CN112877309B

CN112877309B - 一种N端延长型PTEN亚型PTENζ蛋白及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN112877309B
Application number: CN202110191547.4A
Authority: CN
Inventors: 尹玉新; 梁会; 汪菡
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2021-02-19
Filing date: 2021-02-19
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2041-02-19
Also published as: CN112877309A

Abstract

本发明提供了一种N端延长型PTEN亚型PTENζ蛋白及其编码基因和应用，属于功能蛋白技术领域。本发明提供的PTEN亚型是在PTEN蛋白基础上在N端连接有一段28aa的多肽，该多肽为一段高尔基定位信号肽段。PTENζ蛋白的翻译起始于5’‑UTR区域的一个非经典的AUG翻译起始位点‑ATT⁹⁴⁸，该位点下游的回文结构对翻译起始有重要作用。由ATT⁹⁴⁸起始翻译得到431个氨基酸序列的蛋白命名为PTENζ。PTENζ主要分布在高尔基体和细胞膜。本发明利用CRISPR‑Cas9特异性敲除Hela细胞中PTENζ，利用RUSH系统证实PTENζ特异性敲除导致内质网向高尔基体的囊泡运输时显著提高转运速度。

Description

一种N端延长型PTEN亚型PTENζ蛋白及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于功能蛋白技术领域，具体涉及一种N端延长型PTEN亚型PTENζ蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

真核生物体内的蛋白质翻译起始受到精密的调节。目前公认的机制为由真核翻译起动因子(eIF,eukaryotic initiation factor)、GTP和Met-tRNAiMet形成三元复合物，再与核糖体40S亚基结合，同时Met-tRNAiMet的反密码子CAU与40S亚基上mRNA的起始密码子ATG互补配对，形成40S起动复合体进而60S亚基再与之结合，eIF随后脱落，形成80S起动复合体，从而起动蛋白质翻译(贾弘褆,2005)。虽然ATG一直被认为是真核生物中唯一的翻译起始点，然而随着研究的不断深入，发现真核生物中除ATG作为主要的起始密码子外，还有其他某些密码子同样也可起始翻译，并在机体生理和病理过程中发挥着重要的作用。例如，Kozak曾探究其他非ATG密码子的启动翻译效率，发现在Kozak序列下GTG起动翻译效率最高，但也只有ATG效率的3～5％(Kozak,1989)，Hann等在研究c-myc促癌机制过程中发现，在公认起始密码子ATG上游存在一个位于同一阅读框内的CTG，同样可以起始翻译从而翻译出比之前发现的c-myc2蛋白更大的c-myc1蛋白，这一发现在鸟类和小鼠模型中得到验证(Hann,1992)。随后在酵母、植物细胞以及人免疫细胞中都发现非ATG的起始密码子的存在(RIECHMANN J.L.,1999；Starck,2012)。

目前，发现的非ATG起始密码子均为与ATG相差仅一个碱基的密码子，如CTG、ATT、TTG、ACG、ATA、ATC等(Chia-Pei Chang,2010)。单三联体的非ATG起始密码子均比ATG的翻译起始能力低，如前所述，在Kozak序列中GTG的翻译起始能力最高，但也只有ATG效率的3％～5％(Kozak,1989)。酵母的ALA1基因由ACG起始翻译(Tang HL,2004)，将此ACG更换为其他起始密码子后发现，TTG、CTG、ACG和ATT具有ATG相应翻译起始能力的50％左右，而GTG、ATA和ATC则仅有ATG相应翻译起始能力的20％左右。然而在由TTG起始翻译的酵母GRS1基因中进行类似实验时，发现GTG的起始翻译效率在非ATG中最高，而ATA几乎完全丧失翻译起始能力(Chia-Pei Chang,2010)。上述结果表明这些非ATG起始密码子的翻译起始效率不仅与密码子序列相关，同时也受到周围碱基序列的影响，与ATG类似，均有各自的最适序列。

在真核生物中，多种非ATG翻译起始密码子的存在使得真核生物中一条mRNA不再只编码一条蛋白，而是可以选择不同的翻译起始点合成出不同的蛋白，同时不同翻译起始点的翻译效率受到周围序列以及外部环境的影响，这说明翻译起始的选择是基因表达调控的一个重要环节，可能参与了细胞内多种生理和病理过程。例如酵母GCN4基因的调节主要位于翻译起始水平，从而提高酵母的氨基酸合成能力；重复三联体翻译出来的蛋白多为有毒蛋白，参与Huntington综合症等疾病发生发展过程，阐明其机制有利于了解病因，进而对疾病进行靶向治疗。

PTEN(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome Ten)是人类肿瘤中最常突变的基因之一，在多种动物模型中都有确凿的证据证明，PTEN是强有力的抑癌基因。除了抑制肿瘤之外，PTEN还参与胚胎发育、代谢及组织稳态维持多种生物学过程。因此，自其1997年被发现并克隆以来，针对PTEN的探索一直是研究领域的热点。

PTEN基因定位于人类10号染色体10q23.3，全长200kb，包含有9个外显子和8个内含子，转录的mRNA全长55kb，其中5’UTR由804个核苷酸组成，长度超过一般真核细胞基因的5’UTR并富含GC。PTEN cDNA由1209个核苷酸组成，编码含403个氨基酸、分子量约为55kD的蛋白。PTEN蛋白具有高度保守性，人、狗、鼠、果蝇的PTEN蛋白具有99.75％同源性。PTEN由N端磷酸酶结构域、C2、C-tail和PDZ结构域组成，后三者分别介导与膜磷脂的结合、蛋白稳定性和蛋白相互作用。PTEN蛋白具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶的双重特异性磷酸酶功能，其中124位半胱氨酸及129位精氨酸分别为这两种磷酸酶活性所必需。细胞浆内PTEN通过去磷酸化其主要底物PIP3(phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate)而影响PI3K/Akt通路的活性及细胞生存和增生。细胞核内PTEN通过稳定着丝粒而维持染色体稳定性，进而调节细胞衰老。由于PTEN的细胞核内功能并不依赖于磷酸酶活性和PI3K/Akt通路活性的调节，因此，PTEN在基本生物学过程中的广泛作用并不能仅仅归因于这个活性。一个很可能的解释是PTEN具有未被发现的新功能或者新的亚型。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新型的N端延长型PTEN亚型PTENζ蛋白及其编码基因，所述PTENζ蛋白的编码基因的5’-UTR区域存在一个新的AUU翻译起始位点，由此形成一个含28个氨基酸的N端延长型的PTEN亚型，并明确该蛋白在调节基本细胞活动及多种组织器官功能中新的生物学功能。

本发明的目的在于提供所述N端延长型PTEN亚型PTENζ蛋白的应用，PTENζ蛋白通过与USO1蛋白相互作用，参与内质网向高尔基体的蛋白运输中。

本发明提供了一种N端延长型PTEN亚型PTENζ蛋白，所述PTENζ蛋白是在PTEN蛋白基础上在N端连接有一段28aa的多肽；所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选的，所述PTENζ蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明提供了一种敲除所述N端延长型PTEN亚型PTENζ蛋白的试剂在提高细胞内蛋白质运输效率的应用。

本发明提供了一种编码所述N端延长型PTEN亚型PTENζ蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述基因的起始密码子为ATT。

本发明提供了一种用于敲除所述N端延长型PTEN亚型PTENζ蛋白的gRNA，所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明提供了一种用于敲除所述N端延长型PTEN亚型PTENζ蛋白的试剂，所述试剂包括CRISPER-Cas9基因编辑系统；

所述CRISPER-Cas9基因编辑系统包含所述gRNA。

本发明提供了所述gRNA或所述试剂在提高细胞内蛋白质运输效率的应用。

优选的，所述细胞内蛋白运输效率是细胞内蛋白质从内质网到高尔基体的运输效率。

本发明提供了一种用于调节所述PTENζ蛋白表达水平的DNA分子，所述DNA分子为一段32bp的回文序列；所述回文序列的的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

本发明提供了所述DNA分子在提高所述N端延长型PTEN亚型PTENζ蛋白表达水平中的应用。

本发明提供的N端延长型PTEN亚型PTENζ蛋白，所述PTENζ蛋白是在PTEN蛋白基础上在N端连接有一段28aa的多肽；所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。研究表明，PTENζ蛋白与经典的PTEN蛋白在细胞内分布不同，其功能也存在差别，PTENζ蛋白中N端连接一段多肽为高尔基体定位信号，主要分布在高尔基体、胞浆和细胞膜上，通过与USO1蛋白相互作用，参与内质网到高尔基体的蛋白运输。实验证明，通过敲除PTENζ蛋白导致细胞内质网向高尔基体的囊泡运输显著增快。因此，PTENζ蛋白的鉴定对于理解PTEN在调节基本细胞活动及多种组织器官功能中的重要性有了新的诠释。

本发明提供了一种编码所述N端延长型PTEN亚型PTENζ蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述基因的起始密码子为ATT。本发明通过构建了四个突变质粒(UUG⁸³¹>CTC、CUG⁸⁴⁶>CTC、AAG⁹³⁶>CTC、AUU⁹⁴⁸>CTC 4种翻译起始位点突变)来确定PTENζ的翻译起始位点的具体种类，结果表明，AUU⁹⁴⁸突变显著降低PTENζ的表达，而UUG⁸³¹、CUG⁸⁴⁶、AAG⁹³⁶突变并不能降低PTENζ的表达。因此，AUU⁹⁴⁸为PTENζ的表达所必需的，是PTENζ的翻译起始点。

本发明提供了所述敲除所述N端延长型PTEN亚型PTENζ蛋白的gRNA或所述试剂在提高细胞内蛋白质运输效率的应用。本发明采用CRISPER-Cas9方法特异性敲除PTENζ蛋白(将PTENζ翻译起始密码子由ATT突变为不能起始翻译的ATC)，利用RUSH(retention usingselective hooks)系统检测PTENζ蛋白敲除的细胞系和野生型细胞中内质网到高尔基体蛋白运输的效率，结果表明，PTENζKI细胞系和PTENζWT细胞系蛋白运输过程中3种运输状态的细胞数量存在明显差异，PTENζKI(KI)中囊泡完全运输至高尔基体的细胞比例显著高于野生型(WT)。由此可观察到，PTENζKI细胞系中囊泡运输速度显著高于PTENζWT细胞系。结合USO1在囊泡运输中的重要作用以及与PTENζKI蛋白的相互作用，本发明可以得到PTENζKI蛋白在内质网到高尔基体之间的囊泡运输中发挥作用。

本发明提供的用于调节所述PTENζ蛋白表达水平的DNA分子，所述DNA分子为一段32bp的回文序列；所述回文序列的的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。回文序列形成的回文结构在介导PTENζATT起始翻译中起关键作用，实验表明，回文结构破坏以后，会极大程度的下调PTENζ的水平。这说明PTENζ的表达依赖于其翻译起始点下游的回文结构。

附图说明

图1为未知蛋白PTENζ的分子量略高于PTEN的电泳图；

图2为PTENζ在多种肿瘤细胞系中有广泛表达结果；

图3为PTEN mRNA的5’-UTR存在的可变翻译起始点；

图4为对潜在可变翻译起始位点点突变载体构建；

图5为GFP抗体检测PTENα-GFP以及PTEN-GFP质粒蛋白表达结果；

图6为GFP抗体验证各潜在翻译起始位点的翻译能力示意图；

图7为纯化PTENζ蛋白载体的构建示意图；

图8为镍珠纯化PTENζ蛋白结果；

图9为质谱检测纯化PTENζ蛋白的氨基酸序列，捕捉到片段用黑体加粗表示；

图10为分析预测PTENζ编码区的二级结构；

图11为PTEN-FLAG、PTENζ-FLAG以及点突变载体质粒结构示意图；

图12为PTENζ编码区发卡结构序列突变示意图；

图13为FLAG抗体检测PTENζ编码区发卡结构对PTENζ蛋白表达量影响的结果；

图14为免疫荧光检测PTENζ蛋白亚细胞定位的荧光图片；

图15为PTENζN端28个氨基酸与荧光蛋白融合质粒示意图；

图16为PTENζN端28氨基酸序列融合荧光蛋白后细胞定位的荧光图片；

图17为野生型Hela细胞与PTENζ敲除的Hela细胞加入生物素5分钟由内质网向高尔基体的囊泡运输荧光检测结果；

图18为三种运输状态图例；

图19为在PTENζKI细胞系和PTENζWT细胞系中不同运输状态细胞所占比例统计结果。

具体实施方式

本发明提供了一种N端延长型PTEN亚型PTENζ蛋白，所述PTENζ蛋白是在PTEN蛋白基础上在N端连接有一段28aa的多肽；所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示(MSILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPD)。所述PTENζ蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID NO:2所示(MSILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPDMTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQH TQITKV)。

在本发明中，PTENζ定位于高尔基体，其N端28个氨基酸形成的多肽序列为一段高尔基体的定位信号。利用C端绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)与PTENζ蛋白融合，并用β-catenin抗体标记细胞膜、GM130抗体标记高尔基体，利用免疫荧光实验验证PTENζ蛋白的亚细胞定位，结果显示，GFP标记的PTENζ蛋白主要分布于高尔基体和细胞膜，与β-catenin和GM130有良好的共定位。同时，由于红色荧光蛋白(Discosoma sp.redfluorescentprotein，DsRed)在细胞中过表达分布于整个胞浆中，没有特异性亚细胞定位。本发明将PTENζ蛋白的N端的28个氨基酸序列与红色荧光蛋白融合，在细胞中过表达，利用免疫荧光实验发现，PTENζ蛋白的N端的28个氨基酸序列改变了原本均匀分布在胞浆中的红色荧光蛋白的亚细胞定位，而使红色荧光蛋白分布在高尔基体上，与用GM130标记的高尔基体有良好的共定位。以上实验结果表明PTENζ蛋白的N端的28个氨基酸序列是一段高尔基体定位信号。

在本发明中，PTENζ参与内质网向高尔基体的囊泡运输。本发明通过构建PTENζ纯合敲除细胞系，利用RUSH系统检测PTENζ蛋白敲除的细胞系和野生型细胞中内质网到高尔基体蛋白运输的效率。在PTENζKI细胞系和PTENζWT细胞系蛋白运输过程中3种运输状态的细胞数量存在明显差异，PTENζKI(KI)中囊泡完全运输至高尔基体的细胞比例显著高于野生型(WT)。由此可观察到，PTENζKI细胞系中囊泡运输速度显著高于PTENζWT细胞系。因此，本发明提供一种敲除PTENζ蛋白的试剂在提高细胞中蛋白质或囊泡运输速度中的应用。

本发明提供了一种编码所述N端延长型PTEN亚型PTENζ蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示(atttccatcctgcagaagaagccccgccaccagcagcttctgccatctctctcctcctttttcttcagccacaggctcccagacatgacagccatcatcaaagagatcgttagcagaaacaaaaggagatatcaagaagatggattcgacttagacttgacctatatttacccaaacattattgctatgggatttcctgcagaaagacttgaaggcgtatacaggaacaatattgatgatgtagtaaggtttttggattcaaagcataaaaaccattacaagatatacaatctttgtgctgaaagacattatgacaccgccaaatttaattgcagagttgcacaatatccttttgaagaccataacccaccacagctagaacttatcaaacccttttgtgaagatcttgaccaatggctaagtgaagatgacaatcatgttgcagcaattcactgtaaagctggaaagggacgaactggtgtaatgatatgtgcatatttattacatcggggcaaatttttaaaggcacaagaggccctagatttctatggggaagtaaggaccagagacaaaaagggagtaactattcccagtcagaggcgctatgtgtattattatagctacctgttaaagaatcatctggattatagaccagtggcactgttgtttcacaagatgatgtttgaaactattccaatgttcagtggcggaacttgcaatcctcagtttgtggtctgccagctaaaggtgaagatatattcctccaattcaggacccacacgacgggaagacaagttcatgtactttgagttccctcagccgttacctgtgtgtggtgatatcaaagtagagttcttccacaaacagaacaagatgctaaaaaaggacaaaatgtttcacttttgggtaaatacattcttcataccaggaccagaggaaacctcagaaaaagtagaaaatggaagtctatgtgatcaagaaatcgatagcatttgcagtatagagcgtgcagataatgacaaggaatatctagtacttactttaacaaaaaatgatcttgacaaagcaaataaagacaaagccaaccgatacttttctccaaattttaaggtgaagctgtacttcacaaaaacagtagaggagccgtcaaatccagaggctagcagttcaacttctgtaacaccagatgttagtgacaatgaacctgatcattatagatattctgacaccactgactctgatccagagaatgaaccttttgatgaagatcagcatacacaaattacaaaagtctag)，所述基因的起始密码子为ATT。

在本发明中，为了确定PTEN mRNA的5’-UTR序列是否具有起始编码PTENα以外其它亚型蛋白的能力，将PTENα的编码序列(SEQ ID NO：7)构建入表达C端绿色荧光蛋白(GFP)标签的载体，其中GFP的起始密码子被替换为相对较弱的ATA，目的在于抑制GFP起始的表达。检测发现该重组载体可以表达出大小略微大于90kDa(PTEN-GFP)的蛋白，由此证明PTENmRNA的5’-UTR序列具有起始编码PTENα以外其它亚型蛋白的能力。由于在与估测蛋白大小相符的范围内与经典的翻译起始密码子只有一个碱基差异的密码子有四个，本发明构建了四个突变质粒用于确定PTENζ的翻译起始位点。UUG⁸³¹、CUG⁸⁴⁶、AAG⁹³⁶和AUU⁹⁴⁸都可能起始55kDa蛋白的翻译，本发明在CTG⁵¹³>CTC的基础上分别构建了这4个UUG⁸³¹>CTC、CUG⁸⁴⁶>CTC、AAG⁹³⁶>CTC、AUU⁹⁴⁸>CTC的突变，用于确定翻译起始位点的类型。结果显示，PTEN-GFP的表达并不受突变的影响，而PTENζ-GFP却因突变发生而影响表达。AUU⁹⁴⁸突变显著降低PTENζ的表达，而UUG⁸³¹、CUG⁸⁴⁶、AAG⁹³⁶突变并没有这一作用。因此，AUU⁹⁴⁸为PTENζ的表达所必需，是PTENζ的翻译起始点。

本发明提供了一种用于敲除所述N端延长型PTEN亚型PTENζ蛋白的gRNA，所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。本发明对所述设计gRNA的方法不做特殊限制，采用本领域所熟知的gRNA方法即可。

本发明优选提供了一种含针对PTENζ起始密码子的gRNA的表达载体，为携带所述gRNA的pX459载体，具体构建方法为将互补的两条单链gRNA序列经过变性与退火形成双链gRNA，并通过T4连接酶连接到pX459载体(Plasmid#62988)中。

本发明提供了一种用于敲除所述N端延长型PTEN亚型PTENζ蛋白的试剂，所述试剂包括CRISPER-Cas9基因编辑系统；所述CRISPER-Cas9基因编辑系统包含所述gRNA。

在本发明中，所述CRISPER-Cas9基因编辑系统包括含针对PTENζ起始密码子的gRNA的表达载体和ABE7.10(Plasmid#85171)载体。

在本发明中，所述提高细胞内蛋白质运输效率的方法优选为将携带上述gRNA的pX459载体与ABE7.10(Plasmid#85171)载体按照质量比1:3的比例共转染真核细胞，筛选阳性细胞，挑取单克隆细胞培养，鉴定，得到PTENζ纯合敲除细胞系。实验证明，与野生型细胞相比，敲除PTENζ蛋白的细胞系在囊泡运输效率方面有显著提高，同时完全运输至高尔基体的细胞比例方面有显著提高。所述细胞内蛋白运输效率是细胞内蛋白质从内质网到高尔基体的运输效率。

本发明提供了一种用于调节所述PTENζ蛋白表达水平的DNA分子，所述DNA分子为一段32bp的回文序列；所述回文序列的的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。回文结构在介导PTENζ的ATT起始翻译中起关键作用蛋白质的表达水平常受到其翻译起始点临近mRNA二级结构的调节。根据前期报道关于PTENα的翻译受到其翻译起始点CTG⁵¹³毗邻的回文结构的调控，破坏该二级结构将极大程度的下调PTENα的表达水平的内容。本发明预测了PTENζ翻译起始点ATT⁹⁴⁸临近mRNA序列的二级结构特点，并实验检测了其存在与否对PTENζ翻译水平的影响；结果表明，在ATT⁹⁴⁸临下游11bp处发现一个32bp的回文结构(GCAGAAGAAGCCCCGCCACCAGCAGCTTCTGC，SEQ ID NO:6)。通过点突变破坏该结构会大幅下调PTENζ的表达水平。

上述结果表明，回文结构在介导PTENζ的ATT⁹⁴⁸起始翻译中起关键作用，本发明提供了所述DNA分子在提高所述N端延长型PTEN亚型PTENζ蛋白表达水平中的应用。

下面结合实施例对本发明提供的一种N端延长型PTEN亚型PTENζ蛋白及其编码基因和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

PTENζ蛋白的翻译起始于ATT⁹⁴⁸的鉴定方法

(1)采用质粒表达及突变分析显示PTENζ的翻译起始于ATT⁹⁴⁸

根据前期研究工作中鉴定了PTEN新亚型蛋白PTENα、PTENβ等一些PTEN的亚型蛋白，在对PTEN及亚型蛋白的研究过程中，发现相对传统PTEN蛋白分子量位置(55kDa)略微高一点的一个未知蛋白的条带(见图1，参见[1]PTENα，aPTEN Isoform translated throughalternative initiation,regulates mitochondrial function and energymetabolism，Hui Liang,Shiming He,Jingyi Yang,et al.Cell Metabolism,19,836-848,2014,May 6.[2]PTENβis an alternatively translated isoform of PTEN thatregulates rDNA transcription，Hui Liang,Xi Chen,Qi Yin,Danhui Ruan,etal.nature communications，2017.)。

随后检测了不同的肿瘤细胞系，收集Hela、HEK293等多个肿瘤细胞并用以体积百分含量为0.15％NP40为主要裂解成分的低渗缓冲液于4℃条件下裂解细胞，4℃，12000rpm离心收集细胞上清并与5×loading buffer混合，100℃煮样10min。将上述蛋白裂解产物用6％SDS-PAGE分离并进行后续的免疫印迹实验。其中电泳条件为：80V电压电泳20min、120V电压电泳50min左右，直至55kDa所对应的蛋白质条带位于聚丙烯酰胺凝胶的最前端；转膜条件为恒流100mA、6h。将转印有PTEN新亚型蛋白的PVDF膜用5％脱脂奶粉于室温封闭1h后，利用特异性识别PTEN蛋白C端氨基酸序列的PTEN单克隆抗体(CST#9559)对PTEN新亚型蛋白条带进行识别。

结果发现在多种PTEN基因完整的细胞系中PTEN单克隆抗体均可以识别到该未知蛋白条带，而在PTEN缺失的细胞系中(PC3细胞系)检测不到该蛋白(图2)。由于实验所使用的抗体是识别PTEN羧基末端氨基酸序列的单克隆抗体，这一结果说明该蛋白的产生与PTEN基因密切相关且含有与PTEN蛋白C端类似的氨基酸序列。由此推测，55kDa位置的未知蛋白有可能是新发现的氨基末端延伸的新型PTEN亚型蛋白。

随后，通过分析PTEN mRNA的5’-UTR，在与所发现条带处蛋白大小吻合的序列范围内序列，结果发现与传统AUG¹⁰³²处于同一阅读框的共有4个非AUG型起始密码子(与AUG相差一个碱基)，分别是UUG⁸³¹、CUG⁸⁴⁶、AAG⁹³⁶和AUU⁹⁴⁸(见图3)。

首先，为了检测这些非AUG型起始密码子是否具有起始蛋白翻译的能力，从Hela细胞cDNA中克隆出PTEN和PTENα的编码序列，将PTEN(SEQ ID NO：8)和PTENα的编码序列(SEQID NO：7)利用BamHI酶切位点构建入C端表达GFP标签的pEGFP-N1质粒中，构建PTEN-GFP和PTENα-GFP表达载体(见图4)。将PTEN-GFP和PTENα-GFP表达载体分别转入Hela中，用GFP(中山金桥)抗体按照上述方法进行免疫印迹检测。

GFP抗体可以特异性识别出该质粒表达的分子量略大于PTEN蛋白的目的蛋白(见图5)，在WesternBlot结果中该亚型蛋白的条带略微高于PTEN蛋白的条带。在没有N端延长序列的PTEN-GFP组并未检测出该表带，说明该条带不是PTEN蛋白的修饰产物。综上，PTENζ是由PTEN mRNA 5’-UTR内的非AUG型密码子起始翻译产生的新亚型蛋白。

接下来通过在前述PTENα-GFP表达载体进行点突变以初步探测PTENζ的翻译起始点。PTENε的翻译起始点CTG⁸¹⁶突变为TAG后，PTEN其他亚型蛋白的条带消失，而对PTENζ亚型蛋白条带无影响，这排除了PTENζ可能是PTENα以及其他亚型蛋白剪切产物或降解产物的可能性。随后，在CTG⁸¹⁶>TAG的基础上，分别将UUG⁸³¹、CUG⁸⁴⁶、AAG⁹³⁶和AUU⁹⁴⁸突变为CTC(见图4)，按照上述方法分别转入Hela中，并进行免疫印迹实验。

结果发现，ATT⁹⁴⁸突变以后，PTENζ表达消失，而UUG⁸³¹、CUG⁸⁴⁶、AAG⁹³⁶突变对PTENζ条带无影响，这提示ATT⁹⁴⁸就是新亚型蛋白PTENζ的翻译起始点(图6)。

(2)质谱分析揭示PTENζ蛋白序列

从Hela细胞中扩增出PTENα序列(SEQ ID NO:7)，随后利用同源重组的方式将该序列利用EcoRI酶切位点与表达C-his标签的pFAST-Bac1质粒连接，在pFast-Bac1质粒中插入带有C端His标签的PTENα，同时将PTEN以及其他PTEN亚型蛋白的翻译起始点突变为CTC(见图7)，以消除PTEN以及其他PTEN亚型蛋白的表达，仅保留ATT⁹⁴⁸翻译起始位点，得到PTENζ真核表达载体。将上述构建的PTENζ真核表达载体以病毒感染的方式转入sf9昆虫细胞，扩大培养后通过超声破碎细胞，随后离心收集上清裂解液。之后在4℃层析柜内将上清与His-beads结合3h，之后依次用含有不同咪唑浓度的洗脱液(50mM，100mM，200mM，500mM)分别洗去杂蛋白获得相应的纯蛋白，最终选取200mM洗脱液纯化的蛋白(见图8)。最后利用SDS-PAGE对纯蛋白产物进行分离并用考马斯亮蓝染液对SDS-PAGE胶进行染色，将条带大小在55～70kDa之间蛋白条带切胶回收进行蛋白质质谱鉴定。LC-MS/MS检测到多条与PTENζN端序列匹配的肽段，覆盖程度可达42.9％，并且此次检测还成功的成功捕获了PTENζ蛋白最N端的蛋白肽段MSILQKKPR。该质谱结果显示，ATT⁹⁴⁸就是PTENζ翻译的起始点。

(3)回文结构在介导PTENζATT起始翻译中起关键作用

蛋白质的表达水平受翻译起始点临近mRNA二级结构的调节，因此分析和预测了PTENζ编码区的二级结构，具体内容如下：在http://www.unafold.org网站对PTENζN端序列进行预测，显示在PTEN翻译起始位点下游存在稳定发夹结构。结果在其翻译起始点ATT⁹⁴⁸下游11bp处发现一个32bp的回文序列(图10)。为了探究该回文序列是否具有调节PTENζ表达水平的作用，将PTENζ以及PTEN从Hela细胞中扩增出，随后利用同源重组的方式将该序列与表达C-flag标签的pCMV-tag 2b质粒连接，构建PTENζ-FLAG以及PTEN-FLAG载体(见图11)，通过在质粒中进行点突变(见图12)方式破坏该二级结构，构建PTENζ-panlindromdisruption-FLAG载体(图11)，并将构建的质粒转入HEK293细胞内并在转染72h后收集细胞，以体积百分含量为0.15％NP40为主要裂解成分的低渗缓冲液于4℃条件下裂解细胞，在4℃、12000rpm离心收集细胞上清并与5×loading buffer混合，100℃煮样10min。将上述蛋白裂解产物用6％SDS-PAGE分离并进行后续的免疫印迹实验。其中电泳条件为：80V电压电泳20min，随后120V电压电泳直至55kDa所对应的蛋白质条带位于聚丙烯酰胺凝胶的最前端；转膜条件为恒流100mA、6h。将转印有PTEN新亚型蛋白的PVDF膜用5％脱脂奶粉于室温封闭1h后，利用特异性识别FLAG氨基酸序列的单克隆抗体(Sigma3165)对PTEN新亚型蛋白条带进行识别。

结果发现，该回文结构破坏以后，会极大程度的下调PTENζ的水平(图13)。这说明PTENζ的表达依赖于其翻译起始点下游的回文结构。

实施例2

PTENζ的生理功能

(1)PTENζ定位于高尔基体，其N端28个氨基酸的蛋白序列为一段高尔基体的定位信号

蛋白的功能与其定位密切相关。为了解析PTENζ的功能及其分子机制，揭示PTENζ与传统PTEN蛋白是否有同样的亚细胞定位。从Hela细胞cDNA分别扩增出PTENζ以及传统PTEN蛋白的核苷酸序列并在起始密码子上游加入kozak序列(GCCACCATG)以增强表达，随后通过同源重组的方式将其连接入携带C端GFP标签的pEGFP-N1载体内。与此同时，为了增强该亚型蛋白的表达，利用点突变的方式将PTENζ蛋白的可变翻译起始密码子(ATT⁹⁴⁸)突变为ATG并将该质粒内传统PTEN蛋白的起始密码子ATG突变为CTC，从而获得C-GFP标签的PEGFP-N1-PTENζ以及PEGFP-N1-PTEN过表达载体。

将上述C-GFP标签的PEGFP-N1-PTENζ以及PEGFP-N1-PTEN过表达载体和空对照质粒分别转入Hela细胞内，同时用β-catenin(Santa Cruz)标记细胞膜，用GM130(AbClonalA5344)标记高尔基体，用DAPI标记细胞核。随后用confocal观察PTENζ蛋白的亚细胞分布情况。

结果表明，不同于传统PTEN蛋白(在胞浆胞核均匀分布)，PTENζ在细胞细胞膜与β-catenin存在明显共定位，且在核周存在聚集性定位，与GM130存在明显共定位(图14)，第一排为空GFP组，第二排的C端GFP的PTEN组，第三、四排为C端GFP标签的PTENζ组，说明PTENζ特异性定位于细胞膜以及高尔基体。

克隆PTENζN端延长的28氨基酸序列(MSILQKKPRHQQLLPSLSSFFFSHRLPD，对应的核苷酸序列为SEQ ID NO:9，ATTTCCATCCTGCAGAAGAAGCCCCGCCACCAGCAGCTTCTGCCATCTCTCTCCTCCTTTTTCTTCAGCCACAGGCTCCCAGAC)，利用同源重组插入pDS-RED-N1质粒中，构建C端红色荧光蛋白的融合蛋白表达载体PTENζN ter-DsRed。同样在pEGFP-N1质粒中同源重组PTENζN端延长的28氨基酸序列，构建PTENζN ter-GFP(图15)。在Hela细胞中过表达该融合荧光蛋白，用GM130(AbClonal A5344)标记高尔基体，用DAPI标记细胞核。

随后用confocal观察荧光蛋白在细胞中的分布，GFP和DsRed蛋白均匀分布于整个细胞，与PTENζN端延长的28氨基酸序列融合后定位发生明显变化，与GM130有明显的共定位(图16)。以上实验结果表明PTENζ蛋白的N端的28个氨基酸序列是一段高尔基体定位信号。

(2)PTENζ参与内质网向高尔基体的囊泡运输

为了进一步PTENζ的功能研究，设计并构建含有针对PTENζ起始密码子的gRNA的表达载体，根据ABE7.10的PAM序列NGG及突变方式T>C或A>G，结合PTENζ起始密码子附近DNA序列，设计gRNA。其核苷酸序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示。将互补的两条单链gRNA序列经过变性与退火形成双链gRNA，并通过T4连接酶连接到pX459载体(Plasmid#62988)中。

gRNA：GGAAATGGCTCTGGACTTGGCGG(SEQ ID NO：4)；

互补gRNA：CCGCCAAGTCCAGAGCCATTTCC(SEQ ID NO：5)。

将携带上述gRNA的pX459载体与ABE7.10(Plasmid#85171)载体按照质量比1:3的比例共转染Hela细胞，所得细胞系经Puromycin筛选四天后得到转入质粒的阳性细胞。将阳性细胞计数，并按照每个96孔板种80个细胞的密度进行铺板，共计种8个96孔板。培养10～14天后，可在部分孔中得到阳性细胞单克隆。

挑取单克隆至24孔板的一孔中继续培养，待长满后取部分细胞悬液，在65℃过夜消化10h后作为模板，使用根据PTENζ基因序列设计合成的如下两条引物进行PCR与测序检验：

P6-F：GAGCCAAGCGGCGGCAG(SEQ ID NO：10)；

P6-R：GGAGCCTGTGGCTGAAG(SEQ ID NO：11)。

将鉴定发生突变单克隆继续培养并保种，最终得到PTENζ纯合敲除细胞系。

利用RUSH(retention using selective hooks)系统检测PTENζ蛋白敲除的细胞系和野生型细胞中内质网到高尔基体蛋白运输的效率。

该实验中，利用Str-Ii_SBP-EGFP-Golgin84质粒，转染Hela野生型(WT)以及HelaPTENζ敲除(PTENζKI)细胞系，表达48小时后利用免疫荧光检测进行检测。GM130抗体标记高尔基体，图中绿色荧光蛋白融合蛋白(Golgin84-GFP融合蛋白)在未加入生物素(biotin)时(图17，0min add biotin)，野生型细胞系和PTENζ敲除细胞系(PTENζKI)中绿色荧光蛋白融合蛋白主要位于内质网，在加入生物素20min时，两组细胞中绿色荧光蛋白融合蛋白都定位于高尔基体上，与GM130有明显共定位，这表明这套运输效率检测在野生型和PTENζ敲除细胞系中具有可行性。在加入生物素5分钟时(图17，5min add biotin)，由免疫荧光结果可以发现，PTENζ敲除的细胞系中绿色荧光蛋白到达高尔基体的效率显著高于野生型细胞中绿色荧光蛋白到达高尔基体的效率。

为了更好的区分不同细胞系之间囊泡运输效率，以定量细胞数量的方式并结合报告蛋白的状态来表征不同细胞运输效率。将报告蛋白在内质网与高尔基体之间的蛋白运输状态分为三类：1)报告蛋白完全滞留在内质网内；2)报告蛋白从内质网中向高尔基体运输，但并未完成运输存在于内质网与高尔基体之间；3)报告蛋白有内质网完全运输至高尔基体中，结束运输过程。三种状态的典型图例如图18所示。在对多个样本进行免疫荧光检测和计数，结果如图19所示，PTENζKI细胞系和PTENζWT细胞系蛋白运输过程中3种运输状态中细胞数量存在明显差异，PTENζKI(KI)中囊泡完全运输至高尔基体的细胞比例显著高于野生型(WT)。由此可观察到，PTENζKI细胞系中囊泡运输速度显著高于PTENζWT细胞系。结合前期USO1在囊泡运输中的重要以及与PTENζKI蛋白的相互作用，可以推断PTENζKI蛋白在内质网到高尔基体之间的囊泡运输中发挥作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京大学

<120> 一种N端延长型PTEN亚型PTENζ蛋白及其编码基因和应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Ile Leu Gln Lys Lys Pro Arg His Gln Gln Leu Leu Pro Ser

1 5 10 15

Leu Ser Ser Phe Phe Phe Ser His Arg Leu Pro

20 25

<210> 2

<211> 431

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Ile Leu Gln Lys Lys Pro Arg His Gln Gln Leu Leu Pro Ser

1 5 10 15

Leu Ser Ser Phe Phe Phe Ser His Arg Leu Pro Asp Met Thr Ala Ile

20 25 30

Ile Lys Glu Ile Val Ser Arg Asn Lys Arg Arg Tyr Gln Glu Asp Gly

35 40 45

Phe Asp Leu Asp Leu Thr Tyr Ile Tyr Pro Asn Ile Ile Ala Met Gly

50 55 60

Phe Pro Ala Glu Arg Leu Glu Gly Val Tyr Arg Asn Asn Ile Asp Asp

65 70 75 80

Val Val Arg Phe Leu Asp Ser Lys His Lys Asn His Tyr Lys Ile Tyr

85 90 95

Asn Leu Cys Ala Glu Arg His Tyr Asp Thr Ala Lys Phe Asn Cys Arg

100 105 110

Val Ala Gln Tyr Pro Phe Glu Asp His Asn Pro Pro Gln Leu Glu Leu

115 120 125

Ile Lys Pro Phe Cys Glu Asp Leu Asp Gln Trp Leu Ser Glu Asp Asp

130 135 140

Asn His Val Ala Ala Ile His Cys Lys Ala Gly Lys Gly Arg Thr Gly

145 150 155 160

Val Met Ile Cys Ala Tyr Leu Leu His Arg Gly Lys Phe Leu Lys Ala

165 170 175

Gln Glu Ala Leu Asp Phe Tyr Gly Glu Val Arg Thr Arg Asp Lys Lys

180 185 190

Gly Val Thr Ile Pro Ser Gln Arg Arg Tyr Val Tyr Tyr Tyr Ser Tyr

195 200 205

Leu Leu Lys Asn His Leu Asp Tyr Arg Pro Val Ala Leu Leu Phe His

210 215 220

Lys Met Met Phe Glu Thr Ile Pro Met Phe Ser Gly Gly Thr Cys Asn

225 230 235 240

Pro Gln Phe Val Val Cys Gln Leu Lys Val Lys Ile Tyr Ser Ser Asn

245 250 255

Ser Gly Pro Thr Arg Arg Glu Asp Lys Phe Met Tyr Phe Glu Phe Pro

260 265 270

Gln Pro Leu Pro Val Cys Gly Asp Ile Lys Val Glu Phe Phe His Lys

275 280 285

Gln Asn Lys Met Leu Lys Lys Asp Lys Met Phe His Phe Trp Val Asn

290 295 300

Thr Phe Phe Ile Pro Gly Pro Glu Glu Thr Ser Glu Lys Val Glu Asn

305 310 315 320

Gly Ser Leu Cys Asp Gln Glu Ile Asp Ser Ile Cys Ser Ile Glu Arg

325 330 335

Ala Asp Asn Asp Lys Glu Tyr Leu Val Leu Thr Leu Thr Lys Asn Asp

340 345 350

Leu Asp Lys Ala Asn Lys Asp Lys Ala Asn Arg Tyr Phe Ser Pro Asn

355 360 365

Phe Lys Val Lys Leu Tyr Phe Thr Lys Thr Val Glu Glu Pro Ser Asn

370 375 380

Pro Glu Ala Ser Ser Ser Thr Ser Val Thr Pro Asp Val Ser Asp Asn

385 390 395 400

Glu Pro Asp His Tyr Arg Tyr Ser Asp Thr Thr Asp Ser Asp Pro Glu

405 410 415

Asn Glu Pro Phe Asp Glu Asp Gln His Thr Gln Ile Thr Lys Val

420 425 430

<210> 3

<211> 1296

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atttccatcc tgcagaagaa gccccgccac cagcagcttc tgccatctct ctcctccttt 60

ttcttcagcc acaggctccc agacatgaca gccatcatca aagagatcgt tagcagaaac 120

aaaaggagat atcaagaaga tggattcgac ttagacttga cctatattta cccaaacatt 180

attgctatgg gatttcctgc agaaagactt gaaggcgtat acaggaacaa tattgatgat 240

gtagtaaggt ttttggattc aaagcataaa aaccattaca agatatacaa tctttgtgct 300

gaaagacatt atgacaccgc caaatttaat tgcagagttg cacaatatcc ttttgaagac 360

cataacccac cacagctaga acttatcaaa cccttttgtg aagatcttga ccaatggcta 420

agtgaagatg acaatcatgt tgcagcaatt cactgtaaag ctggaaaggg acgaactggt 480

gtaatgatat gtgcatattt attacatcgg ggcaaatttt taaaggcaca agaggcccta 540

gatttctatg gggaagtaag gaccagagac aaaaagggag taactattcc cagtcagagg 600

cgctatgtgt attattatag ctacctgtta aagaatcatc tggattatag accagtggca 660

ctgttgtttc acaagatgat gtttgaaact attccaatgt tcagtggcgg aacttgcaat 720

cctcagtttg tggtctgcca gctaaaggtg aagatatatt cctccaattc aggacccaca 780

cgacgggaag acaagttcat gtactttgag ttccctcagc cgttacctgt gtgtggtgat 840

atcaaagtag agttcttcca caaacagaac aagatgctaa aaaaggacaa aatgtttcac 900

ttttgggtaa atacattctt cataccagga ccagaggaaa cctcagaaaa agtagaaaat 960

ggaagtctat gtgatcaaga aatcgatagc atttgcagta tagagcgtgc agataatgac 1020

aaggaatatc tagtacttac tttaacaaaa aatgatcttg acaaagcaaa taaagacaaa 1080

gccaaccgat acttttctcc aaattttaag gtgaagctgt acttcacaaa aacagtagag 1140

gagccgtcaa atccagaggc tagcagttca acttctgtaa caccagatgt tagtgacaat 1200

gaacctgatc attatagata ttctgacacc actgactctg atccagagaa tgaacctttt 1260

gatgaagatc agcatacaca aattacaaaa gtctag 1296

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggaaatggct ctggacttgg cgg 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccgccaagtc cagagccatt tcc 23

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcagaagaag ccccgccacc agcagcttct gc 32

<210> 7

<211> 1731

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctggagcggg ggggagaagc ggcggcggcg gcggccgcgg cggctgcagc tccagggagg 60

gggtctgagt cgcctgtcac catttccagg gctgggaacg ccggagagtt ggtctctccc 120

cttctactgc ctccaacacg gcggcggcgg cggcggcaca tccagggacc cgggccggtt 180

ttaaacctcc cgtccgccgc cgccgcaccc cccgtggccc gggctccgga ggccgccggc 240

ggaggcagcc gttcggagga ttattcgtct tctccccatt ccgctgccgc cgctgccagg 300

cctctggctg ctgaggagaa gcaggcccag tcgctgcaac catccagcag ccgccgcagc 360

agccattacc cggctgcggt ccagagccaa gcggcggcag agcgaggggc atcagctacc 420

gccaagtcca gagccatttc catcctgcag aagaagcccc gccaccagca gcttctgcca 480

tctctctcct cctttttctt cagccacagg ctcccagaca tgacagccat catcaaagag 540

atcgttagca gaaacaaaag gagatatcaa gaggatggat tcgacttaga cttgacctat 600

atttatccaa acattattgc tatgggattt cctgcagaaa gacttgaagg cgtatacagg 660

aacaatattg atgatgtagt aaggtttttg gattcaaagc ataaaaacca ttacaagata 720

tacaatcttt gtgctgaaag acattatgac accgccaaat ttaattgcag agttgcacaa 780

tatccttttg aagaccataa cccaccacag ctagaactta tcaaaccctt ttgtgaagat 840

cttgaccaat ggctaagtga agatgacaat catgttgcag caattcactg taaagctgga 900

aagggacgaa ctggtgtaat gatatgtgca tatttattac atcggggcaa atttttaaag 960

gcacaagagg ccctagattt ctatggggaa gtaaggacca gagacaaaaa gggagtaact 1020

attcccagtc agaggcgcta tgtgtattat tatagctacc tgttaaagaa tcatctggat 1080

tatagaccag tggcactgtt gtttcacaag atgatgtttg aaactattcc aatgttcagt 1140

ggcggaactt gcaatcctca gtttgtggtc tgccagctaa aggtgaagat atattcctcc 1200

aattcaggac ccacacgacg ggaagacaag ttcatgtact ttgagttccc tcagccgtta 1260

cctgtgtgtg gtgatatcaa agtagagttc ttccacaaac agaacaagat gctaaaaaag 1320

gacaaaatgt ttcacttttg ggtaaataca ttcttcatac caggaccaga ggaaacctca 1380

gaaaaagtag aaaatggaag tctatgtgat caagaaatcg atagcatttg cagtatagag 1440

cgtgcagata atgacaagga atatctagta cttactttaa caaaaaatga tcttgacaaa 1500

gcaaataaag acaaagccaa ccgatacttt tctccaaatt ttaaggtgaa gctgtacttc 1560

acaaaaacag tagaggagcc gtcaaatcca gaggctagca gttcaacttc tgtaacacca 1620

gatgttagtg acaatgaacc tgatcattat agatattctg acaccactga ctctgatcca 1680

gagaatgaac cttttgatga agatcagcat acacaaatta caaaagtctg a 1731

<210> 8

<211> 1212

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgacagcca tcatcaaaga gatcgttagc agaaacaaaa ggagatatca agaggatgga 60

ttcgacttag acttgaccta tatttatcca aacattattg ctatgggatt tcctgcagaa 120

agacttgaag gcgtatacag gaacaatatt gatgatgtag taaggttttt ggattcaaag 180

cataaaaacc attacaagat atacaatctt tgtgctgaaa gacattatga caccgccaaa 240

tttaattgca gagttgcaca atatcctttt gaagaccata acccaccaca gctagaactt 300

atcaaaccct tttgtgaaga tcttgaccaa tggctaagtg aagatgacaa tcatgttgca 360

gcaattcact gtaaagctgg aaagggacga actggtgtaa tgatatgtgc atatttatta 420

catcggggca aatttttaaa ggcacaagag gccctagatt tctatgggga agtaaggacc 480

agagacaaaa agggagtaac tattcccagt cagaggcgct atgtgtatta ttatagctac 540

ctgttaaaga atcatctgga ttatagacca gtggcactgt tgtttcacaa gatgatgttt 600

gaaactattc caatgttcag tggcggaact tgcaatcctc agtttgtggt ctgccagcta 660

aaggtgaaga tatattcctc caattcagga cccacacgac gggaagacaa gttcatgtac 720

tttgagttcc ctcagccgtt acctgtgtgt ggtgatatca aagtagagtt cttccacaaa 780

cagaacaaga tgctaaaaaa ggacaaaatg tttcactttt gggtaaatac attcttcata 840

ccaggaccag aggaaacctc agaaaaagta gaaaatggaa gtctatgtga tcaagaaatc 900

gatagcattt gcagtataga gcgtgcagat aatgacaagg aatatctagt acttacttta 960

acaaaaaatg atcttgacaa agcaaataaa gacaaagcca accgatactt ttctccaaat 1020

tttaaggtga agctgtactt cacaaaaaca gtagaggagc cgtcaaatcc agaggctagc 1080

agttcaactt ctgtaacacc agatgttagt gacaatgaac ctgatcatta tagatattct 1140

gacaccactg actctgatcc agagaatgaa ccttttgatg aagatcagca tacacaaatt 1200

acaaaagtct ga 1212

<210> 9

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atttccatcc tgcagaagaa gccccgccac cagcagcttc tgccatctct ctcctccttt 60

ttcttcagcc acaggctccc agac 84

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gagccaagcg gcggcag 17

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggagcctgtg gctgaag 17

Claims

1.一种N端延长型PTEN亚型PTENζ蛋白，其特征在于，所述PTENζ蛋白是在PTEN蛋白基础上在N端连接有一段28aa的多肽；所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述N端延长型PTEN亚型PTENζ蛋白，其特征在于，所述PTENζ蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种敲除权利要求1或2所述N端延长型PTEN亚型PTENζ蛋白的试剂在提高细胞内蛋白质运输效率的应用，所述细胞内蛋白质运输效率是在细胞内蛋白质从内质网到高尔基体的运输效率。

4.一种编码权利要求1或2所述N端延长型PTEN亚型PTENζ蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述基因的起始密码子为ATT。

5.一种用于敲除权利要求1或2所述N端延长型PTEN亚型PTENζ蛋白的gRNA，其特征在于，所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

6.一种用于敲除权利要求1或2所述N端延长型PTEN亚型PTENζ蛋白的试剂，其特征在于，所述试剂包括CRISPR-Cas9基因编辑系统；

所述CRISPR-Cas9基因编辑系统包含权利要求5所述gRNA。

7.权利要求5所述gRNA或权利要求6所述试剂在提高细胞内蛋白质运输效率的应用，所述细胞内蛋白质运输效率是在细胞内蛋白质从内质网到高尔基体的运输效率。

8.一种用于调节权利要求1或2所述PTENζ蛋白表达水平的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子为一段32bp的回文序列；所述回文序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

9.权利要求8所述DNA分子在调控权利要求1或2所述N端延长型PTEN亚型PTENζ蛋白表达水平中的应用，所述应用为所述DNA分子破坏后，下调PTENζ的水平。