MX2012009565A - Uso de la secuencia lider de pten largo para la liberacion de moleculas transmembrana. - Google Patents

Uso de la secuencia lider de pten largo para la liberacion de moleculas transmembrana.

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Abstract

Se proporciona una composición para liberar moléculas de carga a través de membranas biológicas que comprende (I) un péptido que comprenda residuos de aminoácidos consecutivos que tengan la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 1 para el transporte de una molécula de carga a través de una membrana biológica y (II) la molécula de carga, en la cual la molécula de carga no sea un péptido que comprenda residuos de aminoácidos que tengan la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 4. Se proporcionan también métodos de liberación de moléculas de carga a través de membranas biológicas. Se proporcionan también métodos de tratar un tumor, cáncer, un trastorno metabólico, y un trastorno cardiovascular.

Description

USO DE LA SECUENCIA LÍDER DE PTEN-LARGA PARA LIBERACIÓN DE MOLÉCULAS TRANSMEMBRANA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con composiciones para liberar moléculas de carga a través de membranas biológicas. Se relaciona también con métodos de tratamiento de tumores, cáncer, trastornos metabólicos, y trastornos cardiovasculares.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION El supresor de tumor PTEN (ver WO 98/34624, el cual es incorporado integramente a la presente como referencia) es una fosfatasa citoplásmica que desfosforila al segundo mensajero importante 3, 4, 5- trifosfato de fosfatidil inositol (Machama y Dixon, 1998) . Esta actividad subregula las muchas señales oncogénicas iniciadas por activación PIP3 de Akt que incluye las rutas anti-apoptóticas , el progreso del ciclo celular y el metabolismo celular creciente (Sulis y Parsons, 2003) . El papel de PTEN en cáncer es evidente a partir de su frecuente pérdida, ya sea genética o funcionalmente , en muchos tipos de tumores diferentes (Bonneau y Longy, 2000). Originalmente se descubrió como eliminada en cánceres gliales, desde entonces ha sido implicada en tumorigénesis de la próstata, mama, endometrio, melanocitos, riñon y pulmones. Mutaciones de linea germinal de PTEN se asociaron también con síndromes de predisposición al cáncer hereditarios, tales como Síndrome de Cowden (Eng 2003) . Modelos de ratón de pérdida de PTEN han recapitulado su papel como un supresor de tumor, tanto en el ratón heterocigótico como en nuligénicos específicos de tejido en muchos diferentes tipos de tejido (Di Cristofano, Pesce y colaboradores, 1998; Kwabi-Addo, Giri y colaboradores, 2001; Petrocelli y Slingerland 2001; You, Castrillón y colaboradores, 2002; Fraser, Zhu y colaboradores, 2004) .
La proteína PTEN contiene un dominio fosfatasa de especificidad dual N-terminal, y un dominio de enlace fosfolipídico C2 C-terminal, seguidos por una cola no estructurada de importancia reguladora a causa de los sitios de fosforilación encontrados ahí (Lee, Yang y colaboradores, 1999; Vásquez, Ramaswany y colaboradores, 2000; Torres y Pulido, 2001; Vásquez, Grossman y colaboradores, 2001) . La proteína PTEN es mayormente citoplásmica, no obstante, hay evidencia creciente de una presencia de PTEN en el núcleo, una localización que es regulada por la monoubiquitinacion de la proteína por NEDD4-1 (Baker, 2007; Wang, Trotman y colaboradores, 2007) .
La exploración del ribosoma del 5'UTR precede al inicio de translación que ocurre en el codón de inicio, AUG. Aunque los medios actuales por los cuales el ribosoma decide que el propio codón de inicio permanezca incompletamente comprendido, hay ciertas propiedades tanto del ARNm mismo como de la secuencia que dictará donde el complejo de pre-iniciación enlentecerá su exploración y comience a traducir. La clásica "secuencia de Kozac" CCACCATGG, donde ATG subrayada es el codón de iniciación, se ha mostrado que es el contexto de secuencia más favorable para iniciación (Kozac, 1991) , la estructura secundaria de ARNm también promueve la iniciación probablemente mediante un enlentecimiento actual de la exploración del complejo de pre-iniciación que requiere una helicasa para fundir estructuras secundarias antes de lectura (Kozac, 1990) .
En ciertos transcritos, el inicio de la traducción puede ocurrir desde los codones no-AUG. Usualmente, éste comprende solamente un porcentaje mínimo de la proteína total traducida desde un transcrito y el resultado es una especie mezclada de proteínas que varían en su extremo N-terminal. Kozac delineó las eficiencias de inicio de traducción desde codones no-AUG y encontró que GUG y CUG fueron ambos capaces de iniciar traducción in vitro, sin embargo, mucho menos eficientemente (Kozac, 1989) . Investigaciones adicionales han mostrado que la disponibilidad de metionina puede alterar la promiscuidad del inicio de traducción mediante un mecanismo que permanece poco claro, pero probablemente implica la fosforilación de elF2, un componente del complejo de pre-iniciación 43S, por una quinasa sensible al nutriente (Hershey, 1991; Hann, 1994).
Se ha mostrado que numerosas proteínas son traducidas desde codones de iniciación alternativos. El factor de transcripción, c-myc, tiene un codón de iniciación CUG de 3' a 5' alterno el cual fue traducido, añade 14 aminoácidos al extremo N-terminal de la proteína (Hann y Eisenman, 1984) . Esta isoforma alterna ha mostrado ser alterada selectivamente en el linfoma de Burkitt (Hann, King y colaboradores, 1988) . En cultivos de tejido la forma más larga de myc es transcrita predominantemente a altas densidades celulares cuando la metionina está a bajas concentraciones (Hann, Sloan-Brown y colaboradores, 1992) . Estudios adicionales han revelado que la forma más larga de c-myc es inhibidora de crecimiento y tiene un diferente grupo de objetivos transcripcionales que la proteína de c-myc clásica (Hann, Dixit y colaboradores, 1994), ( Florkiewickcz y Sommer, 1989= (Prats, Kaghad y colaboradores, 1989) .
Adicionalmente se sabe que la localización subcelular actual de una proteína puede ser dictada por codones de iniciación alternos. En el caso la iniciación del proto-oncogén de ratón int-2 alterno desde un codón CUG de 3' a 5' codifica en una localización nuclear mientras que el codón AUG codifica a una péptido señal por localización en la ruta secretora (Acland, Dixon y colaboradores, 1990) . Se describió un fenómeno similar en el FGF3 humano, en el cual la proteína traducida desde AUG se destinó para la ruta secretora mientras la proteína traducida desde un CUG de 3' a 5' se localizó en el núcleo (Kiefer, Acland y colaboradores, 1994) . Además, en algunas proteínas eucarióticas , tales como TEF-1 y PRPS-3, la proteína es completamente iniciada desde un codón CUG (Taira, Lizasa y colaboradores, 1990; Xiao, Davidson y colaboradores, 1991) .
Proteínas que son destinadas para secreción son dirigidas hacia el retículo endoplásmico mediante un tramo de aminoácidos hidrofóbicos denominado péptido señal (Blobel, Walter y colaboradores, 1979) . Usualmente encontrado en el extremo N-terminal de proteínas, el péptido señal enlaza a la partícula de reconocimiento de señal (SRP) en la traducción y causa que el ribosoma se detenga y trasloque al retículo endoplásmico aproximadamente donde enlaza al receptor de SRP. Una vez que el ribosoma se acopla, el complejo SRP-SRP receptor es liberado y la traducción se reanuda a través del lumen del RE a través del traslocon Sec61. El péptido señal es entonces escindida en el caso de proteínas solubles que liberan a la proteína desde el traslocon Sec. En el caso de proteínas que extienden la membrana, la hélice transmembrana sirve como una péptido señal para la traslocación de RE. Estas proteínas son extensivamente modificadas por glucosilación en el Golgi y son lanzadas a la membrana plasmática en vesículas secretoras (Alberts 2,002) .
Se ha mostrado que numerosas proteínas secretadas son importantes en cáncer. La ruta de señalización de Wnt por ejemplo, se ha mostrado que se altera en cáncer de pulmón. Wnt es un ligando secretado por la familia de receptores de Frizzled. La activación de Wnt de Frizzled causa desorden al disociarse el complejo de degradación de D-catenina, el cual incluye APC, que permite la elevación de los niveles de ?-catenina y trasloca al núcleo donde puede interactuar y transactiva al factor de transcripción TCF. Mutaciones inactivadoras en APC y mutaciones activadora en D-catenina se han detallado en ambos cánceres, de colon esporádico y hereditario. Adicionalmente , numerosos antagonistas de ligandos extracelulares tales como SFRP y Wnt-5a compiten por los mismos receptores de Frizzled como Wnt. Ambos han mostrado ser supresores de tumores; el ratón nuligénico SFRP desarrolla tumores linfoides y se han detectado en melanomas silenciadores epigenéticos de Wnt-5a.
Como se describió en la presente, la secuencia lider de una nueva proteina traducida diferencialmente , denominada PTEN-larga, es capaz de actuar como un péptido de penetración celular es similar a TAT de VIH.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN Una composición que comprende (i) un péptido que comprende los residuos de aminoácidos consecutivos 22 a 173 de la secuencia expuesta en SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos de 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, para el transporte de una molécula de carga a través de una membrana biológica y (ii)la molécula de carga, en la que la molécula de carga no es un péptido que comprende residuos de aminoácidos que tengan la secuencia expuesta en SEC ID NO: 4.
Un método para liberar una molécula de carga en una célula, que comprende poner en contacto a la célula con una composición que comprende (i) un péptido que comprende los residuos de aminoácidos consecutivos 22 a 173 de la secuencia expuesta en SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos expuestos en la SEC ID NO: 1, para el transporte de la molécula de carga a través de una membrana biológica y (ii)la molécula de carga no es un péptido que comprenda residuos de aminoácidos que tengan la secuencia expuesta en SEC ID NO: 4, bajo condiciones que permitan la entrada de la molécula de carga en la células.
Un método para tratar un tumor en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad de una composición que comprenda un péptido que comprenda los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, conjuga a una molécula de carga, en donde la molécula de carga no es un péptido que comprenda los residuos de aminoácido que tengan la secuencia expuesta en SEC ID NO: 4 en una cantidad efectiva para tratar el tumor del sujeto.
Un método para tratar cáncer en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad de una composición que comprende un péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, conjugada a una molécula de carga, en donde la molécula de carga no es un péptido que comprende los residuos de aminoácidos que tengan la secuencia expuesta en SEC ID NO: 4 en una cantidad efectiva para tratar el cáncer en el suj eto .
Un método para tratar un trastorno metabólico en un sujeto, en donde el trastorno metabólico se caracteriza por una deficiencia en una enzima metabólica, que comprende administrar al sujeto una cantidad de una composición que comprenda un péptido que comprenda los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, conjugada a la enzima metabólica en una cantidad efectiva para tratar el trastorno metabolico en el sujeto.
Un método para tratar diabetes en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad de una composición que comprende un péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, conjugada a una molécula de carga en una cantidad efectiva para tratar la diabetes en el sujeto.
Un método para tratar una enfermedad cardiovascular en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad de una composición que comprende un péptido que comprende los residuos de aminoácidos 23 a 173 de la SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, conjugada a una molécula de carga en una cantidad efectiva para tratar la enfermedad cardiovascular en el sujeto.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Diagrama de constructos PTEN-larga- .
Constructos de expresión que muestran las combinaciones creadas para activar la expresión de PTEN ya sea desde el sitio de inicio endógeno o bien desde el sitio de inicio alterno. PTEN canónica se muestra en negro, mientras la región traducida en el UTR se muestra en gris.
Figura 2. Diagrama de ARNm de PTEN de Homo sapiens. El ARNm de PTEN codifica a 173 aminoácidos (SEC ID NO: 9) en marco con y de 3' a 5' del codón de inicio ATG canónico mostrado. La traducción comienza de 3' a 5' desde el ATG canónico a un CTG en el nucleótido -519.
Figura 3. Alineación del extremo N-terminal de ortólogos de PTEN. Se alinearon las secuencias de la proteina de PTEN de las especies indicadas, usando una matriz de calificación de BLOSUM62 sobre el Vector NTI (Invitrogen) . La secuencia N-terminal extendida tanto para Homo sapiens (SEC ID NO: 15) y Mus musculus (SEC ID NO: 13) (asterisco) fueron traducidas desde ARNm publicado usando un codón de iniciación alterno CUG en -519 (H. sapiens) y -520 (M. musculus) del codón de inicio AUG canónico que usó el ORFinder (NCBI). Se obtuvieron las secuencias de ARNm de Homo sapiens (NM_000314) y de Mus musculus /NM_008960) , secuencia de Apis mellifera (SEC ID NO: 10), de Baylor College of Medicine Honey Bee Genome Project. La secuencia de proteina para PTEN de Caenorhabditis elegans (SEC ID NO: 11) (Daf. 18 ) fue descargada de Wormbase. Bos taurus (XM_613125) (SEC ID NO: 12) y Pan troglodytes (SEC ID NO: 14 ) (XP_52154 4 ) fueron descargadas de NCBI . La secuencia consenso es la SEC ID NO: 16.
Figura 4. Evidencia para la existencia de PTEN-larga A) Estudio de diferentes lineas celulares con dos diferentes anticuerpos de PTEN . MCF10A y HEK293 son de tipo salvaje para PTEN. BT549 y HCC1937 son PTEN nulo y ZR-75-1 tiene una mutación en PTEN (L136) ; B) Estudio adicional de diferentes lineas celulares con un anticuerpo monoclonal en PTEN que reconoce tanto a PTEN como PTEN-larga; C) células t ES expresan grandes cantidades de PTEN-larga. PTEN-larga es sensible a la expresión de shARM de PTEN estable en estas células y está completamente ausente en células nuligénicas de PTEN. Niveles de pAkt para la mayor parte siguieron inversamente el nivel de PTEN; D) ARNsi de PTEN causa deficiencia genética de ambas PTEN y PTEN-larga en células HEK293. E) Expresión endógena de plásmidos en la linea celular PC3 de PTEN nulo. PTENorf codifica solamente a ORF a partir del codón de inicio AUG (banda 2) . La adición de la ATR (ATR = región traducida alternativamente) es capaz de debilitar la traducción de PTEN-larga (banda 3). La mutación del sitio de inicio de 3' a 5' a ATG desplazó el complemento de proteína para ser completamente PTEN-larga y 6) . E)Un anticuerpo construido en aminoácidos codificados por el 5'ATR y usado tanto en un lisado celular a partir de HEK293 así como también en la línea celular U87 de PTEN nulo que sobre-expresa ya sea al PTENorf o bien a un plásmido que codifica al 5'ATR (ATG/ATG) . PTEN-larga puede ser visto en células que sobre-expresan solamente al 5'ATR. Está presente una banda de fondo observada en células U87 en el fondo de la tinción.
Figura 5. Predicción del péptido señal. La secuencia de 5'UTR de PTEN fue traducida e introducida en SignaIIP3.0. Se usó el modelo de Hidden Markov para péptidos de señal eucarióticos para la predicción. La región N denota la secuencia N-terminal del péptido señal cargada positivamente. La región H es el núcleo hidrofóbico del péptido señal. La región C es la región ligeramente polar marcada por una prolina, la cual usualmente rompe la helicoidal del núcleo hidrofóbico. La probabilidad de escisión es predictiva de un sitio de escisión para liberar el péptido señal, permitiendo a la proteína ser liberada en el lumen del ER. (Dalbey y Heijne, 2002) . Se predijo que la escisión ocurre en la posición 21. La secuencia mostrada es la SEC ID NO: 17.
Figura 6. Concanavalina A desplegable. Se lisaron células HEK293 y se usó concanavalina sefarosa para desplegar proteínas glucosiladas . La resolución de los eluatos fue por SDS-PAGE y se inmunotiñeron para PTEN (6H2.1). Puede observarse un enriquecimiento en el PTEN-larga en el desplegamiento versus introducción. Se observa enriquecimiento de la banda de PTEN mas largo. PTEN tiene múltiples sitios de O-glucosilación potenciales, pero solamente un sitio de N-glucosilación . Se usó la lectina concanavalina-A, la cual enlaza a porciones de azúcares. En un ensayo de desplegamiento para determinar si una porción del complemento de PTEN en células HE 293 es glucosilada. Se tuvo la capacidad de purificar una mezcla de PTEN que fue aproximadamente 50% de PTEN-larga, un vasto enriquecimiento de PTEN-larga sobre PTEN normal. Esto muestra que PTEN-larga es glucosilada y que ya sea la forma citoplásmica de 55kDa de PTEN es glucosilada o bien que PTEN-larga es escindida extracelularmente .
Figura 7. PTEN y ????-ß enlazan a heparán. Se pasó extracto de hígado de ratón a través de una columna de sefarosa de HiTrap Heparina de 1 mi (Amersham) . La columna fue lavada con 500 mM de NaCl, y se eluyó la proteína con volúmenes de columna secuenciales de NaCl 1M. Las fracciones fueron analizadas por SDS-PAGE para PTEN usando un anticuerpo monoclonal de PTEN. PTEN había mostrado previamente tener una afinidad por especies cargadas muy negativamente, una propiedad de PTEN que conduce a su preferencia del Ptdlns ( 3 , 4 , 5 ) Pt3 altamente aniónico (Das, Dixon y colaboradores, 2003) . Como el heparán es una de las moléculas biológicas cargadas más negativamente, se postuló que el heparán fue en este caso mediador del enlace de PTEN a la matriz extracelula . Usando extractos de proteina des hígados de ratón, se descubrió que PTEN enlaza a heparán con alta afinidad. Además, la elución continua de PTEN a partir de una columna de agarosa heparina usando NaCl 1M, también eluyó PTEN-larga.
Figura 8. Ensayo de Protección de Proteasa. Se resuspendieron células HEK293 en concentración creciente de Proteinasa K. Se añadió Tritón a una concentración final de 0.2% a la reacción que contenía la máxima concentración de Proteinasa K. La reacción se detuvo con PMSF y se elaboraron lisados celulares en regulador Laemmli. La resolución de los lisados se hizo pro SDS-PAGE sobre un gel de poliacrilamida al 8% y se inmunotiñeron para PTEN (6H2.1), AKT, E-caderina. La banda más grande de la inmunotinción de PTEN se designó PTEN-larga. Estos datos muestran que E-caderina y PTEN-larga están extensamente sobre la superficie celular.
Figura 9. Altas eluciones de sales de PTEN y PTEN a partir de la purificación por afinidad con heparina de medios acondicionados. PTEN y PTEN-larga puede ser eluídas desde una columna de Heparina HiTrap (Amersham) después de purificación por afinidad a partir del medio acondicionado. Ambos, un anticuerpo monoclonal para la cola de PTEN (anterior) y un anticuerpo especifico para aminoácidos traducidos en el 5'ATR reconocen una banda de proteina de aproximadamente 55 kDa de masa .
Figura 10. Purificación de PTEN a partir de suero humano. Suero humano de sangre AB se pre-clarificó de anticuerpos con proteina A/G y se sometió a heparina sefarosa. Las manchas fueron resueltas por SDS-PAGE y fueron inmunoteñidas para PTEN o con solo secundario para controlar de contaminación por cadenas pesadas.
Figura 11A. Actividad anti-angiogénica de PTEN-larga. PTEN-larga es expresada en un subgrupo de vasos y capilares en la retina en desarrollo. Este patrón de expresión está en contraste rotundo con el de la forma canónica de PTEN y es consistente con un papel para PTEN-larga en la inducción de regresión vascular que ocurre en estas regiones. Esta correlación es reforzada por la marcada sobre regulación de PTEN-larga, cuando este proceso de regresión vascular ha sido inducido por hiper-oxia como por tinción Westhern de lisados de retina entera sobre la parte superior derecha.
Figura 11B. Actividad anti-angiogénica de PTEN-larga. Y por la pérdida de PTEN-larga en células endoteliales bajo condiciones hipóxicas Figura 11C. Actividad anti-angiogénica de PTEN-Larga. Estas manifestaciones indican la utilidad de PTEN-larga como una terapia anti-angiogénica, por ejemplo en retinopatia diabética, asi como también en trastornos vasculares hiper-proliferativos . Las flechas indican tejido positivo a PTEN-larga y CD34 (vasos sanguíneos) .
Figura 12. Actividad pro-apoptótica de PTEN-Larga. Se indujo la apoptosis en células epiteliales mamarias MCF-10A que fueron tratadas con PTEN-larga por 24 horas como se indicó. La escisión de caspasa 3 fue indicadora de actividad apoptótica .
Figura 13. Tratamiento de Ratones con PTEN-Larga.
La gráfica de tamaño de tumores calibrados mediante mediciones con vernier durante 10 días de tratamiento frecuente, ya sea con PTEN-larga o bien con vector vacío de control. Células 293 fueron transíectadas con ARG/ATG PTEN-larga en el vector pcADN3.1 His V5. Se hicieron lisados citoplásmicos 48 horas después de transfección y se pasaron sobre perlas con el anticuerpo de V5 y se eluyeron con el péptido de V5. La tinción Western de los eluatos de purificación de las perlas cargadas con V5 se muestra posteriormente. La observación inicial que PTEN-larga pudiera ser usada para tratar tumores. Se establecieron los xenoinjertos usando células de glioblastoma U87 (1 millón) inyectadas en la almohadilla de grasa mamaria de un ratón scid. El tratamiento se inició aproximadamente dos semanas después de trasplante.
Figura 1 . Resultados de Tratamiento de Ratones con PTEN-larga. La gráfica muestra la fracción de ratones supervivientes (en días) tratados con control e inyecciones de PTEN-larga por 14 días.
Figura 15. Los constructos indicados para PTEN (PTENorf que carece de 5'UTR), PTEN-larga y PTEN-larga con una mutación G a R del aminoácido 305, la cual es comparable a la mutación G129R en PTENorf, fueron transíectadas en células 293. Usando proteina purificada desde estas células se mostró que PTEN-larga es una fosfatasa activa, y que el mutante G305R de PTEN-larga (la cual es G129R en PTEN) reduce la actividad fosfatasa.
Figura 16. La actividad fosfatasa es esencial para la actividad de PTEN-larga, se mostró en los experimentos con el mutante PTEN-larga (G305R) . Con base en la literatura de PTEN se sabe que las truncaciones hechas en el interior del dominio G2 desestabiliza la proteina, y con base en la estructura cristalina de PTEN se cree que interacciones entre el domino C2 y los dominios fosfatase son criticas para actividad fosfatasa. Por consiguiente el dominio mínimo para actividad de PTEN-larga en el extremo C-terminal requerirá el dominio C2 pero no la cola. En el extremo N-terminal el sitio de escisión predicho está en el aminoácido 21, y por consiguiente la región funcional de la proteína está en esta región. Con respecto a esto es importante observar que cuando tumores U87 fueron tratados en paralelo con PTEN o con PTEN-larga, no se observó ningún efecto significativo a partir del tratamiento de PTEN, solamente con el tratamiento con PTEN-larga .
Figura 17. Purificación de PTEN-larga a partir de células 293 transfectadas con ATG/ATH-PTEN-larga en el vector de expresión pcADN3.1 con marcas His y V5. Después de elución en columna de Ni+ , el eluato se resolvió en una columna de filtración sobre gel. Se muestra OD280 con línea azul. PTEN-larga es enriquecida en las fracciones 7 a 18. El producto para este experimento fue de aproximadamente 1 mg. Las flechas indican PTEN-larga y migración alterada de productos de PTEN-larga.
Figura 18A. La respuesta a la dosis de células de cáncer de próstata LNCaP a la proteína purificada de PTEN-larga usando muerte celular como una lectura de salida (la proteína fue purificada por ARVYS) . lx iguales a 0.33 microgramos por mi. Las células fueron tratadas en medio sin factores de crecimiento. Después de 24 horas, las células fueron lavadas con medio libre de suero y fueron Usadas en regulador de muestra de Laemmli. Se efectuaron las tinciones Western para las proteínas indicadas.
Figura 18B. Células de glioblastoma U87 tratadas con PTEN-larga, PTEN-larga (G305R) o un control de Mock mostraron inducción de apoptosis como se indicó por escisión de PARP y sub-regulación de señal de pAKT en serina 473. Estos datos confirman adicionalmente que PTEN-larga puede inducir apoptosis y reducir la señalización de P13K/AKT.
Figura 19A. La proteína PTEN-larga purificada con AKTA fue capaz de reducir el tamaño de tumor durante un período de 5 días, que se midieron tanto con vernier como usando un mensajero de luciferasa conjuntamente con un sistema de imagenología de animal vivo xenógeno. A los ratones se les administró ~ 0.05 mg de PTEN-larga por día por 5 días. Se establecieron los xenoinjertos con 1 millón de células de glioblastoma U87 inyectadas en la almohadilla de grasa mamaria que expresa a luciferasa debido a la infección con FUW-neo-luciferasa . Se inyectó a los ratones con luciferina intraperitoneal 10 minutos antes de imagenología con el Xenogen Imaging System. Las mediciones de luciferasa para 4 ratones antes de (pánel izquierdo) y en el quinto día de tratamiento (pánel derecho) .
Figura 19B. La proteína de PTEN-larga purificada con AKTA fue capaz de reducir el tamaño de tumor durante un período de 5 días, que se midieron tanto con vernier como usando un mensajero de luciferasa conjuntamente con un sistema de imagenología de animal vivo xenógeno. A los ratones se les administró ~ 0.05 mg de PTEN-larga por día por 5 días. Se establecieron los xenoinjertos con 1 millón de células de glioblastoma U87 inyectadas en la almohadilla de grasa mamaria que expresa a luciferasa debido a la infección con FUW-neo-luciferasa . Se inyectó a los ratones con luciferina intraperitoneal 10 minutos antes de imagenología con el Xenogen Imaging System. Mediciones con vernier en cm2 antes de y durante los 5 días de tratamiento.
Figura 19C. La proteína de PTEN-larga purificada con AKTA fue capaz de reducir el tamaño de tumor durante un período de 5 días, que se midieron tanto con vernier como usando un mensajero de luciferasa conjuntamente con un sistema de imagenología de animal vivo xenógeno. A los ratones se les administró ~ 0.05 mg de PTEN-larga por día por 5 días. Se establecieron los xenoinjertos con 1 millón de células de glioblastoma U87 inyectadas en la almohadilla de grasa mamaria que expresa a luciferasa debido a la infección con FUW-neo-luciferasa . Se inyectó a los ratones con luciferina intraperitoneal 10 minutos antes de imagenologia con el Xenogen Imaging System. Fotones detectados mediante el sistema de Xenogen como se imagenizaron en pánel . Se muestra el error estándar para cuatro ratones en cohorte. La prueba-t de Student para protones detectados desde el día cero hasta el día 5.
Figura 20. En un experimento independiente, tumores U87 se dejaron crecer en 1.5 cm2 antes de tratamiento con PTEN (orf-403 aminoácidos; n=5) , PTEN-larga (G305R; n = 5) o PTEN-larga de tipo salvaje (n = 4) . Después de 5 días de tratamiento el cambio promedio de luminiscencia mostró una disminución significativa para ratones tratados con PTEN-larga, pero ninguna disminución para las cohortes tratadas con PTEN o PTEN-larga (G305R) . La luminiscencia reducida se correlacionó con tamaño de tumor reducido. Estos datos demuestran que PTEN-larga requiere el 5'ATR y la actividad fosfatasa para funcionar.
Figura 21A. Los análisis de xenoinjertos de U87 tratados con PTEN-larga demuestran la activación de apoptosis e inhibición de la señalización de P13K. Se trataron tumores por 5 días como se hizo anteriormente. Se cosecharon tumores tratados con PTEN-larga de tipo salvaje y con G305R después de 5 días del tratamiento indicado y se Usaron para análisis Western. La proteína de tipo salvaje para PTEN-larga fue capaz de reducir la fosforilación de AKT y POXO y de activar la escisión de caspasa-3.
Figura 21B. Los análisis de xenoinjertos de U87 tratados con PTEN-larga demuestran la activación de apoptosis e inhibición de la señalización de P13K. Se trataron tumores por 5 días como se hizo anteriormente. Tumores representativos tratados por 5 días como se indicó fueron fijados en formalina e impregnados de parafina. Las secciones fueron teñidas por un anticuerpo gue detecta caspasa-3 escindida, un marcador de apoptosis. Células tratadas con PTEN-larga tuvieron un incremento significativo en porcentaje de células apoptóticas P = 0.0419, prueba t de Student.
Figura 21C. Los análisis de xenoinjertos de U87 tratados con PTEN-larga demuestran la activación de apoptosis e inhibición de la señalización de P13K. Se trataron tumores por 5 días como se hizo anteriormente. Imágenes representativas de la tinción de caspasa-3 escindida.
Figura 22A. En el mismo tumor tratado con PTEN-larga por 5 días el número de vasos sanguíneos se redujo grandemente. Se cosecharon tumores tratados con PTEN-larga de tipo salvaje y con G305R después de 5 días del tratamiento indicado y se fijaron en formalina y se impregnaron de parafina. Las secciones fueron teñidas por un anticuerpo que detecta CD31, un marcador de células epiteliales que llena los vasos sanguíneos. Células tratadas con PTEN-larga tuvieron una reducción significativa en el número de vasos por campo visual (objetivo 40x) P=0.007579, prueba-t de Student .
Figura 22B. En el mismo tumor tratado con PTEN-larga por 5 días el número de vasos sanguíneos se redujo grandemente. Se cosecharon tumores tratados con PTEN-larga de tipo salvaje y con G305R después de 5 días del tratamiento indicado y se fijaron en formalina y se impregnaron de parafina. Las secciones fueron teñidas por un anticuerpo que detecta CD31, un marcador de células epiteliales que llena los vasos sanguíneos. Imágenes representativas de la tinción con CD3.
Figura 23A. Se establecieron xenoinjertos de U87 en seis grupos (n = 3/ grupo) y fueron tratados por 4 días con PTEN-larga vía intramuscular (IM), intraperitoneal (IP), intratumoral (IT), subcutánea (SC), inyección intravenosa (IV) . El cambio promedio en el tamaño del tumor (CM2) desde el día cero al día 4 medido por vernier.
Figura 23B. Figura 23A. Se establecieron xenoinjertos de U87 en seis grupos (n = 3/ grupo) y fueron tratados por 4 días con PTEN-larga vía intramuscular (IM), intraperitoneal (IP), intratumoral (IT), subcutánea (SC), inyección intravenosa (IV) . A la derecha se muestran imágenes representativas de imagenologia de xenógeno. A partir de estos datos se puede concluir que todos los métodos de inyección tuvieron el efecto de crecimiento de tumor en comparación con los ratones no tratados, y que solamente la cohorte tratada IM mostró una cantidad significativamente decreciente de regresión.
Figura 24A. Se corrieron experimentos con xenoinjertos sobre 6 lineas celulares, de mama, cerebro, y próstata. Anteriormente están los cambios graficados en cuatro lineas celulares de cáncer de mama. (A, B, y D) .
Figura 24B. Se corrieron experimentos con xenoinjertos sobre 6 lineas celulares, de mama, cerebro, y próstata. Anteriormente están los cambios graficados en cuatro lineas celulares de cáncer de mama. (A, B, y D) . Gráficas de mediciones de las áreas superficiales de tumor (cm2) medidas por vernier durante los días de tratamiento indicados .
Figura 24C. Se corrieron experimentos con xenoinjertos sobre 6 lineas celulares, de mama, cerebro, y próstata. Anteriormente están los cambios graficados en cuatro lineas celulares de cáncer de mama. (A, B, y D) .El cambio en células HCT-1143 se observó solamente después de 24 horas de tratamiento. En las cuatro lineas celulares hay una clara reducción en el tamaño del tumor después del tratamiento .
Figura 25. PTEN-larga enlaza a células. La proteina PTEN-larga se añadió a medio con células U87 sobre hielo por 10 minutos, se fijó y luego se tiñó con el anticuerpo que la reconoce .
Figura 26. Ensayo de Miles: La inducción de permeabilidad vascular es inhibida por PTEN-larga. Esta inhibición puede ser invertida mediante pre-incubación de la proteina purificada con el anticuerpo de PTEN (6H2.1) . PTEN-larga es capaz de inhibir la inducción de permeabilidad vascular mediante VEGF. Esta inducción podía ser restaurada mediante pre-incubación de PTEN-larga con el anticuerpo construido contra PTEN, pero no por el control de IgG.
Figura 27. El marco de lectura de 576 aminoácidos (código de una sola letra) (SEC ID NO: 5) de PTEN-larga después de mutación de la leucina (L) iniciadora a metionina (M) para generar una forma traducida más eficientemente. El marco de lectura de 403 aminoácidos de PTEN descrito originalmente de PTEN inicia desde el codón subrayado.
Figura 28. La versión MSES de PTEN-larga (SEC ID NO: 6) para expresión en bacterias en las cuales los primeros 21 aminoácidos han sido removidos. El epítope marcado V5-His C-terminal (SEC ID NO: 7) fue fusionado al extremo C-terminal (cursivas) . Las series de arginina (R) y el último aminoácido de la secuencia líder de PTEN-larga de 153 aminoácidos están subrayados .
Figura 29. La tinción Western de las fracciones citoplásmica (C) y nuclear (N) indican que MSES PTEN-larga entra a ambos compartimentos de la célula. Los anticuerpos para BAF180 y tubulina fueron usados para controlar el fraccionamiento celular. Se usó el epítope V5 para medir la entrada de todas los constructos de PTEN. El anticuerpo de PTEN-larga se usó para medir la entrada de PTEN-larga y la eliminación R6.
Figura 30. Generación de PL-p53. La secuencia líder de 153 aminoácidos de MSES PTEN-larga llamada PL (subrayada) se fusionó a la secuencia de 393 aminoácidos de p53 humana (código de una sola letra) (SEC ID NO: 8) . El epítope V5 HIS marcado (cursivas) (SEC ID NO: 7) se añadió al extremo C-terminal de p53.
Figura 31A. PL-p53 entra al núcleo y suprime el crecimiento de tumor. La adición de PL-p53 al medio de células MDA-MB-468 y H1299 (1 mg/ml) provoca la captación en el núcleo.
Figura 31B. PL-p53 entra al núcleo y suprime el crecimiento de tumor. La adición de PL-p53 al medio de MDA- MB-468 y células H1299 (1 mg/ml) provoca la captación en el núcleo .
Figura 31C . La separación nuclear (N) y citoplásmica (C) fue monitoreada con anticuerpos para el factor remodelador de cromatina BAF180 y el factor citoplásmico tubulina. Para células MDA-MB468 un anticuerpo de p53 detectó el mutante endógeno de p53 en la muestra pseudo-tratada , el cual fue incrementado en la muestra tratada. Para células H1299 se observó el epítope V5 fusionado a P_L-p53 solamente en la muestra tratada. El tratamiento de células MDA-MB-468 con 0.05 mg/día por 10 días condujo a reducción significativa del crecimiento del tumor versus el control de RFP pseudo-tratado.
Figura 31D. La adición de PL-p53 a células H1299 con el tiempo mostró captación e inducción rápida de PUMA y p21 a subsecuentes puntos del tiempo.
Figura 32. La prueba de tolerancia a la glucosa en ratones tratados con MSES PTEN (long) expresado en bacterias, RFP (pseudo-control de la proteína fluorescente roja), control de IgG, y anticuerpo anti-PTEN , 138G6 que bloquea la captación en células.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Una composición que comprende (i) un péptido que comprende los residuos de aminoácidos consecutivos del 22 al 173 de la secuencia expuesta en SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, para el transporte de una molécula de carga a través de una membrana biológica y (ii) la molécula de carga, en donde la molécula de carga no es un péptido que comprende residuos de aminoácidos que tienen la secuencia expuesta en SEC ID NO: 4.
En una modalidad el péptido es fijado covalentemente a la molécula de carga. En una modalidad, el péptido es fijado covalentemente a la molécula de carga vía enlace disulfuro. En una modalidad el péptido es fijado no covalentemente a la molécula de carga.
En una modalidad la molécula de carga es un péptido, un polipéptido, una proteina, una nanoparticula , un liposoma, un fago, un vector viral, un ADN plasmidico, un ácido nucleico, un ácido nucleico peptidico, o un compuesto morfolino. En una modalidad la molécula de carga es un péptido, polipéptido o proteina y en donde el péptido para el transporte de la molécula de carga es fijado covalentemente a la molécula de carga vía un enlace peptidico. En una modalidad la molécula de carga es un ácido nucleico y es un ADN. En una modalidad la molécula de carga es un ácido nucleico y es un ARN . En una modalidad la molécula de carga es un ácido nucleico y es un ARNsi o un oligonucleótido antisentido. En una modalidad la molécula de carga es un ácido nucleico y codifica a una proteina p53 humana. En una modalidad la molécula de carga es un ácido nucleico y codifica a una proteina supresora de tumor. En una modalidad la proteina supresora de tumor es pl6. En una modalidad la proteina supresora de tumo es ARF. En una modalidad la proteina supresora de tumor es VHL. En una modalidad la proteina supresora de tumor es SMAD4. En una modalidad la proteina supresora de tumor es ARIDIA. En una modalidad la proteina supresora de tumor es BAF180. En una modalidad la proteina supresora de tumor es BRCA1. En una modalidad la proteina supresora de tumor es BRCA2. En una modalidad la proteina supresora de tumor es RB. En una modalidad la proteina supresora de tumor es LKB1. En una modalidad la molécula de cargo es una proteina y es una proteina p53 humana. En una modalidad la molécula de cargo es una proteina y es una proteina supresora de tumor. En una modalidad la proteina supresora de tumor es pl6. En una modalidad la proteina supresora de tumor es ARF. En una modalidad la proteina supresora de tumor es VHL. En una modalidad la proteina supresora de tumor es SMAD4. En una modalidad la proteina supresora de tumor es ARIDIA. En una modalidad la proteina supresora de tumor es BAF180. En una modalidad la proteina supresora de tumor es BRCA1. En una modalidad la proteina supresora de tumor es BRCA2. En una modalidad la proteina supresora de tumor es RB. En una modalidad la proteina supresora de tumor es LKB1. En una modalidad la molécula de carga es una proteina y es una enzima. En una modalidad la enzima es una enzima metabólica. En una modalidad la molécula de carga es un polipéptido o una proteina y es un antigeno. En una modalidad la molécula de carga es una toxina botulinica o un fragmento de ésta. En una modalidad la molécula de carga es BCL2 o tioredoxina.
En una modalidad la molécula de carga es un agente de diagnóstico. En una modalidad el agente de diagnóstico es un agente de contraste radio-opaco, un agente de contraste paramagnético, un agente de contraste superparamagnético, un fluoróforo, o un agente de contraste para tomografia computarizada .
En una modalidad la molécula de carga es un agente terapéutico. En una modalidad el agente terapéutico es una micromolécula activa biológicamente. En una modalidad el agente terapéutico es una molécula citotóxica o un agente quimioterapéutico o un agente radioterapéutico .
En una modalidad la molécula de carga es fijada al péptido para transporte via un enlazador polimérico. En una modalidad el enlazador polimérico es un polietilenglicol .
En una modalidad la molécula de carga es un ácido nucleico. En una modalidad la molécula de carga es una proteina y tiene un peso molecular de hasta 160 kDa.
En una modalidad el péptido que comprende residuos de aminoácidos consecutivos que tiene la secuencia expuesta en SEC ID NO: 1 para el transporte de una molécula de carga a través de una membrana biológica es derivada. En una modalidad el péptido comprende residuos de aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEC ID NO: 1.
En una modalidad la composición comprende residuos de aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEC ID NO: 8.
Un método para liberar una molécula de carga en una célula, que comprende pone en contacto a la célula con una composición que comprende (i) un péptido que comprende residuos de aminoácidos consecutivos del 22 al 173 de la secuencia expuesta en SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos expuestos en la SEC ID NO: 1, para el transporte de la molécula de carga a través de una membrana biológica y (ii) la molécula de carga, en donde la molécula de carga no es un péptido que comprende residuos de aminoácidos que tienen la secuencia expuesta en SE ID NO: 4, bajo condiciones que permiten la entrada de la molécula de carga en la célula.
En una modalidad el péptido es fijado covalentemente a la molécula de carga. En una modalidad el péptido es fijado covalentemente a la molécula de carga via un enlace peptidico. En una modalidad el péptido es fijado covalentemente a la molécula de carga via un enlace disulfuro. En una modalidad el péptido es fijado no covalentemente a la molécula de carga.
En una modalidad la molécula de carga es un péptido, un polipéptido, una proteina, una nanoparticula , un liposoma, un fago, un vector viral, un ADN plasmidico, un ácido nucleico, un ácido nucleico peptidico, o un compuesto morfolino. En una modalidad la molécula de carga es un péptido o proteina y en donde el péptido para el transporte de la molécula de carga es fijado covalentemente a la molécula de carga via un enlace peptidico. En una modalidad la molécula de carga es un ácido nucleico y es un ADN. En una modalidad la molécula de carga es un ácido nucleico y es un ARN. En una modalidad la molécula de carga es un ácido nucleico y es un ARNsi o un oligonucleótido antisentido. En una modalidad la molécula de carga es un ácido nucleico y codifica a una proteina p53 humana. En una modalidad la molécula de carga es un ácido nucleico y codifica a una proteína supresora de tumor. En una modalidad la proteina supresora de tumor es pl6. En una modalidad la proteína supresora de tumor es ARF. En una modalidad la proteína supresora de tumor es VHL. En una modalidad la proteína supresora de tumor es SMAD . En una modalidad la proteína supresora de tumor es ARIDIA. En una modalidad la proteína supresora de tumor es BAF180. En una modalidad la proteína supresora de tumor es BRCA1. En una modalidad la proteína supresora de tumor es BRCA2. En una modalidad la proteína supresora de tumor es RB. En una modalidad la proteína supresora de tumor es LKB1. En una modalidad la molécula de carga es una proteína y es una proteína p53 humana. En una modalidad la molécula de carga es una enzima. En una modalidad la enzima es una enzima metabólica. En una modalidad la molécula de carga es una proteína y es una proteína supresora de tumor. En una modalidad la proteína supresora de tumor es pl6. En una modalidad la proteína supresora de tumor es ARF. En una modalidad la proteína supresora de tumor es VLH. En una modalidad la proteína supresora de tumor es SMAD4. En una modalidad la proteína supresora de tumor es ARIDIA. En una modalidad la proteína supresora de tumor es BF180. En una modalidad la proteína supresora de tumor es BRCA1. En una modalidad la proteína supresora de tumor es BRCA2. En una modalidad la proteína supresora de tumor es RB. En una modalidad la proteína supresora de tumor es LKB1. En una modalidad la molécula de carga es un polipéptido o una proteína y es un antígeno. En una modalidad la molécula de carga es una toxina botulínica o un fragmento de ésta. En una modalidad la molécula de carga es BCL2. En una modalidad la molécula de carga es tioredoxina .
En una modalidad la molécula de carga es un agente de diagnóstico. En una modalidad el agente de diagnóstico es un agente de contraste radio-opaco, un agente de diagnóstico paramagnético, un agente de contraste superparamagnético, un fluoróforo, o un agente de contraste para tomografía computarizada .
En una modalidad la molécula de carga es un agente terapéutico. En una modalidad el agente terapéutico es una micromolécula activa biológicamente. En una modalidad el agente terapéutico es una molécula citotóxica o un agente quimioterapéutico o un agente radioterapéutico .
En una modalidad el péptido comprende residuos de aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEC ID NO: 1. En una modalidad la célula es una célula tumoral. En una modalidad la célula está en un sujeto humano.
En una modalidad la composición comprende residuos de aminoácidos que tienen la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 8.
Un método de tratar un tumor en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad de una composición que comprende un péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, conjugada a la molécula de carga, en donde la molécula de carga no es un péptido que comprende residuos de aminoácidos que tienen la secuencia expuesta en SEC ID NO: 4 en una cantidad efectiva para tratar el tumor en el sujeto.
Una composición que comprende un péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1 conjugada a una molécula de carga, para tratar un tumor en un sujeto, en donde la molécula de carga no es un péptido que comprende residuos de aminoácidos que tienen la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 4 en una cantidad efectiva para tratar el tumor en el sujeto.
En una modalidad la molécula de carga es una proteina supresora de tumor. En una modalidad la proteina supresora de tumor es p53. En una modalidad la proteina supresora de tumor es pl6. En una modalidad la proteina supresora de tumor es ARF. En una modalidad la proteina supresora de tumor es VLH. En una modalidad la proteina supresora de tumor es SMAD4. En una modalidad la proteina supresora de tumor es ARIDIA. En una modalidad la proteina supresora de tumor es BF180. En una modalidad la proteina supresora de tumor es BRCA1. En una modalidad la proteina supresora de tumor es BRCA2. En una modalidad la proteina supresora de tumor es RB. En una modalidad la proteina supresora de tumor es LKB1.
En una modalidad la proteina supresora de tumor es p53 y la composición comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia es expuesta en la SEC ID NO: 8.
En una modalidad el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, está fijado covalentemente a la molécula de carga. En una modalidad el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, está fijado covalentemente a la molécula de carga vía un enlace peptidico. En una modalidad el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, está covalentemente fijado a la molécula de cargo vía un enlace disulfuro.
En una modalidad el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, está fijado no covalentemente a la molécula de carga.
Un método para tratar cáncer en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad de una composición que comprende un péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos de la SEC ID NO: 1, conjugado a una molécula de carga, en donde la molécula de carga no es un péptido que comprende los residuos de aminoácidos que tienen la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 4 en una cantidad efectiva para tratar el cáncer en el sujeto.
Una composición que comprende un péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID N0:1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, conjugado a una molécula de carga para tratar cáncer en un sujeto, en donde la molécula de carga no es un péptido que comprende los residuos de aminoácidos que tienen la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 4 en una cantidad efectiva para tratar el tumor en el sujeto.
En una modalidad la molécula de carga es una proteina supresora de tumor. En una modalidad la proteina supresora de tumor es. p53. En una modalidad la proteina supresora de tumor es pl6. En una modalidad la proteina supresora de tumor es ARF. En una modalidad la proteina supresora de tumor es VLH. En una modalidad la proteina supresora de tumor es SMAD4. En una modalidad la proteina supresora de tumor es ARIDIA. En una modalidad la proteina supresora de tumor es BF180. En una modalidad la proteina supresora de tumor es BRCA1. En una modalidad la proteina supresora de tumor es BRCA2. En una modalidad la proteina supresora de tumor es RB. En una modalidad la proteina supresora de tumor es LKB1.
En una modalidad la proteina supresora de tumor es p53 y la composición comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia es expuesta en la SEC ID NO: 8.
En una modalidad el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, está fijado covalentemente a la molécula de carga. En una modalidad el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, está fijado covalentemente a la molécula de carga vía un enlace peptidico. En una modalidad el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, está covalentemente fijado a la molécula de carga vía un enlace disulfuro.
En una modalidad el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, está fijado no covalentemente a la molécula de carga.
Un método para tratar un trastorno metabólico en un sujeto en donde el trastorno metabólico se caracteriza por una deficiencia en una enzima metabólica, que comprende administrar al sujeto una cantidad de una composición que comprende un péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, conjugado a la enzima metabólica en una cantidad efectiva para tratar el trastorno metabólico en el sujeto.
Una composición que comprende un péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID N0:1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, conjugado a una molécula de carga para tratar un trastorno metabólico en un sujeto, en donde el trastorno metabólico en el sujeto se caracteriza por una deficiencia en la enzima metabólica.
En una modalidad el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, está fijado covalentemente a la enzima metabólica. En una modalidad el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, está fijado covalentemente a la enzima metabólica vía un enlace peptidico. En una modalidad el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, está covalentemente fijado a la enzima metabólica via un enlace disulfuro.
En una modalidad el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, está fijado no covalentemente a la enzima metabólica.
Un método para tratar un diabetes en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad de una composición que comprende un péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos de 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, conjugado a una molécula de carga en una cantidad efectiva para tratar la diabetes en el sujeto.
Una composición que comprende un péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID N0:1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, conjugado a una molécula de carga para tratar diabetes en un sujeto.
En una modalidad la molécula de carga es un péptido, una proteína, una nanopartícula, un liposoma, un fago, un vector viral, un ADN plasmídico, un ácido nucleico, un ácido nucleico peptídico, o un compuesto morfolino.
En una modalidad la molécula de carga es un péptido que comprende los residuos de aminoácidos que tienen una secuencia expuesta en la SEC ID NO: 4. En una modalidad la composición comprende aminoácidos consecutivos que se exponen en la SEC ID NO: 6.
En una modalidad la molécula de carga es una proteína y la proteína es una proteína supresora de tumor. En una modalidad la proteína supresora de tumor es p53. En una modalidad la proteína supresora de tumor es pl6. En una modalidad la proteína supresora de tumor es ARF. En una modalidad la proteína supresora de tumor es VLH . En una modalidad la proteína supresora de tumor es SMAD4. En una modalidad la proteína supresora de tumor es ARIDIA. En una modalidad la proteina supresora de tumor es BF180. En una modalidad la proteina supresora de tumor es BRCA1. En una modalidad la proteina supresora de tumor es BRCA2. En una modalidad la proteina supresora de tumor es RB. En una modalidad la proteina supresora de tumor es LKB1. En una modalidad la proteina supresora de tumor es p53 y la composición comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia es expuesta en la SEC ID NO: 8.
En una modalidad la molécula de carga es BCL2. En una modalidad la molécula de carga es tioredoxina.
En una modalidad el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, está fijado covalentemente a la molécula de carga. En una modalidad el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, está fijado covalentemente a la molécula de carga vía un enlace peptidico. En una modalidad el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, está covalentemente fijado a la molécula de cargo vía un enlace disulfuro.
En una modalidad el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, está fijado no covalentemente a la molécula de carga.
Un método para tratar una enfermedad cardiovascular en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad de una composición que comprende un péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos de la SEC ID NO: 1, conjugado a una molécula de carga, en una cantidad efectiva para tratar la enfermedad cardiovascular en el sujeto.
Una composición que comprende un péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID N0:1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, conjugado a una molécula de carga para tratar una enfermedad cardiovascular en el sujeto.
En una modalidad la molécula de carga es un péptido, un polipéptido, una proteina, una nanoparticula , un liposoma, un fago, un vector viral, un ADN plasmidico, un ácido nucleico, un ácido nucleico peptidico, o un compuesto morfolino .
En una modalidad la molécula de carga es un péptido que comprende residuos de aminoácidos que tienen la secuencia expuesta en SEC ID NO: 4. En una modalidad la composición comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia se expone en la SEC ID NO: 6.
En una modalidad la molécula de carga es una proteina y la proteina es una proteina supresora de tumor. En una modalidad la proteina supresora de tumor es p53. En una modalidad la proteina supresora de tumor es pl6. En una modalidad la proteina supresora de tumor es ARF. En una modalidad la proteina supresora de tumor es VLH . En una modalidad la proteina supresora de tumor es SMAD . En una modalidad la proteina supresora de tumor es ARIDIA. En una modalidad la proteina supresora de tumor es BF180. En una modalidad la proteina supresora de tumor es BRCA1. En una modalidad la proteina supresora de tumor es BRCA2. En una modalidad la proteina supresora de tumor es RB. En una modalidad la proteina supresora de tumor es LKB1. En una modalidad la proteina supresora de tumor es p53 y la composición comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia es expuesta en la SEC ID NO: 8.
En una modalidad la molécula de carga es BCL2. En una modalidad la molécula de carga es tioredoxina.
En una modalidad la enfermedad cardiovascular es seleccionada del grupo que consiste de arterioesclerosis, ateroesclerosis, cardiomiopatias, enfermedad arterial coronaria, enfermedad vascular periférica, insuficiencia cardíaca congestiva, infarto al miocardio, y lesión por isquemia/reperfusión. En una modalidad la enfermedad cardiovascular es arterioesclerosis .
En una modalidad, la enfermedad cardiovascular es infarto al miocardio. En una modalidad la enfermedad cardiovascular es infarto al miocardio y la composición es administrada durante el infarto al miocardio. En una modalidad la composición es administrada en una cantidad efectiva para prevenir la muerte celular.
En una modalidad el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, está fijado covalentemente a la molécula de carga. En una modalidad el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, está fijado covalentemente a la molécula de carga vía un enlace peptídico. En una modalidad el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, está covalentemente fijado a la molécula de cargo vía un enlace disulfuro.
En una modalidad el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, está fijado no covalentemente a la molécula de carga.
Un péptido "para el transporte de una molécula de carga", como se usa en la presente, es un péptido que actúa como un péptido de penetración celular, es decir un péptido que media el transporte de una molécula fijada a éste (la "molécula de carga") a través de una membrana biológica.
Una "molécula de carga" como se usa en la presente es una molécula de interés para ser transportada a través de una membrana biológica, por ejemplo, desde el espacio extracelular a un espacio intracelular, la cual está fijada covalentemente o no covalentemente a uno de los péptidos transportadores descritos en la presente. En la modalidad de la molécula de cargo que es un péptido, polipéptido o proteína, el péptido transportador puede estar fijado covalentemente mediante un enlace peptídico a la molécula de carga para así formar una proteína de fusión. El polipéptido de PTEN como se expone en la SEC ID NO: 4 está excluido específicamente de la definición de molécula de carga.
Como se usa en la presente "ARNsi" es un ARN de doble hebra (ds) , usualmente de aproximadamente 19 a 25 nucleótidos de largo, a menudo con suspensiones en 3' (2 nucleótidos) en cada extremo. Un método de fijar covalentemente el ARNsi al péptido para transporte de una molécula de carga es vía un enlace disulfuro en el extremo 5' de una hebra en el sentido de ARNsi.
Como se usa en la presente "enfermedad cardiovascular" significa un estado patológico que afecta el funcionamiento fisiológico normal de un corazón de mamífero y/o el suministro sanguíneo cardíaco y/o otros componentes vasculares que incluyen, arterieesclerosis, cardiomiopatías, enfermedad arterial coronaria, enfermedad vascular periférica, insuficiencia cardíaca congestiva, infarto al miocardio, y lesión por isquemia/reperfusión.
Un "agente quimioterapéutico", como se usa en la presente es un agente alquilante, anti-metabolito, antraciclina, alcaloide vegetal, inhibidores de topoisomerasa , o inhibidor de tirosina quinasa usando en el arte de tratar cáncer.
Un "agente radioterapéutico" , como se usa en la presente, es un radioisótopo usado en el arte de tratar el cáncer .
Una "micromolécula" , como se usa en la presente, es un compuesto orgánico de bajo peso molecular que no es un polímero y que tiene un peso molecular de menos de 1 kDa y más usualmente de menos de 800 Da.
En modalidades, el tumor es una célula cancerosa, en modalidades adicionales, el tumor canceroso es un tumor de las células gliales del sujeto, próstata, ovarios, endometrio, mama, melanocito, riñon, pulmón, colon, corazón, cuello, o páncreas.
En una modalidad, la molécula de carga es una proteina supresora de tumor. Una "proteína supresora de tumor", como se usa en la presente es una proteína, codificada por un gen supresor de tumor, la cual tiene un efecto represivo o desalentador sobre la regulación del ciclo celular o promueve la apoptosis, o algunas veces, ambos. Ejemplos no limitantes de proteínas supresoras de tumores incluyen p53, ??ß, ARF, VHL, SMAD4, ARIDIA, BAF180, BRCA1, BRCA2, RB y LKB1.
En una modalidad la molécula de carga es una proteína p53 o una p53 que codifica al ácido nucleico (p53 de la proteína tumoral TP53, Homo sapiens - Entrez Gene GeneID:7157) o un fragmento activo de ésta, o nucleótido individual, polimorfismo o fragmento de ésta.
Las secuencias peptídicas descritas en la presente para transporte de moléculas de carga son, genéricamente, péptidos de penetración celular, aungue los péptidos de penetración celular son típicamente de 30 aminoácidos o menos. La liberación de ARN (incluyendo ARNsi) en células usando un péptido de penetración celular se describe en athupala y colaboradores, Expert Opin Ther. Pat . Febrero de 2009; 19(2): 137-140, el cual se incorpora integramente a la presente como referencia. La liberación de vacunas usando un péptido de penetración celular se describe en Brook y colaboradores, Biochim Biophys Acta. Enero de 2010; 1805 ( 1 ): 25-34 , el cual se incorpora integramente a la presente como referencia. La liberación de nanoparticulas, liposomas, y otros nanoportadores se describe en Juliano y colaboradores Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol . Mayo de 2009; 1(3): 324-35, el cual se incorpora integramente a la presente como referencia. La liberación de agentes quimioterapéuticos y agentes anticancerigenos usando un péptido de penetración celular se describe en Bitter y colaboradores, Recent Pat . Anticancer Drug Discov. 2 de Diciembre de 2009, Epub, el cual es incorporado integramente a la presente como referencia.
"Tratar" un trastorno/enfermedad significará que enlentece, detiene o revierte el progreso del trastorno, y/o mejora, aminora, o elimina los síntomas del trastorno. Por consiguiente, tratar un trastorno abarca revertir el progreso del trastorno, incluyendo hasta el punto de eliminar el trastorno mismo.
En una modalidad de los métodos descritos en la presente el método es usado para liberar una cantidad efectiva profilácticamente de la molécula de carga a un sujeto. Como se usa en la presente, una cantidad "efectiva terapéuticamente" de una sustancia es una cantidad efectiva para prevenir o para retardar el principio de una condición patológica dada en un sujeto al cual la sustancia es administrada. En una modalidad de los métodos descritos en la presente el método es usado para liberar una cantidad efectiva terapéuticamente de la molécula de carga a un sujeto. Como se usa en la presente, una cantidad "efectiva terapéuticamente" de una sustancia es una cantidad efectiva para tratar, mejorar o aminorar un síntoma o causa de una condición patológica dada en un sujeto que sufre de ésta, a dicho sujeto se le ha administrado la sustancia.
En una modalidad, la cantidad efectiva terapéutica o profilácticamente es desde aproximadamente 1 mg de agente/sujeto a aproximadamente 1 g de agente/sujeto por dosificación. En otra modalidad, la cantidad efectiva profiláctica o terapéuticamente es desde aproximadamente 10 mg de agente/sujeto a 500 mg de agente/sujeto. En una modalidad adicional, la cantidad efectiva terapéutica o profilácticamente es desde aproximadamente 50 mg de agente/sujeto a 200 mg de agente/sujeto. En una modalidad adicional, la cantidad efectiva terapéutica o profilácticamente es aproximadamente de 100 mg de agente/sujeto. En aún una modalidad adicional la cantidad efectiva terapéutica o profilácticamente es seleccionada desde 50 mg de agente/su eto, 100 mg de agente/sujeto, 150 mg de agente/sujeto, 200 mg de agente/sujeto, 250 mg de agente/sujeto, 300 mg de agente/sujeto, 400 mg de agente/sujeto, y 500 mg de agente/su eto.
En una modalidad de los métodos descritos en la presente la composición que comprende el péptido y la molécula de carga es administrada a un sujeto usando cualquiera de los varios métodos y sistemas de liberación conocidos por los expertos en el arte. La administración puede ser, por ejemplo, intravenosa, oral, nasal, intraperitoneal, vía el fluido cefalorraquídeo, vía implante, transmucósica, transdérmica , intramuscular, intravascular, intra-arterial , intracoronaria, intramiocardíacá o subcutánea .
En una modalidad de los métodos descritos en la presente la composición es administrada al sujeto por introducción directa en el tumor. En una modalidad de los métodos descritos en la presente la composición es inyectada en tumor sólido. En una modalidad de los métodos descritos en la presente, la composición es directamente introducida en el tumor mediante un catéter. En una modalidad de los métodos descritos en la presente la composición es administrada al sujeto por introducción directa en un vaso sanguíneo que suministra al tumor. En una modalidad de los métodos descritos en la presente la composición es inyectada en los vasos sanguíneos que suministran al tumor. En una modalidad de los métodos descritos en la presente la composición es introducida directamente mediante un catéter en los vasos sanguíneos que suministran al tumor. En una modalidad de los métodos descritos en la presente, la composición es administrada al sujeto intravenosamente. En una modalidad de los métodos descritos en la presente la composición es administrada al sujeto subcutáneamente.
El término PTEN se refiere al polipéptido definido por la SEC ID NO: 4.
PTEN-larga algunas veces ha sido mencionado de otra manera como PTEN-beta, ????-ß, PTEN-S.
Sistemas de liberación de fármacos inyectables para las composiciones descritas en la presente, incluyen soluciones, suspensiones, geles, microesferas e inyectables poliméricos, y pueden comprender excipientes tales como agentes que alteran la solubilidad (por ejemplo, etanol, propilenglicol y sacarosa) y polímeros (por ejemplo, policaprilactonas y PLGA' a). Sistemas implantables incluyen barras y discos, y pueden contener excipientes como los ejemplos no limitantes PLGA y policaprilactona .
Sistemas orales para las composiciones de la invención incluyen tabletas y cápsulas. Éstas pueden contener excipientes como aglutinantes (por . ejemplo, hidroxipropilmetil celulosa, polivinil pirrolidona, otros materiales celulósicos y almidón) , diluyentes (por ejemplo, lactosa y otros azúcares, almidón, fosfato dicálcico y materiales celulósicos), agentes desintegrantes (por ejemplo, polímeros de almidón y materiales celulósicos) y agentes lubricantes (por ejemplo, estearatos y talco).
Sistemas de liberación transmucósica para las composiciones de la invención incluyen parches, tabletas, supositorios, pesarios, geles y cremas, y pueden contener excipientes como solubilizantes y mejoradores (por ejemplo, propilenglicol , sales biliares y aminoácidos), y otros vehículos (por ejemplo, polietilenglicol , ásteres de ácidos grasos y derivados, y polímeros hidrofílicos como hidroxipropilmetil celulosa y ácido hialurónico) .
Sistemas de liberación dérmica para las composiciones de la invención incluyen, por ejemplo, geles acuosos y no acuosos, cremas, múltiples emulsiones, microemulsiones, liposomas, ungüentos, soluciones acuosas y no acuosas, lociones, aerosoles, hidrocarburos bases y polvos, y pueden contener excipientes como solubilizantes, mejoradores de la permeación (por ejemplo ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, alcoholes grasos y aminoácidos) , y polímeros hidrofilicos (por ejemplo, policarbofil y polivinil pirrolidona) . En una modalidad, el portador aceptable farmacéuticamente es un liposoma o un mejorador transdérmico .
Soluciones, suspensiones y polvos para sistemas de liberación reconstituibles para las composiciones de la invención incluyen vehículos como agentes de suspensión (por ejemplo, gomas, goma de xantana, celulósicas y azúcares), humectantes (por ejemplo, sorbitol), solubilizantes (por ejemplo, etanol, agua. PEG y propilenglicol) , tensoctivos (por ejemplo, lauril sulfato de sodio, Spans, Tweens, y cetil piridina) , conservadores y antioxidantes (por ejemplo, parabenos, vitamina E y C, y ácido ascórbico) , agentes antiformación de tortas, agentes recubridores y agentes secuestrantes (por ejemplo, EDTA) .
Como se usa en la presente, "5'ATR" es la región traducida alternativamente 5' como se describe en la sección experimental posterior.
En una modalidad, la composición descrita en la presente comprende adicionalmente un portador farmacéutico. Como se usa en la presente un "portador farmacéutico" es un solvente, agente de suspensión o vehículo aceptable farmacéuticamente para liberar las composiciones de la presente al humano o animal. El portador puede ser líquido, aerosol, gel o sólido y es seleccionado con la manera de administración planeada en mente.
En una modalidad de los métodos descritos en la presente la célula es una célula tumoral la cual es una célula tumoral sólida. "Tumor sólidos" como se usa en la presente incluye tumores sólidos cancerosos y no cancerosos. Tumores sólidos cancerosos incluyen, sin limitación, cáncer del tracto biliar, cáncer encefálico, incluyendo glioblastomas y méduloblastomas , cáncer de mama, cáncer cervical, coriocarcinomas ; cáncer de colon; cáncer endométrico; cáncer esofágico; cáncer gástrico; neoplasma intraepitelial , incluyendo la enfermedad de Bowen y la enfermedad de Paget; cáncer hepático; cáncer pulmonar; linfomas, incluyendo la enfermedad de Hodgkin y linfomas linfociticos ; neuroblastomas ; cáncer oral, incluyendo carcinoma de células escamosas; cáncer ovárico, incluyendo aquellos que se originan de células epiteliales, células estromales, células madres y células mesenquimales; cáncer de páncreas; cáncer de próstata; cáncer colon rectal; sarcomas, incluyendo leiomiosarcoma , rabdomiosarcoma , liposarcoma, fibrosarcoma y osteosarcoma ; cáncer cutáneo, incluyendo melanoma, sarcoma de Kaposi, cáncer basocelular y de células escamosas, cáncer testicular, incluyendo tumores germinales (seminoma, no seminoma [teratomas, coriocarcinomas]), tumores estromales y tumores de células madre; cáncer de tiroides, incluyendo adenocarcinoma de tiroides y carcinoma medular; y cáncer renal incluyendo adenocarcinoma y tumor de Wilms, pero excluye tumores de tejidos no sólidos como leucemias y otros neoplasmas hematológicos, incluyendo leucemia mielogenosa y linfocitica aguda; mieloma múltiple; leucemias asociadas con SIDA y linfoma de leucemia de células T.
La SEC ID NO: 1 de el listado de secuencias es la secuencia líder y secuencia de señal (residuos 1 a 21) de la proteína PTEN-larga.
La SEC ID NO: 2 del listado de secuencias es un análogo de la secuencia líder y secuencia de señal (residuos 1 a 21) de la proteína PTEN-larga. En cualquiera de las modalidades de los métodos y composiciones descritos en la presente, la SEC ID NO: 2 puede ser usada en lugar de la SEC ID NO: 1, donde se cite la SEC ID NO: 1.
La SEC ID NO: 3 es un epítope sobre PTEN-larga.
La SEC ID NO: 4 es el polipéptido de PTEN (es decir no PTEN-larga) .
La SEC ID NO: 6 es el MSES PTEN-larga.
La SEC ID NO: 8 es una proteína de fusión de PTEN-larga-p53. En cualquiera de las modalidades de los métodos y composiciones descritos en la presente, los aminoácidos 1 a 53 de la SEC ID NO: 8 pueden ser usados en lugar de la SEC ID NO: 1 donde sea citada la SEC ID NO: 1.
En una modalidad de cualquiera de los métodos anteriormente descritos el péptido que comprende los aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o una porción de la SEC ID NO: 1, es un péptido que comprende una porción de los aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1 la cual retiene la habilidad para transportar una molécula de carga a través de una membrana biológica.
Donde se da un intervalo en la especificación, se entiende que el intervalo incluye todos los enteros y 0.1 unidades en ese intervalo, y cualquier sub-intervalo de éste. Por ejemplo, un intervalo de 77 a 90% incluye 77.0%, 77.1%, 77.2%, 77.3%, 77.4%, 77.5%, 77.6%, 77.7%, 77.8%, 77.9%, 80.0%, 80.1%, 80.2%, 80.3%, 80.4%, 80.5%, 80.6%, 80.7%, 80.8%, 80.9%, y 90.0% asi como también el intervalo de 80.0 %a 81.5%, etc.
Todas las combinaciones de los varios elementos descritos en la presente están en el alcance de la invención.
Esta invención será mejor comprendida von referencia a Detalles Experimentales que siguen, pero los expertos en el arte fácilmente apreciaran que los experimentos específicos detallados son solamente ilustrativos de la invención como se describe más profundamente en las reivindicaciones que siguen posteriormente .
Detalles Experimentales Primera Serie de Experimentos El supresor de tumor PTEN es uno de los genes alterados más comúnmente en cáncer. Funciona como una fosfatasa lipidica de 3, 4, 5- trifosfato de fosfatidil inositol el cual a su vez suprime la señalización oncogénica a partir de fosfatidil inositol 3-quinasa (PI3K) y Akt . La inspección de ARNm de PTEN reveló que la región sin traducir 5' (UTR) está en marco con el marco de lectura abierto (ORF) de PTEN para 770 pb . En este ORF de UTR, hay un codón de inicio CUG alterno en una secuencia de Kozac débil a 513 pares de bases en la dirección de 3' a 5' del codón de inicio AUG canónico. Aunque la expresión de ORF de PTEN canónico genera una proteina que migra a aproximadamente 55 kDa, la expresión de ADNc de PTEN que contiene el 5' UTR es capaz de generar una segunda proteina de 70 kDa denominada PTEN-larga. La mutación d los sitios de inicio indicó que la PTEN de 55 kDa es generada a partir de la traducción en codón de inicio canónico aunque PTEN-larga es iniciada desde el sitio de inicio alterno de 3' a 5' . La inmunotinción con diferentes anticuerpos de PTEN demostró la presencia endógena de PTEN-larga en múltiples lineas celulares. Los estudios en células ES de ratones nuligénicos y agotados confirmaron que esta proteina más grande fue realmente PTEN. La secuencia de la proteina N-terminal añadida codificó a una péptido señal y a un sitio de escisión, indicando que PTEN-larga entra a la ruta secretora. PTEN-larga enlaza preferentemente a la lectina concanvalina A, demostrando que es glucosilada Además, PTEN-larga puede ser purificada a partir de medio acondicionado por purificación por afinidad usando tanto un anticuerpo en PTEN asi como también sulfato de heparina. PTEN-larga también es sensible a la degradación en un ensayo de protección de proteasa in vivo mientras PTEN normal no lo es, lo que indica que PTEN-larga se localiza sobre el exterior de la membrana celular.
Reactivos, líneas celulares y anticuerpos - La proteinasa K y la concavalina A fueron adquiridas de Sigma (Sta. Louis, MO) . Las columnas de heparina sefarosa y HiTrap Heparina HP fueron adquiridas de Amersham (Piscataway, NJ) . Los anticuerpos para PTEN fueron adquiridos de Cell Signaling (Danvers MA) y Cascade (Winchester MA) . El anticuerpo de Akt fue obtenido de Cell Signaling (Danvers, MA) y el anticuerpo de E caderina de Upstate Millipore (Billerica, MA) . Un anticuerpo monoclonal purificado por afinidad se construyó contra el epitope PRHQQLLPSLSSFFFSHRLPD (SEC ID NO: 3), encontrado en la nueva traducción de PTEN, fue efectuado por Zymed Laboratories (South San Francisco, CA) . Los anticuerpos secundarios fueron adquiridos de Pierce (Rockford, IL) . Células HEK293, ZR-75-1, SKBR-3, MDAMB-361, BT549, y PC3 fueron obtenidas de ATCC (Manassas, VA) y se desarrollaron de conformidad con las guias suministradas.
Plásmidos y Constructos - pCEP4-PTEN, que codifica al marco de lectura abierto total de PTEN y regiones 5' sin traducir fueron generados como se reportó previamente por clonación de ADNc de PTEN (depositado en NCBI como U90351) en el sitio Notl de pCEP4 (Invitrogen) (Li, Simpson y colaboradores, 1998) . El 5'UTR se extendió adicionalmente sobre este plásmido por ligado de un adaptador que codifica de 3' a 5' la secuencia del sitio de restricción Notl original usado para clonación. El adaptador codificado hasta 10 pares de bases d 3' a 5' del primer codón de inicio CTG alterno posible localizado en -513 del sitio de inicio canónico. Un adaptador en el cual el sitio de inicio alterno putativo fue mutado a ATG, fue también usado para crear un segundo grupo de constructos de expresión en el cual la forma larga seria expresada efectivamente. Además, se efectuó la mutagénesis del codón de inició canónico en ATA, produciendo en total 4 diferentes constructos (Figura 5.1.) . Estas 4 variaciones, asi como también el marco de lectura abierto del PTEN original también fueron subclonadas en el vector de retrovirus MSCV (Clontech, Mountainview, CA) por infección vía expresión estable.
Ensayo de Protección de Proteasa - Se colectaron células HEK293 en PBS helado sin tripsina y alícuotas de 5 x 105 células fueron incubadas por 30 minutos con concentraciones crecientes de Proteinasa K, desde 0.5 pg/ml a 10 µ?/p??. Se incluyó un Tritón al 0.1% para verificarla habilidad de Proteinasa K para degradar las proteínas indicadas. La reacción fue detenida con 5 mM de PMSF. Las células fueron lisadas en regulador de muestra Laemmli 2x (125 nM de Tris pH 6.8, glicerol al 20%, azul de bromofenol al 0.05%, SDS al 4%, 2-mercaptoetanol al 10%) y se inmunotiñeron para PTEN, Akt y E. cadehina .
Purificación de PTEN procedente de hígados de ratón - Hígados de ratones C57BL6 fueron desmenuzados congelados en nitrógeno líquido, se pulverizaron y suspendieron en regulador TNN (50 mM de Tris, pH 7.4, 150 mM de NaCl, NP-40 al 0.5%, 5 mM de EDTA, glicerol al 3%, 1 mM de DTT. Inhibidores del Coctel de Proteasa de Mamíferos lx [Sigma] . La suspensión fue homogeneizada con un mortero y centrifugada a 40,000 RPM a 4 grados por 1 hora. El sobrenadante fue filtrado sucesivamente con filtros de 0.45 micrones y 0.22 micrones. Una columna de exclusión de sefacril malla 200 (Amersham) fue pre-equilibrada con TNN y se aplicó la muestra a una velocidad de 0.3 ml/hr, seguida por regulador, se colectaron fracciones de 2 mi y las muestras de bajo peso molecular fueron conjuntadas y aplicadas a una columna pre-equilibrada de HiTrap Heparin HP (Amersham) . La columna fue lavada con tres volúmenes de columna de TNN y la proteína fue eluida gradualmente con 3x volúmenes de columna de soluciones de NaCl TNN 0.3 M, 0.5 M y 1 M. Las fracciones se colectaron en incrementos de 0.5 mi y se inmunotiñeron para PTEN.
Purificación de PTEN con heparina a partir del medio - Células HEK 293 fueron desarrolladas hasta confluencia en PBS al 10% en DMEM en placas de 15 cm. Las células fueron incubadas toda la noche con 15 mi de DMEM sin PBS Se colectó el medio de 20 placas y se filtró a través de un filtro de 0.45 micrones . Una columna de heparina de 1 mi fue equilibrada con DMEM usando AktaPrime (AmershamBioscience) usando un flujo de 4 ml/min a 4°C. Luego se pasó el medio acondicionado a través de la columna a 1 ml/min. La columna fue lavada con 10 volúmenes de BC200 (200 mM de NaCl, 50 mM de MT Tris, pH . 7.4, 1 mM de EDTA, Tritón X-100 al 0.2%), Las proteínas fueron eluidas con 5 mi de NaCl 1M a 1 ml/min en fracciones de 1 mi. La concentración de cada fracción de proteína se determinó por OD a 280 nm. Se precipitaron las mitades de cada fracción con ácido t ricloroacét ico al 20%, se lavaron con acetona fría y se secaron al vacío. La proteína fue reconstituida en 20 µ? de regulador de lisis de Laemmli y fue inmunoteñida usando un anticuerpo para PTEN y PTEN-larga.
Purificación de PTEN a partir de Suero - Se obtuvo suero humano a partir de plasma AB de Sigma. Se filtró 1 mi de suero a través de un filtro de 0.45 micrones y se preclarificaron de anticuerpos usando Proteína A/G Agarosa durante 1 hora de incubación. La heparina/agarosa fue incubada con el suero preclarificado toda la noche junto con un control de sefarosa y se lavó al día siguiente con BC150 (150 mM de NaCl, 25 mM de Tris, pH 7.4, NP-40 al 1%, Desoxicolato de sodio al 0.25%, 1 mM de EDTA) . Las proteínas fueron eluidas con regulador de muestra de Laemmli y se inmunotiñeron para PTEN o productos secundarios solamente por contaminación de cadena pesada.
Degradación de Concanavalina A - Se lisaron células HEK293 a subconfluencia con BC500 (500 mM de NaCl, 20 mM de Tris, pH 7.4, Tritón X-100 al 1%, 1 mM de MnCl2, 1 mM de CaCl2, lx del Coctel Inhibidor de Proteasa) . El lisado celular fue centrifugado y filtrado. Se efectuaron las degradaciones con 20 microlitros de concanavalina A sefarosa (Sigma) por 1 hora a 4°C. La resina fue lavada con BC500 y la proteína fue eluida con regulador de muestra de Laemmli.
Resultados AR!toi de PTEN tiene un sitio de inicio de iniciación alterna de 3' a 5' ARNm de PTEN depositado en NCBI (Li y Sun, 1997; Steck, Pershouse y colaboradores, 1997) contiene un 5'UTR extensivo. Aproximadamente 770 pb de secuencias contiguas en la región 5'UTR están en marco con el codón de inicio. No se codificaron metioninas en esta región; no obstante, hay varios codones CUG de iniciación alterna que comienzan en -519 a partir del codón de inicio canónico. La traducción de esta secuencia reveló dominios no identificables de acuerdo con el sitio de exploración (scansite.mit.edu) y Prosite (www. ebi . ac . uk/ppsearch) . La traducción de esta región entera añadirla 173 aminoácidos a PTEN incrementando su masa molecular a aproximadamente 70 kiloDaltones (Figura 2) .
La alineación de otros ortólogos de PTEN reveló que la secuencia traducida del ÜTR de Homo sapiens puede encontrarse en los marcos de lectura abiertos de PTEN de varias especies. Pan troglodytes , Box Taurus, Apis mellifera y Caenorhabditis elegans contienen todas la secuencia homologa de la proteina en el producto traducido de la 5'UTR de Homo sapiens (Figura 3). Además, la alineación de la 5'UTR de Homo sapiens y 5'UTR de PTEN de Mus musculus mostró homología extensiva de nucleótidos (no mostrada). La 5'UTR de Mus musculus fue traducida en marco con el codón de iniciación canónico 522 pares de bases y reveló una secuencia de proteina altamente homologa en comparación con la traducción de la 5'UTR de Homo sapiens (Figura 5.3). La homología de la 5'UTR y la presencia actual de la secuencia de aminoácidos derivada de la 5'UTR de Homo sapiens en las proteínas traducidas de otras especies es indicadora de la importancia evolutiva de esta secuencia.
ARNm de PTEN puede iniciar traducción a partir de un sitio de 3' a 5' alterno. La sobre-expresión del ORF de PTEN generó una sola banda de proteína a 55 kDa . La inclusión de 5'UTR dio como resultado una segunda banda de proteína más grande de aproximadamente 70 kDa. Una banda de proteína más grande en PTEN inmunoteñido estuvo también presente en numerosas líneas celulares endógenamente y fue detectable mediante diferentes anticuerpos monoclonales (Figura 4). Esta banda de proteína más grande estuvo también presente en células ES de ratón de tipo salvaje y estuvo ausente en células ES de ratones nuligénicos de PTEN y disminuyó en clones de ES de ratón que expresan establemente un shARN de PTEN (Figura 4). El agotamiento de la proteína PTEN de humano en células HEK293 usando ARNsi también causó un agotamiento de la proteína de 70 kDa.
La expresión de un plásmido que codifica al ORF de PTEN en la línea celular nullPC3 de PTEN dio como resultado la generación de una proteina de 55 kDa . Cuando los plásmidos que también codificaron ala 5'UTR fueron sobre-expresados, se produjo una proteina de 70 kDa. La mutación del codón de iniciación putativo de 3' a 5' de CTG a ATG (Figura 1, "ATG/ATG") predominantemente desplazó el patrón de inmunotinción a la forma de 70 kDa (Figura 4) . La banda de 55 kDa también fue confirmada como originaria del codón de inicio ATG por mutagénesis (Figura 4, "CTG/ATA" ) .
Por consiguiente, la 5'UTR fue suficiente para iniciar la traducción de una forma más larga de PTEN . Por consiguiente, la 5'UTR fue denominada 5'ATR para la Región Traducida Alternativamente y la proteina más grande detectada fue denominada "PTEN-larga".
Se generó un anticuerpo policlonal purificado por afinidad contra aminoácidos traducidos desde la 5'UTR y se usó para confirmar la producción de PTEN-larga recombinante en estudios de sobre-expresión así como también la forma endógena en células HEK293 (Figura 4). A partir de la inmunotinción del lisado celular entero de células HEK293 y de estudios de sobre-expresión en células PC3, aparecieron múltiples formas de PTEN-larga, indicando ya sea modificaciones post-traduccionales potenciales, formas de empalme no documentadas o aún codones de iniciación alterna en la 5'UTR.
PTEn-larga codifica a un péptido señal N-terminal La secuencia N-terminal de PTEN-larga contiene una expansión larga de alaninas que pudieran ser indicadoras ya sea de una secuencia transmembrana o bien de una péptido señal. El análisis de la secuencia traducida usando SignalIP 3.0 predijo con un alto grado de probabilidad (> 95%) que la secuencia contiene una péptido señal (Figura 5) . Una péptido señal comprende característicamente aminoácidos básicos seguidos por una expansión hidrofóbica. La helicoidal transmembrana hidrofóbica putativa es rota por una prolina y seguida por una secuencia algo polar. Se predijo también que la secuencia sería escindida, indicando que la proteína pudiera liberarse en el lumen de la ER.
Una de las características distintivas de proteínas extracelulares y secretadas es la adición de porciones de azúcar complejas en el aparato de Golgi, un proceso conocido como glucosilación . Los azúcares pueden ser añadidos a asparaginas en la secuencia consenso N-X-S/T (X no puede ser prolina) vía glucosilación de N (Gupta y Brunak 2002); los grupos hidroxilo de serinas, treoninas y tirosinas también pueden ser el objetivo de lo que se ha denominado 0-glucosilación (Julenius, Molgaard y colaboradores, 2005). PTEN tiene múltiples sitios de O-glucosilación, pero solamente un sitio de N-glucosilación. La lectina concanavalina A, la cual enlaza a porciones azúcares, se usó para un ensayo de degradación para determinar si una porción del complemento de PTEN en células HEK293 fueron glucosiladas . Una mezcla de PTEN que fue aproximadamente de 50% PTEN-larga (Figura 5) fue purificada a partir de estas células. Esto muestra que PTEN-larga es glucosilada y que ya sea la forma citoplásmica de 55 kDa de PTEn es glucosilada o bien que PTEN-larga es escindida extracelularmente .
PTEN-larga enlaza a heparán y se encontró sobre la superficie celular PTEN enlazó a numerosos proteoglicanos como sindecanos y glipicanos, los cuales se encontraron fijados a la laminilla de la membrana. Estos proteoglicanos son dos de las molécula extracelulares más heparanadas (Biero y Zhang y colaboradores, 2005) . Se ha mostrado previamente que PTEN tiene alta afinidad por especies cargadas muy negativamente, una propiedad de PTEN que conduce a su preferencia de la PIP3 muy aniónica (Das, Dixon y colaboradores 2003) . Como el heparán es una de las moléculas biológicas cargada más negativamente, fue posible que el heparán pudiera mediar el enlace de PTEN a la matriz extracelular . Usando extractos proteinicos de hígados de ratón, se descubrió que PTEN enlazó a heparán con alta afinidad. Además, la elución continua de PTEN desde una columna de heparina agarosa usando NaCl 1M también eluyó PTEN-larga (Figura 7).
PTEN-larga adherida a la superficie externa de la membrana celular, se sensibilizaría a la degradación de proteasa. En el ensayo de protección de proteasa, se incubaron células vivas con una proteasa y solamente se degradaron las proteínas extracelulares ya que la membrana lipídica es impermeable a la proteasa y sirve para proteger a todas las proteínas intracelulares. Se removieron las células HEK293 del cultivo adherente mediante ligera agitación con PBS y se suspendieron con concentraciones crecientes de Proteinasa K. Se detuvo la reacción con P SF y se lisaron las células con regulador de Laemmli. PTEN-larga presentó sensibilidad al tratamiento con Proteinasa K junto con E-cadehina, la cual es una proteína extracelular conocida (Figura 8). Por otro lado, PTEN mostró modesta sensibilidad a proteasa, lo cual indica que alguna porción de la especie de 55 kDa es también extracelular (según lo es la glucosilada) o alguna lisis celular tuvo lugar durante el ensayo que expuso PTEN citoplásmica a Proteinasa K. Se incluyó un control con el permeabilizante de membrana Tritón para probar que PTEN podía ser degradada si se expone a Proteinasa K. Está por verse si esto es propio de PTEN o una forma escindida de PTEN-larga que migra a 55 kDa y retiene al epítope C-terminal del anticuerpo de PTEN. Estos datos indican que PTEN-larga está sobre la superficie celular.
PTEN-larga soluble es secretada en medio La presencia de PTEN-larga sobre la superficie celular no excluye la posibilidad de que una porción de la proteina sea soluble y liberada en el ámbito celular. Se uso heparina sefarosa para purificar por afinidad a PTEN-larga a partir de medio libre de suero acondicionado sobre células HEK293. La elución de la columna reveló la presencia de PTEN en el medio migrando a un peso molecular de 50 kDa (Figura 9) . Una inmunotinción con el anticuerpo especifico para PTEN-larga reveló la misma especie de 50 kDa, indicando que esta proteina retiene la secuencia traducida del el sitio de inicio alterno y la secuencia del epitope C-terminal del anticuerpo monoclonal de PTEN. Esto implica fuertemente que la porción de PTEN que se observó que es de 55 kDa es de hecho producto de traducción escindida originaria del codón de inicio de 3' a 5' . Estas células se usaron para producir medio acondicionado libre de suero toda la noche y el anticuerpo monoclonal de PTEN 6H2.1 fue usado para inmunoprecipitar PTEN desde 1 mi de medio. La banda más grande de PTEN fue precipitada exitosamente desde medio junto con la banda menor de 55 kDa. Porque la proteina fue sobre-expresada, probablemente no tuvo lugar el procesamiento propio de la proteína lo cual dio como resultado la secreción de PTEN de 70 kDa de tamaño total.
PTEN se encontró en suero humano Una de las mejores fuentes de material secretado fisiológicamente es el suero. Se usó heparina sefarosa para purificar por afinidad PTEN a partir de suero humano. El suero humano fue centrifugado y filtrado para remover el material en partículas. Luego se diluyó 1:5 en BC150 y se preclarificó extensivamente con Proteína A/G para remover IgG. El suero fue incubado discontinuamente con una pequeña cantidad de heparina sefarosa. La heparina sefarosa fue eluida con regulador de Laemmli y el eluato fue teñido para PTEN y para anticuerpos secundarios solamente, solo para descartar contaminación de cadenas pesadas. Se encontró que ambas PTEN y PTEN-larga estuvieron en suero humano (Figura 10) .
Actividad Anti-Angiogénica de PTEN-larga Se mostró el papel anti-angiogénico de PTEN-larga mediante lo siguiente: (1) PTEN-larga normalmente es expresada débilmente en la retina en desarrollo del ratón pero se observa alto nivel de expresión en vasos sanguíneos que sufren involución/muere celular durante el desarrollo neonatal (Figura 11); (2) se encontró PTEN-larga en vasos sanguíneos apoptóticos en tumores. Además, células epiteliales tratadas con PTEN-larga purificadas parcialmente con células transfectadas inhibieron la migración celular e indujeron apoptosis. (Figura 12). PTEN-larga purificada puede también inducir muerte celular asociada con la activación de apoptosis en células U87, endoteliales HUVEC, o células 293 en cultivo, cuando se mide por escisión de caspasa-3.
Actividad Anti-Angiogénica y Anti-Tamor In vivo de PTEN-larga La Figura 13 muestra el tratamiento de ratones con PTEN-larga (A) Se inyectaron ratones (n = 5) con la linea celular U87 de glioblastoma para formar xenoinjertos en 2 sitios (izquierda y derecha en almohadillas de grasa mamaria. Después de los injertos de tumor, se inyectó directamente un tumor con PTEN-larga y el tumor contralateral no fue inyectado (w/PTEN-larga ) . También fue inyectado un grupo control de 5 ratones (Vector vacio) con una preparación de proteina purificada imitada derivada de células transfectadas con vector vacio. De nuevo El tumor contralateral no fue inyectado (w/Vector Vacio) . Los ratones fueron tratados en los dias 1 a 11 y en los días 13 a 14. Se midió el diámetro máximo (cm) con vernier en los dias indicados. Los ratones fueron sacrificados cuando el volumen de tumor fue > 1 cm (B) Se preparó proteina por transfeccion del vector de PTEN-larga en células 293 y se purificó parcialmente usando la resina de afinidad V5 seguido por elución con el péptido de V5. La Figura 14 muestra la fracción de ratones supervivientes (en días) tratados con inyecciones control de PTEN-larga por 14 dias .
Tinción Retiniana Las tinciones para PTEN-larga y vasos sanguíneos en la retina de murina p7 revelaron que PTEN-larga tiñó selectivamente los vasos haloideos los cuales comenzaron a regresar a este punto en el desarrollo vascular retiniano. El anticuerpo de PTEN-larga fue directamente contra el epítope: N-PRHQQLLPSI.PD-C (SEC ID NO: 3). La tinción de los vasos fue con BSl-lectina Pur ficación En un método para purificación de PTEN-larga, células 293 fueron transfectadas con PTEN-larga ATG /ATG y los lisados celulares fueron pasados sobre una columna de afinidad de Ni+. PTEN-larga fue purificada consistentemente usando una columna de Ni+ sobre el Purificador AKTA usando regulador de elución con imidazol.
Regresión del Tumor Xenoinjertos de células U87 transíectadas antes de inyección ya sea con PTEN (orf de 403 aminoácidos) o PTEN-larga. En el séptimo día post-inyección hubo una reducción en los vasos sanguíneos mamarios en la cohorte que sobre-expresó a PTEN-larga en comparación con la cohorte que sobre-expresó a PTEN (n = 4 de 4). Esto sugiere que PTEN-larga puede afectar el entorno del tumor.
Liberación trazis-membrana por la secuencia líder de PTEN-larga Las Figuras 18 y 21 muestran la habilidad de PTEN-larga, pero no de PTEN, de reducir la fosforilación de AKT intracelular cuando se aplica a células intactas.
Ejemplos Un péptido de molécula de carga es fijado covalentemente vía un enlace peptídico a un segundo péptido que comprende residuos de aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia expuesta en los residuos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1. Se pone en contacto una membrana celular con esta composición, el péptido de la molécula de carga es transportado a través de la membrana celular y liberada adentro de la célula.
Una proteína de molécula de carga es fijada covalentemente vía un enlace peptídico a un péptido que comprende residuos de aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia expuesta en los residuos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1. Se pone en contacto una membrana celular con esta composición, la proteína de la molécula de carga es transportada a través de la membrana celular y liberada adentro de la célula. La proteína de la molécula de carga puede ser p53 humana, o un fragmento activo o variable activa de ésta.
Un péptido de molécula de carga es fijado covalentemente a un ácido nucleico que comprende residuos de aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia expuesta en los residuos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1. Se pone en contacto la membrana celular con esta composición, el ácido nucleico de la molécula de carga es transportado a través de la membrana celular y liberado adentro de la célula. El ácido nucleico puede ser fijado covalentemente al péptido vía un enlace disulfuro. El ácido nucleico puede ser un ARNsi.
La traducción de esta secuencia ya existió en numerosos ortólogos de PTEN en su secuencia codificadora actual. En 5'UTR de ratón fue también inesperado porque se había observado un enlace similar en Usados de tejido de ratón. La secuencia de nucleótidos de 5'UTR de ratón fue altamente homologa a la 5'UTR de Homo sapiens y de manera similar en marco con el codón de inicio. Existen dos codones de inicio alternos potenciales en -522 y -516 y la traducción de esta secuencia desde estos sitios revela 90% de aminoácidos homólogos a la secuencia de Homo sapiens. La conservación de esta proteína putativa es notable y demostró una importancia evolutiva esta secuencia. A fin de describir mejor esta secuencia se re-denominó la 5'ATR o región de traducción alternativamente de PTEN-larga para describir su potencial para traducción.
Se construyó un plásmido en el cual el marco de lectura abierto de PTEN fue clonado junto con la 5'ATR y la expresión de este PTEN recombinante se compró con el marco de lectura abierto que produce 403 aminoácidos canónicos solo. La inclusión de 5'ATR generó una segunda banda de proteina de PTEN superior que migró a aproximadamente 70 kDa en comparación con los plásmidos de expresión que contienen solo el ORF canónico de PTEN, el cual creó una sola banda que migra a 55 kDa. La proteina más grande representó solamente una porción mínima de la proteína traducida total; no obstante, la mutación del sitio de inicio putativo en ATG desplazó la proporción de proteína predominantemente a la forma más grande.
La conservación de la secuencia de la proteína desde 5'ATR indicó que hubo más de un artefacto de evolución. El extremo N-terminal contuvo una expansión de aminoácidos alifáticos que se predijo que sería una secuencia transmembrana. El uso de Prosite y de 3.01P predijo que el extremo N-terminal de PTEN-larga sería un péptido señal con un sitio de escisión de proteasa directamente después de él.
Se usó un ensayo de protección de proteasa in vivo para probar si PTEN-larga se localizó sobre la superficie celular de las células. PTEN-larga mostró degradación progresiva con cantidades crecientes de proteasa extracelular , mientras que PTEN no lo hizo, lo que indica que al menos algo de PTEN-larga es extracelular y al menos en parte se fijó ala laminilla exterior de la membrana celular. Este es un resultado muy intrigante dada la implicación de una fosfatasa lipidica activa sobre la laminilla exterior de la membrana celular. Dos familias de proteoglicanos enlazados a membranas externas, glipicanos y sindecanos, fueron identificados previamente en un complejo proteinico de PTEN.
La presencia de PTEN sobre la superficie celular no excluye la posibilidad de un PTEN secretado soluble. Los sindecanos y glipicanos son dos de los proteoglicanos más pesadamente heparanados . El heparán es un glicoaminoglicano cargado muy negativamente y se ha mostrado que PTEN tiene una afinidad por aniones, lo que explica en parte la selección de PIP3 cargado muy negativamente como su sustrato. Experimentos de optimización de purificación de PTEN a partir de hígado de ratón revelaron que ambas PTEN y PTEN-larga podían ser purificados usando una columna de heparán sefarosa. Además, se purificó una proteína de aproximadamente 50 kDa, a partir de medio libre de suero acondicionado sobre células HEK293, usando una columna de heparina sefarosa. La proteína purificada fue reconocida por un anticuerpo monoclonal especifico contra PTEN y un anticuerpo monoclonal contra aminoácidos únicos presentes en PTEN-larga. Previamente el anticuerpo de PTEN-larga solamente reconoció una banda de proteina alrededor de 70 kDa . La observación de que ambos anticuerpos podían reconocer la banda indica que probablemente tiene lugar el procesamiento proteolítico y que la proteína observada por inmunotinción es un fragmento de PTEN que retuvo los epítopes de ambos anticuerpos. Tanto PTEN como PTEN-larga podían también ser purificadas a partir de suero humano usando la purificación por afinidad con heparina. Un cuerpo de literatura durante los últimos 10 años ha acumulado que asume la secuencia de PTEN. En la presente se prueba la existencia de una nueva forma de PTEN, que es traducida desde un sitio alterno y es secretada tanto en la laminilla exterior como en los espacios extracelulares .
Los resultados in vivo mostraron que PTEN-larga es un nuevo compuesto anti-tumor que normalmente está presente en suero humano y que tiene propiedades anti-angiogénicas y pro-apoptóticas .
Segunda Serie de Experimentos Generación de MSES-PTEN-larga Para el propósito de purificación en E. coli se alteró el marco de lectura abierto de PTEN-larga al eliminar los primeros 21 aminoácidos para remover la secuencia del péptido señal eucariótico, la cual fue denominada la versión MSES basada en sus primeros aminoácidos (Figura 28) . Esta proteina, la cual tiene 153 aminoácidos de la única región traducida alternativamente a PTEN-larga y los 403 aminoácidos compartidos entre PTEN-larga y PTEN fue introducida en E. coli usando un vector de expresión inducible con IPTG y purificado a partir de extractos usando columnas de afinidad de níquel y heparina. Para el propósito de examinar la importancia de las seis repeticiones de arginina para la entrada celular, esta secuencia fue eliminada en el marco (R6) y la proteína fue purificada como se indicó anteriormente .
PTEN-larga entra a las células PSES PTEN-larga de tipo salvaje purificada o la proteína mutante R6 fue añadida al medio de células humanas MDA-MB-168 desarrolladas en cultivo a una concentración de 1 microgramo/ml . Bajo condiciones idénticas paralelas, las células fueron también tratadas con PTEN de 403 aminoácidos original carente de la región traducida alternativamente o de un pseudo-tratamiento preparado a partir de células que expresan solamente a la proteína de RFP. Las células fueron incubadas a 37°C por 30 minutos antes de aislamiento de células para fraccionamiento celular. Se aislaron las fracciones citoplásmica y nuclear. La efectividad del fraccionamiento se midió mediante tinción Western con tubulina y BAF180 para controlar respectivamente las fracciones citoplásmica y nuclear. Solamente con PTEN-larga de tipo salvaje se introdujeron las células y estuvieron presentes en el citoplasma y núcleo. De manera importante ni PTEN ni PTEN-larga eliminadas para R6 fueron capaces de entrar a la célula. Estos datos indican que se requirió la secuencia R6 para entrar eficientemente a la célula y que no son los 21 aminoácidos iniciales.
Generación de la Proteína de fusión PTEN-larga-p53 Los estudios anteriores sugirieron que los primeros 153 aminoácidos del constructo en la Figura 2 podían ser usados para liberar otra secuencia de proteína en una célula. Para responder a esta pregunta los 153 aminoácidos iniciales del constructo MSES PTEN-larga, la cual es llamada PL (por Pten Long Leader) , fueron fusionados a los 393 aminoácidos de p53 humana para generar una proteína de fusión PL-p53 (Figura 30) . Un epítope marcado V5-His fue fusionado al extremo C-terminal para uso para propósitos de purificación y detección .
PL-p53 entra a células, activa la supresión genética y suprime el crecimiento de tumor La proteína de fusión PL-p53 fue inducida en E. coli usando IPTG y fue purificada a partir de Usados bacterianos usando columnas de afinidad de níquel y heparina. La proteína PL-p53 fue incubada con células humanas de cáncer MDA-MB-468 o H1299 por 1 hora antes de colectar las células para fraccionamiento para determinar si la proteína de fusión podía entrar a las células. Podía detectarse p53 creciente en el núcleo de células H1299 tratadas pero no en el de las psuedotratadas y en células MDA-MB-468 y se asoció con un incremento en la expresión de PUMA y p21, ambos objetivos del factor de transcripción de p53 (Figura 31) . El tratamiento diario de xenoinjertos de MDA-MB-468 condujo a la reducción en el volumen de tumor durante un período de 10 días pero los tumores del control pseudotratado preparados a partir de E. coli que expresa RFP (proteína rojo fluorescente) no se reduj eron .
Prueba de tolerancia, a la glucosa en ratones con tratados con MSES-PTE-Larga expresada en bacterias Los ratones fueron tratados con MSES PTEN-larga (Larga) expresada en bacterias, RFP control imitado de proteína rojo fluorescente), control con IgG, y anticuerpo anti-PTEN 138G6 que bloquea la captación en las células. PTEN-larga redujo el nivel de glucosa versus otros tratamientos, mientras el anticuerpo anti-PTEN 138G6 incrementó la glucosa en relación al control con IgG (Figura 32). Estos datos demuestran que PTEN-larga puede reducir la glucosa sanguínea. Los ratones fueron inyectados IP antes tratamiento con glucosa.

Claims (114)

  1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. - Una composición caracterizada porque comprende (i) un péptido que comprende los residuos de aminoácidos consecutivos 22 a 173 de la secuencia expuesta en SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, para el transporte de una molécula de carga a través de una membrana biológica y (ii) la molécula de carga, en donde la molécula de carga no es un péptido que comprende los residuos de aminoácidos que tienen la secuencia expuesta en SEC ID NO: 4. 2. - La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el péptido es fijado covalentemente a la molécula de carga. 3. - La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el péptido es fijado covalentemente a la molécula de carga vía un enlace disulfuro . 4. - La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el péptido es fijado no covalentemente a la molécula de carga. 5. - La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de carga es un péptido, un polipéptido, una proteina, una nanoparticula, un liposoma, un vector viral, ADN plasmidico, un ácido nucleico, un ácido nucleico peptidico, o un compuesto morfolino. 6. - La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la molécula de carga es un péptido, polipéptido o proteina y en donde el péptido para el transporte de la molécula de carga es fijado covalentemente a la molécula de carga vía un enlace peptidico . 7. - La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la molécula de carga es un ácido nucleico y es un ADN. 8. - La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la molécula de carga es un ácido nucleico y es un ARN . 9. -La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la molécula de carga es un ácido nucleico y es un ARNsi o un oligonucleótido antisentido . 10.- La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la molécula de carga es un ácido nucleico y codifica a la proteina p53 humana. I I .-La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la molécula de carga es una proteina y es una proteina p53 humana. 12. - La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la molécula de carga es un ácido nucleico y codifica a una proteina supresora de tumor . 13. -La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la proteina supresora de tumor es seleccionada del grupo que consiste de pl6, ARF, VHL, SMAD4, ARIDIA, BAF180, BRCA1, BRCA2 , RB y LKB1. 14. - La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la molécula de carga es una proteina y es una proteina supresora de tumor. 15. - La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la proteina supresora de tumor es seleccionada del grupo que consiste de pl6, ARF, VHL, SMAD4, ARIDIA, BAF180, BRCA1, BRCA2, RB y LKB1. 16. - La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la molécula de carga es una proteina y es una enzima. 17. -El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la enzima es una enzima metabólica. 18. - La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la molécula de carga es un polipéptido o una proteina y es un antigeno. 19. - La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de carga es una toxina botulinica o un fragmento de ésta. 20. - La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de carga es un agente de diagnóstico. 21. - La composición de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque el agente de diagnóstico es un agente de contraste radio-opaco, un agente de contraste paramagnético, un agente de contraste superparamagnético, un fluoróforo, o un agente de contraste para tomografia computarizada. 22. - La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de carga es un agente terapéutico. 23. - La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el agente terapéutico es una micromolécula activa biológicamente. 24. - La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el agente terapéutico es una molécula citotóxica o un agente quimioterapéutico o un agente radioterapéutico . 25. - La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de carga es fijada al péptido para transporte via un enlazador polimérico . 26.- La composición de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque el enlazador polimérico es polietilenglicol . 27. - La composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la molécula de carga es un ácido nucleico. 28. - La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la molécula de carga es una proteina y tiene un peso molecular de hasta 160 kDa. 29. - La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el péptido que comprende residuos de aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEC ID NO: 1 para el transporte de una molécula de carga, a través de una membrana biológica, es derivatizado . 30. - La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el péptido comprende residuos de aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEC ID NO: 1. 31. -Un método para liberar una molécula de carga adentro de una célula, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con una composición que comprende (i) un péptido que comprende los residuos de aminoácidos consecutivos 22 a 173 de la secuencia expuesta en SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos expuestos en SEC ID NO: 1, para el transporte de la molécula de carga a través de una membrana biológica y (ii) la molécula de carga, en donde la molécula de carga no es un péptido que comprende residuos de aminoácidos que tienen la secuencia expuesta en SEC ID NO: 4, bajo condiciones que permiten la entrada de la molécula de carga en la célula. 32. -El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el péptido es fijado covalentemente a la molécula de carga. 33. - El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el péptido es fijado covalentemente a la molécula de carga vía un enlace peptidico. 34. - El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el péptido es fijado covalentemente a la molécula de carga vía un enlace disulfuro. 35. - El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el péptido es fijado no covalentemente a la molécula de carga. 36. - El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la molécula de carga es un péptido, un polipéptido, una proteina, una nanoparticula , un liposoma, un fago, un vector viral, ADN plasmidico, un ácido nucleico, un ácido nucleico peptidico, o un compuesto morfolino. 37. - El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la molécula de carga es un péptido, polipéptido o proteina y en donde el péptido para el transporte de la molécula de carga es fijado covalentemente a la molécula de carga vía un enlace peptidico. 38. - El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la molécula de carga es un ácido nucleico y es un ADN. 39. - El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la molécula de carga es un ácido nucleico y es un AR . 40.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la molécula de carga es un ácido nucleico y es un ARNsi o un oligonucleótido antisentido. 41. - El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la molécula de carga es un ácido nucleico y codifica a la proteina p53 humana. 42. -El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la molécula de carga es una proteina y es una proteina p53 humana. 43. - El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la molécula de carga es un ácido nucleico y codifica a una proteina supresora de tumor. 44. - El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la proteina supresora de tumor es seleccionada del grupo que consiste de pl6, ARF, VHL, SMAD4, ARIDIA, BAF180, BRCA1, BRCA2, RB y LKB1. 45.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la molécula de carga es una proteína y es una proteína supresora de tumor. 46.- El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la proteína supresora de tumor es seleccionada del grupo que consiste de pl6, ARF, VHL, S AD4, ARIDIA, BAF180, BRCA1, BRCA2, RB y LKB1. 47. - El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la molécula de carga es una proteina y es una enzima. 48. - El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la enzima es una enzima metabólica. 49. - El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la molécula de carga es un polipéptido o una proteina y es un antigeno. 50. - El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la molécula de carga es una toxina botulinica o un fragmento de ésta. 51. - El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la molécula de carga es un agente de diagnóstico . 52. - El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque el agente de diagnóstico e un agente de contraste radio-opaco, un agente de contraste paramagnético, un agente de contraste superparamagnético, un fluoróforo, o un agente de contraste para tomografia computarizada . 53. - El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la molécula de carga es un agente terapéutico . 54. - El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el agente terapéutico es una micromolécula activa biológicamente. 55. - El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque el agente terapéutico es una molécula citotóxica o un agente quimioterapéutico o un agente radioterapéutico . 56. -El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el péptido comprende residuos de aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia expuesta en SEC ID N0:1. 57. - El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la célula es una célula tumoral. 58. - El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque la célula está en un sujeto humano. 59. - UN método para tratar un tumor en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad de una composición que comprende un péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, conjugados a una molécula de carga, en donde la molécula de carga no es un péptido que comprende residuos de aminoácidos que tienen la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 4 en una cantidad efectiva para tratar el tumor en el sujeto. 60. - El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque la molécula de carga es una proteina supresora de tumor. 61. - El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque la proteina supresora de tumor es seleccionada del grupo que consiste de p53, pl6, ARF, VHL, SMAD4, ARIDIA, BAF180, BRCA1 , BRCA2, RB y LKB1 62. - El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque la proteina supresora de tumor es p53. 63. - El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque la composición comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia se expone en la SEC ID NO: 8. 64. -el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 59 a 63, caracterizado porque el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o porción de residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1, es fijado covalentemente a la molécula de carga. 65. - El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1, o porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1, es fijado covalentemente a la molécula de carga vía un enlace peptidico . 66. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 59 a 63, caracterizado porque el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1, o porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1 es fijado covalentemente a la molécula de carga vía un enlace disulfuro. 67. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 59 a 63, caracterizado porque el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1, o porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1 es fijado no covalentemente a la molécula de carga. 68. -Un método para tratar cáncer en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad de una composición que comprende un péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, conjugado a una molécula de carga, en donde la molécula de carga no es un péptido que comprende los residuos de aminoácidos que tienen las secuencias expuestas en la SEC ID NO: 4 en una cantidad efectiva para tratar el cáncer en el sujeto. 69. -El método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque la molécula de carga es una proteina supresora de tumor. 70. - El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque la proteina supresora de tumor es seleccionada del grupo que consiste de p53, pl6, ARF, VHL, SMAD4, ARIDIA, BAF180, BRCA1, BRCA2 , RB y LKB1 71. - El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque la proteina supresora de tumor es p53. 72. - El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque la composición comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia se expone en la SEC ID NO: 8. 73. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 69 a 72, caracterizado porque el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o porción de residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1, es fijado covalentemente a la molécula de carga. 74. - El método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1, o porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1, es fijado covalentemente a la molécula de carga vía un enlace peptidico . 75. - El método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1, o porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1 es fijado covalentemente a la molécula de carga via un enlace disulfuro . 76.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 69 a 72, caracterizado porque el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1, o porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1 es fijado no covalentemente a la molécula de carga. 77. - Un método para tratar un trastorno metabólico donde el trastorno metabólico se caracteriza por una deficiencia en una enzima metabólica caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad de una composición que comprende un péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, conjugado a la enzima metabólica, en una cantidad efectiva para tratar el trastorno metabólico en el sujeto. 78. -El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1 es fijado covalentemente a la enzima metabólica. 79. - El método de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1, o porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1, es fijado covalentemente a la enzima metabólica via un enlace peptidico . 80. - El método de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1, o porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1 es fijado covalentemente a la enzima metabólica via un enlace disulfuro . 81. - El método de conformidad la reivindicación 78, caracterizado porque el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1, o porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1 es fijado no covalentemente a la enzima metabólica. 82. - Un método para tratar diabetes en un sujeto caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad de una composición que comprende un péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, conjugado a una molécula de carga, en una cantidad efectiva para tratar la diabetes en el sujeto. 83. - El método de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado porque la molécula de carga es un péptido, un polipéptido, una proteína, una nanopartícula, un liposoma, un fago, un vector viral, ADN plasmídico, un ácido nucleico, un ácido nucleico peptídico, o un compuesto morfolino. 84. -El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque la molécula de carga es un péptido que comprende residuos de aminoácidos que tienen la secuencia expuesta en SEC ID NO: 4. 85. -El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque la composición comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia es expuesta en la SEC ID NO: 6. 86. - El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque la molécula de carga es una proteina y la proteína es una proteína supresora de tumor. 87. - El método de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado porque la proteína supresora de tumor es seleccionada del grupo que consiste de p53, pl6, ARF, VHL, SMAD4, ARIDIA, BAF180, BRCA1, BRCA2, RB y LKB1 88. - El método de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque la proteína supresora de tumor es p53. 89. - El método de conformidad con la reivindicación 88, caracterizado porque la composición comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia se expone en la SEC ID NO: 8. 90. -El método de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado porque la molécula de carga es BCL2. 91. - El método de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado porque la molécula de carga es tioredoxina. 92. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 82 a 91, caracterizado porque el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o porción de residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1, es fijado covalentemente a la molécula de carga. 93. - El método de conformidad con la reivindicación 92, caracterizado porque el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1, o porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1, es fijado covalentemente a la molécula de carga vía un enlace peptidico . 94. - El método de conformidad con la reivindicación 92, caracterizado porque el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1, o porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1 es fijado covalentemente a la molécula de carga via un enlace disulfuro . 95. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 82 a 89, caracterizado porque el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1, o porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1 es fijado no covalentemente a la molécula de carga. 96. - Un método para tratar una enfermedad cardiovascular en un sujeto caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad de una composición que comprende un péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o una porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, conjugado a una molécula de carga, en una cantidad efectiva para tratar la enfermedad cardiovascular en el sujeto. 97. - El método de conformidad con la reivindicación 96, caracterizado porque la molécula de carga es un péptido, un polipéptido, una proteina, una nanoparticula, un liposoma, un fago, un vector viral, ADN plasmidico, un ácido nucleico, un ácido nucleico peptidico, o un compuesto morfolino. 98. -El método de conformidad con la reivindicación 97, caracterizado porque la molécula de carga es un péptido que comprende residuos de aminoácidos que tienen la secuencia expuesta en SEC ID NO: 4. 99. - El método de conformidad con la reivindicación 98, caracterizado porque la composición comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia es expuesta en la SEC ID NO: 6. 100. - El método de conformidad con la reivindicación 97, caracterizado porque la molécula de carga es una proteina y la proteína es una proteina supresora de tumor. 101. - El método de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque la proteína supresora de tumor es seleccionada del grupo que consiste de p53, pl6, ARF, VHL, SMAD4, ARIDIA, BAF180, BRCA1 , BRCA2 , RB y LKB1 102. - El método de conformidad con la reivindicación 101, caracterizado porque la proteína supresora de tumor es p53. 103. - El método de conformidad con la reivindicación 102, caracterizado porque la composición comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia se expone en la SEC ID NO: 8. 104. - El método de conformidad con la reivindicación 96, caracterizado porque la molécula de carga es BCL2. 105. - El método de conformidad con la reivindicación 96, caracterizado porque la molécula de carga es tioredoxina. 106. - El método de conformidad con la reivindicación 96, caracterizado porque la enfermedad cardiovascular es seleccionada del grupo que consiste de arterioesclerosis, ateroesclerosis, cardiomiopatías, enfermedad de la arteria coronaria, enfermedades vasculares periféricas, insuficiencia cardiaca congestiva, infarto al miocardio, y lesión por isquemia/reperfusión. 107. -El método de conformidad con la reivindicación 106, caracterizado porque la enfermedad cardiovascular es ateroesclerosis. 108. -El método de conformidad con la reivindicación 106, caracterizado porque la enfermedad cardiovascular es infarto al miocardio. 109. -El método de conformidad con la reivindicación 106, caracterizado porque la composición es administrada durante el infarto al miocardio. 110. -El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque la composición es administrada en una cantidad efectiva para prevenir muerte celular. 111. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 96 a 110, caracterizado porque el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de la SEC ID NO: 1, o porción de residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1, es fijado covalentemente a la molécula de carga . 112. - El método de conformidad con la reivindicación 111, caracterizado porque el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1, o porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1, es fijado covalentemente a la molécula de carga via un enlace peptidico. 113.- El método de conformidad con la reivindicación 111, caracterizado porque el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1, o porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1 es fijado covalentemente a la molécula de carga via un enlace disulfuro. 114.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 96 a 110, caracterizado porque el péptido que comprende los residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1, o porción de los residuos de aminoácidos 22 a 173 de SEC ID NO: 1 es fijado no covalentemente a la molécula de carga.
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