述多核苷酸不是以下多核苷酸：由具有对应于2017年9月10日版本的NCBI登录号NM_203306.2的序列组成的或包括所述序列的多核苷酸，由具有对应于2017年8月29日版本的NCBI登录号NR_027064的序列组成的或包括所述序列的多核苷酸，以及由具有对应于2017年4月23日版本的NCBI登录号NR_040248的序列组成的或包括所述序列的多核苷酸。

在第四方面，本发明涉及表达载体，所述表达载体包括编码本发明的微肽的多核苷酸。

在第五方面，本发明还涉及宿主细胞，所述宿主细胞包括编码本发明的微肽的多核苷酸或包括编码本发明的微肽的多核苷酸的表达载体。

在第六方面，本发明涉及包括本发明的微肽、多核苷酸、表达载体或宿主细胞的组合物。

在第七方面，本发明还涉及药物组合物，所述药物组合物包括本发明的组合物和药学上可接受的载体。

在第八方面，本发明涉及本发明的微肽、多核苷酸、表达载体、宿主细胞、组合物或药物组合物用于医药的用途。

在进一步的方面，本发明涉及本发明的微肽、多核苷酸、表达载体、宿主细胞、组合物或药物组合物用于癌症治疗的用途。

最后，在另一方面，本发明涉及本发明的SEQ ID NO:2的微肽、编码所述微肽的多核苷酸、表达载体、宿主细胞、组合物或药物组合物用于纤维化治疗的用途。

附图说明

图1.SEQ ID NO:1微肽的微肽的计算机分析。(A)哺乳动物(灵长类动物和啮齿动物)中SEQ ID NO:1微肽的氨基酸序列保守性。(B)SEQ ID NO:1微肽的三维结构预测，(iTasser软件)以及与泛素(Ubiquitin)结构比较。

图2.SEQ ID NO:2微肽的微肽的计算机分析。(A)SEQ ID NO:2微肽直系同源物的氨基酸序列比对。(B)SEQ ID NO:2微肽的三维结构预测，(iTasser软件)。

图3.SEQ ID NO:3的微肽的计算机分析。(A)哺乳动物中SEQ ID NO:3氨基酸保守性。(B)SEQ ID NO:3微肽的三维结构预测(iTasser软件)。

图4.感染的BxPC-3细胞中的序列SEQ ID NO:1的微肽的检测。(A)由qPCR测定的，BxPC-3中多西环素(doxycycline)处理后的序列SEQ ID NO:1表达的微肽的分析。示出了相对于未处理的对照的mRNA表达。(B)使用针对HA标签的抗体的序列SEQ ID NO:1过表达的微肽的蛋白质印迹分析。(C)免疫染色示出了使用定制的抗SEQ ID NO:1抗体的BxPC-3感染的细胞中的微肽SEQ ID NO:1的细胞质定位。

图5.序列SEQ ID NO:1过表达的微肽诱导细胞周期停滞和细胞衰老。用编码HA-SEQ ID NO:1的诱导型慢病毒转导BxPC-3细胞。通过多西环素处理持续4天来诱导序列SEQID NO:1表达的微肽。(A)SEQ ID NO:1-表达细胞和对照细胞的相衬图像。(B)通过CellTiter-Glo测定法进行细胞生存力分析。(C)通过流式细胞术进行细胞周期分析。左，直方图。右，在每个细胞周期阶段中的细胞数目的定量(D)通过qPCR的p27和p21表达的分析。(E)使用抗HA和抗p21抗体的所示细胞的蛋白质印迹。(F)多西环素处理的和未处理的细胞中SA- -Gal阳性细胞数目的定量。(G)在(F)中量化的细胞的代表性图片。图示出了平均值±SEM，使用至少3次技术重复。**P<0.01***P<0.001****P<0.0001，双侧t检验。

图6.序列SEQ ID NO:1表达的微肽在细胞应激时诱导细胞死亡。用空的或SEQ IDNO:1-HA逆转录病毒感染SkBR-3、HPAF II、MIA PaCa-2和BxPC-3细胞，并通过嘌呤霉素选择。通过qPCR(A)以及通过蛋白质印迹(B)分析序列SEQ ID NO:1表达的微肽。(C)在用嘌呤霉素选择后3天，所指示细胞的相衬图像。(D)通过流式细胞术分析的，用和不用嘌呤霉素处理的BxPC-3感染的细胞的膜联蛋白(Annexin)-V/PI染色。(E)用编码SEQ ID NO:1-HA的诱导型慢病毒感染BXPC-3细胞，并用新霉素(Neomycin)选择。通过多西环素诱导序列SEQ IDNO:1表达的微肽，并用多柔比星(Doxorubicin)或放线菌素D(Actinomycin D)处理细胞。(E)通过结晶紫染色测量所示细胞的细胞生存力。

图7.检测A549和H10细胞中的过表达的SEQ ID NO:1微肽。(A)由qPCR测定的，A549和H10中多西环素处理后的SEQ ID NO:1表达的分析。示出了相对于对照的mRNA表达。(B)使用针对HA标签的抗体的SEQ ID NO:1过表达的蛋白质印迹分析。(C)免疫染色示出了使用定制的抗SEQ ID NO:1抗体在A549和H10感染的细胞中的SEQ ID NO:1的细胞质定位。

图8.SEQ ID NO:1过表达减少细胞增殖。用编码HA-SEQ ID NO:1的诱导型慢病毒转导A549和H10细胞。通过多西环素处理持续14天来诱导SEQ ID NO:1表达。(A)SEQ ID NO:1表达的转导细胞在14天内的生长曲线。(B)通过流式细胞术进行细胞周期分析。左，直方图。右，在每个细胞周期阶段中的细胞数目的定量。图示出了平均值±SD，使用至少3次技术重复。****P<0.0001，双侧t检验。

图9.在A549和H10细胞系中，SEQ ID NO:1过表达损害侵袭性并且减少间充质性状。在基质胶(matrigel)涂覆的插入物中分析了所示细胞的侵袭。(A)固定含有被侵袭的细胞的膜插入物的底面，并用结晶紫染色，并在铺板后24h拍照。(B)使用ImageJ软件计算侵袭性细胞的数目。条形图显示了侵袭室的细胞的相对数目。(C)通过qPCR的几种间充质基因的分析。显示了相对于对照的mRNA表达。*P<0.05、**P<0.01双侧t检验。

图10.以p53依赖性方式通过基因毒性应激诱导SEQ ID NO:1。用多柔比星(1μM)或放线菌素D(1nM)和Nutlin-3a(10μM)处理HCT116、HCT116 p53KO、A549和BxPC3。在A549和HCT116(A)以及在HCT116 p53KO和BxPC-3(B)中通过qPCR测量了SEQ ID NO:1转录水平。示出了相对于未处理的对照的mRNA表达。在A549和HCT116(A)以及在HCT116 p53KO和BxPC-3(B)中使用定制的抗SEQ ID NO:1抗体通过蛋白质印迹分析测量了SEQ ID NO:1蛋白。(C)免疫染色示出了在多柔比星处理后，使用定制的抗SEQ ID NO:1抗体在A549细胞中SEQ IDNO:1的上调。

图11.序列SEQ ID NO:1表达的微肽改变细胞泛素化模式。(A)使用抗HA和蛋白质印迹实验的共免疫沉淀表明在SEQ ID NO:1表达细胞的牵拉(pull down)下存在泛素化蛋白。(B)在用MG132进行蛋白酶体阻断处理后，在SEQ ID NO:1或空载体BxPC-3感染的细胞中通过蛋白质印迹的泛素化蛋白水平的分析。

图12.(A)通过qPCR分析，在用SEQ ID No:2的微肽或空载体感染的IMR90、MIAPaCa-2和BxPC-3细胞系中SEQ ID NO:2mRNA表达的微肽。值是相对于作为对照的表达空载体的细胞。条对应于平均值±SD。(B)针对用SEQ ID NO:2的微肽或空载体感染的IMR90、MIAPaCa-2和BxPC-3细胞中的HA标签的蛋白质印迹。

图13.转导的mCAF细胞中SEQ ID NO:2微肽的检测。(A)通过qPCR分析的，在用SEQID No:2的微肽或空载体感染的mCAF细胞中SEQ ID NO:2mRNA表达的微肽。值是相对于作为对照的表达空载体的细胞。条对应于平均值±SD。(B)针对用SEQ ID NO:2的微肽或空载体感染的HA标签mCAF细胞的蛋白质印迹。

图14.BxPC-3细胞系中SEQ ID NO:2的微肽亚细胞定位。免疫染色示出了使用定制的抗SEQ ID NO:2抗体的SEQ ID NO:2的微肽细胞质定位。核用DAPI复染。

图15.SEQ ID NO:2的微肽的表达在IMR90(A)、MIA PaCa-2(B)和BxPC-3(C)细胞系中诱导间充质同一性丧失。通过qPCR测量的所示基因的mRNA水平。值是相对于作为对照的表达空载体的细胞。*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001，使用学生t检验(Student’s t-test)进行统计。误差条代表n＝3技术重复的标准误差。

图16.SEQ ID NO:2的微肽的过表达诱导间充质同一性丧失。通过qPCR在mCAF(A-B)细胞中测量所示基因的mRNA水平。值是相对于作为对照的表达空载体的细胞。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001，使用学生t检验进行统计。误差条代表n＝3技术重复的标准误差。

图17.SEQ ID NO:2的微肽损害胰腺癌细胞系的迁移能力。在用MIDORI或空载体感染的MIA PaCa-2(A)和BxPC-3(B)细胞中进行伤口愈合测定。相衬图像示出了在进行刮擦后指定时间点的伤口。

图18.SEQ ID NO:2的微肽的表达损害胰腺癌细胞的细胞侵袭。(A)用SEQ ID NO:2的微肽或空载体转导的BxPC-3细胞在基质胶覆盖的插入物中的侵袭。接种后24小时侵袭细胞的代表性图片。(B)侵袭细胞的相对数目。条代表相对于空载体条件下侵袭细胞的两个独立实验的平均值±SD(n＝2)。*p<0.05，使用学生t检验。

图19.SEQ ID NO:2的微肽的表达降低mCAF细胞的促肿瘤活性。(A)WT PDAC胰腺癌细胞在基质胶覆盖的插入物中的侵袭，其中表达SEQ ID NO:2的微肽或空载体的mCAF接种在Boyden室的底部隔室中。接种后24小时侵袭细胞的代表性图片。(B)侵袭细胞的相对数目。±SD(n＝3技术重复)，相对于空载体条件下的侵袭细胞。

图20.转导的MDA-MB-231细胞中SEQ ID NO:2微肽的检测。(A)通过qPCR分析的，在用SEQ ID No:2的微肽或空载体感染的MDA-MB-231细胞中SEQ ID NO:2mRNA表达的微肽。值是相对于作为对照的表达空载体的细胞。条对应于平均值±SD。(B)针对用SEQ ID NO:2的微肽或空载体感染的MDA-MB-231细胞中的HA标签的蛋白质印迹。

图21.SEQ ID NO:2的微肽的过表达诱导间充质同一性丧失。通过qPCR在MDA-MB-231细胞系中测量所示基因的mRNA水平。值是相对于作为对照的表达空载体的细胞。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001，使用学生t检验进行统计。误差条代表n＝3技术重复的标准误差。

图22.SEQ ID NO:2的微肽的表达减少乳腺癌细胞的细胞侵袭。(A)用SEQ ID NO:2的微肽或空载体转导的MDA-MB-231乳腺癌细胞在基质胶覆盖的插入物中的侵袭。接种后24小时侵袭细胞的代表性图片。(B)侵袭细胞的相对数目±SD(n＝3技术重复)，相对于空载体条件下的侵袭细胞。*p<0.05，使用学生t检验。

图23.在癌细胞系中SEQ ID NO:3的微肽的过表达。(A)通过qPCR在A549细胞中SEQID NO:3过表达的分析。(B)通过蛋白质印迹在A459细胞中SEQ ID NO:3微肽表达的检测。(C)SEQ ID NO:3过表达后的所示细胞系的相衬图像。

图24.SEQ ID NO:3的微肽的过表达诱导p21上调和促凋亡程序。(A)SEQ ID NO:3过表达后，在HCT116和A549癌细胞系中p21表达的qPCR分析。(B)A549 SEQ ID NO:3-过表达细胞中的p21蛋白的蛋白质印迹分析。用Nutlin-3(10μM)处理的细胞用作p21上调的阳性对照。(C)SEQ ID NO:3-过表达HCT116细胞中所示凋亡相关基因的qPCR分析。

图25.通过p53基因毒性应激后SEQ ID NO:3被转录上调。(A)在48h内，用MDM2抑制剂Nutlin3a(10μM)处理HCT116和HCT116 p53KO细胞。通过RT-qPCR测试SEQ ID NO:3转录水平。将mRNA水平相对未经处理的对照归一化。(B)在24h内，用遗传毒性剂多柔比星(1μM)处理HCT116和HCT116 p53KO细胞。通过RT-qPCR测试SEQ ID NO:3mRNA水平。给出了相对于GAPDH参考基因的mRNA水平。条代表n＝3技术重复的平均值±SD。

具体实施方式

本发明涉及提供用于治疗癌症的新化合物。

SEQ ID NO:1、2和3的微肽

在第一方面，本发明涉及微肽，所述微肽包括选自由SEQ ID NO:1、2和3或其功能等效的变体组成的组的氨基酸序列。

如本文所用，术语“微肽”用于指具有4至100个氨基酸，优选地20至90个氨基酸的肽。它们可以是天然的或合成的来源。实际上，它们由lncRNA中、注释为非蛋白编码的RNA分子中或注释为“基因间隔区”的RNA分子中包含的开放阅读框编码。

术语“开放阅读框”对应于DNA或RNA分子中可以潜在地编码肽或蛋白的核苷酸序列。所述开放阅读框以起始密码子(通常编码甲硫氨酸的起始密码子)开始，随后是一系列密码子(每个密码子编码氨基酸)，并以终止密码子(终止密码子不被翻译)结束。如本文所用，术语“长非编码RNA”或“lncRNA”包括长于200个核苷酸并且被注释为非编码的转录物。

术语“多肽”和“肽”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是直链的或支链的，它可以包括修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。

术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。此外，术语“氨基酸”包括D-氨基酸和L-氨基酸两者(立体异构体)。

术语“天然氨基酸”或“天然存在的氨基酸”包括20个天然存在的氨基酸；通常在体内翻译后修饰的那些氨基酸，包括例如羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；以及其他不常见的氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羟赖氨酸、异锁链素、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。

如本文所用，术语“非天然氨基酸”或“合成氨基酸”是指在位置“a”被胺基替换并且在结构上与天然氨基酸相关的羧酸或其衍生物。修饰的或不常见的氨基酸的说明性非限制性实例包括2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、2,4-二氨基丁酸、锁链素、2,2'-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羟基赖氨酸、alio羟基赖氨酸、3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸、异锁链素、别异亮氨酸(alloisoleucine)、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、6-N-甲基赖氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸等。

下表1和2列出了可以在本发明中使用的天然存在的氨基酸(表1)和非常规的或修饰的氨基酸(表2)。

表1

表2

“功能等效的变体”理解为意指在基本上维持功能时，通过修饰、替换、插入和/或缺失一个或多个氨基酸而衍生自序列SEQ ID NO:1、2或3的所有那些微肽。

优选地，序列SEQ ID NO:1、2或3的“变体”是(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守的或非保守的氨基酸残基(优选保存的氨基酸残基)替换的微肽，并且这类替换的氨基酸可以是或不是由遗传密码编码的，(ii)其中存在一个或多个修饰的氨基酸残基的微肽，例如，通过取代基键合修饰的残基，(iii)由类似mRNA的可变加工得到的微肽，(iv)微肽片段和/或(v)由序列SEQ ID NO:1、2或3或上述(i)至(iii)中定义的变体与其他多肽诸如分泌前导序列融合所得的微肽，所述分泌前导序列是用于纯化(例如，His标签)、用于检测(例如，Sv5表位标签)或用于递送至特定靶细胞的序列。片段包括通过原始序列的蛋白水解切割(包括多位点蛋白水解)产生的多肽。功能等效的变体可以是翻译后或化学修饰的结果。这样的变体对于本领域技术人员将是显而易见的。

序列SEQ ID NO:1、2或3的变体可以是天然的也可以是人造的。术语“天然变体”涉及在其他物种中天然出现的人SEQ ID NO:1、2或3的所有那些变体，即SEQ ID NO:1、2或3的直系同源物。

序列SEQ ID NO:1、2或3的功能等效的变体可以是包括添加、替换或修饰一个或多个氨基酸残基的衍生自序列SEQ ID NO:1、2或3的氨基酸序列。举例说明，序列SEQ ID No:1、2或3的功能等效的变体包括以下序列：所述序列包括在序列SEQ ID No:1、2或3的氨基末端添加1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、10个氨基酸、15个氨基酸、20个氨基酸、25个氨基酸、30个氨基酸、35个氨基酸、40个氨基酸、45个氨基酸、50个氨基酸、60个氨基酸、70个氨基酸、80个氨基酸、90个氨基酸、100个氨基酸、150个氨基酸、200个氨基酸、至少500个氨基酸、至少1000个氨基酸或更多，和/或包括在序列SEQ ID NO：1、2或3的羧基末端添加1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸、15个氨基酸、20个氨基酸、25个氨基酸、30个氨基酸、35个氨基酸、40个氨基酸、45个氨基酸、50个氨基酸、60个氨基酸、70个氨基酸、80个氨基酸、90个氨基酸、100个氨基酸、150个氨基酸、200个氨基酸、至少500个氨基酸、至少1000个氨基酸或更多，并且保持序列SEQ ID NO：1、2或3的活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％。

如本文所用的术语“保守替换”或“保守的氨基酸残基”，是指用具有类似空间特性的天然或非天然存在的氨基酸或肽模拟物替代肽中天然序列中存在的氨基酸。如果要替代的天然氨基酸的侧链为极性的或疏水性的，则保守替换应使用也为极性的或疏水性的天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸或肽模拟物部分(除了具有与被替代的氨基酸的侧链相同的空间特性之外)。

由于天然存在的氨基酸典型地根据其特性进行分组，因此考虑到以下事实，可以容易地确定由天然存在的氨基酸的保守替换：根据本发明，通过空间类似的不带电荷的氨基酸替代带电荷的氨基酸被视为保守替换。

为了通过非天然存在的氨基酸产生保守替换，也可以使用本领域众所周知的氨基酸类似物(合成氨基酸)。

当影响保守替换时，替换的氨基酸应在侧链上具有与原始氨基酸相同或类似的官能团。

如本文所用的短语“非保守替换”或“非保守氨基酸残基”是指用具有不同的电化学和/或空间特性的其他天然或非天然存在的氨基酸替换亲本序列中存在的氨基酸。因此，替换的氨基酸的侧链可以显著大于(或小于)被替换的天然氨基酸的侧链，和/或可以具有相比被替换的氨基酸具有显著不同的电子特性的官能团。此种类型的非保守替换的实例包括用苯丙氨酸或环己基甲基甘氨酸替换丙氨酸，用异亮氨酸替换甘氨酸，或用-NH-CH[(-CH2)5-COOH]-CO-替换天冬氨酸。那些落在本发明范围内的非保守替换是那些仍构成具有抗增殖特性的肽的替换。

本发明的肽还可以包括非氨基酸部分，诸如例如，与肽连接的疏水性部分(各种直链、支链、环状、多环或杂环烃以及烃衍生物)；各种保护基团，特别是在化合物是线性的情况下，这些保护基团连接到化合物的末端以减少降解。合适的保护性官能团在以下中描述：Green and Wuts,"Protecting Groups in Organic Synthesis",John Wiley and Sons,Chapters 5and 7,1991。

为了改善各种生理特性，诸如降低的降解或清除；降低的由各种细胞泵的排斥，改善免疫原性活性，改善各种给药方式(诸如各种序列的附着，这允许穿透各种屏障，穿透肠道等)；增加的特异性，增加的亲和力，增加的稳定性、生物利用度、溶解度，降低的毒性等，可以包括存在于化合物中的化学(非氨基酸)基团。

本发明的变体可以包括天然肽(降解产物、合成地合成肽或重组肽)、类似物、衍生物、盐、逆反异构体(retro-inverso isomer)、拟似物(mimics)、模拟物(mimetics)或肽模拟物(典型地是合成地合成肽)以及类肽和半类肽。

“类似物”、“衍生物”和“模拟物”包括模拟肽结构的化学结构并且保留肽结构的功能特性的分子。设计肽类似物、衍生物和模拟物的方法是本领域已知的。例如，参见Farmer,P.S.in Dmg Design(E.J.Ariens,ed.)Academic Press,New York,1980,vol.10,pp.119-143；Ball,J.B.and Alewood,P.F.(1990)J.Mol.Recognition3:55.Morgan,B.A.andGainor,J.A.(1989)Ann.Rep.Med.Chem.24:243，以及Freidinger,R.M.(1989)TrendsPharmacol.Sci.10:270。还可参见Sawyer,T.K.(1995)Peptidomimetic Design andChemical Approaches to Peptide Metabolism in Taylor,M.D.and Amidon,G.L.(eds.)Peptide-Based Drug Design:Controlling Transport and Metabolism,Chapter 17；Smith,A.B.3rd,et al.(1995)J.Am.Chem.Soc.117:11113-11123；Smith,A.B.3rd,et al.(1994)J.Am.Chem.Soc.116:9947-9962；以及Hirschman,R.,et al.(1993)J.Am.Chem.Soc.115:12550-12568。

“衍生物”(例如，肽或氨基酸)包括其中化合物上的一个或多个反应基团已经被取代基衍生化的形式。肽衍生物的实例包括其中氨基酸侧链、肽主链或者氨基-或羧基-末端已被衍生化的肽(例如，具有甲基化酰胺键的肽化合物)。化合物X的“类似物”包括保留功能活性所必需的化学结构，但也包含某些不同的化学结构的化合物。天然存在的肽的类似物的实例是包括一个或多个非天然存在的氨基酸的肽。

化合物的“模拟物”包括其中功能活性所必需的化合物的化学结构已被模拟该化合物的构象的其他化学结构所替代的化合物。肽模拟物的实例包括其中肽主链被一个或多个苯二氮

分子替换的肽化合物(参见，例如，James,G.L.et al.(1993)Science 260:1937-1942)或通过使用酰胺键等排体和/或天然肽主链的修饰(包括扩链或杂原子掺入)来模拟肽二级结构的低聚物，其实例包括氮杂肽、低聚氨基甲酸酯、低聚尿素、β-肽、γ-肽、低聚(亚苯基亚乙炔基)、乙烯磺酰肽类(vinylogous sulfonopeptides)、聚-N-取代的甘氨酸(类肽)等。制备肽模拟物化合物的方法是本领域众所周知的，并且在例如QuantitativeDrug Design,C.A.Ramsden Gd.,Chapter 17.2,F.Choplin Pergamon Press(1992)中有详细说明。

除上述之外，本发明的微肽还可以包括一个或多个修饰的氨基酸或者一个或多个非氨基酸单体(例如脂肪酸、复合碳水化合物等)。

本教导进一步考虑了环状肽或肽内的环状结构。环化方法是本领域众所周知的，参见例如WO2010/041237。

本发明的微肽可以诸如通过使用标准固相技术被生物化学合成。这些方法包括排他性固相合成、部分固相合成方法、片段缩合、经典溶液合成。固相多肽合成程序是本领域众所周知的，并且由John Morrow Stewart and Janis Dillaha Young,Solid PhasePolypeptide Syntheses(2nd Ed.,Pierce Chemical Company,1984)进一步描述。

合成肽可以通过制备型高效液相色谱法纯化(Creighton T.(1983)Proteins,structures and molecular principles.WH Freeman and Co.NY)并且其组成可以经由氨基酸测序确认。

重组技术也可以用于生成本发明的微肽。为了使用重组技术生产本发明的肽，将编码本发明的微肽的多核苷酸连接到核酸表达载体中，该核酸表达载体包括在顺式调控序列(例如启动子序列)的转录控制下的多核苷酸序列，所述顺式调控序列适用于指导本发明单体在宿主细胞中的组成型、组织特异性或诱导型转录。

除了在宿主细胞中可以合成外，本发明的肽还可以使用体外表达系统来合成。这些方法在本领域中是众所周知的，并且系统的组分是可商购的。

序列SEQ ID NO:1、2或3及其功能等效的变体的活性或功能可以通过由本申请的实施例中示出的方法测定肽的抗增殖活性来确定。

序列SEQ ID NO:1、2或3的功能等效的变体还包括以下氨基酸序列：所述氨基酸序列具有与序列SEQ ID NO:1、2或3至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。

在特定的实施方式中，本发明的微肽的功能等效的变体具有显示出与SEQ ID NO:1、2或3的序列至少80％同一性的序列。在两个或多个氨基酸或核苷酸序列的上下文中，术语“同一性”、“相同”或“同一性百分比”是指，当进行比较和比对(如果需要，引入缺口)以得出最大的对应性而不将任何保守氨基酸替换视为序列同一性的一部分时，两个或多个序列或子序列是相同的或具有相同的指定百分比的氨基酸残基。同一性百分比可以使用序列比较软件或算法或通过目测来测量。可以使用本领域已知的各种算法和软件以获得氨基酸或核苷酸序列的比对。序列比对算法的一个这样的非限制性实例是在Karlin et al.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.,87:2264-8中描述，在Karlin et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.,90:5873-7中修改，并且并入N BLAST和XBLAST程序(Altschul et al.,1991,NucleicAcids Res.,25:3389-402)中的算法。在某些实施方式中，可以使用如Altschul et al.,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-402中所述的Gapped BLAST。BLAST-2、WU-BLAST-2(Altschul et al.,1996,Methods in Enzymology,266:460-80)、ALIGN、ALIGN-2(Genentech，南旧金山，加利福尼亚)或Megalign(DNASTAR)是可以用于比对序列的额外的公开可用的软件程序。在某些实施方式中，使用GCG软件中的GAP程序(例如，使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或90的缺口权重和1、2、3、4、5或6的长度权重)确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。在某些替代实施方式中，并入了Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.48:444-53(1970))的GCG软件包中的GAP程序可以用于确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比(例如，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，以及缺口权重为16、14、12、10、8、6或4，以及长度权重为1、2、3、4、5)。替代地，在某些实施方式中，使用Myers和Miller的算法(CABIOS,4:1 1-7(1989))确定核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比。例如，可以使用ALIGN程序(2.0版)并且使用带有残基表的PAM120，缺口长度罚分为12以及缺口罚分为4，来确定同一性百分比。本领域技术人员可以确定通过特定的比对软件进行最大比对的适当参数。在某些实施方式中，使用比对软件的默认参数。在某些实施方式中，将第一氨基酸序列与第二氨基酸序列的同一性百分比“X”计算为100x(Y/Z)，其中，Y是在第一和第二序列的比对中(如通过目测或特定的序列比对程序比对的)得分为相同匹配的氨基酸残基的数目，以及Z为第二序列中的残基总数目。如果第二个序列比第一个序列长，则使用考虑了两个序列的整体的全局比对，因此必须对每个序列中的所有字母和空值进行比对。在这种情况下，可以使用与上述相同的公式，但是将其中第一和第二序列重叠的区域的长度用作Z值，所述区域具有与第一序列的长度基本上相同的长度。

作为非限制性实例，在某些实施方式中，可以使用Bestfit程序(Wisconsin序列分析包，Unix版本8，遗传学电脑集团(Genetics Computer Group)，大学研究园(UniversityResearch Park)，科学大道575号，麦迪逊，Wl 5371 1)确定任何特定的多核苷酸或多肽与参考序列是否具有一定的百分比序列同一性(例如，至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同，并且在一些实施方式中为至少95％、96％、97％、98％或99％相同)。Bestfit使用Smith and Waterman,Advances in Applied Mathematics 2:482-9(1981)的局部同源性算法，以找到两个序列之间的最佳同源性片段。当使用Bestfit或任何其他序列比对程序来确定特定序列是否例如与根据本发明的参考序列95％相同时，设置参数使得在参考氨基酸序列的全长上计算同一性百分比，并且允许同源性中的缺口最高达参考序列中核苷酸总数目的5％。

在一些实施方式中，两个氨基酸序列基本上相同，意指当进行比较和比对以得出最大对应性时，如使用序列比较算法或通过目测测量的，两个氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％以及在一些实施方式中至少95％、96％、97％、98％、99％的氨基酸残基同一性。同一性可以存在于长度为至少约10、约20、约40-60个残基或它们之间的任何整数值的序列区域上，并且可以存在于比60-80个残基更长例如至少约90-100个残基的区域上，并且在一些实施方式中，序列在所比较的序列的全长上是基本上相同的。

针对本发明的微肽的抗体

在另一方面，本发明涉及能够特异性结合至本发明的微肽的抗体。

如本文所用，术语“抗体”涉及单体或多聚体蛋白，其包括具有结合至确定的抗原或抗原内表位的能力的至少一种多肽，并且包括全部或部分的轻或重。

术语抗体还包括任何类型的已知抗体，诸如例如多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体，诸如嵌合抗体、人源化抗体、灵长类抗体、人抗体以及双特异性抗体(包括双抗体(diabodies))、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性即可。

本发明还包括上述不同类型的抗体的片段的用途，其基本上保留了抗体的抗血管生成活性。术语“抗体片段”包括抗体片段诸如Fab、F(ab')2、Fab’、单链Fv片段(scFv)、双抗体和纳米抗体。

当涉及抗体及其抗原结合片段时，短语“特异性结合”意指该抗体结合至其变体的本发明的微肽而与其他人蛋白没有结合或结合不明显。然而，该术语不排除本发明的抗体也可以与本发明的其他形式的微肽交叉反应的事实。典型地，抗体以至少约1x 10^-6M或10^{- 7}M、或约10^-8M至10^-9M、或约10^-10M至10^-11M或更高的缔合常数(Kd)结合，并且以是其与预定抗原或紧密相关抗原以外的非特异性抗原(例如BSA，酪蛋白)结合的亲和力的至少两倍大的亲和力与预定抗原结合。短语“识别抗原的抗体”和“对抗原具有特异性的抗体”在本文中与术语“与抗原特异性结合的抗体”可互换使用。

当涉及肽时，短语“特异性结合”或“特异性地结合”是指专一地或主要地对靶分子具有中等或高结合亲和力的肽分子。短语“特异性结合至”是指在蛋白和其他生物品的异质群体的存在下确定靶蛋白的存在的结合反应。因此，在指定的测定条件下，指定的结合部分优先结合至特定的靶蛋白，并且不大量结合至测试样品中存在的其他组分。在这种条件下与靶蛋白的特异性结合可以需要由于其对特定靶抗原的特异性而被选择的结合部分。可以使用多种测定形式来选择与特定蛋白特异性反应的配体。例如，固相ELISA免疫测定、免疫沉淀、Biacore和蛋白质印迹用于鉴定与本发明的微肽或其变体特异性反应的肽。典型地，特异性或选择性反应将是背景信号或噪声的至少两倍，并且更典型地是背景的十倍以上。

编码本发明的微肽的多核苷酸，以及包含所述多核苷酸的载体和宿主细胞

在第三方面，本发明涉及编码本发明的微肽的多核苷酸，条件是所述多核苷酸不是由具有对应于2017年9月10日版本的NCBI登录号NM_203306.2、对应于2017年8月29日版本的NR_027064以及对应于2017年4月23日版本的NR_040248的序列组成的多核苷酸。

如本文所用，术语“多核苷酸”是指由经由磷酸二酯键(或其合成类似物上的相关结构变体)连接的多个核苷酸单元(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其相关结构变体或合成类似物)组成的聚合物。术语多核苷酸包括双链或单链基因组的和cDNA、RNA、任何合成的和基因操纵的多核苷酸，以及有义和反义多核苷酸两者(尽管本发明仅公开了有义链)。这包括单链和双链分子，即DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA杂交体。

本发明的多核苷酸可以是本身分离的或形成载体的部分，从而允许所述多核苷酸在合适的宿主细胞中增殖。因此，在另一方面，本发明涉及编码如上所述的本发明的多核苷酸的载体，在下文中为本发明的载体。

适于插入所述多核苷酸的载体是来源于原核生物中的表达载体的载体，诸如pUC18、pUC19、Bluescript及其衍生物、mpl8、mpl9、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌体和“穿梭”载体诸如pSA3和pAT28；酵母中的表达载体，诸如2微米质粒、整合质粒、YEP载体、着丝粒质粒等的类型的载体；在昆虫细胞中的表达载体，诸如pAC系列和pVL的载体；在植物中的表达载体，诸如pIBI、pEarleyGate、pAVA、pCAMBIA、pGSA、pGWB、pMDC、pMY、pORE系列等；以及真核细胞中的表达载体，包括适于使用任何商购的杆状病毒系统转染昆虫细胞的杆状病毒。用于真核细胞的载体优选地包括病毒载体(腺病毒，与腺病毒相关的病毒诸如逆转录病毒，以及特别是慢病毒)，以及非病毒载体，诸如pSilencer4.1-CMV(Ambion)、pcDNA3、pcDNA3.1/hyg、pHMCV/Zeo、pCR3.1、pEFI/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAXl、pZeoSV2、pCI、pSVL和PKSV-10、pBPV-1、pML2d和pTDTl。

载体还可包括报告基因或标记基因，其允许鉴定在与载体接触后掺入了载体的那些细胞。

在本发明上下文中有用的报告基因包括lacZ、荧光素酶、胸苷激酶、GFP等。在本发明上下文中有用的标记基因包括，例如，新霉素抗性基因，赋予对氨基糖苷G418的抗性；潮霉素磷酸转移酶基因，赋予对潮霉素的抗性；ODC基因，赋予对鸟氨酸脱羧酶(2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸(DFMO))的抑制剂的抗性；二氢叶酸还原酶基因，赋予对甲氨蝶呤的抗性；嘌呤霉素-N-乙酰基转移酶基因，赋予对嘌呤霉素的抗性；ble基因，赋予对zeocin的抗性；腺苷脱氨酶基因，赋予对9-β-D-木呋喃糖腺嘌呤的抗性；胞嘧啶脱氨酶基因，使细胞在N-(膦酰基乙酰基)-L-天冬氨酸存在下生长；胸苷激酶，使细胞在氨基蝶呤存在下生长；黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因，使细胞在黄嘌呤存在且鸟嘌呤不存在下生长；大肠杆菌(E.coli)的trpB基因，使细胞在吲哚代替色氨酸存在的情况下生长；大肠杆菌的hisD基因，使细胞使用组氨醇来代替组氨酸。将选择基因掺入质粒中，该质粒可以额外地包括适合于所述基因在真核细胞中表达的启动子(例如，CMV或SV40启动子)，优化的翻译起始位点(例如，遵循所谓的Kozak's规则或IRES的位点)，多腺苷酸化位点诸如例如SV40多腺苷酸化或磷酸甘油酸激酶位点，内含子诸如例如β-球蛋白基因内含子。替代地，可以在同一载体中同时使用报告基因和标记基因两者的组合。

另一方面，如本领域技术人员所知，载体的选择将取决于随后载体将被引入的宿主细胞。举例来说，在其中引入了所述多核苷酸的载体也可以是酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或PI衍生的人工染色体(PAC)。YAC、BAC和PAC的特征是本领域技术人员已知的。例如，Giraldo和Montoliu(Giraldo,P.&Montoliu L.,2001Size matters:use ofYACs,BACs and PACs in transgenic animals,Transgenic Research 10(2):83-110)已经提供了所述类型的载体的详细信息。本发明的载体可以通过本领域技术人员已知的常规方法获得(Sambrook J.et al.,2000"Molecular cloning,a Laboratory Manual",3rded.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,N.Y.Vol 1-3)。

可以将本发明的多核苷酸作为裸露的DNA质粒在体内引入宿主细胞，但也可以通过本领域已知的方法使用载体，包括但不限于转染、电穿孔(例如经皮电穿孔)、显微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀，使用基因枪或使用DNA载体转运蛋白。参见Wu C,et al.,J.Biol.Chem.1992；267:963-967，Wu C and Wu G,Biol.Chem.1988；263:14621-14624，以及Williams R,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1991；88:2726-2730。将裸露的DNA配制并给药至哺乳动物肌肉组织的方法也是已知的。参见Feigner P,et al.,US 5,580,859和US 5,589,466。其他分子也可用于促进体内核酸的转染，诸如阳离子寡肽、衍生自DNA结合蛋白的肽或阳离子聚合物。参见Bazile D,et al.,WO 1995021931和Byk G,etal.,WO 1996025508。

可以用于将多核苷酸引入宿主细胞的另一种众所周知的方法是粒子轰击(又称基因枪转化)。基因枪转化通常以几种方式之一完成。一种常见的方法涉及将惰性或生物活性颗粒推进到细胞。参见Sanford J,et al.,US 4,945,050、US 5,036,006和US 5,100,792。

替代地，可以通过脂质转染将载体引入体内。阳离子脂质的使用可以促进带负电荷的核酸的封装，并且还促进与带负电荷的细胞膜融合。参见Feigner P,Ringold G,Science 1989；337:387-388。已经描述了用于核酸转移的特别有用的脂质化合物和组合物。参见Feigner P,et al.,US 5,459,127，Behr J,et al.,WO1995018863，以及Byk G,WO1996017823。

因此，在另一方面，本发明涉及包括本发明的多核苷酸或本发明的载体的宿主细胞，在下文中为本发明的细胞。可以通过本领域技术人员已知的常规方法获得细胞(参见例如Sambrook et al.，引用同上)。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指已将本发明的核酸诸如根据本发明的多核苷酸或载体引入其中并能够表达本发明的微肽的细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文可互换使用。应该理解的是，这样的术语不仅指特定的受试者细胞，而且也指这样的细胞的子代或潜在子代。因为由于突变或环境影响，某些修饰可以在后代中发生，所以这类子代实际上可以与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用术语的范围内。该术语包括可以通过引入异源DNA而修饰的任何可培养细胞。优选地，宿主细胞是在其中本发明的多核苷酸可以被稳定地表达、翻译后修饰、定位于合适的亚细胞区室，并且使其与合适的转录机制接合的宿主细胞。合适的宿主细胞的选择也将受到检测信号选择的影响。例如，如上所述，报告构建体在响应于转录调节蛋白而激活或抑制基因转录时可以提供可选择或可筛选的性状；为了获得最佳选择或筛选，将考虑宿主细胞表型。本发明的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或杆菌(Bacilli.)。应当理解，原核细胞将优选地用于包括本发明的多核苷酸或载体的转录控制序列的增殖。用于转化的合适的原核宿主细胞包括，例如，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)以及假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)中的各种其他物种。真核细胞包括但不限于酵母细胞、植物细胞、真菌细胞、昆虫细胞(例如杆状病毒)、哺乳动物细胞和寄生生物例如锥体虫的细胞。如本文所用，酵母不仅包括严格分类学意义上的酵母，即单细胞生物，还包括丝状真菌的酵母样多细胞真菌。示例性物种包括乳酸克鲁维酵母(Kluyvereilactis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和Ustilaqo maydis，其中酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是优选的。可以用于实施本发明的其他酵母是粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)和多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)。哺乳动物宿主细胞培养系统包括已建立的细胞系，诸如COS细胞、L细胞、3T3细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、胚胎干细胞，其中BHK、HeK或HeLa细胞是优选的。真核细胞优选地通过应用本发明的转录控制序列或表达载体而用于重组基因表达。

包括本发明的微肽、多核苷酸、载体和宿主细胞的组合物和药物组合物

在进一步的方面，本发明涉及包括根据本发明的微肽或本发明的多核苷酸、表达载体或宿主细胞的组合物。

如本文所用，术语“组合物”涉及包括上述组分以及由任何量的不同组分的组合直接或间接得到的任何产物的材料组合物。本领域技术人员将注意到，该组合物可以配制成单一制剂，或者可以以每种组分的独立制剂存在，可以将其组合作为组合制剂用于联合使用。该组合物可以是成套试剂盒，其中，每种组分被单独配制和包装。

在另一方面，本发明还涉及药物组合物，包括本发明的组合物和药学上可接受的载体。

如本文所用，术语“药物组合物”是指包括根据本发明的治疗有效量的试剂和至少一种药学上可接受的赋形剂的组合物。根据本发明的药物组合物可以制备为例如注射剂，诸如液体溶液剂、混悬剂和乳剂。

如本文所用，与由本发明的药物组合物所包括的本发明的微肽、多核苷酸、载体或细胞相关的术语“治疗有效量”，涉及足够量的根据本发明的微肽、多核苷酸、载体或细胞以提供所需的效果，即以实现明显的预防、治愈、延迟、减轻严重程度或缓解源自疾病的一种或多种症状，并且除其他原因外，通常通过试剂本身的特征和要实现的治疗效果来确定。这也将取决于待治疗的受试者，所述受试者遭受的疾病的严重程度，所选择的剂型等。因此，本发明中提及的剂量必须仅被视为对本领域技术人员的指导，本领域技术人员必须根据上述变量来调整剂量。在实施方式中，有效量产生了被治疗疾病的一种或多种症状的缓解。

即使个体需求有所不同，但确定有效量的本发明化合物的最佳范围仍属于本领域技术人员的共同常识。通常，可以由本领域技术人员调节的提供有效量的这类化合物所需的剂量将根据以下而变化：年龄、健康、体能、性别、饮食、重量、受体改变的程度、治疗的频率和损伤或疾病的性质和程度、患者的医疗状况、给药途径、所使用的特定化合物的药理学考虑因素(诸如活性、功效、药代动力学和毒理学特征)、是否使用系统药物递送以及是否将化合物作为药物组合的一部分给药。

本领域技术人员熟悉在广泛已知并且可获得的来源如《雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Science)》(17th Ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985)和Goodman和Gilman's中讨论的原理和程序。术语“药学上可接受的赋形剂”或“药学上可接受的载体”是指在所采用的剂量和浓度下对受试者基本上无毒并且与药物组合物的其他组分相容的任何化合物或化合物的组合。因此，赋形剂是与药物组合物的活性成分一起配制的无活性物质，目的是填充(bulking-up)包含所述活性成分的组合物。当生产剂型时，填充允许方便和准确地分配药物物质。赋形剂还可以起到各种增强治疗的目的，诸如促进化合物(药物)的吸收或溶解性或其他药代动力学方面的考虑。赋形剂还可以用于制造过程中，诸如通过促进粉末的流动性或不粘特性来帮助处理有关的活性物质，此外还有助于体外稳定性，诸如防止在预期的保质期内变性。合适的赋形剂的选择取决于给药的途径和剂型，以及活性成分和其他因素。赋形剂可以是任何常规类型的无毒固体、半固体或液体填充剂，稀释剂，封装材料或配制助剂。赋形剂或载体的说明性非限制性实例包括水、盐(盐水)溶液、酒精、右旋糖、植物油、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯、石油脂肪酸酯(fattyacid esters petroetrals)、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。

在特定的实施方式中，包含用于本发明的化合物的药物组合物是用于肠胃外给药的药物组合物。因此，所述适合于肠胃外注射的药物组合物包括生理学上可接受的无菌水性或非水性溶液剂、分散剂、混悬剂或乳剂，或者可以包括用于重构为无菌注射溶液剂或分散剂的无菌粉剂。合适的水性或非水性赋形剂或载体、稀释剂、溶剂或媒介物(vehicle)的实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、其合适的混合物、甘油三酯，包括植物油诸如橄榄油或可注射的有机酯诸如油酸乙酯。在特定的实施方式中，包含用于本发明的化合物的药物组合物是用于静脉内、肌内或皮下给药的药物组合物。典型地，用于静脉内、肌内或皮下给药的药物组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。如果需要，包括根据本发明使用的化合物的药物组合物还包括局部麻醉剂，以缓解注射部位的任何疼痛。通常，将成分分别提供或混合在一起以单位剂型提供，例如，作为干燥的冻干粉或无水浓缩物，放在表明了活性成分的量的密封的容器诸如安瓿或小袋中。当药物组合物要通过输注给药时，可以用包含无菌药物级水或盐水的输液瓶分配。在通过注射给药药物组合物的情况下，可以提供注射用无菌水或盐水的安瓿，使得可以在给药之前将成分混合。

在另一特别的实施方式中，包含用于本发明的化合物的药物组合物是用于口服给药的药物组合物。

用于口服给药的固体剂型包括常规胶囊剂、缓释胶囊剂、常规片剂、缓释片剂、可咀嚼片剂、舌下片剂、泡腾片、丸剂、混悬剂、粉剂、颗粒剂和凝胶剂。在固体剂型中，活性成分(即选自由以下组成的组的化合物：a)SEQ ID No:1、2或3的肽；b)根据a)的肽的功能等效的变体；c)编码a)或b)的多核苷酸；d)包括根据c)的多核苷酸的载体；e)能够将根据a)或b)的肽分泌到培养基中的细胞；以及f)包括根据a)或b)的肽的纳米颗粒)与诸如以下的至少一种合适的赋形剂或载体混合：柠檬酸钠或磷酸二钙或(a)填充剂或增量剂，诸如例如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露醇或硅酸；(b)粘合剂，诸如例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖或阿拉伯胶；(c)保湿剂，诸如例如甘油；(d)崩解剂，诸如例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些复合硅酸盐或碳酸钠；(e)溶液迟延剂，诸如例如石蜡；(f)吸收促进剂，诸如例如季铵化合物；(g)润湿剂，诸如例如鲸蜡醇或单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，诸如例如高岭土或膨润土；和/或(i)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠或它们的混合物。在胶囊剂和片剂的情况下，剂型还可以包括缓冲剂。

类似类型的固体制剂也可以用作软或硬填充明胶胶囊剂中的填充剂，该胶囊剂使用赋形剂诸如乳糖或乳糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等。固体剂型诸如包衣的片剂、胶囊剂和颗粒剂可以用包衣或外壳诸如肠溶包衣和本领域已知的其他形式制备。它们还可以包含遮光剂，并且可以被配制为使得它们以延迟的方式释放一种或多种活性成分。可以使用的包埋制剂的实例是聚合物质和蜡。如果合适，活性成分也可以与上述赋形剂中的一种或多种一起呈微胶囊的形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂，其包含本领域中使用的合适的赋形剂或载体。除了活性成分(即选自由以下组成的组的化合物：a)SEQ ID No:1、2或3的肽；b)根据a)的肽的功能等效的变体；c)编码a)或b)的多核苷酸；d)包括根据c)的多核苷酸的载体；e)能够将根据a)或b)的肽分泌到培养基中的细胞以及f)包括根据a)或b)的肽的纳米颗粒)之外，液体剂型还可以包含一种或多种本领域常用的赋形剂或载体，诸如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，诸如例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油特别是棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄榄油、蓖麻油、芝麻籽油、

甘油、四氢糠醇、聚乙二醇、脱水山梨醇的脂肪酸酯或这些物质的混合物等。除了所述惰性稀释剂之外，制剂还可以包括佐剂，例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和加香剂。除了一种或多种活性成分之外，混悬剂还可以包含悬浮剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯或聚氧乙烯脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄芪胶或这些物质的混合物等。

在另一种特别的实施方式中，包含用于本发明的化合物的药物组合物是用于局部给药的药物组合物。对于局部给药，所述药物组合物可以配制成乳膏、凝胶、洗剂、液体、润发油、喷雾溶液、分散剂、固体条、乳剂、微型乳剂等，可以根据使用合适的赋形剂诸如例如乳化剂、表面活性剂、增稠剂、着色剂及其两种或更多种的组合的常规方法进行配制。

包括根据本发明使用的化合物的药物组合物也可以以透皮贴剂或离子电渗装置的形式给药。因此，在特定的实施方式中，根据本发明使用的化合物以透皮贴剂的形式给药，例如以缓释透皮贴剂的形式给药。合适的透皮贴剂在例如US5262165、US5948433、US6010715和US6071531中有更详细的描述。

几种药物递送系统是已知的并且可以用于给药根据本发明使用的化合物，包括例如封装在脂质体、微泡、乳剂、微粒、微胶囊中，或者借助于其他纳米技术系统诸如例如聚合物疗法等。所需剂量可以作为单个单位或以缓释形式给药。

本领域描述了可持续释放形式以及合适的材料和用于其制备的方法。在特定的实施方式中，包括根据本发明使用的化合物的药物组合物的可口服给药形式为缓释形式，其进一步包括至少一种包衣或基质。包衣或缓释基质包括但不限于天然聚合物、半合成或合成的水不溶性的改性的蜡、脂肪、脂肪醇、脂肪酸、天然半合成或合成的增塑剂或它们中的两种或更多种的组合。可以使用本领域技术人员已知的常规方法应用肠溶包衣。

在特定的实施方式中，当根据本发明使用的化合物包括核酸时，可以将药物组合物配制成旨在用于基因疗法的组合物；作为说明而非限制，该药物组合物可以包含病毒或非病毒载体，其包括合适的多核苷酸或基因构建。作为说明并且非限制，所述载体可以是病毒的例如基于逆转录病毒、腺病毒等，或非病毒的诸如ADN-脂质体、ADN-聚合物、ADN-聚合物-脂质体复合物等(参见"Nonviral Vectors for Gene Therapy”，Huang、Hung和Wagner编辑，Academic Press(1999))。可以通过常规方法将包含相应多核苷酸或基因构建的所述载体直接给药至受试者。替代地，所述载体可用于离体转化或转染或感染细胞例如哺乳动物(包括人)细胞，随后将细胞植入人体或动物中以获得期望的治疗效果。为了给药至人体或动物，所述细胞将在对细胞生存力没有不利影响的合适培养基中配制。

在进一步的方面，本发明涉及本发明的微肽、多核苷酸、表达载体、宿主细胞、组合物或药物组合物用于医药的用途。

本发明的微肽、多核苷酸和载体在癌症中的治疗用途

如本申请的实施例中所示，本发明的作者发现本发明的微肽能够用作肿瘤抑制剂，因此是治疗癌症的令人关注的工具。

因此，在另一方面，本发明涉及本发明的微肽、多核苷酸、表达载体、宿主细胞、组合物或药物组合物用于癌症治疗的用途。

如本文所用，术语“治疗”包括旨在终止、预防、改善和/或降低对本文所述的临床病症例如癌症的易感性的任何类型的疗法。因此，如本文所用，“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等是指获得期望的药理和/或生理效果，涵盖对包括人在内的哺乳动物的病理病症或疾患的任何治疗。就完全或部分预防疾患或其症状而言，该效果可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾患和/或归因于该疾患的不利影响而言，该效果可以是治疗性的。即，“治疗”包括(1)预防疾患在受试者中发生或复发，(2)抑制疾患，诸如阻止其发展，(3)停止或终止疾患或至少与之相关的症状，使得宿主不再遭受该疾患或其症状，诸如，例如通过恢复或修复丧失、缺失或有缺陷的功能或刺激效率低的过程使得疾患或其症状消退，或(4)解除、减轻或缓解疾患或与之相关的症状，其中缓解在广义上是指至少减小参数的大小。与未接受治疗的预期生存期相比，“治疗”还可以意指延长的生存期。需要治疗的那些包括已经患有该病症或疾患的那些以及易于患该病症或疾患的那些或要预防该病症或疾患的那些。

如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”或“肿瘤疾病”是指涉及未调节的细胞生长的一大类疾病，并且也被称为恶性赘生物。该术语通常应用于疾病，其特征在于不受控制的细胞分裂(或在于生存期或凋亡抑制的增加)，以及所述细胞能够侵袭其他邻近组织(侵袭)并通过淋巴管和血管扩散到通常不存在该细胞的人体其他区域(转移)，通过血液循环，并且然后侵袭身体中其他部位的正常组织。根据它们是否可以通过侵袭和转移扩散，将肿瘤分类为良性的或恶性的：良性肿瘤是不能通过侵袭或转移而扩散的肿瘤，即它们仅局部地生长；而恶性肿瘤是能够通过侵袭和转移扩散的肿瘤。已知涉及癌症的生物过程包括血管生成、免疫细胞浸润、细胞迁移和转移。癌症通常具有以下一些特征：维持增殖信号传导、逃避生长抑制因子、抵抗细胞死亡、使复制永生、诱导血管生成以及激活侵袭并且最终转移。癌症侵袭身体的附近部位，并且也可能通过淋巴系统或血液扩散到身体的更远部位。通过肿瘤细胞类似的细胞类型对癌症进行分类，因此可以认为该细胞类型是肿瘤的起源。

癌症或肿瘤的实例包括但不限于乳腺、心脏、肺、小肠、结肠、脾脏、肾脏、膀胱、头部、颈部、卵巢、前列腺、脑、直肠、胰腺、皮肤、骨骼、骨髓、血液、胸腺、子宫、睾丸、肝胆和肝肿瘤。特别地，肿瘤/癌症可以选自以下的组：腺瘤、血管肉瘤、星形细胞瘤、上皮癌、生殖细胞瘤、胶质母细胞瘤、胶质瘤、血管内皮瘤、肝母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、肝胆癌症、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、畸胎瘤、端雀斑样痣性黑素瘤(acrallentiginous melanoma)、光化性角化病腺癌、腺样囊性癌、腺肉瘤、腺鳞癌、星形细胞肿瘤、巴索林腺癌(bartholin gland carcinoma)、基底细胞癌、支气管腺癌、癌肉瘤、胆管癌、囊腺瘤、内胚窦瘤、子宫内膜增生症、子宫内膜间质肉瘤、子宫内膜样腺癌、室管膜肉瘤、Swing's肉瘤、局灶性结节性增生、生殖细胞肿瘤、胰高血糖素瘤、血管母细胞瘤、血管瘤、肝腺瘤、肝腺瘤病、肝细胞癌、胰岛瘤、上皮内瘤变、上皮间鳞状细胞瘤、浸润型鳞状细胞癌、大细胞癌、平滑肌肉瘤、恶性黑素瘤、恶性间皮瘤、髓上皮瘤、黏液表皮样癌、神经上皮腺癌、结节性黑素瘤、乳头状浆液性腺癌、垂体瘤、浆细胞瘤、假性肉瘤、肺母细胞瘤、肾细胞癌、浆液性癌、小细胞癌、软组织癌、生长抑素分泌肿瘤、鳞癌、鳞状细胞癌、未分化癌、葡萄膜黑素瘤、疣状癌、舒血管肠肽瘤(vipoma)、维尔姆斯瘤(Wilm's tumor)。

在特定的实施方式中，本发明涉及本发明的微肽、多核苷酸、表达载体、宿主细胞、组合物或药物组合物用于癌症治疗的用途，其中，该癌症是原发性肿瘤或癌症转移。

如本文所用，术语“原发性肿瘤”是指起源于其存在的位置或器官并且没有从其他位置转移到该位置的肿瘤。

在本发明的上下文中，“转移”被理解为癌症从其开始的器官向不同器官的增殖。它通常通过血液或淋巴系统发生。当癌细胞扩散并形成新的肿瘤时，后者被称为继发性或转移性肿瘤。形成继发性肿瘤的癌细胞类似于原始肿瘤的那些癌细胞。例如，如果乳腺癌扩散(转移)到肺，则继发性肿瘤由恶性乳腺癌细胞形成。肺部疾病是转移性乳腺癌，而不是肺癌。

在另一种实施方式中，微肽、多核苷酸、表达载体、宿主细胞、组合物或药物组合物，其中，微肽是序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的微肽，用于癌症治疗的用途，其特征在于癌症包括在p53基因中的失活突变。

因此，在特定的实施方式中，癌细胞在p53基因的至少一个等位基因中携带失活突变。

如本文所用，术语“失活突变”是指部分或完全消除由突变的多核苷酸编码的多肽的活性的突变。在p53的特定情况下，失活突变是那些导致其启动DNA修复反应的能力部分或完全缺乏的突变。

导致p53失活的合适突变通常是错义突变，诸如本领域已知的那些(Michalovitzet al.,J.Cell.Biochem.,1991,45(l):22-9；Vogelstein and Kinzler,Cell,1992,70(4):523-6；Donehower and Bradley,Biochim.Biophys.Acta.,1993,1155(2):181-205；Levine,Cell,1997,88(3):323-31)。这些突变几乎只影响p53的核心DNA结合结构域，该结构域负责与p53 DNA结合位点进行接触，尽管已在N端反式激活结构域或C端四聚结构域中描述了一些失活突变(Beroud and Soussi,Nucleic Acids Res.,1998,26(l):200-4；Cariello et al.,Nucleic Acids Res.,1998,26(1):198-9；Hainaut et al.,P.,NucleicAcids Res.1998；26:205-213)。

在另一种特定的实施方式中，本发明的转基因非人动物对于完全缺乏的p53基因(p53-/-)是纯合的。

在特别的实施方式中，本发明的微肽、多核苷酸、表达载体、宿主细胞、组合物或药物组合物用于治疗癌(carcinoma)癌症。

如本文所用，术语“癌(carcinoma)”是指上皮或内分泌组织的恶性肿瘤，包括呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌和黑素瘤。

在另一种特定的实施方式中，本发明的微肽、多核苷酸、表达载体、宿主细胞、组合物或药物组合物用于治疗或选自鳞状细胞癌、腺癌、移行细胞癌或基底细胞癌的癌。

在进一步的特定的实施方式中，本发明的微肽、多核苷酸、表达载体、宿主细胞、组合物或药物组合物用于治疗选自肺癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、结肠和直肠癌、皮肤癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、肝细胞癌或肾细胞癌的癌。

癌(carcinoma)的类型包括但不限于：腺泡细胞癌、光化性角化病腺癌、腺癌、腺样囊性癌、腺鳞癌、肾上腺皮质癌、间变性癌、胰腺间变性癌、甲状腺间变性癌、前庭大腺癌、基底细胞癌、基底细胞样癌、支气管腺癌、原位癌、CASTLE、嫌色细胞癌、透明细胞癌、集合管癌、胶样癌、导管原位癌、导管细胞癌、胚胎癌、子宫内膜癌、上皮癌、上皮-肌上皮癌、纤维板层癌、滤泡癌、巨细胞癌、玻璃样细胞癌、肝细胞癌、

细胞癌、炎性癌、原位癌、导管内癌、粘膜内癌、幼年性癌、克雷布斯(Krebs)癌、肺大细胞未分化癌、喉癌、小叶原位癌、髓样癌、默克尔(Merkel)细胞癌、微浸润癌、子宫颈微偏腺癌、黏液表皮样癌、“Murky细胞”癌、鼻咽癌、神经上皮腺癌、非小细胞肺癌、燕麦细胞癌、卵巢小细胞癌－高钙血型、多形性癌、多形性小叶癌、肾细胞癌、肉瘤样癌、硬癌、分泌性癌、浆液性癌、软组织癌、梭形细胞癌、鳞癌、鳞状细胞癌、残癌、浅表扩散癌、终末导管癌、贯声门癌、移行细胞癌、管癌和未分化癌。

在特定的实施方式中，SEQ ID NO:1的微肽，或编码或包括SEQ ID NO:1的微肽的或包括编码SEQ ID NO:1的微肽的多核苷酸的本发明的多核苷酸、表达载体、宿主细胞、组合物或药物组合物，用于治疗胰腺、乳腺、肺、结肠或皮肤癌症。更特别地，用于治疗胰腺、乳腺、肺或结肠癌(carcinoma)或鳞状细胞癌。

在另一种实施方式中，SEQ ID NO:2的微肽，或编码或包括SEQ ID NO:2的微肽的或包括编码SEQ ID NO:2的微肽的多核苷酸的本发明的多核苷酸、表达载体、宿主细胞、组合物或药物组合物用于治疗胰腺和乳腺癌症。更特别地，癌症是三阴性乳腺癌症和胰腺腺癌。

在另一种特定的实施方式中，SEQ ID NO:2的微肽，或编码或包括SEQ ID NO:2的微肽的或包括编码SEQ ID NO:2的微肽的多核苷酸的本发明的多核苷酸、表达载体、宿主细胞、组合物或药物组合物靶向肿瘤和肿瘤中的基质隔室(stromal compartment)(与癌症相关的成纤维细胞)两者。

在另一种特定的实施方式中，SEQ ID NO:3的微肽，或编码或包括SEQ ID NO:3的微肽的或包括编码SEQ ID NO:3的微肽的多核苷酸的本发明的多核苷酸、表达载体、宿主细胞、组合物或药物组合物用于治疗结肠和肺癌症。更特别地，用于治疗结肠和肺癌(carcinoma)。

在治疗纤维化中的用途

如本申请的实施例中所示，证明了序列SEQ ID NO:2的微肽诱导粘附因子诸如COLLAGEN I(胶原I)、COLLAGEN IV(胶原IV)、FIBRONECTIN(纤连蛋白)和CD44的下调。这些因子的上调与纤维化的发展有关，纤维化是一种与慢性炎性疾病相关的病理特征，其定义是归因于细胞外基质组分诸如胶原的过度沉积的组织的过度生长、变硬和/或瘢痕化(WynnTA et al.,2012,Nat.Med.18:1028-40)。另外，已经证明透明质酸和其他与细胞粘附相关的配体(诸如胶原和金属蛋白酶)的受体CD44是细胞外基质粘附和纤维化所必需的(Li Y,et al,2011；J Exp Med.208,1459-71and Yang LW et al,2018,doi:10.1097/SHK.0000000000001132)。

因此，在另一方面，本发明涉及本发明的SEQ ID NO:2的微肽、编码所述微肽的多核苷酸、表达载体、宿主细胞、组合物或药物组合物用于纤维化治疗的用途。

如本文所用，术语“纤维化”是指以纤维组织的过度沉积为特征的病症，并且其是许多疾病状态的潜在表现。纤维化类似于瘢痕化过程，在于两者都涉及铺设结缔组织(包括胶原和糖胺聚糖)的受刺激细胞。这可以是反应性、良性或病理性状态。结缔组织在器官和/或组织中的沉积可消除下面的器官或组织的架构和功能。

纤维化可发生在多种组织或器官中。这些纤维化病症包括皮肤纤维化(例如，与硬皮病有关)。真皮纤维化是在皮肤(或真皮)中表现出来的纤维化。纤维化病症还包括肥厚性瘢痕、瘢痕疙瘩、烧伤、佩罗尼氏病(Peyronie's disease)和杜普伊特伦挛缩(Dupuytren'scontractures)。纤维化病症还包括非真皮纤维化。非真皮纤维化是在皮肤(或真皮)以外的器官中表现出来的纤维化。非真皮纤维化的重要实例是肺(或肺部的)纤维化。肺纤维化可与间质性肺疾病和弥漫性增生性肺疾病相关。肺纤维化的实例是特发性肺部的纤维化(JPF)，包括具有严重气道限制的IPF(本文称为严重IPF)。

非真皮纤维化的其他实例包括肝/肝脏纤维化、眼纤维化、肠的纤维化、肾/肾脏纤维化、胰腺纤维化、血管纤维化、心肌纤维化、骨髓纤维化等。一些形式的纤维化称为间质纤维化，并且它们包括真皮或非真皮间质纤维化。

在已知病因的范围内，纤维化可以进一步按其病因分类。例如，纤维化可以与感染(例如，病毒性感染或寄生虫感染)相关或由其引起，或者它可以是药物诱导的纤维化(例如，化疗)，或者它可以与物质滥用(例如，酒精诱导的纤维化)相关或由其引起，或者它可以与手术或其他侵入性操作相关或由其引起，或者它可以与潜在的病症或事件(例如，心肌梗死或糖尿病)相关或由其引起，或者它可以与辐射暴露(例如，用于癌症的放射治疗)相关或由其引起。实例包括与饮用酒精、病毒性肝炎和/或血吸虫病有关的肝/肝脏纤维化；心肌梗死后心肌纤维化；与糖尿病有关的肾/肾脏纤维化；以及炎症后肾/肾脏纤维化。纤维化可以是移植诱导的，或者它可以独立于移植而发生(即，在未进行移植以及不需要移植的受试者中)。

在本申请中，模糊地使用术语“胶原I”、“I型胶原”、“α1”或“α-1I型胶原”。它们指的是包括两条α1链和一条α2链(分别由COL1A1和COL1A2基因编码)的三重螺旋蛋白。

本文使用的术语CD44参考在细胞间相互作用、细胞粘附和迁移中涉及的细胞表面糖蛋白。在人类中，CD44抗原由11号染色体上的CD44基因编码。CD44也称为HCAM(归巢细胞粘附分子)、Pgp-1(吞噬糖蛋白-1)，爱马仕(Hermes)抗原、淋巴细胞归巢受体、ECM-III和HUTCH-1。

在特定的实施方式中，本发明涉及本发明的微肽、多核苷酸、表达载体、宿主细胞、组合物或药物组合物用于纤维化治疗的用途，其中纤维化与器官或组织中的功能丧失以及外科手术和/或美学并发症有关。

在另一种特定的实施方式中，本发明涉及本发明的微肽、多核苷酸、表达载体、宿主细胞、组合物或药物组合物用于纤维化治疗的用途，其中，纤维化选自以下：肺纤维化、肝脏纤维化(肝硬化)、肾脏纤维化、角膜纤维化、与皮肤和腹膜手术相关的纤维化、与烧伤相关的纤维化、骨关节纤维化或瘢痕疙瘩。

***

将通过以下实施例描述本发明，该实施例应被认为仅是说明性的而不是对本发明范围的限制。

实施例

方法

化学治疗

多柔比星、放线菌素D和Nutlin-3a购自Sigma-Aldrich。在药物治疗实验中，使用1μM的多柔比星、使用5nM的放线菌素D以及使用10μM的Nutlin-3a。

克隆程序

合成(IDT技术)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3编码序列(ORF)，其与氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS的柔性接头和处于C-端的HA标签融合，并且两侧为EcoRI和XhoI酶限制位点。在通过EcoRI和XhoI消化后，将构建体连接至pMSCV-Puro逆转录病毒载体中。按照制造商的说明，使用

克隆技术在pINDUCER20载体(Invitrogen)中克隆SEQ ID NO:1。

细胞培养

将BxPC-3和A549细胞系在补充有10％FBS和青霉素-链霉素的RPMI中培养。将患者来源的H10皮肤鳞状细胞癌细胞系在补充有B27和青霉素-链霉素的DMEM-F12中培养。癌症相关的成纤维细胞(CAF)和PDAC细胞系来源于LSL^{-KrasG12D/+；LSL-Trp53R172H/+；Pdx-1-Cre}小鼠，并且在补充有10％FBS和青霉素-链霉素的DMEM-F12中培养。将所有其他细胞系在补充有10％FBS和青霉素链霉素的DMEM中培养。常规测试培养物中的支原体，并且始终是阴性的。

逆转录病毒和慢病毒转导

使用Fugene HD(Roche)用逆转录病毒或慢病毒载体和包装载体(pCL-Ampho用于逆转录病毒转导，pLP1、pLP2和pLP-VSVG用于慢病毒转导)转染5×10⁶个HEK293T细胞。转染后36h开始，连续两天每天两次收集病毒上清液，并用于感染IMR90以及癌细胞系，其预先以每10cm板8×10⁵个细胞的密度铺板。感染前，将聚凝胺以8mg/ml的浓度添加到病毒上清液中。

mRNA水平分析

按照提供者的建议，用

提取总RNA，并用TURBO^TM DNase处理。使用iScript^TM cDNA合成试剂盒(BioRad)对1g RNA进行逆转录。使用7900HT快速实时PCR系统(Applied Biosystems)中的PowerUp SYBR Green Master Mix(Thermo FisherScientific)通过定量实时PCR分析基因表达。将循环阈值(Ct)值相对GAPDH归一化。

蛋白质印迹

将细胞团粒(4-5*10⁶个细胞)在中盐裂解缓冲液(150mM NaCl、50mM Tris pH 8、1％NP40以及蛋白抑制剂混合物)中均质化。在12％丙烯酰胺凝胶中每条泳道负载50 g蛋白，并且在Tris-甘氨酸SDS运行缓冲液中进行电泳。使用了以下抗体：抗HA标签(Abcam,1:5000)、抗p53(Santa Cruz,1:1000)、抗p21(Thermo Fisher,1:1000)、抗GAPDH(ThermoFisher,1:5000)。

免疫荧光

将细胞以5×10⁴个细胞/ml的细胞密度接种在涂覆有纤连蛋白的玻璃盖玻片上。然后，将细胞固定在4％多聚甲醛中15min，用PBS洗涤两次，并且然后在室温下用0.2％(v/v)Triton X-100渗透持续15min。封闭步骤在3％BSA中进行1小时。将细胞在包含一级抗体HA标签单克隆抗体5B1D10(1:150，Thermo Scientific)和由Abyntek生成的定制抗体(1:150)的相同封闭缓冲液中在4℃下温育过夜。第二天，将细胞用PBS和二级抗体Alexa-Fluor488山羊抗小鼠洗涤3次，并且以1:500稀释添加Alexa-Fluor 488山羊抗兔，并且在黑暗中在室温下温育1小时。最后，将细胞用PBS洗涤3次，封固在具有DAPI的

封固介质(PALEX MEDICAL,S.A.)中，并且使用Nikon Eclipse Ti-E倒置显微镜系统(Nikon,Melville,NY)在488-500nm激发下观察。

膜联蛋白V测定

在慢病毒感染和嘌呤霉素选择持续72h后，将感染的细胞用冷PBS洗涤两次，并且以1×10⁶个细胞/mL的细胞密度重悬于结合缓冲液中。按照制造商的说明(BDPharmingen^TM)，将100μL细胞用5μL膜联蛋白V-FITC处理。在室温下于黑暗中温育15min后，添加400ul结合缓冲液，并且每个样品均补充有10μL碘化丙啶。流式细胞仪分析在LSRFortessa细胞仪上进行。

细胞周期分析和细胞生存力测定

通过用多西环素(2g/ml)处理4天在BxPC3细胞中诱导SEQ ID NO:1表达的微肽。将细胞在4℃下使用100％乙醇固定，用碘化丙啶染色，并通过流式细胞仪(LSR-Fortessa细胞仪)分析细胞周期。按照制造商的说明使用CellTiter-Glo 2.0(Promega)评估SEQ ID NO:1-表达细胞的微肽中的细胞生存力。

对于药物敏感性测定，将多西环素诱导与多柔比星(1.5mM)或放线菌素D(5nM)偶联(从第2天到第4天)，并且通过用结晶紫染色测量细胞生存力。

SA-β-G染色测定

对于SA-β-gal染色，按照制造商的规程，将细胞固定并且使用商业衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(Cell Signalling)染色。

细胞增殖测定

通过胰蛋白酶消化将A549和H10细胞系解离，并且以5x10³个细胞/孔的密度接种到24-孔细胞培养板中。每两天，将细胞从孔中解离并且使用Neubauer室计数。监测细胞生长曲线14天。

伤口愈合测定

将MIA PaCa-2和BxPC-3细胞胰蛋白酶化，计数，并且将400,000个细胞/孔接种到6-孔板中。第二天，使用移液管吸头刮擦细胞单层表面，形成伤口。使用配备了HamamatsuC9100相机的Olympus CellR显微镜跟踪伤口的闭合。

侵袭测定

将BxPC-3、MDA-MB-231、A549和H10细胞系胰蛋白酶化，计数，并且将20.000个细胞/孔一式三份接种到

细胞培养插入物(Boyden室)中，其中，多孔膜涂覆有

层以模拟细胞外基质(ECM)。使细胞在37℃下在细胞培养箱中通过涂层膜侵袭持续24小时。温育时间后，将培养插入物在室温下在甲醇中固定5分钟，并且在室温下使用结晶紫染色20分钟。去除过量的结晶紫染色，用PBS洗涤，并且使用Olympus CellR显微镜拍摄室的照片。使用ImageJ对侵袭细胞进行计数，并且相对于对照标准化计算倍数变化。

为了测试CAF的促侵袭(pro-invasive)活性，将40.000CAF/孔接种到24-孔板中。48h后，将PDAC细胞胰蛋白酶化，计数，并将20.000个细胞接种到

涂覆的插入物的上层隔室中，该插入物置于包含CAF的孔的上方。将CAF和PDAC细胞以这种方式共培养24h，并且如上所述进行染色。

实施例1：微肽鉴定。

本发明的作者已经鉴定出对应于序列SEQ ID NO:1、2和3的3种微肽。

SEQ ID NO 1的微肽是高度保守的87aa微肽，其序列为：

MEGLRRGLSRWKRYHIKVHLADEALLLPLTVRPRDTLSDLRAQLVGQGVSSWKRAFYYNARRLDDHQTVRDARLQDGSVLLLVSDPR(图1A)。

氨基酸序列的计算机分析预测出类似于蛋白泛素的3D结构(图1B)。SEQ ID NO 1微肽由lncRNA TINCR(人中LINC00036以及小鼠中Gm20219)编码。

SEQ ID NO:2的微肽是64-氨基酸微肽，其序列为：

MVRRKSMKKPRSVGEKKVEAKKQLPEQTVQKPRQECREAGPLFLQSRRETRDPETRATYLCGEG(图2A)。

它由ZEB2反义1(ZEB2AS1)长的非编码RNA(lncRNA)编码。ZEB2AS1是天然反义转录物，对应于锌指E-盒结合同源异形盒2(ZEB2)的5'非翻译区(UTR)。编码微肽的ORF滥发(spam)部分的lncRNA的第二和第三外显子。为了构建SEQ ID NO:2微肽3D结构的模型(图2B)，已使用I-Tasser(一种3D蛋白结构预测器)。进一步的计算机分析揭示了物种中的高氨基酸序列保守性以及SEQ ID NO:2的微肽的潜在细胞质定位。

SEQ ID NO:3的微肽是由LINC0086 lncRNA的第一个外显子编码的78-氨基酸微肽。其在进化过程中高度保守的序列是：

MAASAALSAAAAAAALSGLAVRLSRSAAARGSYGAFCKGLTRTLLTFFDLAWRLRMNFPYFYIVASVMLNVRLQVRIE(图3A)。

该序列的计算机分析预测了三级结构(图3B)，该三级结构在蛋白的C端具有跨膜结构域，并且在前25个氨基酸中具有信号肽。

实施例2：在胰腺癌细胞和乳腺癌细胞中，SEQ ID NO:1的微肽的过表达诱导细胞周期停滞、细胞衰老，并使癌细胞对应激敏感。

为了确定微肽的生物学功能，将编码SEQ ID NO:1的ORF在逆转录病毒表达载体(pMSCV)和多西环素可诱导的慢病毒载体(pINDUCER20)两者中在具有HA表位标签的框中克隆。用pINDUCER20-SEQ ID NO:1-HA载体转导BxPC-3胰腺癌细胞系，并且用新霉素选择感染的细胞。在用多西环素处理后，通过qPCR(图4A)以及通过蛋白质印迹(图4B)检测SEQ IDNO:1表达，表明该微肽在细胞中表达且稳定。使用针对SEQ ID NO:1的定制抗体进行免疫染色，揭示了细胞质细胞定位(图4C)。SEQ ID NO:1表达的微肽显著地降低细胞增殖(图5A和5B)，并且诱导细胞周期停滞在G1期(图5C)，连同CDK抑制剂p27和p21上调(图5D和5E)，以及衰老细胞(SA- -Gal阳性细胞)的数目增加(图5F和5G)。明显地，当与细胞应激偶联时，诸如在选择感染细胞时由嘌呤霉素产生的应激(当使用pMSCV非诱导载体时)，SEQ ID NO:1表达的微肽诱导广泛的细胞死亡，如一些胰腺和乳腺癌细胞系中所示出的(图6C)。膜联蛋白-V/PI测定显示，与对照相比，SEQ ID NO:1-嘌呤霉素条件下早期凋亡细胞(22.4％)和晚期凋亡细胞(58.6％)的百分比大幅增加(图6D)。与这些结果一致，SEQ ID NO:1表达的微肽对由药物如多柔比星和放线菌素D诱导的细胞死亡敏感(图6E)。

实施例3：在肺腺癌细胞和鳞状细胞癌细胞中，SEQ ID NO:1的微肽的过表达降低细胞增殖并且诱导细胞周期停滞。

如前所述建立表达诱导型SEQ ID NO:1-HA载体的肺癌细胞系A549和鳞状细胞癌细胞系H10。通过qPCR(图7A)以及通过蛋白质印迹(图7B)检测SEQ ID NO:1表达。使用针对SEQ ID NO:1的定制抗体的免疫染色揭示了具有丝状模式的主要细胞质定位。该数据证明了微肽也可以在这些细胞系中表达和检测。

为了评估SEQ ID NO:1对增殖的影响，监测用SEQ ID NO:1-HA载体或对照载体转导的A549和H10细胞持续14天。生长曲线显示，与对照相比，过表达微肽SEQ ID NO:1的细胞具有始终较低的生长速率(图8A)。对增殖的这种影响还伴随着停滞在G1期的细胞增加(图8B)。与之前在胰腺细胞系BxPC-3中显示的数据一起，有充分的证据表明SEQ ID NO:1的微肽在几种癌症类型(胰腺癌、肺癌和鳞状细胞癌)中有降低细胞增殖的作用。

实施例4：SEQ ID NO:1的微肽损害细胞侵袭能力并且下调间充质程序。

考虑到SEQ ID NO:1的过表达的影响，进行了进一步的实验来研究其在另一个关键的致癌性状——细胞侵袭中的作用。在SEQ ID NO:1的多西环素诱导4天后，使用Boyden室测定法确定A549和H10癌细胞的侵袭性，表明微肽的表达诱导了侵袭的显著降低(图9A和B)。与该观察结果一致，SEQ ID NO:1的微肽的过表达抑制H10 SCC细胞系中EMT调节剂波形蛋白(VIMENTIN)、SLUG、SNAIL、神经钙黏素(N-CADHERIN)、TWIST1、TWIST2、ZEB1和ZEB2的表达(图9C)。间充质程序的这种下调进一步证实了SEQ ID NO:1的微肽作为肿瘤抑制因子的作用。

实施例5：SEQ ID NO:1的微肽的转录和翻译在基因毒性应激后以p53依赖性方式增加。

众所周知，当DNA受损时，肿瘤抑制基因p53在激活后在控制细胞凋亡、细胞周期停滞、衰老以及细胞迁移和侵袭中具有作用。由于SEQ ID NO:1的微肽的潜在肿瘤抑制功能，因此进行了进一步的研究以研究两种蛋白是如何连接的。用癌症治疗中常用的不同DNA破坏剂(多柔比星和放线菌素D)和一种p53稳定剂(Nutlin-3a)处理不同的细胞系(A549、BxPC-3和HCT116)，以促进p53激活。然后，测量SEQ ID NO:1的表达，并且观察到在基因毒性应激后诱导了SEQ ID NO:1(mRNA和蛋白水平)(图10A、B和C)。重要的是，仅具有野生型p53的细胞(HCT116和A549)显示出SEQ ID NO:1的转录和翻译上调(图10A)。另一方面，具有改变的p53状态、蛋白敲除(HCT116 p53KO)或致病性突变p53(BxPC-3)的细胞未显示出相同的反应(图10B)。

作为肿瘤抑制因子，p53负责保护细胞免受致癌性改变。p53的激活可以促进肿瘤细胞的凋亡，并且被认为是一些抗肿瘤药物如多柔比星的关键作用机理。p53的失活突变经常在各种人类癌症中观察到，并且已知会赋予肿瘤抗性。这些结果表明，SEQ ID NO:1以p53依赖性方式被调节，并且从而可能在具有p53的突变失活的所有癌症中被下调。因此，其肿瘤抑制活性可与p53功能相关，从而支持使用该微肽作为癌症中的治疗剂。

实施例6：SEQ ID NO:1的微肽编码改变细胞泛素化模式的泛素样蛋白。

通过计算机工具进行结构建模预测了作为泛素样蛋白的序列SEQ ID NO:1的微肽(图1B)。泛素是广泛存在于所有真核细胞中的高度保守的小蛋白，其可以不锚定或共价连接至另一种蛋白。当与其靶蛋白缀合时，它协调重要的生物学过程，如经由蛋白酶体的蛋白降解、DNA修复、细胞周期调节、信号级联和DNA损伤反应。最近，已经证明，与泛素具有结构相似性的泛素样蛋白(ULP)也存在于细胞中，并且具有可类似于泛素化的蛋白缀合能力(Hochstrasser，2009)。考虑到序列SEQ ID NO:1的微肽的结构特征，测试了该微肽的泛素相关功能。免疫沉淀实验已表明了序列SEQ ID No:1的微肽结合至泛素化的蛋白(图11A)。此外，序列SEQ ID NO:1的微肽过表达改变了BxPC-3感染的细胞中的蛋白泛素化模式(图11B)。

总而言之，我们的结果表明，可能是通过改变细胞泛素化模式，SEQ ID NO:1的微肽诱导细胞周期停滞、细胞衰老，使癌细胞对应激敏感并且减少细胞侵袭和间充质性状。这开辟了使用SEQ ID NO:1的微肽作为疗法以减少肿瘤生长和侵袭性并且使它们在组合疗法中对化学/放射疗法更敏感的可能性。

实施例7：SEQ ID NO:2的微肽的过表达下调EMT因子并且减少胰腺癌中的迁移和侵袭。

编码SEQ ID NO:2的微肽的ORF被克隆到与HA标签融合的pMSCV逆转录病毒载体中。由此获得的构建体用于逆转录病毒转导人原代成纤维细胞(IMR90)、胰腺癌细胞系(MIAPaCa-2和BxPC-3)和鼠胰腺癌相关的成纤维细胞(mCAF)。通过使用HA标签抗体的定量PCR和蛋白质印迹分析在所有细胞系中证实了SEQ ID NO:2的微肽的过表达(图12和13)。使用对SEQ ID NO:2的微肽具有特异性的定制多克隆抗体的免疫染色显示出了SEQ ID NO:2的微肽被表达并且位于细胞质中(图14)。

然后，发明人测试了SEQ ID NO:2微肽的过表达在上皮细胞向间充质细胞转化(EMT)相关的基因表达中的作用。值得注意的是，如EMT调节剂SNAIL、SLUG、ZEB1、ZEB2、TWIST1和波形蛋白(如果表达)以及粘附因子诸如胶原I、胶原IV、CD44和纤连蛋白的下调所示出的，SEQ ID No:2的微肽诱导原代成纤维细胞和胰腺癌细胞系以及与胰腺癌相关的成纤维细胞中的间充质同一性丧失(图15和16)。明显地，mCAF中粘附分子的表达降低还伴随着金属蛋白酶-2的下调(图16)。粘附分子以及金属蛋白酶是由癌症相关的成纤维细胞分泌的因子，其是为了创造促转移环境所必需的(Hwang RF et al.,Cancer Res.2008；68:918–26and Vonlaufen A et al.,Cancer Res.2008；68:2085-93)。

与这些结果一致，SEQ ID NO:2的微肽的过表达导致在MIA PaCa-2和BxPC-3细胞系的伤口愈合测定中迁移能力降低(图17A和B)以及BxPC-3细胞系的侵袭降低(图18A和B)。

此外，在癌症相关的成纤维细胞中细胞外基质因子诸如胶原I、胶原IV和纤连蛋白与分泌的金属蛋白酶-2的下调解决了使用SEQ ID NO:2的微肽作为抗纤维化剂以靶向肿瘤内的以及一般病理纤维化病症中的该特定细胞群的促肿瘤活性的可能性。

为了测试CAF促侵袭活性，将CAF与PDAC细胞共培养，其被接种到

涂覆的插入物的上层隔室中并且允许通过基质胶层侵袭。图19A和B显示出CAF中SEQ ID NO:2表达的微肽以非细胞自主方式减少胰腺癌细胞侵袭，支持使用SEQ ID NO:2的微肽作为治疗剂，其可潜在地靶向癌细胞和基质(stromal)对应物两者。

实施例8：在三阴性乳腺癌中，SEQ ID NO:2的微肽的过表达下调EMT因子并且损害侵袭。

包含SEQ ID NO:2的微肽的构建体(在实施例7中解释的)也用于逆转录病毒转导人三阴性乳腺癌细胞系(MDA-MB-231)。

通过使用HA标签抗体的定量PCR和蛋白质印迹分析在MDA-MB-231细胞中证实了SEQ ID NO:2的微肽的过表达(图20A和B)。

SEQ ID NO:2的微肽的过表达诱导人三阴性乳腺癌细胞系中间充质同一性的丧失。值得注意的是，在MDA-MB-231中EMT调节剂SLUG、ZEB1、ZEB2和波形蛋白的下调之后是上皮标记物诸如上皮钙黏素(E-CADHERIN)和细胞角蛋白-5(CYTOKERATIN-5)的上调(图21)，进一步证实了SEQ ID NO:2的微肽在促进上皮表型中的作用。

与这些结果一致，SEQ ID NO:2的微肽的过表达导致MDA-MB-231乳腺癌细胞系的侵袭测定中侵袭能力降低(图22)，总而言之这表明SEQ ID NO:2的微肽可以充当EMT阴性调节剂，从而有助于降低癌症恶性特征诸如侵袭、转移和对化疗药物的抗性。

实施例9：SEQ ID NO:3的微肽的过表达诱导细胞死亡。

在pMSCV逆转录病毒载体中在具有HA表位标签的框中克隆编码SEQ ID NO:3的微肽的ORF。蛋白质印迹和qPCR分析表明，在逆转录病毒转导后，成功表达了SEQ ID NO:3的微肽，并且蛋白产物是稳定的(图23A和23B)。

重要的是，SEQ ID NO:3的微肽的过表达诱导了癌细胞系(A549、人肺癌和HCT116、人结直肠癌)中大量细胞死亡(图23C)。

实施例10：SEQ ID NO:3的微肽的过表达诱导p21和促凋亡程序。

测试了SEQ ID NO:3的微肽的过表达对CDK抑制剂(和肿瘤抑制因子)p21的表达的影响。有趣的是，SEQ ID NO:3的微肽的过表达导致了A459和HCT116细胞中大量的p21上调(图24A)。这与SEQ ID NO:3微肽过表达后增加的p21蛋白水平相关，如图24B中所示。

考虑到SEQ ID NO:3的微肽对细胞死亡的诱导以及p21在细胞凋亡中的作用，本发明的作者测试了细胞凋亡相关基因的表达。SEQ ID NO:3的微肽的过表达诱导了HCT116结直肠癌细胞系中促凋亡基因BAX和BAK的上调以及抗凋亡基因BCL-2的下调(图24C)。

实施例11：SEQ ID NO:3在基因毒性应激后以p53依赖性方式被上调。

如前所示，p53是重要的肿瘤抑制因子。考虑到微肽SEQ ID NO:3在肿瘤抑制中的潜在作用，本发明的作者测试了通过应激和通过p53蛋白对SEQ ID NO:3的潜在调节。本发明的作者用p53激活剂Nutlin3a(10μM)以及用基因毒性化疗剂多柔比星(1μM)处理了同基因细胞系HCT116和HCT116 p53敲除。有趣的是，SEQ ID NO 3在HCT116中因基因毒性应激而被上调，但在HCT116 p53KO中的上调受损(图25)。这些结果表明，SEQ ID NO:3由应激/损伤以p53依赖性方式调节，并且从而可能在具有p53突变失活的所有癌症中被下调。因此，其肿瘤抑制活性可与p53功能相关，从而支持使用微肽作为癌症中的治疗剂。

序列表

<110> 瓦尔希伯伦私人肿瘤研究基金会(FUNDACIó PRIVADA INSTITUT

D'INVESTIGACIó ONCOLòGICA DE VALL HEBRON)

<120> 微肽及其用途

<130> PPI20026424ES

<150> EP18382173.5

<151> 2018-03-15

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 87

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Glu Gly Leu Arg Arg Gly Leu Ser Arg Trp Lys Arg Tyr His Ile

1 5 10 15

Lys Val His Leu Ala Asp Glu Ala Leu Leu Leu Pro Leu Thr Val Arg

20 25 30

Pro Arg Asp Thr Leu Ser Asp Leu Arg Ala Gln Leu Val Gly Gln Gly

35 40 45

Val Ser Ser Trp Lys Arg Ala Phe Tyr Tyr Asn Ala Arg Arg Leu Asp

50 55 60

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65 70 75 80

Leu Leu Val Ser Asp Pro Arg

85

<210> 2

<211> 64

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Met Val Arg Arg Lys Ser Met Lys Lys Pro Arg Ser Val Gly Glu Lys

1 5 10 15

Lys Val Glu Ala Lys Lys Gln Leu Pro Glu Gln Thr Val Gln Lys Pro

20 25 30

Arg Gln Glu Cys Arg Glu Ala Gly Pro Leu Phe Leu Gln Ser Arg Arg

35 40 45

Glu Thr Arg Asp Pro Glu Thr Arg Ala Thr Tyr Leu Cys Gly Glu Gly

50 55 60

<210> 3

<211> 78

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

Met Ala Ala Ser Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu

1 5 10 15

Ser Gly Leu Ala Val Arg Leu Ser Arg Ser Ala Ala Ala Arg Gly Ser

20 25 30

Tyr Gly Ala Phe Cys Lys Gly Leu Thr Arg Thr Leu Leu Thr Phe Phe

35 40 45

Asp Leu Ala Trp Arg Leu Arg Met Asn Phe Pro Tyr Phe Tyr Ile Val

50 55 60

Ala Ser Val Met Leu Asn Val Arg Leu Gln Val Arg Ile Glu

65 70 75

<210> 4

<211> 87

<212> PRT

<213> 裸鼢鼠(Heterocephalus glaber)

<400> 4

Met Glu Gly Leu Arg Arg Gly Leu Arg Arg Trp Lys Arg Phe His Ile

1 5 10 15

Lys Val His Leu Ala Asp Glu Ala Leu Leu Leu Pro Leu Thr Val Arg

20 25 30

Pro Gly Asp Thr Leu Ser Asp Val Arg Ala Gln Leu Val Gly Arg Gly

35 40 45

Val Gly Ser Trp Arg Arg Thr Phe Tyr Tyr Asn Ala Arg Ala Leu Arg

50 55 60

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65 70 75 80

Leu Leu Leu His Asp Pro Arg

85

<210> 5

<211> 87

<212> PRT

<213> 西部低地大猩猩(Gorilla gorilla gorilla)

<400> 5

Met Glu Gly Leu Arg Arg Gly Leu Ser Arg Trp Lys Arg Tyr His Ile

1 5 10 15

Lys Val His Leu Ala Asp Glu Ala Leu Leu Leu Pro Leu Thr Val Arg

20 25 30

Pro Arg Asp Thr Leu Ser Asp Leu Arg Val Gln Leu Val Gly Gln Gly

35 40 45

Val Ser Ser Trp Lys Arg Ala Phe Tyr Tyr Asn Ala Arg Arg Leu Asp

50 55 60

Asp His Gln Thr Val Arg Asp Ala Arg Leu Gln Asp Gly Ser Val Leu

65 70 75 80

Leu Leu Val Ser Asp Pro Arg

85

<210> 6

<211> 87

<212> PRT

<213> 白脸卷尾猴(Cebus capucinus imitator)

<400> 6

Met Glu Gly Leu Arg Arg Gly Leu Ser Arg Trp Lys Arg Tyr His Ile

1 5 10 15

Lys Val His Leu Ala Asp Glu Ala Leu Leu Leu Pro Leu Thr Val Arg

20 25 30

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50 55 60

Asp His Gln Thr Val Arg Asp Ala Arg Leu Gln Asp Gly Ser Val Leu

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Leu Leu Val Ser Asp Pro Arg

85

<210> 7

<211> 86

<212> PRT

<213> 黑猩猩(Pan troglodytes)

<400> 7

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1 5 10 15

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20 25 30

Pro Arg Asp Thr Leu Ser Asp Leu Arg Ala Gln Leu Val Gly Gln Gly

35 40 45

Val Ser Ser Trp Lys Arg Ala Phe Tyr Tyr Asn Ala Arg Arg Leu Asp

50 55 60

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65 70 75 80

Leu Leu Val Ser Asp Pro

85

<210> 8

<211> 86

<212> PRT

<213> 豚尾猴(Macaca nemestrina)

<400> 8

Met Glu Gly Leu Arg Arg Gly Leu Ser Arg Trp Lys Arg Tyr His Ile

1 5 10 15

Lys Val His Leu Ala Asp Glu Ala Leu Leu Leu Pro Leu Thr Val Arg

20 25 30

Pro Arg Asp Thr Leu Ser Asp Leu Arg Ala Gln Leu Val Gly Gln Gly

35 40 45

Val Ser Ser Trp Lys Arg Ala Phe Tyr Tyr Asn Ala Arg Arg Leu Asp

50 55 60

Asp His Gln Thr Val Arg Asp Ala Arg Leu Gln Asp Gly Ser Val Leu

65 70 75 80

Leu Leu Val Ser Asp Pro

85

<210> 9

<211> 87

<212> PRT

<213> 十三条纹地松鼠(Ictidomys tridecemlineatus)

<400> 9

Met Glu Gly Leu Arg Arg Gly Leu Trp Arg Trp Lys Arg Tyr His Ile

1 5 10 15

Lys Val His Leu Ala Asp Glu Ala Leu Leu Leu Pro Leu Thr Val Arg

20 25 30

Pro Arg Asp Thr Leu Ser Asp Leu Arg Ala Gln Leu Val Gly Gln Gly

35 40 45

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Leu Leu Val Ser Asp Pro Arg

85

<210> 10

<211> 87

<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 10

Met Glu Glu Leu Arg Arg Gly Leu Ser Arg Trp Lys Arg Tyr His Ile

1 5 10 15

Lys Val His Leu Ala Asp Glu Ala Leu Leu Leu Pro Leu Thr Val Arg

20 25 30

Pro Arg Asp Thr Leu Ser Asp Leu Arg Ala Gln Leu Val Gly Gln Gly

35 40 45

Val Ser Ser Trp Arg Arg Thr Phe Tyr Tyr Asn Ser Arg Pro Leu Pro

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65 70 75 80

Leu Leu Leu Ser Asp Thr Arg

85

<210> 11

<211> 87

<212> PRT

<213> 中国仓鼠(Cricetulus griseus)

<400> 11

Met Glu Gly Leu Arg Arg Gly Leu Ser Arg Trp Lys Arg Tyr His Ile

1 5 10 15

Lys Val His Leu Ala Asp Glu Ala Leu Leu Leu Pro Leu Thr Val Arg

20 25 30

Pro Arg Asp Thr Leu Ser Asp Leu Arg Ala Gln Leu Val Gly Gln Gly

35 40 45

Val Ser Ser Trp Arg Arg Thr Phe Tyr Tyr Asn Ala Arg Pro Leu Pro

50 55 60

Asp His Gln Thr Val Arg Glu Ala Arg Leu Gln Asp Gly Ser Val Leu

65 70 75 80

Leu Leu Leu Ser Asp Pro Arg

85

<210> 12

<211> 64

<212> PRT

<213> 苏门答腊猩猩(Pongo abelii)

<400> 12

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1 5 10 15

Lys Val Glu Ala Lys Lys Gln Leu Pro Glu Gln Thr Val Gln Lys Pro

20 25 30

Arg Gln Glu Cys Arg Glu Ala Gly Pro Leu Phe Leu Gln Ser Arg Arg

35 40 45

Glu Thr Arg Asp Pro Glu Thr Arg Ala Thr Tyr Leu Cys Gly Glu Gly

50 55 60

<210> 13

<211> 64

<212> PRT

<213> 小嘴狐猴(Microcebus murinus)

<400> 13

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1 5 10 15

Lys Val Glu Ala Lys Lys Gln Leu Pro Glu Gln Thr Val Gln Lys Pro

20 25 30

Arg Gln Glu Cys Arg Glu Ala Gly Pro Leu Phe Leu Arg Ser Arg Arg

35 40 45

Glu Arg Arg Asp Pro Glu Thr Arg Ala Thr Tyr Leu Cys Gly Glu Gly

50 55 60

<210> 14

<211> 64

<212> PRT

<213> 克氏冕狐猴(Propithecus coquereli)

<400> 14

Met Val Arg Arg Lys Ser Met Lys Lys Pro Arg Ser Val Gly Glu Lys

1 5 10 15

Lys Val Glu Ala Lys Lys Gln Leu Pro Glu Gln Thr Val Gln Lys Pro

20 25 30

Arg Gln Glu Cys Arg Glu Ala Gly Pro Leu Phe Leu Gln Ser Arg Arg

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<210> 15

<211> 77

<212> PRT

<213> 九带犰狳(Dasypus novemcinctus)

<400> 15

Met Ala Ala Ser Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ser

1 5 10 15

Gly Leu Val Val Arg Leu Ser Arg Ser Ala Ala Val Arg Gly Ser Tyr

20 25 30

Gly Ala Phe Cys Lys Gly Leu Thr Arg Thr Leu Leu Thr Phe Phe Asp

35 40 45

Leu Ala Trp Arg Leu Arg Met Asn Phe Pro Tyr Phe Tyr Val Val Ala

50 55 60

Ser Val Met Leu Asn Val Arg Leu Gln Val Arg Ile Glu

65 70 75

<210> 16

<211> 78

<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 16

Met Ala Val Thr Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu

1 5 10 15

Ser Gly Leu Ala Val Arg Leu Ser Arg Trp Ala Ala Thr Arg Ser Ser

20 25 30

Tyr Gly Ala Phe Cys Lys Gly Leu Thr Arg Thr Leu Leu Thr Phe Phe

35 40 45

Asp Leu Ala Trp Arg Leu Arg Val Asn Phe Pro Tyr Phe Tyr Met Val

50 55 60

Ala Ser Val Met Leu Asn Val Arg Leu Gln Val Arg Ile Glu

65 70 75

<210> 17

<211> 78

<212> PRT

<213> 野猪(Sus scrofa)

<400> 17

Met Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu

1 5 10 15

Ser Gly Leu Ala Val Arg Leu Ser Arg Ser Ala Ala Ala Arg Gly Ser

20 25 30

Tyr Ser Ala Phe Cys Lys Gly Leu Thr Arg Thr Leu Leu Thr Phe Phe

35 40 45

Asp Leu Ala Trp Arg Leu Arg Met Asn Phe Pro Tyr Val Tyr Val Leu

50 55 60

Ala Ser Val Met Leu Asn Val Arg Leu Gln Val Arg Ile Glu

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<210> 18

<211> 78

<212> PRT

<213> 穴兔(Oryctolagus cuniculus)

<400> 18

Met Ala Ala Ser Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu

1 5 10 15

Ser Gly Leu Ala Val Arg Leu Ser Arg Ser Ala Ala Ala Arg Gly Ser

20 25 30

Tyr Ser Ala Phe Cys Lys Gly Leu Thr Arg Thr Leu Leu Thr Phe Phe

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Asp Leu Ala Trp Arg Leu Arg Met Asn Phe Pro Tyr Phe Tyr Ile Val

50 55 60

Ala Ser Val Met Leu Asn Val Arg Leu Gln Val Arg Ile Glu

65 70 75

<210> 19

<211> 78

<212> PRT

<213> 黑猩猩(Pan troglodytes)

<400> 19

Met Ala Ala Ser Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu

1 5 10 15

Ser Gly Leu Ala Val Arg Leu Ser Arg Ser Ala Ala Ala Arg Gly Ser

20 25 30

Tyr Gly Ala Phe Cys Lys Gly Leu Thr Arg Thr Leu Leu Thr Phe Phe

35 40 45

Asp Leu Ala Trp Arg Leu Arg Met Asn Phe Pro Tyr Phe Tyr Ile Val

50 55 60

Ala Ser Val Met Leu Asn Val Arg Leu Gln Val Arg Ile Glu

65 70 75

<210> 20

<211> 78

<212> PRT

<213> 小嘴狐猴(Microcebus murinus)

<400> 20

Met Ala Ala Ser Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu

1 5 10 15

Ser Gly Leu Ala Val Arg Leu Ser Arg Ser Ala Ala Ala Arg Ser Ser

20 25 30

Tyr Gly Ala Phe Cys Lys Gly Leu Thr Arg Thr Leu Leu Thr Phe Phe

35 40 45

Asp Leu Ala Trp Arg Leu Arg Met Asn Phe Pro Tyr Phe Tyr Ile Val

50 55 60

Ala Ser Val Met Leu Asn Val Arg Leu Gln Val Arg Ile Glu

65 70 75

<210> 21

<211> 69

<212> PRT

<213> 豚鼠(Cavia porcellus)

<400> 21

Met Pro Ala Ala Ala Ala Leu Ser Gly Leu Ala Val Arg Leu Ser Arg

1 5 10 15

Ser Ala Ala Val Arg Gly Ser Tyr Gly Ala Phe Cys Lys Gly Leu Thr

20 25 30

Arg Thr Leu Leu Thr Phe Phe Asp Leu Ala Trp Arg Leu Arg Ser Asn

35 40 45

Phe Pro Tyr Phe Tyr Val Val Ala Ser Val Met Leu Asn Val Arg Leu

50 55 60

Gln Val Arg Ile Glu

65

<210> 22

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性接头

<400> 22

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Claims (18)

1.一种微肽，包括选自由SEQ ID NO:1、2和3或其功能等效的变体组成的组的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的微肽，其中，所述功能等效的变体具有显示与所述SEQ ID NO:1、2或3的序列至少80％同一性的序列。

3.一种抗体，所述抗体能够特异性结合至根据权利要求1和2所述的微肽。

4.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求1或2中任一项所述的微肽，条件是所述多核苷酸不是由具有对应于2017年9月10日版本的NCBI登录号NM_203306.2、对应于2017年8月29日版本的NR_027064以及对应于2017年4月23日版本的NR_040248的序列组成的多核苷酸。

5.一种表达载体，包括根据权利要求4所述的多核苷酸。

6.一种宿主细胞，包括根据权利要求4所述的多核苷酸或根据权利要求5所述的表达载体。

7.一种组合物，包括根据权利要求1或2中任一项所述的微肽、根据权利要求4所述的多核苷酸、根据权利要求5所述的表达载体或根据权利要求6所述的宿主细胞。

8.一种药物组合物，包括根据权利要求7所述的组合物和药学上可接受的载体。

9.根据权利要求1或2中任一项所述的微肽、根据权利要求4所述的多核苷酸、根据权利要求5所述的表达载体、根据权利要求6所述的宿主细胞、根据权利要求7所述的组合物或根据权利要求8所述的药物组合物用于医药的用途。

10.根据权利要求1或2中任一项所述的微肽、根据权利要求4所述的多核苷酸、根据权利要求5所述的表达载体、根据权利要求6所述的宿主细胞、根据权利要求7所述的组合物或根据权利要求8所述的药物组合物用于癌症治疗的用途。

11.根据权利要求10所述用途的微肽、多核苷酸、表达载体、宿主细胞、组合物或药物组合物，其中，所述癌症是原发性肿瘤或癌症转移。

12.根据权利要求10所述用途的微肽、多核苷酸、表达载体、宿主细胞、组合物或药物组合物，其中，所述微肽是序列SEQ ID NO:1或3的微肽，并且其中，所述癌症的特征在于其包括在p53基因的失活突变。

13.根据权利要求10所述用途的微肽、多核苷酸、表达载体、宿主细胞、组合物或药物组合物，其中，所述癌症是癌。

14.根据权利要求13所述用途的微肽、多核苷酸、表达载体、宿主细胞、组合物或药物组合物，其中，所述癌选自鳞状细胞癌、腺癌、移行细胞癌或基底细胞癌。

15.根据权利要求13或14中任一项所述用途的微肽、多核苷酸、表达载体、宿主细胞、组合物或药物组合物，其中，所述癌选自肺癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、结肠和直肠癌、皮肤癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、肝细胞癌或肾细胞癌。

16.根据权利要求1或2中任一项所述的微肽、根据权利要求4所述的多核苷酸、根据权利要求5所述的表达载体、根据权利要求6所述的宿主细胞、根据权利要求7所述的组合物或根据权利要求8所述的药物组合物用于纤维化治疗的用途，其中，所述微肽是序列SEQ IDNO:2的微肽。

17.根据权利要求16所述用途的微肽、多核苷酸、表达载体、宿主细胞、组合物或药物组合物，其中，所述纤维化与器官或组织中的功能丧失以及外科手术和/或美学并发症有关

18.根据权利要求17或18中任一项所述用途的微肽、多核苷酸、表达载体、宿主细胞、组合物或药物组合物，其中，所述纤维化选自肺纤维化、肝脏纤维化(肝硬化)、肾脏纤维化、角膜纤维化、与皮肤和腹腔手术相关的纤维化、与烧伤相关的纤维化、骨关节纤维化或瘢痕疙瘩。

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